亲吻肽拮抗剂及其用途 本发明涉及亲吻肽 (kisspeptin) 拮抗剂及其在用于治疗个体中由亲吻肽活性引 起和 / 或使恶化的病症中的用途。此外， 本发明还涉及用于鉴定亲吻肽拮抗剂的方法。
RFamide 是在其 C- 末端具有通常的 Arg-Phe-NH2 基序一组肽激素， 并且都与 G 蛋 白偶联受体结合。已表明 RFamide 参与全身的许多过程， 包括炎症反应、 对食物摄入和发育 的控制。RFamide 发挥作用的一个主要方面是生殖， 其涉及两种 RFamide ： 促性腺激素抑制 激素 (GnIH) 和亲吻肽。
KiSS-1 基因位于人染色体 1q32 上， 由四个外显子 - 两个非翻译和两个部分翻译的 外显子组成， 产生 145 个氨基酸 (aa) 的肽 [1]。前体肽被剪切成 54 个氨基酸的长度， 还可 以进一步被截短至 14、 13 或 10 个氨基酸 ； 这些截短物被统称为亲吻肽， 并且在哺乳动物中 高度保守。 目前已知这些肽是孤儿 G 蛋白偶联受体 (GPCR)( 在大鼠中被称为 GPR54， 在人中 被称为 AXOR12) 的配体 [2-4]。10aa 的肽， YNWNSFGLRF-NH2 足以激活受体。
GPR54 受体具有 396aa 的开放阅读框架， 并与甘丙肽 (galanin) 受体家族相关， 但 是其并不与甘丙肽结合。 大鼠 GPR54 在且哺乳动物中高度保守， 与人受体有 81％的同源性， 与小鼠有 85％的同源性 [2， 4， 5]。在脑和外周组织中的受体和配体已得到充分表征， 其中 GPR54 和 KiSS-1 位于下丘脑、 主动脉、 卵巢、 前列腺和胎盘， GPR54 还表达于垂体中 [2， 4， 6， 7]。
考虑到受体和配体表达的位置， 假设了它们在生殖中起作用， 并且通过证明 GPR54 因杂合和纯合突变性功能缺失而引起特发性低促性腺激素性性腺功能减退症 (iHH) 而得 到证实， 在 iHH 患者中表现青春期延迟或无青春期 (failed puberty)， 以低或无血浆促黄 体激素 (LH) 脉冲为特征 [8-13]。这也在 GPR54-/- 小鼠中观察到， 其具有小的睾丸 / 卵巢， 小的外生殖器和输精管， 发育不全的 Leydig 细胞和子宫角， 与在 iHH 人患者中看到的非常 相似 [14]。这就使得关注 KiSS-1 和 GPR54 在控制青春期尤其是其时机中起作用的假设。 之后， 发现青春期猴子的 KiSS-1 mRNA 水平比幼年期猴子更高 [15]。小鼠在第 10 日 (d10) 没有 KiSS-1 神经元， 从第 25 日开始在前腹侧室旁核 (Anterioventral Paraventricular nucleus， AVPV) 中出现 KiSS-1 神经元， 并且雄性小鼠大约在第 45 日而雌性小鼠在第 61 日 增加至成年水平。这与这些动物的青春期时机相一致 [16]。然而， GPR54 mRNA 水平在出生 后的整个青春期保持恒定， 因此， 亲吻肽输注可在所有阶段刺激 LH 释放。因此， 亲吻肽被认 为青春期始发中 GnRH 分泌的主要调节剂 [17]。
亲吻肽和 GPR54 在下丘脑中的表达产生了亲吻肽可能参与调控下丘脑 - 垂体 - 性 腺 (HPG) 轴的假设。已通过证明亲吻肽在雄性大鼠和人中以剂量依赖的方式快速增加血 浆促黄体激素 (LH)、 促卵泡激素 (FSH) 和睾丸素 ( 其中其对 LH 的强效作用是对 FSH 的 10 倍 )[18-20] 而证实了这种假设。还进一步证明可以通过施用促性腺激素释放激素受体 (GnRHR) 拮抗剂而消除所述促性腺激素的增加。这表明亲吻肽在下丘脑水平发挥作用以 刺激 GnRH 释放 [15]。有关下丘脑的中间隆起处的 GnRH 神经元具有 GPR54 受体， 而 90 ％ 的 KiSS-1 神经元纤维与 GnRH- 免疫反应性神经元共定位的发现进一步证实了这一点 [21， 22]。 另外， GT1-7 下丘脑细胞也表达 KiSS-1 和 GPR54 mRNA， 其因对雌二醇反应而增加， 而亲
吻肽在 24 小时后刺激这些细胞释放 GnRH[23]。以上数据还表明亲吻肽并不在垂体水平起 作用， 但是尚未排除直接在垂体水平起作用。其他研究小组还证明亲吻肽在垂体中的促性 腺激素细胞和生长激素细胞中表达， 并且亲吻肽可以直接刺激 LH 和生长激素的释放 [24， 25]。
KiSS-1 神经元定位于啮齿动物和灵长动物下丘脑的弓状核 (ARC) 和 AVPV。然而 在羊和大鼠中， 仅在 ARC 中发现 KiSS-1 神经元 [16， 26， 27]。现在已确定 ARC 参与类固醇的 负调节， 而 AVPV 参与促性腺激素释放的正反馈控制。首次注意到， 在将雄性小鼠阉割之后， 观察到在 ARC 中， KiSS-1 细胞数量和 mRNA 表达水平增加， 并且雌激素替代使其降低至正常 水平， 而在 AVPV 中， KiSS-1 细胞数量减少， 并且雌激素给药使其升高回正常水平 [26]。现 在已证明 KiSS-1 细胞体表达雌激素受体 α(ERα) 和黄体酮受体， 表明 KiSS-1 在类固醇反 馈环中的作用 [27， 28]。这表明 ARC 在负控制下调节 LH 脉冲， 而 AVPV 在正控制下可能刺激 LH 激增和诱导排卵。这通过亲吻肽抗血清甚至在高雌激素存在下也抑制大鼠 LH 激增而得 到证明， 此外， 还因为雌鼠 AVPV 中的 KiSS-1 神经元比雄鼠多 10 倍。该类固醇控制在整个 发情周期是起作用的， 因为在 AVPV 中的 KiSS-1- 阳性细胞数量在动情前期最高， 而在动情 间期最低， 而在 ARC 中的情形则与其相反 [16， 29]。对于羊， 作用于 ARC 上的正和负反馈产 生与其它哺乳动物尾部区域促进 LH 激增相同的反应。除了类固醇控制， KiSS-1 还通过褪 黑素受到光周期的调节， 而且 KiSS-1 神经元在其细胞体上具有 Mel1c 受体。与保持在长日 照条件下的雌性西伯利亚仓鼠相比， 保持在短日照下的雌性西伯利亚仓鼠对外源性亲吻肽 的反应也降低 [30-33]。瘦素 (leptin) 似乎也具有影响作用， 因为严格禁食的啮齿动物具 有降低的 KiSS-1 mRNA、 GnRH、 LH 和 FSH 以及延迟的青春期 [34， 35]。
还在 HPG 轴外部的诸如心脏血管系统的外周组织中发现亲吻肽， 已证明亲吻 肽 -10/13 作为主动脉平滑肌的血管收缩剂起作用 [7， 36]。 GPR54 还高度表达于中枢神经系 统 (CNS)， 脑海马区域中， 已证明其通过涉及 MAP 激酶的机理可逆地增强海马齿状回颗粒细 胞中的突触传递， 其中所述机理似乎受到钙 - 激活激酶和酪氨酸激酶的调控 [37]。KiSS-1 和 GPR54 mRNA 还定位于大鼠卵巢中， 其在大鼠卵巢中的表达同样与动情周期相关。在卵巢 中， KiSS-1 定位于卵巢表面上皮细胞、 间质腺、 黄体以及在卵泡中， 直至动情前期都存在于 膜细胞中， 而动情前期时表达移至卵泡细胞层 [6]。最近， 在子宫输卵管中发现 KiSS mRNA， 并且假设其参与防止异位妊娠 [38]。然而， KiSS-1 和 GPR54 的最高水平在胎盘中。
在胎盘中， KiSS-1 和 GPR54 定位于小鼠 [39] 和人 [40] 的合体滋养层细胞 ； 和大 鼠的巨细胞 [41]。GPR54 还定位于外绒毛滋养层细胞， 表明其可能有旁分泌作用 [42]。在 人中， 妊娠前三个月配体和受体都以高水平存在， 但是足月仅有 KiSS-1 存在， 而在大鼠中 到 E18.5 期二者都不存在。这与滋养层的侵入相一致， 而 KiSS-1 由于其抗转移性质而被假 设为该侵入的抑制剂 [39， 41]。
还已知亲吻肽是许多癌症组织例如胰腺癌、 甲状腺癌和肝细胞癌中的抗转移因 子 [43-45]。已假设了此功能的不同机制， 包括基质细胞衍生因子 -1(SDF-1) 的拮抗作 用， 以抑制其趋化因子受体 CXCR4 的转移性质， 以及上调调节性钙依赖磷酸酶 - 相作蛋 白 -1(modulatory calcineurin-interactin protein-1， MCIP-1)， MCIP-1 是能够抑制钙依 赖磷酸酶信号传导途径的趋化激素 [46， 47]。另一个假设是亲吻肽受到特异性蛋白 1(SP1) 和位于染色体区域 6q16.3q23 的其共激活因子 DRIP130 的调控。当此区域出现杂合性缺失(LOH) 时， 肿瘤常缺失 KiSS-1， 而这允许转移发生。 这可由抑制侵入和迁移的 SP1 和 DRIP130 补救 [48， 49]。
在培养的细胞中也证明了这种抑制， 并且作为输出 (output) 以研究亲吻肽所使 用的信号传导途径。在中国卵巢仓鼠 (CHO) 细胞中， 亲吻肽 -10(Kp10) 可以抑制趋化性、 迁移、 集落形成和生长以及可以引起细胞变圆。Kp-10 还可以通过粘着斑激酶 (FAK) 和 paxillin 蛋白的磷酸化作用而引起粘着斑和应力纤维的形成 [3， 50， 51]。已证明亲吻肽和 GPR54 提高肌醇 -3- 磷酸、 细胞内钙和 pERK， 表明 GPR54 激活 Gq/11 信号传导途径 [4]。这与 抗转移性质不完全一致， 因为这种途径通常刺激生长和迁移。 因此， 表明亲吻肽可能激活其 它途径， 如 Rho 和 Rac/Cdc42 途径 [5， 51]。
在这个背景下， 本发明的发明人惊奇地发现， 亲吻肽拮抗剂可以用于治疗个体中 由亲吻肽活性引起和 / 或使恶化的病症。
因此， 在第一方面， 本发明提供了亲吻肽拮抗剂在制备用于治疗个体中由亲吻肽 活性引起和 / 或使恶化的病症的药物中的用途。第二方面， 本发明提供了亲吻肽拮抗剂， 其 用于治疗个体中由亲吻肽活性引起和 / 或使恶化的病症。
具体而言， 发现 GPR54 受体的拮抗剂通过在下丘脑抑制 GnRH 释放， 而可用于调控 与促性腺激素和性类固醇相关的疾病。 因此， 亲吻肽拮抗剂是一个重要的发现， 因为它们可 能替代用于抑制促性腺激素的 GnRH 激动剂和拮抗剂， 并且它们的作用更快速和完全。 GnRH 类似物以抑制型形态被用于抑制促性腺激素和性激素， 并且它们已经在激素 依赖性疾病 ( 如前列腺癌、 乳癌和卵巢癌 ) 的治疗中获得广泛的治疗应用， 并在体外受精用 于诱导排卵， 以及作为新一代的避孕药。
因此， 由于亲吻肽是 GnRH 的主要刺激物 ( 例如， 已知亲吻肽受体 GPR54 的突变引 起不育 )， 本发明的发明人发现亲吻肽拮抗剂可能与 GnRH 拮抗剂有相似的应用范围 ； 此外， 由于亲吻肽操纵 GnRH 神经元的上游， 预期亲吻肽拮抗剂的作用应该比基于 GnRH 的治疗法 更快速和有效。
本文中， “个体中的亲吻肽活性” 包括亲吻肽在体外和 / 或体内的任何特性、 活性 或特征。因而， 本文中的 “亲吻肽拮抗剂” 的含义包括能够防止和 / 或降低亲吻肽在体外和 / 或体内的任何特性、 活性或特征的分子。例如， 亲吻肽拮抗剂可以防止和 / 或降低亲吻肽 物理性地与亲吻肽受体或其它细胞成分缔合或结合的能力。
因而， 本发明的分子和拮抗剂能够可逆地或不可逆地结合亲吻肽受体和 / 或选择 性地结合亲吻肽受体。 所述 “选择性地结合” 包括本发明的分子和拮抗剂与亲吻肽受体结合 的能力比与其它多肽结合的能力强至少 10 倍 ； 优选地强至少 50 倍， 和更优选地强至少 100 倍。优选地， 本发明的分子和拮抗剂在生理条件下， 例如在体内与亲吻肽受体结合。测量肽 与其配体或受体结合或缔合的方法 ( 无论是在体内或是在体外 ) 是生物化学和细胞生物学 领域的技术人员所熟知的。
例如， 如以下实施例中所显示的， 本发明的拮抗剂可以是亲吻肽的竞争性拮抗剂， 其结合但并不激活亲吻肽同源受体 ( 如 GPR54)。
亲吻肽拮抗剂还可以阻止和 / 或降低亲吻肽刺激具体细胞行为的能力， 例如细胞 中 ( 例如在转化或原代细胞系如 CHO、 HEK、 COS、 GnRH GTI 神经元细胞系以及正常滋养层和 细胞系如 JEG 中 ) 亲吻肽介导的刺激肌醇磷酸生成。本领域中熟知用于肌醇磷酸生成的细
胞测量的生物化学测定法。
在尤其优选的方面， 拮抗剂为亲吻肽的肽类似物。亲吻肽的肽类似物的结构 / 活 性关系 (SAR) 受到的关注相对较少， 直到现在仍完全集中于激动作用 [52， 53]。 亲吻肽的氨 基酸序列 ( 又被称为亲吻肽 1-54) 为 ：
GTSLSPPPESSGSRQQPGLSAPHSRQIPAPQGAVLVQREKDLPNYNWNSFGLRF.NH2。
因而， 第三方面， 本发明提供了包含以下序列或由以下序列组成的肽分子或者其 片段或变体用于治疗患者中由亲吻肽活性引起和 / 或使恶化的病症的用途， 或者在制备用 于治疗患者中由亲吻肽活性引起和 / 或使恶化的病症的药物中的用途， 所述序列为 ： 1 2 3
X -G/W-X -R/(D)R-X
其中 ：
X1 为 F 或 A 或任意 D- 氨基酸残基 ；
X2 为 L 或 A 或任意 D- 氨基酸残基 ；
X3 为 F 或 W ； 且
其中所述肽分子的 C- 末端氨基酸残基包含去除该残基上的电荷的基团 z ；
并且所述肽序列不为 ： F-G-L-R-F ；
F-G-L-R-W ； 或
F-G-(D)F-R-F。
优选地， 本发明肽分子的 C- 末端氨基酸残基包含基团 z 的情况下， 该 C- 末端残基 上的负电荷被去除。
应理解， 在本文中使用常规的用于表示氨基酸的单字母代码来定义本发明所述的 肽分子。术语 “氨基酸” 包括水溶性有机化合物中具有与 α- 碳原子连接的羧基 (-COOH) 和 氨基 (-NH2) 基团的任何基团。氨基酸可以用通式 R-CH(NH2)COOH 表示 ； R 基团为氢或有机 基团， 并且决定了任意具体氨基酸的性质。 α- 碳原子周围的四个不同基团的四面体排列使 氨基酸具有光学活性。两种镜像形式被称为 L- 异构体和 D- 异构体。通常， 仅有 L- 氨基酸 是蛋白质 ( 如真核蛋白质 ) 的组成成分。
除非另作说明， 本发明的肽分子包含 L- 氨基酸。当 D- 氨基酸存在于本发明的肽 分子时， 用带有前缀 “(D)” 的常规单字母氨基酸代码表示。
如所述， 本发明的分子可以包含在特定位置具有 “任意 D- 氨基酸” 的肽序列或由 在特定位置具有 “任意 D- 氨基酸” 的肽序列组成。所述 “任意 D- 氨基酸” 包括在序列中在 特定位置的任意天然或非天然 ( 例如化学修饰的 )D- 氨基酸。天然 D- 氨基酸的实例如下 ： D- 丙氨酸 ； D- 天冬氨酸 ； D- 半胱氨酸 ； D- 谷氨酸 ； D- 苯丙氨酸 ； D- 甘氨酸 ； D- 组氨酸 ； D- 异 亮氨酸 ； D- 赖氨酸 ； D- 亮氨酸 ； D- 蛋氨酸 ； D- 天冬酰胺 ； D- 脯氨酸 ； D- 谷氨酰胺 ； D- 精氨 酸； D- 丝氨酸 ； D- 苏氨酸 ； D- 缬氨酸 ； D- 色氨酸 ； D- 酪氨酸。
非天然 D- 氨基酸的实例如下 ： 萘基丙氨酸 ； D- 吡啶基丙氨酸 ； D- 叔丁基丝氨酸 ； D- 鸟氨酸 ； D-ε 氨基赖氨酸 ； D- 高精氨酸 ； D-α 甲基亮氨酸以及用卤素取代 ( 如 F) 这些 和其它非天然氨基酸中的质子。
通过形成肽键， 氨基酸结合形成短链 ( 肽 ) 或较长的链 ( 多肽 )。已知蛋白质和 / 或肽由不同比例的大约 20 种常见氨基酸组成， 其序列决定了蛋白质和 / 或肽的形状、 性质
和生物学作用。这种肽或多肽链中的氨基酸残基通常用它们在链上的排列位置来表示， 第 一位 ( 即位点 1) 指定为链 N- 末端的氨基酸。
可 以 通 过 Lu et al(1981)J.Org.Chem.46， 3433 和 其 中 的 参 考 文 献 中 公 开 的 Fmoc- 聚酰胺式固相肽合成法来合成本发明分子的肽序列。 用 9- 芴基甲氧羰基 (Fmoc) 基团 提供临时的 N- 氨基保护。 使用含 20％哌啶的 N， N- 二甲基甲酰胺进行该高度碱不稳定的保 护基团的重复去除。可以将侧链官能团保护成其丁基醚 ( 对于丝氨酸、 苏氨酸和酪氨酸的 情况 )、 丁基酯 ( 对于谷氨酸和天冬氨酸的情况 )、 丁基氧羧基衍生物 ( 对于赖氨酸和组氨 酸的情况 )、 三苯甲基衍生物 ( 对于半胱氨酸的情况 ) 和 4- 甲氧基 -2， 3， 6- 三甲基苯磺酰衍 生物 ( 对于精氨酸的情况 )。 当 C- 末端残基为谷氨酰胺或天冬酰胺时， 使用 4， 4′ - 二甲氧 基二苯甲基基团保护侧链氨基官能团。 固相载体基于由二甲基丙烯酰胺 ( 主链单体 )、 双丙 烯酰乙二胺 ( 交联剂 ) 和丙烯酰肌氨酸甲酯 ( 功能化试剂 ) 三种单体组成的聚二甲基 - 丙 烯酰胺聚合物。 所使用的肽 - 树脂可断裂连接剂为酸不稳定的 4- 羟甲基 - 苯氧基乙酸衍生 物。除了天冬酰胺和谷氨酰胺之外， 全部氨基酸衍生物均作为它们预制的对称酐衍生物加 入， 而使用反向 N， N- 二环己基碳二亚胺 /1- 羟基苯并三唑介导的偶联方法加入天冬酰胺和 谷氨酰胺。使用茚三酮、 三硝基苯磺酸或吲哚醌 (isotin) 检测方法来监测所有的偶联和去 保护反应。合成完成时， 从树脂载体切下肽， 同时用含有 50％清除剂混合物的 95％三氟乙 酸处理去除侧链的保护基团。常用的清除剂为乙二硫醇、 苯酚、 苯甲醚和水， 准确的选择取 决于所合成的肽的氨基酸组成。通过真空蒸发去除三氟乙酸， 接着通过用乙醚研磨而提供 粗肽。通过简单的萃取步骤来去除存在的任何清除剂， 其中通过冷冻干燥水相提供不含清 除剂的粗肽。 用于肽合成的试剂通常可购自 Calbiochem-Novabiochem(UK)Ltd， Nottingham NG7 2QJ， UK。纯化可以通过例如体积排阻色谱法、 离子交换色谱法和 ( 主要地 ) 反相高效 液相色谱法等技术中的任意一种或组合来实现。肽的分析可以使用薄层色谱法、 反相高效 液相色谱法、 酸水解后的氨基酸分析以及快速原子轰击 (FAB) 质谱分析来进行。
还可以使用化学和生物化学领域技术人员所熟知的液相法来合成本发明分子的 肽序列。
本发明分子的肽序列可以包含肽模拟物化合物或由肽模拟物化合物组成。术语 “肽模拟物” 是指模拟作为治疗剂的特定肽的结构和理想特征， 同时避免了不期望特征的化 合物。例如， 可以口服给药的化合物吗啡， 是脑啡肽和 / 或内啡肽的肽模拟物。
一般而言， 由于缺乏口服生物利用度和蛋白水解的降解， 涉及肽的治疗应用是受 限的， 并且通常通过注射给药。通常， 例如肽在体内被外肽酶和内肽酶快速降解， 以致其生 物半衰期通常非常短。肽作为潜在的治疗剂的另一个缺陷是它们缺乏口服给药生物利用 度。 肽在胃肠道被蛋白水解酶降解很可能是重要的影响因素。 然而， 因为已认识到即使是不 易被快速代谢失活的小环形肽或包括 D- 氨基酸的肽， 仍然显示出较差的口服生物利用度， 而使得问题更加复杂。 这可能是由于跨肠膜转运较差和通过肝提取而从血液快速清除并且 接着排泄到肠中而造成的。这些结果表明， 多个酰胺键可能干扰口服生物利用度。由此认 为当肽药物被口服给药时， 肽链中连接氨基酸残基的肽键可能断裂或被切割。
有许多不同的方法用于设计和合成肽模拟物。在一种方法中， 例如 Sherman 和 Spatola， J.Am.Chem.Soc.， 112 ： 433(1990) 所公开的方法中， 以基本等排 (isoteric) 的方 式由多种化学官能团替代一个或更多个酰胺键。 这种分步的方法在获得活性类似物方面取得一些成绩。在一些例子中， 这些类似物显示比它们天然存在的对应物具有更长的生物半 衰期。尽管如此， 这种方法有些局限性。很少能成功替代多于一个的酰胺键。因而， 所得到 的类似物在分子的其它部位仍然对酶促失活敏感。替代肽键时， 优选新的接头部分具有与 肽键基本上相同的电荷分布和基本上相同的平面。
反转肽模拟物 (Retro-inverso peptidomimetics)， 其中的肽键是反向的， 可以用 本领域中已知的方法合成， 例如 et al(1997) J.Immunol.1593230-3237 中所描述 的方法。该方法包括制备含有涉及主链变化， 但不涉及侧链定向变化的伪肽。反转肽包含 NH-CO 键而不是 CO-NH 肽键， 对蛋白酶解具有更强的抗性。之前已合成了某些 GnRH 肽的反 转肽模拟物 (Fromme， 2003， Endocrinology， 144 ： 3262-9)。
在另一种方法中， 将各种非编码或修饰的氨基酸如 D- 氨基酸和 N- 甲基氨基酸用 于修饰哺乳动物肽。可选择地， 通过共价修饰如环化， 或者通过加入 γ- 内酰胺或其他类型 的桥而稳定假定的生物活性构象。参见例如， Veber etal， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 75 ： 2636(1978) 和 Thursell et al， Biochem.Biophys.Res.Comm.， 111 ： 166(1983)。
许多合成策略的共同主题是向基于肽的骨架中引入一些环化部分 (moiety)。 环化 部分限制肽结构的构象空间， 并且这常常产生对特定生物受体的亲合力增加的肽。这种策 略的其他优势在于， 向肽中引入环化部分还可获得对细胞肽酶的敏感性减小的肽。 合成环化稳定的肽模拟物的一种策略是闭环置换反应 (RCM)。这种方法包括合成 肽前体并使其接触 RCM 催化剂， 从而产生限定构象的肽的步骤。合适的肽前体可以包含两 个或更多个不饱和的 C-C 键。该方法可使用固相肽合成技术来进行。在这个实施方案中， 锚定至固相载体的前体与 RCM 催化剂相接触， 然后将产物从固相载体切下， 从而产生限定 构象的肽。
另一种方法， 由 D.H.Rich 在 Protease Inhabitors， Barrett 和 Selveson eds.， Elsevier(1986) 中公开， 已通过在酶抑制剂设计中应用过渡态类似物概念设计肽模拟物。 例如， 已知辛伐他汀 (staline) 的仲醇模拟胃蛋白酶底物中易断裂的酰胺键的四面体过渡 态。然而， 过渡态类似物概念与激素激动剂 / 拮抗剂设计没有明显关联。
为避免怀疑， 用标准肽键连接肽序列中的氨基酸残基并不是必需的。 例如， 如上所 述， 可以用反向肽键连接氨基酸残基， 或者可以通过模拟标准肽键的键长和空间定向的其 它键将它们连接在一起。
在合成之后， 可以使用本领域中已知的方法， 如 HPLC 和色谱法纯化本发明的活性 剂 (agent) 的肽序列。
本文所述的 “分子” 包括包含本发明的肽序列或由本发明的肽序列组成的分子的 盐 ( 如有机或无机酸加成盐 )、 酯和溶剂化物。应理解， 该术语还包括与相关分子具有相同 生物功能和 / 或活性的衍生物。此外， 为了本发明的目的， 该术语还包括相关分子的前药 ( 例如， 酯 )。术语 “前药” 包括任意物质组分， 其在口服或肠胃外给药后并且在给药后的预 定时间内， 在体内代谢形成相关活性剂， 该活性剂的量是用实验方法可检测的。
本发明的分子还可以由能够使本发明的分子靶向和 / 或定位至靶细胞 ( 如癌细 胞 ) 和 / 或能够增加本发明分子的半衰期 (t1/2) 的一个或更多部分组成， 或者包含能够使 本发明的分子靶向和 / 或定位至靶细胞 ( 如癌细胞 ) 和 / 或能够增加本发明分子的半衰期 (t1/2) 的一个或更多部分。 因此， 所述部分可以提高本发明分子的功效。 优选地， 当该分子
包括包含 D- 氨基酸或由 D- 氨基酸组成的肽序列或者由包含 D- 氨基酸或由 D- 氨基酸组成 的肽序列组成时， 本发明的分子中可包含一个或更多所述部分， 这是因为 D- 氨基酸残基尤 其易于被修饰。
本发明的分子还可以由能够使本发明的分子靶向和 / 或定位至靶细胞 ( 如癌细 胞 ) 和 / 或能够增加本发明分子的半衰期 (t1/2) 的一个或更多部分组成， 或者包括能够使 本发明的分子靶向和 / 或定位至靶细胞 ( 如癌细胞 ) 和 / 或能够增加本发明分子的半衰期 (t1/2) 的一个或更多部分。 因此， 所述部分可以提高本发明的分子的功效。 优选地， 当该活 性剂包括包含 D- 氨基酸的肽序列或由包含 D- 氨基酸的肽序列组成时， 本发明的分子中可 包含一个或更多所述部分， 这是因为那些 D- 氨基酸残基尤其易于被修饰。
优选地， 所述一个或更多部分为类固醇激素分子 ( 包括例如黄体酮、 睾丸酮、 雌二 醇或皮质醇 )， 并且与 D- 氨基酸的侧链结合。类固醇激素分子能够结合血浆蛋白， 且已被 证明能降低肽的代谢清除率 (Ratcliffe et al.， 2006， Endocrinology， 147 ： 571-9)。例 如， 在 WO2004/08725 中描述了与类固醇激素结合的 GnRH 肽， 该篇文献引入本文作为参考。 可选择地， 所述一个或更多部分为维生素， 如维生素 B12 或维生素 D， 并且与亲吻肽类似物 的 NH2 端或者天然或 D- 氨基酸的合适侧链结合。已证明维生素提高肽的口服生物利用度 (Russell-Jones et al.， 1995， Bioconjug.Chem.， 6： 34-42 ； Russell-Jones et al.， 1995， Bioconjug.Chem.， 6： 459-465)。 优选地， 本发明的分子作为亲吻肽拮抗剂的能力不受所述一个或更多部分影响和 / 或显著影响。
优选地， 本发明提供用途， 其中所述肽序列不为 ：
F-G-A-R-W ；
F-G-L-(D)R-W ；
F-G-(D)L-R-W ； 或
(D)F-G-L-R-W。
方便地， 本发明提供用途， 其中 X1 为 (D)F。优选地， X2 为选自 (D)F、 (D)L 和 (D)W 的 D- 氨基酸残基。
更优选地， 所述肽序列选自 ：
(D)F-W-L-R-W ； 或
F-G-(D)W-R-F。
在一个实施方案， 本发明提供用途， 其中所述 N- 末端残基包含去除该残基上的电 1 荷的基团 y。通常， X 包含去除该残基上的电荷的基团 y。
所述基团 y 可选自 ： 乙酰基 ( 在本申请全文中以 “ac” 表示 ) ； 三氟乙酰基 ； 环化氨 基酸 ； 或 N- 末端不带电荷的合成氨基酸 ( 例如氨基通过加入其它化合物 ( 如焦谷氨酸 ) 或 化学基团例如烷基 ( 例如甲酰基、 乙酰基、 丙基、 丁基和更长的烷基 ) 而被修饰的氨基酸 )。 3
优选地， 本发明提供用途， 其中 X 包含去除该残基上的电荷的基团 z。
在一个实施方案中， 本发明提供用途， 其中所述序列选自 ：
I)ac.F-G-(D)F-R-W.z ；
II)ac.F-G-(D)L-R-W.z ；
III)ac.F-G-L-(D)R-W.z ；
IV)ac.F-G-A-R-W.z ；
V)ac.A-G-L-R-W.z ；
VI)ac.(D)F-W-L-R-W.z ； 或
VII)ac.F-G-(D)W-R-F.z。
在一个实施方案中， 用去除该残基上的电荷的基团 y 替代以上 (I) 至 (VI) 的任意 一种肽的 N- 末端残基上的乙酰基 ( 以上和本申请中全文以 “ac” 表示 )， 并且所述基团 y 优 选选自 ： 乙酰基 ； 三氟乙酰基 ； 环化氨基酸 ； 或 N- 末端不带电荷的合成氨基酸。
在一个实施方案中， 本发明第三方面的用途涉及在本发明第三方面的肽序列的 N- 和 / 或 C- 末端包含额外氨基酸残基或肽的肽序列分子， 从而将肽序列加入较大的多肽或 蛋白质分子中。因而， 本发明第三方面的肽序列在 N- 和 / 或 C- 末端可以包含 0 至 10 个氨 基酸 ； 或 10 至 20 个氨基酸 ； 或 20 至 30 个氨基酸 ； 或 30 至 40 个氨基酸 ； 或 40 至 50 个氨 基酸 ； 或 50 至 60 个氨基酸 ； 或 60 至 70 个氨基酸 ； 或 70 至 80 个氨基酸 ； 或 80 至 90 个氨 基酸 ； 或 90 至 100 个氨基酸 ； 或多于 100 个氨基酸。
在优选的实施方案中， 本发明第三方面的用途涉及在肽序列 N- 末端包含额外肽 序列 R-R-M-K-W-K-K-Y 或 ac.R-R-M-K-W-K-K-Y 的分子， 或者由在肽序列 N- 末端的额外肽 序列 R-R-M-K-W-K-K-Y 或 ac.R-R-M-K-W-K-K-Y 组成的分子。 所述 R-R-M-K-W-K-K-Y 序列为来自果蝇触足肽 (Antennapedia) 的七肽序列， 所 述果蝇触足肽促进和 / 或提高细胞中肽序列的递送， 从而提高本发明的肽的治疗用途。所 述果蝇触足肽七肽描述于 Fisher et al.， 2003， J.Peptides Res.， 55 ： 163-72 ； 和 Wang et al.， 2006， Bioorganic and MedicinalChemistry Letters， 16 ： 2628-2631。
因此， 本发明的肽可以包含以下序列或由以下序列组成 ：
R-R-M-K-W-K-K-Y-F-G-(D)F-R-W.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-F-G-(D)L-R-W.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-F-G-L-(D)R-W.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-F-G-A-R-W.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-A-G-L-R-W.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)F-W-L-R-W.z ； 或
R-R-M-K-W-K-K-Y-F-G-(D)W-R-F.z。
任选地， 如上所定义， 所述 N- 末端残基在 N- 末端可以包含基团 y， 并且优选为乙酰 基 (ac)。
优选地， 本发明第三方面的肽序列加入全长亲吻肽的一部分或全部序列中。更优 选地， 本发明第三方面的肽序列的 N- 末端可以延长至包含亲吻肽 1-54 的肽序列 ( 即亲吻 肽序列的 1 至 54 个氨基酸残基 ) 和 / 或亲吻肽 1-45 的肽序列 ( 即亲吻肽序列的 1 至 45 个氨基酸残基 ) 的任意长度。例如， 本发明第三方面的肽序列可以在其 N- 末端具有以下的 序列 ：
GTSLSPPPESSGSRQQPGLSAPHSRQIPAPQGAVLVQREKDLPNYNWNS。
可选择地， 本发明第三方面的肽序列可以加入蛋白质例如白蛋白和 / 或免疫球蛋 白中。加入这些分子中被认为增加本发明肽分子在个体中的半衰期并降低代谢清除率。
在第四方面， 本发明提供肽分子或者其片段或变体在治疗患者中由亲吻肽活性引
起和 / 或使恶化的病症， 或者在制备用于治疗患者中由亲吻肽活性引起和 / 或使恶化的病 症的药物中的用途， 所述肽分子包含以下序列或由以下序列组成 ： A B C
X -X -X -N-XD-XE-G-XF-R-F
其中 ：
XA 为 Y 或任意的 D- 氨基酸残基 ；
XB 为 N 或任意的 D- 氨基酸残基 ；
XC 为 W 或任意的 D- 氨基酸残基 ；
XD 为 G 或 S 或任意的 D- 氨基酸残基 ；
XE 为 F 或 (D)W 或 (D)L ；
XF 为 W 或 L 或任意的 D- 氨基酸残基 ； 且
其中所述肽分子的 C- 末端氨基酸残基包含去除该残基上的电荷的基团 z ；
并且所述肽序列不为 ：
Y-N-W-N-S-F-G-L-R-F ；
(D)Y-(D)N-W-N-S-F-G-W-R-F ；
(D)Y-(D)N-W-N-G-F-G-W-R-F ；
(D)Y-(D)N-W-N-S-F-G-(D)W-R-F ； 或
(D)Y-(D)N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F。
优选地， XA 为选自以下的 D- 氨基酸残基 ： (D)F 和 (D)Y 和 (D)A。通常， XB 为选自 以下的 D- 氨基酸残基 ： (D)A 和 (D)N。在一方面， 当 XA 或 XB 中的一个为 (D)Y 时， 另一个不 A B F 为 (D)N。在另一方面， X 和 X 不都为 D- 氨基酸残基。优选地， 当 X 为 (D)W 时， XA 为 (D) F。
优选地， 本发明提供用途， 其中 XC 为选自以下的 D- 氨基酸残基 ： (D)A 和 (D)W。 D
在一个实施方案中， X 为选自以下的 D- 氨基酸残基 ： (D)A 和 (D)W。优选地， 当 XD 为 S 时， XF 为 (D)W 和 / 或 XA 不为 (D)Y， 更优选地， 当 XD 为 S 时， XF 为 (D)W 和 / 或 XA 为 (D) A。
优选地， XF 为选自以下的 D- 氨基酸残基 ： (D)L 和 (D)W. E F
在一个实施方案中， 当 X 和 X 都为 (D)W 时， XA 不为 (D)Y。优选地， 当 XE 和 XF 都 为 (D)W 时， XA 为 (D)A。
典型地， 本发明提供用途， 其中所述 N- 末端残基包含去除该残基上的电荷的基团 1 y。优选地， X 包含去除该残基上的电荷的基团 y。所述基团 y 选自 ： 乙酰基 ； 三氟乙酰基 ； 环化氨基酸 ； 或 N- 末端不带电荷的合成氨基酸。
在一个优选实施方案中， 本发明提供用途， 其中所述肽分子的 C- 末端 F 残基包含 去除该残基上的电荷的基团 z。
在一个实施方案， 所述肽序列选自 ：
a)Y-N-W-N-G-F-G-L-R-F.z ；
b)Y-N-W-N-G-F-G-(D)L-R-F.z ；
c)Y-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
d)Y-N-W-N-G-(D)W-G-L-R-F.z ；
e)ac.Y-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；f)ac.Y-N-W-N-(D)W-F-G-(D)W-R-F.z ；
g)ac.(D)Y-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
h)ac.Y-N-(D)W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
i)ac.Y-(D)N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
j)ac.Y-N-W-N-(D)A-F-G-(D)W-R-F.z ；
k)ac.(D)A-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
l)ac.Y-N-(D)A-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
m)ac.Y-(D)A-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
n)ac.(D)W-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
o)ac.(D)F-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
p)ac.(D)Y-N-W-N-G-(D)W-G-(D)W-R-F.z ；
q)ac.(D)A-N-W-N-G-(D)W-G-(D)W-R-F.z ；
r)ac.(D)A-N-W-N-S-F-G-(D)W-R-F.z ；
s)ac.(D)-A-N-W-N-G-F-G-W-R-F.z ；
t)ac.(D)A-N-W-N-(D)S-F-G-(D)W-R-F.z ； 或
u)ac.(D)A-N-W-N-G-F-G-(D)L-R-F.z。
在一个实施方案中， 本发明第四方面的用途涉及在本发明第四方面的肽序列的 N- 和 / 或 C- 末端包含额外氨基酸残基或肽的肽序列分子， 从而将肽序列加入较大的多肽或 蛋白质分子中。因而， 本发明第四方面的肽序列在 N- 和 / 或 C- 末端可以包含 0 至 10 个氨 基酸 ； 或 10 至 20 个氨基酸 ； 或 20 至 30 个氨基酸 ； 或 30 至 40 个氨基酸 ； 或 40 至 50 个氨 基酸 ； 或 50 至 60 个氨基酸 ； 或 60 至 70 个氨基酸 ； 或 70 至 80 个氨基酸 ； 或 80 至 90 个氨 基酸 ； 或 90 至 100 个氨基酸 ； 或多于 100 个氨基酸。
在一个优选实施方案中， 本发明第四方面的用途涉及在肽序列的 N- 末端包含额 外肽序列 R-R-M-K-W-K-K-Y 或 ac.R-R-M-K-W-K-K-Y 的分子， 或者由在肽序列的 N- 末端的 额外肽序列 R-R-M-K-W-K-K-Y 或 ac.R-R-M-K-W-K-K-Y 组成的分子。
如前所述， 所述 R-R-M-K-W-K-K-Y 序列为来自果蝇触足肽的七肽序列。因此， 本发 明第四方面的肽可以包含以下序列或由以下序列组成 ：
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-W-N-G-F-G-L-R-F.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-W-N-G-F-G-(D)L-R-F.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-W-N-G-(D)W-G-L-R-F.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-W-N-(D)W-F-G-(D)W-R-F.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)Y-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-(D)W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-(D)N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-W-N-(D)A-F-G-(D)W-R-F.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)A-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-(D)A-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-(D)A-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)W-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)F-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)Y-N-W-N-G-(D)W-G-(D)W-R-F.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)A-N-W-N-G-(D)W-G-(D)W-R-F.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)A-N-W-N-S-F-G-(D)W-R-F.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)A-N-W-N-G-F-G-W-R-F.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)A-N-W-N-(D)S-F-G-(D)W-R-F.z ； 或
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)A-N-W-N-G-F-G-(D)L-R-F.z。
任选地， 如上所定义， 所述 N- 末端残基在 N- 末端可以包含基团 y， 并且优选为乙酰 基 (ac)。
在特别优选的实施方案中， 本发明第四方面的肽序列选自 ：
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)A-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ； 或
ac.R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)A-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z。
如以下实施例中所显示的， 本发明的肽包含保持亲吻肽拮抗剂功能的 N- 末端果 蝇触足肽七肽。
优选地， 本发明第四方面的肽序列加入全长亲吻肽的一部分或全部序列中。更优 选地， 本发明第四方面的肽序列的 N- 末端可以延长至包含亲吻肽 1-54 的肽序列 ( 即亲吻 肽序列的 1 至 54 个氨基酸残基 ) 和 / 或亲吻肽 1-45 的肽序列 ( 即亲吻肽序列的 1 至 45 个氨基酸残基 ) 的任意长度。例如， 本发明第四方面的肽序列可在其 N- 末端具有以下的序 列：
GTSLSPPPESSGSRQQPGLSAPHSRQIPAPQGAVLVQREKDLP。
可选择地， 本发明第四方面的肽序列可以加入蛋白质如白蛋白和 / 或免疫球蛋白 中。加入这些分子中被认为增加本发明肽分子在个体中的半衰期和降低代谢清除率。
本文所述 “个体中由亲吻肽活性引起和 / 或使恶化的病症” 包括个体中的此病症 的症状和 / 或进展和 / 或结局是由亲吻肽活性引起、 诱导、 提高、 增强和 / 或使加重的病症。
优选地， 个体中由亲吻肽活性引起和 / 或使恶化的病症选自 ： 增殖性疾病 ； 子宫内 膜异位症 ； 子宫肌瘤 ； 性早熟 ； 先兆子痫 ； 胎儿宫内生长迟缓 (IUGR) ； 异位妊娠 ； 月经过多 ； 高血压 ； 冠心病 ； 中枢神经系统 (CNS)、 胰腺和 / 或免疫系统疾病 ； 阻抑或抑制排卵 ； 生育 病； 化疗引起和 / 或放疗引起的生殖组织损伤 ； 阻抑和 / 或抑制创伤愈合 ； 阻抑和 / 或抑制 生长激素生成。
例如， 在由促性腺激素和性类固醇激素刺激的生殖组织中， 亲吻肽拮抗剂将抑制 GnRH 分泌， 从而抑制对生殖组织和生殖系统癌症的刺激。 因此， 亲吻肽拮抗剂可用于抑制内 源性促性腺激素， 使得外源性促性腺激素可以以受控的方式给药， 以治疗患有阻抑或抑制 排卵的个体， 从而诱导或提高个体的排卵。 因此， 亲吻肽拮抗剂还可被用于降低或抑制生育 力， 从而获得男性和女性都适用的避孕方式。 此外， 亲吻肽拮抗剂对刺激生殖组织的抑制将 允许它们应用于防止化疗引起或放疗引起的生殖组织损伤， 从而保护接受化疗和 / 或放疗 的癌症个体的生殖组织。
如以下实施例中所显示的， 本发明的拮抗剂能够抑制和 / 或减小亲吻肽对细胞迁移的抑制作用。 由于在创伤愈合中需要出现细胞迁移， 因此， 亲吻肽在抑制创伤愈合中发挥 作用。因此， 在一个实施方案中， 本发明的拮抗剂可用于有此需要的个体以诱导和 / 或促进 创伤愈合。
如以下实施例中所显示的， 令人惊奇地， 本发明的拮抗剂提高测试个体中的生长 激素水平。因此， 本发明的拮抗剂可用于有此需要的个体以促进和 / 或诱导生长激素生成。 例如， 本发明的拮抗剂可以与使用生长激素的现有疗法一起使用， 例如用于肾衰竭的治疗。
亲吻肽独立地抑制滋养层侵入子宫壁 ( 即植入 )， 如在先兆子痫或 IUGR 中所发 生的。对于先兆子痫， 已证明 KiSS-1 mRNA 增加， 抑制母体血液供应的正确的滋养层侵入 [54]。 因而， 亲吻肽拮抗剂可被用于减轻所述抑制， 并且例如， 允许在病态妊娠， 如先兆子痫 期间发生滋养层侵入。
已知亲吻肽独立地诱导血管收缩， 并且因此亲吻肽拮抗剂可以被用于治疗高血 压， 例如在外周组织中作为高血压药物以降低血管的血管收缩。GPR54 表达于 CNS 中， 并且 亲吻肽拮抗剂可用于调节 CNS 功能 ( 如在海马齿状回颗粒细胞中 )。
在一个实施方案中， 由去除该残基上的电荷的基团 y 替代以上 (e) 至 (s) 的任意 一种肽的 N- 末端残基上的乙酰基， 并且所述基团 y 优选选自 ： 乙酰基 ； 三氟乙酰基 ； 环化氨 基酸 ； 或 N- 末端不带电荷的合成氨基酸。
已知亲吻肽以高水平在胎盘中表达， 并且参与植入。植入不良可能导致先兆子痫 和胎儿宫内生长迟缓， 对于这些疾病至今 ( 在本发明以前 ) 未有有效的治疗。
亲吻肽及其受体 (GPR54) 还表达于滋养层和子宫细胞中 (Hiden et al.， 2007， Rev.Endocr.Metab.Disord.， 8： 31-39)， 如以下实施例所显示的， 本发明的发明人证明亲吻 肽导致胎儿生长迟缓。因此， 亲吻肽输入的调节将可应用于先兆子痫、 胎儿宫内生长迟缓 (IUGR) 和异位妊娠。
此外， 亲吻肽和 GPR54 诱导血管收缩增强 (Mead et al.， 2007， Endocrinology， 148 ： 140-147)， 并且存在于动脉粥样硬化斑块中， 因此亲吻肽拮抗剂可以用于治疗高血压 和冠心病。
亲吻肽和它的受体 (GPR54) 还广泛表达于中枢神经系统、 胰腺和免疫系统中 (Muir et al.， 2001， J.Biol.Chem.， 276 ： 28969-28975 ； Kotani et al.， 2001， J.Biol. Chem.， 276 ： 34631-34636)， 因此拮抗剂可以应用于这些组织的疾病。
优选地， 由亲吻肽活性引起和 / 或使恶化的病症为动物的病症。所述动物可以是 人， 或可以是任何哺乳动物， 如驯养哺乳动物 ( 优选有农业或商业重要性的动物， 包括鸡 ； 猫； 狗； 猪； 羊； 牛； 马 )。
更优选地， 所述增殖性疾病选自或包括 ： 良性前列腺增生症 ； 癌症 ； 生殖组织的癌 症； 妇科癌症 ； 前列腺癌 ； 乳癌 ； 卵巢癌 ； 子宫癌 ； 宫颈癌 ； 子宫内膜癌 ； 黑色素瘤 ； 胰腺癌 ； 胃癌。
使用本发明的分子可能治疗所有表达亲吻肽受体的癌症。优选地， 所述癌症为生 殖系统癌症 ( 包括前列腺癌、 子宫内膜癌、 宫颈癌、 卵巢癌和乳癌 )， 这些病症全都表达亲吻 肽受体。
用于检测细胞蛋白表达的方法是本领域中所熟知的。合适用于检测亲吻肽受体 的方法包括 ： 用于检测编码亲吻肽受体的 mRNA 存在的原位杂交和 / 或 PCR ； 用于检测亲吻肽受体蛋白存在的放射性配体结合法 ； 以及使用能够特异性结合亲吻肽受体的抗体的方法 ( 例如免疫印迹法、 免疫组织化学法、 免疫荧光法和 ELISA)。
优选在本发明的第三和 / 或第四方面定义的肽分子为亲吻肽拮抗剂， 或者其片段 或变体为亲吻肽拮抗剂。
优选地， 本发明提供根据本发明第一和 / 或第二方面的拮抗剂， 或者本发明第三 或第四方面定义的肽分子， 其用于药物。更优选地， 所述肽分子为亲吻肽拮抗剂。
在第五个实施方案中， 本发明提供了包含以下序列或由以下序列组成的的肽分 子， 或者其片段或变体 ：
X1-G/W-X2-R/(D)R-X3
其中 ：
X1 为 F 或 A 或任意的 D- 氨基酸残基 ；
X2 为 L 或 A 或任意的 D- 氨基酸残基 ；
X3 为 F 或 W ； 且
其中所述肽分子的 C- 末端氨基酸残基包含去除该残基上的电荷的基团 z ；
并且所述肽序列不为 ：
F-G-L-R-F ；
F-G-L-R-W ；
F-G-(D)F-R-F ；
F-G-A-R-W ；
F-G-L-(D)R-W ；
F-G-(D)L-R-W ；
A-G-L-R-W ； 或
(D)F-G-L-R-W。
优选地， 本发明提供肽分子， 其中 X1 为 (D)F。通常， X2 为选自以下的 D- 氨基酸残 基： (D)F、 (D)L 和 (D)W。
方便地， 根据本发明的第五方面的肽分子选自 ：
(D)F-W-L-R-W ； 或
F-G-(D)W-R-F。
在一个优选实施方案中， 所述 N- 末端残基包含去除该残基上的电荷的基团 y。优 1 选地， X 包含去除该残基上的电荷的基团 y。 尤其优选基团 y 选自 ： 乙酰基 ； 三氟乙酰基 ； 环 化氨基酸 ； 或 N- 末端不带电荷的合成氨基酸。
在一个实施方案中， X3 包含去除该残基上的电荷的基团 z。
优选地， 所述肽序列选自 ：
I)ac.F-G-(D)F-R-W.z ；
II)ac.F-G-(D)L-R-W.z ；
III)ac.F-G-L-(D)R-W.z ；
IV)ac.F-G-A-R-W.z ；
V)ac.A-G-L-R-W.z
VI)ac.(D)F-W-L-R-W.z ； 或VII)ac.F-G-(D)W-R-F.z。
在一个实施方案中， 以上 (I) 至 (VI) 的任意一种肽的 N- 末端残基的乙酰基被去 除该残基上的电荷的基团 y 替代， 并且优选 y 基团选自 ： 乙酰基 ； 三氟乙酰基 ； 环化氨基酸 ； 或 N- 末端不带电荷的合成氨基酸。
在一个实施方案中， 本发明第五方面的肽分子涉及在本发明第五方面的肽序列 N- 和 / 或 C- 末端包含额外氨基酸残基或肽的分子， 或者由在本发明第五方面的肽序列 N- 和 / 或 C- 末端的额外氨基酸残基或肽组成的分子， 从而将所述肽序列加入较大的多肽或 蛋白质分子中。因而， 本发明第五方面的肽序列在 N- 和 / 或 C- 末端可以包含 0 至 10 个氨 基酸 ； 或 10 至 20 个氨基酸 ； 或 20 至 30 个氨基酸 ； 或 30 至 40 个氨基酸 ； 或 40 至 50 个氨 基酸 ； 或 50 至 60 个氨基酸 ； 或 60 至 70 个氨基酸 ； 或 70 至 80 个氨基酸 ； 或 80 至 90 个氨 基酸 ； 或 90 至 100 个氨基酸 ； 或多于 100 个氨基酸。
在 优 选 实 施 方 案 中， 本 发 明 第 五 方 面 的 肽 分 子 包 含 在 N- 末 端 的 额 外 肽 序 列 R-R-M-K-W-K-K-Y 或 ac.R-R-M-K-W-K-K-Y，或 者 由 在 N- 末 端 的 额 外 肽 序 列 R-R-M-K-W-K-K-Y 或 ac.R-R-M-K-W-K-K-Y 组成。
如上所述， 所述 R-R-M-K-W-K-K-Y 序列为来自果蝇触足肽的七肽序列。因此， 本发 明第五方面的肽分子可以包含以下序列或由以下序列组成 ： R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)F-W-L-R-W ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-F-G-(D)W-R-F ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-F-G-(D)F-R-W.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-F-G-(D)L-R-W.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-F-G-L-(D)R-W.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-F-G-A-R-W.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-A-G-L-R-W.z
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)F-W-L-R-W.z ； 或
R-R-M-K-W-K-K-Y-F-G-(D)W-R-F.z。
任选地， 如上所定义， 所述 N- 末端残基可以在 N- 末端包含基团 y， 并且优选为乙酰 基 (ac)。
优选地， 本发明第五方面的肽序列加入全长亲吻肽的一部分或全部序列中。更优 选地， 本发明第五方面的肽序列的 N- 末端可以延长至包含亲吻肽 1-54 的肽序列 ( 即亲吻 肽序列的 1 至 54 个氨基酸残基 ) 和 / 或亲吻肽 1-45 的肽序列 ( 即亲吻肽序列的 1 至 45 个氨基酸残基 ) 的任意长度。例如， 本发明第五方面的肽序列可在其 N- 末端具有以下的序 列：
GTSLSPPPESSGSRQQPGLSAPHSRQIPAPQGAVLVQREKDLPNYNWNS。
可选择地， 本发明第五方面的肽序列可以加入蛋白质例如白蛋白和 / 或免疫球蛋 白中。加入这些分子中被认为增加本发明肽分子在个体中的半衰期并降低代谢清除率。
在第六方面， 本发明提供了包含以下序列或由以下序列组成的肽分子， 或者其片 段或变体 ：
XA-XB-XC-N-XD-XE-G-XF-R-F
其中 ：
XA 为 Y 或任意 D- 氨基酸残基 ；
XB 为 N 或任意 D- 氨基酸残基 ；
XC 为 W 或任意 D- 氨基酸残基 ；
XD 为 G 或 S 或任意 D- 氨基酸残基 ；
XE 为 F 或 (D)W 或 (D)L ；
XF 为 W 或 L 或任意 D- 氨基酸残基 ； 且
其中所述肽分子的 C- 末端氨基酸残基包含去除该残基上的电荷的基团 z ；
并且所述肽序列不为 ：
Y-N-W-N-S-F-G-L-R-F ；
(D)Y-(D)N-W-N-S-F-G-W-R-F ；
(D)Y-(D)N-W-N-G-F-G-W-R-F ；
(D)Y-(D)N-W-N-S-F-G-(D)W-R-F ； 或
(D)Y-(D)N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F。
优选地， 在本发明第六方面肽分子提供 XA 为选自以下的 D- 氨基酸残基 ： (D)F 和 B (D)Y 和 (D)A。优选 X 为选自以下的 D- 氨基酸残基 ： (D)A 和 (D)N。
在一个实施方案中， 本发明提供肽分子， 其中当 XA 或 XB 中的一个为 (D)Y 时， 另一 A B 个不为 (D)N。一个尤其优选的实施方案是其中 X 和 X 不都为 D- 氨基酸残基。在一个实 施方案中， 当 XF 为 (D)W 时， XA 为 (D)F。
优选地， XC 为选自以下的 D- 氨基酸残基 ： (D)A 和 (D)W。方便地， XD 为选自以下的 D- 氨基酸残基 ： (D)A 和 (D)W。通常， XF 为选自以下的 D- 氨基酸残基 ： (D)L 和 (D)W。 D F A
在一个实施方案中， 当 X 为 S 时， X 为 (D)W 和 / 或 X 不为 (D)Y。优选地， 当 XD 为 S 时， XF 为 (D)W 和 / 或 XA 为 (D)A。
在一个实施方案中， 当 XE 和 XF 都为 (D)W 时， XA 不为 (D)Y。优选地， 当 XE 和 XF 都 为 (D)W 时， XA 为 (D)A。
方便地， 本发明提供了肽分子， 其中所述 N- 末端残基包含去除该残基上的电荷的 1 基团 y。在一个实施方案中， X 包含去除此该残基上的电荷的基团 y。通常， 基团 y 选自 ： 乙 酰基 ； 三氟乙酰基 ； 环化氨基酸 ； 或 N- 末端不带电荷的合成氨基酸。
在优选实施方案中， 肽分子的 C- 末端 F 残基包含去除此该残基上的电荷的基团 z。
本发明第六方面的肽分子最优选包含选自以下的肽序列或由选自以下的肽序列 组成 ：
a)Y-N-W-N-G-F-G-L-R-F.z ；
b)Y-N-W-N-G-F-G-(D)L-R-F.z ；
c)Y-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
d)Y-N-W-N-G-(D)W-G-L-R-F.z ；
e)ac.Y-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
f)ac.Y-N-W-N-(D)W-F-G-(D)W-R-F.z ；
g)ac.(D)Y-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
h)ac.Y-N-(D)W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
i)ac.Y-(D)N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；j)ac.Y-N-W-N-(D)A-F-G-(D)W-R-F.z ；
k)ac.(D)A-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
l)ac.Y-N-(D)A-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
m)ac.Y-(D)A-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
n)ac.(D)W-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
o)ac.(D)F-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
p)ac.(D)Y-N-W-N-G-(D)W-G-(D)W-R-F.z ；
q)ac.(D)A-N-W-N-G-(D)W-G-(D)W-R-F.z ；
r)ac.(D)A-N-W-N-S-F-G-(D)W-R-F.z ； 或
s)ac.(D)-A-N-W-N-G-F-G-W-R-F.z ；
t)ac.(D)A-N-W-N-(D)S-F-G-(D)W-R-F.z ； 或
u)ac.(D)A-N-W-N-G-F-G-(D)L-R-F.z。
在一个实施方案中， 由去除该残基上的电荷的基团 y 替代以上 (e) 至 (s) 的任意 一种肽 N- 末端残基的乙酰基， 并且基团 y 优选选自 ： 乙酰基 ； 三氟乙酰基 ； 环化氨基酸 ； 或 N- 末端不带电荷的合成氨基酸。
在一个实施方案中， 本发明第六方面的肽分子涉及在本发明第六方面的肽序列 N- 和 / 或 C- 末端包含额外氨基酸残基或肽的分子， 或者由在本发明第六方面的肽序列 N- 和 / 或 C- 末端的额外氨基酸残基或肽组成的分子， 从而将肽序列加入较大的多肽或蛋 白质分子中。因而， 本发明第六方面的肽序列在 N- 和 / 或 C- 末端可以包含 0 至 10 个氨基 酸； 或 10 至 20 个氨基酸 ； 或 20 至 30 个氨基酸 ； 或 30 至 40 个氨基酸 ； 或 40 至 50 个氨基 酸； 或 50 至 60 个氨基酸 ； 或 60 至 70 个氨基酸 ； 或 70 至 80 个氨基酸 ； 或 80 至 90 个氨基 酸； 或 90 至 100 个氨基酸 ； 或多于 100 个氨基酸。
在优选实施方案中， 本发明第六方面的肽分子涉及在肽序列 N- 末端包含额外肽 序列 R-R-M-K-W-K-K-Y 或 ac.R-R-M-K-W-K-K-Y 的分子， 或者由在肽序列 N- 末端的额外肽 序列 R-R-M-K-W-K-K-Y 或 ac.R-R-M-K-W-K-K-Y 组成的分子。
如前所述， 所述 R-R-M-K-W-K-K-Y 序列为来自果蝇触足肽的七肽序列。因此， 本发 明的肽可以包含以下序列或由以下序列组成 ：
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-W-N-G-F-G-L-R-F.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-W-N-G-F-G-(D)L-R-F.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-W-N-G-(D)W-G-L-R-F.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-W-N-(D)W-F-G-(D)W-R-F.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)Y-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-(D)W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-(D)N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-W-N-(D)A-F-G-(D)W-R-F.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)A-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-N-(D)A-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；R-R-M-K-W-K-K-Y-Y-(D)A-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)W-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)F-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)Y-N-W-N-G-(D)W-G-(D)W-R-F.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)A-N-W-N-G-(D)W-G-(D)W-R-F.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)A-N-W-N-S-F-G-(D)W-R-F.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)A-N-W-N-G-F-G-W-R-F.z ；
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)A-N-W-N-(D)S-F-G-(D)W-R-F.z ； 或
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)A-N-W-N-G-F-G-(D)L-R-F.z。
任选地， 如上文所定义， 所述 N- 末端残基在 N- 末端可以包含基团 y， 并且优选为乙 酰基 (ac)。
在尤其优选的实施方案中， 所述肽序列选自 ：
R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)A-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z ； 或
ac.R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)A-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z。
如以下实施例所显示的， 本发明的肽包含保持亲吻肽拮抗剂功能的 N- 末端果蝇 触足肽七肽。
优选地， 本发明第六方面的肽序列加入全长亲吻肽的一部分或全部序列中。更优 选地， 本发明第六方面的肽序列的 N- 末端可以延长至包含亲吻肽 1-54 的肽序列 ( 即亲吻 肽序列的 1 至 54 个氨基酸残基 ) 和 / 或亲吻肽 1-45 的肽序列 ( 即亲吻肽序列的 1 至 45 个氨基酸残基 ) 的任意长度。例如， 本发明第六方面的肽序列在其 N- 末端可具有以下的序 列：
GTSLSPPPESSGSRQQPGLSAPHSRQIPAPQGAVLVQREKDLP。
可选择地， 本发明第六方面的肽序列可以加入蛋白质例如白蛋白和 / 或免疫球蛋 白中。加入这些分子中被认为增加本发明肽分子在个体中的半衰期和降低代谢清除率。
在一个实施方案中， 本发明提供了肽分子， 其中所述 z 为 NH2 或 N- 丙基酰胺或 N- 乙基酰胺 (NHEt) 或 N- 甲基酰胺或 N- 丁基酰胺。
优选地， z 具有的分子量小于 200， 优选小于 150， 优选小于 100。 优选地， z 为 NHR’ ， 其中 R’ 为 H 或 C1 至 C4 烷基或 z 为 OR” ， 其中 R” 为 C1 至 C4 烷基。优选地， z 为酰胺。优选 地， z 为 NH2 或 N- 丙基酰胺或 N- 乙基酰胺 (NHEt) 或 N- 甲基酰胺或 N- 丁基酰胺。
在第七实施方案中， 本发明提供了药物组合物， 其包含有效量的本发明的拮抗剂 或本发明的肽分子和药学上可接受的赋形剂或稀释剂， 或者由有效量的本发明的拮抗剂或 本发明的肽分子和药学上可接受的赋形剂或稀释剂组成。
本文所述 “有效量” 是指本发明分子的量足够减轻和 / 或缓解和 / 或防止个体中与 由亲吻肽活性引起和 / 或使恶化的病症相关的症状。例如， “有效量” 可以通过在动物 ( 并 且， 如果可能， 人 ) 中进行用于抑制促性腺激素和 / 或类固醇激素的剂量研究而确定 ； 剂量 范围可以是通过皮下或腹膜内或口服递送每日 1-100mg。
还可以通过使用实施例中所描述的方法在体外确定有效量 ( 例如， 用于监测细胞 中对亲吻肽与亲吻肽受体结合的拮抗作用和 / 或对亲吻肽介导的刺激肌醇磷酸生成的拮 抗作用的方法 ) 或通过监测个体中 ( 如动物 ) 与由亲吻肽活性引起和 / 或使恶化的病症相关的症状的减轻和 / 或缓解和 / 或防止而在体内确定所述有效量， 其中所述症状是相关医 药领域的技术人员所熟知的。
关于在体外监测亲吻肽拮抗作用的方法， 本领域技术人员理解， 可以监测其它或 另外的细胞和酶活性来测量亲吻肽介导的刺激。例如， 已知 Gq G 蛋白激活磷脂酶 ( 其生成 2+ IP 和二酰基甘油， 进而分别动员 Ca 和激活蛋白激酶 C) 和蛋白激酶 C 磷酸化并激活细胞 外调节激酶 (ERK) 和 / 或丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 级联及其成员 ； 因此， 技术人员可监 测那些细胞成分中任意一种或全部成分的活性和 / 或存在来确定亲吻肽介导的刺激。
在第八个实施方案中， 本发明提供治疗个体中由亲吻肽活性引起和 / 或使恶化的 病症的方法， 所述方法包括以下步骤或由以下步骤组成 ： 向所述个体施用本发明第七方面 的药物组合物， 或有效量的本发明第一或第二方面的亲吻肽拮抗剂， 或有效量的本发明第 二、 第三、 第四和 / 或第五方面的肽分子。
可以使用注射型缓释药物递送系统递送本发明的分子、 药物和药物组合物。这些 特别设计用于减少注射频率。所述系统的实例为 Nutropin Depot， 其将重组人生长激素 (rhGH) 封装在生物可降解的微粒中， 一旦注射， 在持续时间内缓慢释放 rhGH。优选地， 进行 肌内 (i.m.) 和 / 或皮下 (s.c.) 和 / 或静脉内 (i.v.) 递送。
可以通过将药物直接释放至所需位置的手术植入器械施用本发明的分子、 药物和 药物组合物。例如， Vitrasert 直接释放更昔洛韦 (ganciclovir) 至眼睛， 以治疗 CMV 视网 膜炎。将该有毒活性剂直接施用至患病部位， 来实现有效治疗而没有药物的明显全身副作 用。
还可以利用电穿孔治疗 (EPT) 系统来施用本发明的活性剂、 药物和药物组合物。 向细胞递送脉冲电场的设备提高了细胞膜对药物的渗透性， 导致细胞中的药物递送显著增 强。
本发明的分子、 药物和药物组合物还可以通过电导入 (electroincorporation， EI) 递送。 当皮肤表面上直径至多 30 微米的小微粒经历与电穿孔中所使用的电脉冲相同或 类似的电脉冲时， 出现 EI。在 EI 中， 这些微粒被驱动通过角质层并进入更深层的皮肤。所 述微粒可以负载或包被药物或基因， 或者可以简单地作为 “子弹” 而在皮肤上产生药物可以 进入的孔。
本发明的分子、 药物和药物组合物的另外的递送方法是热敏的 ReGel 可注射系 统。低于体温时， ReGel 是可注射液体， 而在体温下， 其立即形成缓慢消蚀并溶解成已知安 全的生物可降解聚合物的凝胶储库。活性物质随着生物聚合物溶解而被递送。
本发明的分子、 药物和药物组合物还可以口服递送。所述过程利用体内口服摄入 维生素 B12 和 / 或维生素 D 的自然过程来共递送蛋白质和肽。借助于维生素 B12 和 / 或维生 素 D 的摄入系统， 本发明的核酸、 分子和药物制剂可以通过肠壁。在维生素 B12 类似物和 / 或维生素 D 类似物与药物之间形成复合物， 其既保持复合物中维生素 B12 部分 / 维生素 D 部 分对内因子 (IF) 的有效亲合力， 又保持了复合物中活性物质的有效生物活性。
本发明的分子、 药物和药物组合物可以通过 “木马肽 (Trojan peptide)” 引入细 胞。这些是一类称为穿透肽 (penetratin) 的多肽， 其具有转位性质， 并且能够携带亲水化 合物穿过质膜。该系统允许将寡肽直接靶向细胞质和核， 并且可以是非细胞类型特异性的 和高度有效的。参见 Derossi et al.(1998)， Trends Cell Biol 8， 84-87。优选地， 本发明的药物和 / 或药物组合物为单位剂型， 该单位剂型包含日剂量或 单位、 日亚剂量或其适当部分的活性成分。
本发明的分子、 药物和药物组合物通常以包含活性成分的药物组合物的形式， 以 药学上可接受的剂型， 通过口服或通过任何肠胃外途径施用， 所述活性成分任选为无毒的 有机或无机酸或碱、 加成盐的形式。 所述组合物可以以不同剂量施用， 这取决于待治疗的疾 病和患者以及给药途径。
在人治疗中， 本发明的分子、 药物和药物组合物可以单独给药， 但是通常与根据要 给药途径和标准药物实践而选择的合适的赋形剂、 稀释剂或载体混合给药。
例如， 本发明的分子、 药物和药物组合物可以以可包含调味剂或着色剂的片剂、 胶 囊、 卵形栓剂 (ovule)、 酏剂、 溶液或混悬剂的形式口服、 口含或舌下给药， 用于速释、 延时释 放或控释。本发明的分子、 药物和药物组合物还可以通过海绵体中注射给药。
所述片剂可以包含赋形剂， 如微晶纤维素、 乳糖、 柠檬酸钠、 碳酸钙、 磷酸氢钙和甘 氨酸 ； 崩解剂如淀粉 ( 优选玉米、 马铃薯或木薯淀粉 )、 羟基乙酸淀粉钠、 交联羧甲基纤维素 钠和某些复合硅酸盐， 以及颗粒粘合剂如聚乙烯吡咯烷酮、 羟丙基甲基纤维素 (HPMC)、 羟丙 基纤维素 (HPC)、 蔗糖、 明胶和阿拉伯胶。此外， 可以包含润滑剂， 如硬脂酸镁、 硬脂酸、 甘油 二十二烷酸酯和滑石。 相似类型的固体成分还可以用作明胶胶囊的填料。 在这方面优选的赋形剂包括乳 糖、 淀粉、 纤维素、 乳糖或高分子量聚乙二醇。对于含水混悬剂和 / 或酏剂， 本发明的活性剂 可以与各种甜味剂或调味剂、 着色剂或染料组合， 与乳化剂和 / 或助悬剂组合， 以及与稀释 剂如水、 乙醇、 丙二醇和甘油组合， 及其组合物组合。
本发明的分子、 药物和药物组合物还可以肠胃外给药， 例如， 静脉内、 动脉内、 腹膜 内、 鞘内、 心室内、 胸内、 颅内、 肌内或皮下， 或它们可以通过输注技术给药。 它们最好以无菌 水溶液的形式使用， 所述无菌水溶液可包含其他物质， 例如， 足够的盐或葡萄糖以使溶液与 血液等渗。若有必要， 水溶液应当适当缓冲 ( 优选 pH 3 至 9)。在无菌条件下制备合适的肠 胃外制剂易于通过本领域技术人员所熟知的标准制药技术完成。
适合用于肠胃外给药的药物和药物组合物包括水和非水无菌注射溶液， 其可包含 抗氧化剂、 缓冲剂、 抑菌剂和使得制剂与预定接受者的血液等渗的溶质 ； 并且含水和非水无 菌混悬剂可以包含助悬剂和增稠剂。 所述药物和组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器 中， 例如密封的安瓿和小瓶， 并且可以在冻干条件下保存， 在使用前仅需直接加入无菌液体 载体例如用于注射的水。可以由之前描述的各种无菌粉剂、 颗粒剂和片剂制备即用型注射 溶液和混悬剂。
对于向人患者的口服和肠胃外给药， 本发明的分子、 药物和药物组合物的日剂量 水平通常为每成人每日单次或分次剂量给药 0.1 至 100mg。
因而， 本发明分子的片剂或胶囊例如可以包含 0.1mg 至 100mg 的活性剂， 根据需要 用于一次单片 ( 粒 ) 或两片 ( 粒 ) 或更多给药。无论如何， 医生可确定最合适任何个体患 者的实际剂量， 并且随着具体患者的年龄、 体重和反应而变化。 以上剂量是示例性的平均情 况。当然也可以有更高或更低剂量范围的个体实例， 并且这些都在本发明的范围之内。
本发明的分子、 药物和药物组合物还可以鼻内或通过吸入给药， 并且以干粉末吸 入器的形式或以从具有使用合适抛射剂的压力容器、 泵、 喷雾或雾化器提供的气雾剂喷雾
的形式方便地被递送， 所述抛射剂如二氯二氟甲烷、 三氯氟甲烷、 二氯四氟乙烷、 氢氟烷烃 如 1， 1， 1， 2- 四氟乙烷 (HFA 134A) 或 1， 1， 1， 2， 3， 3， 3- 七氟丙烷 (HFA 227EA)、 二氧化碳或 其它合适的气体。 对于压力气雾剂来说， 可以通过提供递送计量的量的阀来确定剂量单位。 所述压力容器、 泵、 喷雾或雾化器可以包含活性剂的溶液或混悬剂， 例如使用乙醇和抛射剂 的混合物作为溶剂， 其可以另外包含润滑剂， 如失水山梨糖醇三油酸酯。 用于吸入器或吹入 器的胶囊和药筒 ( 例如由明胶制成 ) 可以配制成包含本发明的活性剂和合适的粉末基质如 乳糖或淀粉的粉末混合物。
优选配制气雾剂或干粉制剂， 使得每个计量的剂量或 “吸 (puff)” 包含至少 0.1mg 本发明的分子， 用于递送至患者。 应理解气雾剂的每日总剂量将因患者不同而改变， 并且可 以以单次剂量给药， 或更常见是全天分次剂量给药。
可选择地， 本发明的分子、 药物和药物组合物可以以栓剂或阴道栓的形式给药， 或 它们可以以洗剂、 溶液、 乳膏、 凝胶、 软膏或扑粉 (dusting powder) 的形式局部应用。本发 明的分子、 药物和药物组合物还可以以透皮给药， 例如， 通过利用皮肤贴膏给药。它们还可 以通过眼部途径给药， 尤其是用于治疗眼部疾病的情况下。
对于眼科使用， 本发明的分子、 药物和药物组合物可以配制成在等渗的、 pH 经调节 的无菌生理盐水中的微粒化混悬剂， 或优选地， 配制成在等渗的、 pH 经调节的无菌生理盐水 中的溶液， 任选地， 与诸如苯扎氯铵的防腐剂组合。 可选择地， 它们可以配制于软膏， 如矿脂 中。
对于向皮肤的局部应用， 本发明的分子、 药物和药物组合物可以配制成合适的包 含所述活性剂的软膏， 所述活性剂悬浮或溶解于例如一种或多种以下的混合物中 ： 矿物油、 液体矿脂、 白矿脂、 丙二醇、 聚氧乙烯聚氧丙烯剂、 乳化蜡和水。可选择地， 它们可以配制成 合适的洗剂或乳膏， 悬浮或溶解于例如一种或多种以下的混合物中 ： 矿物油、 山梨糖醇酐单 硬脂酸酯、 聚乙二醇、 液体石蜡、 聚山梨糖醇酯 60、 十六烷基酯蜡、 十六醇、 2- 辛基十二醇、 苯甲醇和水。
适合用于口腔局部给药的制剂包括糖锭， 其包含在调味基质中的活性成分， 所述 调味基质通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶 ； 锭剂， 其包含在惰性基质中的活性成分， 所述惰 性基质如明胶和甘油、 或蔗糖和阿拉伯胶 ； 以及漱口水， 其包含在合适的液体载体中的活性 成分。
通常， 对于人， 优选的途径是口服或肠胃外给药本发明的活性剂的分子、 药物和药 物组合物， 这样最为方便。
对于兽医使用， 可根据标准兽医实践将本发明的分子、 药物和药物组合物作为合 适的可接受的制剂施用， 并且兽医将确定最适合具体动物的给药方案和给药途径。
方便地， 所述制剂为药物制剂。
有利地， 所述制剂为兽医用制剂。
尤其优选的是， 使用医学和制药领域已知的肽制剂配制本发明的分子， 如在 GnRH 肽激动剂制剂中使用的那些 ( 例如， 包括聚甘氨酰丙交酯共聚物和 / 或聚乙二醇和 / 或油 和 / 或微晶悬浮液或由聚甘氨酰丙交酯共聚物和 / 或聚乙二醇和 / 或油和 / 或微晶悬浮液 或由其组成的制剂， 可以用于注射本发明的分子 )。
在本发明的第九方面， 本发明提供用于鉴定亲吻肽拮抗剂的方法， 所述方法包括以下步骤或由以下步骤组成 ：
i) 提供待测试的化合物 ；
ii) 确定 (i) 中的化合物结合亲吻肽受体的能力 ；
iii) 确定 (i) 中的化合物拮抗细胞中亲吻肽介导的刺激肌醇磷酸生成的能力 ； 和
iv) 在所述化合物能够结合亲吻肽受体并能够拮抗细胞中亲吻肽介导的刺激肌醇 磷酸生成的情况下鉴定该化合物作为亲吻肽拮抗剂。
因而， 本发明第九方面的方法可以用于确定具体测试化合物或测试分子 ( 例如， 包含以下肽序列或由以下肽序列组成的测试化合物或测试分子 ： 亲吻肽的部分或全部肽序 列的类似物 ) 是否具有结合亲吻肽受体和功能性拮抗细胞内 ( 例如用人亲吻肽受体 GPR54 瞬时或稳定转染的细胞系， 如 CHO、 HEK 或 COS 细胞系 ) 亲吻肽介导的刺激肌醇磷酸生成的 能力。 以下实施例描述适合用于确定化合物结合亲吻肽受体的能力和用于测量细胞中亲吻 肽介导的刺激肌醇磷酸生成的方法。本领域技术人员已知其它适当的方法。
例如， 如上所述， 本领域技术人员将理解可以监测其它或另外的细胞和酶活性来 测量亲吻肽介导的刺激。例如， 已知 Gq G 蛋白激活磷脂酶 ( 其生成 IP 和二酰基甘油， 进而 2+ 分别动员 Ca 和激活蛋白激酶 C) 和蛋白激酶 C 磷酸化并激活细胞外调节激酶 (ERK) 和 / 或丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 级联及其成员 ； 因此， 技术人员可监测那些细胞成分的任意 或全部成分的活性和 / 或存在来确定亲吻肽介导的刺激。
优选地， 若是其具有＜ 100nM 的结合亲合力 ( 即 Kd)， 则确认所述测试化合物或分 子能够结合亲吻肽受体。
优选地， 如以下实施例所描述， 可根据能够拮抗 10nM 亲吻肽刺激细胞内肌醇磷酸 生成的能力而鉴定所述测试化合物或分子。 优选地， 根据能够达到至少 40％抑制 10nM 亲吻 肽刺激而鉴定所述测试化合物或分子 ； 更优选地， 可达到至少 50％或 60％或 70％或 80％或 90％或 100％抑制。
例如， 能够达到 40％或以下地抑制 10nM 亲吻肽刺激的化合物不被认为是拮抗剂。 能够达到 40％至 80％地抑制 10nM 亲吻肽刺激的化合物可以被认为是 “弱” 拮抗剂。能够 达到 80％或以上地抑制 10nM 亲吻肽刺激的化合物可以被认为是 “强” 拮抗剂。
优选地， 本发明第九方面的方法还包括以下步骤或由以下步骤组成 ： 根据本文描 述的方法或本领域中已知的方法， 制备或合成在步骤 (iv) 中鉴定为亲吻肽拮抗剂的化合 物或分子。
更优选地， 所述方法还包括以下步骤或由以下步骤组成 ： 根据在此描述的方法或 本领域中已知的方法， 将本发明第九方面鉴定的化合物或分子 ( 或合成的化合物或分子 ) 配制成药物组合物或药物。
在本申请中列出或讨论的在先公开文件不应当必然地被视为承认所述文件是现 有技术的一部分或公知常识。
优选地， 现在将参考以下附图描述具体体现本发明的某些方面的非限制性实施 例：
表1： 亲吻肽类似物刺激肌醇磷酸 (IP) 和抑制 10nM 亲吻肽刺激 IP。
图1： A-GPR54 稳定转染的 CHO 细胞中亲吻肽的结合剂量反应。
B-GPR54 稳定转染的 CHO 细胞中亲吻肽的 IP 剂量反应。图2： A- 在 完 整 的 雄 性 大 鼠 中 重 复 注 射 化 合 物 210(0、 60、 120min) 干 扰 亲 吻 肽 -10(100pmol)(120min) 的有效 LH- 和睾丸酮释放作用的能力。
B- 在完整的雄性大鼠中重复注射化合物 234 干扰亲吻肽 -10(100pmol) 的有效 LH- 和睾丸酮释放作用的能力。
C- 在睾丸切除雄性大鼠中重复注射化合物 210(0、 60、 120min) 降低升高的 LH 水平 的能力。
图3： 中央输注亲吻肽拮抗剂抑制 OVX 母羊中 LH 的分泌脉冲。显示用亲吻肽拮抗 剂处理的母羊 ( 实心柱 ) 或对照母羊 ( 空心柱 ) 中 LH 的浓度。箭头指示如材料和方法中 定义的 LH 脉冲。
图4： 剂量反应结合曲线和剂量反应 IP 曲线和肽拮抗剂的 IP 竞争试验。
图5： 用拮抗剂 234 抑制亲吻肽刺激的 GnRH 神经元放电。
图6： 亲吻肽处理导致较差植入， 降低胎儿体重。因此亲吻肽在胎儿生长迟缓中发 挥作用， 表明拮抗剂可以用于治疗有较差植入 ( 其将导致例如流产和先兆子痫 ) 病史的女 性。
图7： N- 末端取代和 C- 末端截短产生部分激动剂。在亲吻肽 -10 的 N- 末端进行 氨基酸取代并在 c- 末端进行截短。截短至 7 个氨基酸 (a) 或 5 个氨基酸 (b) 长度引起部 分激动作用。当截短至 5 个氨基酸并与在 Leu8 位有 (D)-Leu 组合时进一步增强了所述部 分激动作用 (c)。
图8： 对人 gpr-54 受体的氨基酸取代产生拮抗剂， 其中用 Gly55 和 D-Trp8 取代是 关键的。(a， b) 用甘氨酸或 D-Ala 氨基酸取代丝氨酸 5 和用 D- 氨基酸取代 Leu8 的组合产 生部分激动剂。(c， d) 进一步用 D-Ala 或 D-Tyr 取代 Tyr1 增强了该拮抗作用， 进一步产生 1 5 对 gpr-54 受体的完全拮抗剂。然而， 从 Tyr 位为 D- 氨基酸的拮抗剂去除 Gly 和 D-Trp8 降 低或消除类似物的拮抗特性。(e) 当用 D-Tyr 替代 Tyr1 时， 这是最为明显的， 因为一个或两 1 个取代的去除即消除了拮抗作用。(f) 用 D-Ala 替代 Tyr 时的作用不太明显， 但拮抗作用 仍被降低 (* ＝ p ＜ 0.05， ** ＝ p ＜ 0.01， *** ＝ p ＜ 0.001)。
图9： 肽 234 以与亲吻肽 -10 相同的亲合力结合。当 I125- 标记的亲吻肽 -10 与亲 吻肽 -10(a) 或肽 234(b) 竞争时， 它们结合的亲合力都为 2nM。
图 10 ： 肽 234 拮抗亲吻肽 -10 对 GnRH 神经元的刺激。GnRH 神经元放电频率随着 时间变化的代表性记录。(a) 在 1nM 亲吻肽 -10( 柱 ) 之后增加的 GnRH 放电频率。下行的 峰值是个体的动作电流。(b) 肽 234(1nM， 柱 ) 抑制亲吻肽 -10(1nM) 的刺激作用。(c) 总 柱状图显示在基线 ( 白柱 ) 和亲吻肽 -10( 黑柱 ) 期间放电频率倍数变化的平均值 ±SEM， 亲吻肽 -10 显著增加了 GnRH 神经元的放电活动 (n ＝ 7， *p ＜ 0.002)。对亲吻肽 -10 的反 应随着 1、 10、 100nM 肽 234 的出现而显著降低 (1nM n ＝ 5， 10nM n ＝ 6， 100nM n ＝ 7， #p ＜ 0.001 所有组 )。
图 11 ： 肽 234 阻抑体内 GnRH 释放。 显示来自肽 234 对 GnRH 释放的影响和组平均值 (±sem， n ＝ 6) 的代表性实例。(a) 通过输注 10nM 肽 234 至柄 - 中间隆起区域， 阻抑 GnRH 在下丘脑的脉冲式释放 ( 深色阴影柱 )。短箭头指示用 PULSAR 确定的 GnRH 峰。(b) 相反 地， 作为对照的载体输注未引起 GnRH 释放的任何显著变化 ( 浅色阴影柱 )。 (c) 数据分析表 明， 与肽 234 使用之前以及载体对照的水平相比， 肽 234 显著阻抑了 GnRH 释放 (p ＜ 0.05)。(d) 载体输注未引起任何显著变化。基于我们之前的评估， 相似尺寸的透析膜通过～ 10％ 的肽， 估计肽 234 在柄 - 中间隆起区域的浓度为 1nM。与肽 234 处理之前相比， *p ＜ 0.05 ； 与相应时间段的对照相比， p ＜ 0.05。
图 12 ： 肽 234 对完整和阉割的雄性大鼠中基础和亲吻肽 -10 刺激的血浆 LH 的影 响。在完整的雄性大鼠中， 肽 234(a) 抑制亲吻肽 -10 诱导的 LH 分泌。在 0 和 60min 时给 动物两次推注肽 234， 接着在 120min 一次输注亲吻肽 -10。 根据所计算的曲线下面积 (AUC ； p ＜ 0.05)， 所述肽显著抑制此后 2 小时的 LH 生成。还用柱图显示亲吻肽输注 60min 之后 ( 即在实验 180-min) 的睾丸酮水平。此外， 阉割雄性大鼠接受三次输注肽 234， 其抑制 LH 分泌 (b)。
图 13 ： 中央输注肽 234 抑制 OVX 母羊中 LH 的分泌脉冲。显示用肽 234 处理的母羊 ( 实心柱 ) 或对照母羊 ( 空心柱 ) 中的 LH 浓度。箭头指示材料和方法中定义的 LH 脉冲。 分析显示在肽 234 输注之后平均 LH 浓度和脉冲幅度显著降低。
表2： 在用肽 234 输注之前、 期间和之后的平均 LH 脉冲幅度、 LH 浓度和 GH 浓 度 (ng/ml)。 在 载 体 和 肽 -234 处 理 母 羊 之 前 (0-180min)、 期 间 (180-240min) 和 之 后 (240-360min) 输注的数据为平均值 ±SEM。重复测量 ANOVA 显示处理和时间之间的显著相 互作用 (P ＜ 0.05)。显示各时间段的个体 P 值。
图 14 ： 中央输注拮抗剂 234 对 OVX 母羊中 GH 的影响。显示用肽 234 处理的母羊 ( 实心柱 ) 或对照母羊 ( 空心柱 ) 中的 GH 浓度。分析显示在肽 234 输注期间平均 GH 浓度 显著增加。
图 15 ： 中央输注拮抗剂 234 对 OVX 母羊中催乳素的影响。显示用肽 234 处理的母 羊 ( 实心柱 ) 或对照母羊 ( 空心柱 ) 中的催乳素浓度。分析显示肽 234 输注对催乳素无影 响。
图 16 ： 中央输注拮抗剂 234 对 OVX 母羊中皮质醇的影响。显示用肽 234 处理的母 羊 ( 实心柱 ) 或对照母羊 ( 空心柱 ) 中的皮质醇浓度。分析显示肽 234 输注对皮质醇无影 响。
图 17 ： 拮抗剂对细胞迁移的影响
肽 233、 234 和 273 在 HUVEC 和 CHO 细胞中作为人 gpr-5 的拮抗剂起作用， 因为它 们几乎完全抑制亲吻肽对迁移的作用。(A) 在 CHO( 中国卵巢仓鼠 ) 细胞中， 100nM 亲吻肽 抑制了 50％的细胞迁移。肽 234 完全消除了这种抑制。(B) 在 HUVEC( 人脐静脉内皮细胞 ) 中， 1nM 亲吻肽抑制了 50％向伤口内的迁移。然而， 存在肽 233、 234 或 273 时， 抑制减少至 仅为 10％。
实施例 1- 关于亲吻肽类似物的实验数据
材料和方法
用于表 1 中剂量反应结合 (IC50) 栏的方法
全细胞受体结合试验 - 以 1 ∶ 1000 稀释比在加入 125I- 标记的亲吻肽的 HEPES 改 良的 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基 (Dulbecco′ s modified Eagle′ smedium， DMEM) 中 制备亲吻肽 -10 和类似物， 以形成 100,000 每分钟计数 (cpm)。 将单层细胞置于冰上并接触 0.5ml 肽 (10pM-1uM) ； 然后在 4℃孵育所述细胞 4h。4h 之后， 用冰冷的杜氏 (Dulbecco) 磷 酸盐缓冲液 (DPBS ； 含有钙和镁 ) 洗涤细胞两次， 然后加入 0.5ml 0.1M 氢氧化钠 (NaOH) 至细胞， 保持 20 分钟， 摇动裂解细胞。将裂解物转移至塑料管， 并在 γ 计数仪上进行结合放 射性计数 60 秒。测量 IC50， 其为受体结合的 50％被类似物竞争的浓度。
用于表 1 中剂量反应 IP(EC50) 栏的方法
肌醇 -3- 磷酸刺激试验 - 在 37℃下将单层细胞在加入 1％青霉素 / 链霉素的 0.5ml HEPES 改良的 DMEM 中放置 30min， 以阻止 IP3 降解。然后在 37℃下用 0.5ml 以 1 ∶ 1000 稀 释于上述培养基的亲吻肽 -10 和类似物 (10pM-1uM) 刺激细胞 1h， 接着将所述细胞在 4℃下 置于 10mM 甲酸 1h， 以裂解细胞。然后将裂解物转移至含有 0.5ml Dowex 树脂的塑料管， 以 结合放射性 IP3， 接着用 1ml H2O 冲洗树脂。随后， 再用 60mM NH4 甲酸盐 /5mM 四硼酸钠冲洗 该树脂， 接着用 1M NH4 甲酸盐 /0.1M 甲酸冲洗， 以释放结合的放射物。然后将 800μl 放射 性溶液转移至含有 2.5ml 闪烁液的闪烁瓶中， 并在 β- 计数仪上进行放射性计数 60 秒。测 量 EC50， 其为刺激出现 50％最大刺激反应的浓度。
用于表 1 中拮抗剂 IP 抑制 (IC50) 栏的方法
肌醇 -3- 磷酸拮抗作用试验 - 在 37℃下将单层细胞在加入 1％青霉素 / 链霉素的 0.5ml HEPES 改良的 DMEM 中放置 30min， 以阻止 IP3 降解。 然后在 37℃下用以 1 ∶ 1000 稀释 于上述培养基的 0.25ml 10nM 亲吻肽 -10 和 0.25ml10nM 亲吻肽 -10 或类似物 (10pM-10uM) 刺激细胞 1h， 接着将所述细胞在 4℃下置于 10mM 甲酸 1h， 以裂解细胞。然后将裂解物转移 至含有 0.5ml Dowex 树脂的塑料管， 以结合放射性 IP3， 并且接着用 1ml H2O 冲洗树脂。 随后 再用 60mM NH4 甲酸盐 /5mM 四硼酸钠冲洗该树脂， 接着用 1M NH4 甲酸盐 /0.1M 甲酸冲洗， 以 释放结合的放射物。然后将 800μl 放射性溶液转移至含有 2.5ml 闪烁液的闪烁瓶中， 并在 β- 计数仪上进行放射性计数 60 秒。计算作为 50％抑制 10nM 亲吻肽 -10 刺激所需浓度的 IC50。
使用学生 T- 检验计算 P- 值， 并且提供各类似物的最显著值。
IP 刺激是指可估计的内在残留激动剂活性。
IC50 为 50％抑制 10nM 亲吻肽 -10 刺激 IP 所需的拮抗剂剂量。
亲吻肽拮抗剂中央处理 OVX 母羊
所有的实验步骤都在 Monash 学院生物医学″ A″动物道德委员会 (MonashSchool of Biomedical Sciences″ A″ Animal Ethics Committee) 认可的协议下进行。
在自然光照下饲养成年考力代 (Corriedale) 母羊， 并在任何实验处理前至少一 个月对其进行双侧卵巢切除 (OVX)。接着按照之前描述的外科手术步骤植入永久存在于第 三脑室 (3V) 的套管 (Barker-Gibb et al.， 1995， J.Endocrinol.， 147 ： 565-79)。3V 外科手 术之后大约 2 周， 向一支颈外静脉插入套管以采集血样， 并将动物饲养于单独的圈内 ； 套管 用肝素化盐水保持通畅。
母羊被分配成两个处理组 (n ＝ 4/ 组 ) ： 亲吻肽拮抗剂 ( 稀释于人工脑脊液， aCSF ； 150mM NaCl， 1.2mM CaCl2， 1mM MgCl2， 2.8mM KCl) 或对照 ( 仅有 aCSF)。第二天， 将输注管 道连接至 3V 套管， 在 07.00h 开始采集血样。每隔 10 分钟收集样品。取样 3h 之后， 在 1h 内以 40μg/h 的剂量将亲吻肽拮抗剂 ( 或对照 ) 输注入 3V 中， 初始剂量为 10μg。亲吻肽 拮抗剂和载体都用 MS16A 输注泵 (Smith Medical Australasia Pty.Ltd.) 以 200μl/h 的速度输注 1h。 输注之后， 3V 管道保持于原位， 并继续采集血样 2h( 总计 6h)。 立 即从样品收集血浆， 并在试验前冷冻于 -20℃。使用 Lee 等的方法 (1976， J.Reprod.Fertil.， 46 ： 1-6)， 用 NIH-oLH-S18 作为标准， 测量血浆 LH 浓度， 一式两份。使用 Burger 等的程序 (1972， J.Lab.Clin.Med.， 80 ： 302-12) 计算试验结果。 试验的灵敏度为 0.08ng/ml， 并且试验组间变异系数在 0.3-12.8ng/ml 范围 之内小于 10％。基于描述用于 GnRH 的方法 (Clarke， 1993， Endocrinology， 133 ： 1624-32) 进行 LH 数据的脉冲分析。
结果
亲吻肽拮抗剂中央处理 OVX 母羊
中央输注亲吻肽拮抗剂似乎抑制 OVX 母羊的 LH 分泌脉冲 ( 图 3)。LH 脉冲分析显 示， 在对照处理的 OVX 母羊 - 和在亲吻肽拮抗剂处理之前的 OVX 母羊中 - 可明显地分辨出 LH 的主要分泌期。通过心室施用亲吻肽拮抗剂后分泌脉冲的数量减少。在鉴别出 LH 脉冲 的情况下， 发现这些脉冲具有降低的振幅。
实施例 2- 关于亲吻肽类似物的进一步实验数据
概述
促性腺激素释放激素 (GnRH) 是生殖系统的主要调节剂， 并且 GnRH 类似物被广泛 用于治疗不育和激素依赖性疾病， 如前列腺癌和子宫内膜异位症。GnRH 神经元活动受许多 因素调节， 包括光周期、 营养、 应激和类固醇激素。关于 gpr-54 中的突变引起低促性腺激素 型性腺功能减退症的发现导致认识到其同源配体 ( 亲吻肽 ) 介导这些在 GnRH 神经元上的 作用。 我们报道了亲吻肽拮抗剂的开发并将其应用于阐明亲吻肽在青春期和类固醇激素反 馈中的作用。通过亲吻肽 -10 中的氨基酸取代确定了一系列的有效拮抗剂。选择的拮抗剂 抑制小鼠大脑中的 GnRH 神经元放电和消除青春期雌性恒河猴的 GnRH 脉冲 ； 后者支持亲吻 肽在青春期开始时的关键作用。此外， 所述拮抗剂减弱了大鼠中黄体生成激素 (LH) 对外源 性亲吻肽的反应， 以及抑制母羊、 大鼠和小鼠在性腺切除之后的 LH 增加， 间接地证明了亲 吻肽 - 神经元是性类固醇反馈作用的靶标。因而， 亲吻肽拮抗剂的开发提供了用于探寻亲 吻肽在调节生殖中的生理学和病理生理学作用的新工具， 以及用于干扰激素相关疾病的治 疗法。
引言
促性腺激素释放激素 (GnRH) 是促性腺激素分泌的主要效应物， 促性腺激素对于 睾丸和卵巢生成配子和类固醇激素的下游调节至关重要。生成 GnRH 的神经元受许多因 素调节， 包括光周期、 代谢信号、 应激和生殖腺类固醇， 它们通过激活或抑制下丘脑中的神 经回路而控制 GnRH 分泌， 但是传导这些作用以改变 GnRH 分泌的机理仍然不清楚 (1-3)。 现在通过发现被称为低促性腺激素型性腺功能减退症的独特不育类型与 G 蛋白偶联受体 (gpr-54) 突变有关而发现了这些机理 (4， 5)。 Gpr-54 是被称为亲吻肽的神经肽家族的同源 并且亲吻肽 /gpr-54 信号传导作为生殖过程的神经内分泌调节枢纽出现 (8)。 受体 (6， 7)， 确实已显示亲吻肽 ( 由 Kiss1 基因编码 ) 是有效的 GnRH 促分泌素， 并且 GnRH 神经元表达 亲吻肽受体 (9， 10)。 此外， 亲吻肽神经元已作为将环境和激素输入传递至 GnRH 神经元的通 路而参与 (11-16)。
通过调节下丘脑 - 垂体 - 性腺 (HPG) 轴， GnRH 类似物广泛地应用于治疗激素依赖 性疾病， 包括前列腺癌、 乳癌、 卵巢癌、 子宫内膜异位症、 子宫肌瘤和性早熟， 以及用于不育 和 IVF 中的排卵诱导 (17， 18)。 由于亲吻肽对 GnRH 和促性腺激素分泌产生如此有力的刺激作用， 在亲吻肽 /gpr-54 系统水平的干扰可能具有用于治疗这些病症的潜力， 并且可能获 得比由 GnRH 类似物所实现的更强且更有效的控制。
在怀孕期间亲吻肽显著提高 (19) 并由滋养层生成 (20)， 并且通过滋养层细胞 和子宫上皮中的 gpr-54 受体抑制基质金属蛋白酶 (MMP) 而抑制滋养层细胞侵入 ( 植 入 )(21)。因而亲吻肽 /gpr-54 调节异常可能在胎盘和胎儿病理如先兆子痫、 胎盘植入 (acretia)、 异位妊娠和胎儿宫内生长迟缓中发挥作用， 但是对此缺少直接证据。在人脉管 中的选择区域， 通过 gpr-54， 亲吻肽也是有效的血管收缩剂 (22)。
因而， 亲吻肽拮抗剂的开发为阐明亲吻肽在对 GnRH 细胞的正和负性腺反馈中的 作用以及在介导对生殖系统的代谢和应激效应中的作用提供了必要的条件。 亲吻肽拮抗剂 还提供了在许多激素依赖性疾病中的潜在治疗干扰， 还可能用于胎盘和脉管功能失调的治 疗。
我们报道了对亲吻肽类似物的系统性结构 - 活性研究和在实验室啮齿动物、 羊和 非人的灵长动物具有体外和体内活性的有效和特异性的拮抗剂。 这些研究表明亲吻肽在青 春期和类固醇激素反馈中的关键作用， 表明了这些拮抗剂的广泛应用。
结果
亲吻肽 -10 中氨基酸的取代对稳定表达人 gpr-54 的 CHO 细胞中刺激肌醇磷酸 (IP) 释放的影响
由于亲吻肽 -10 是用于全部受体结合和激活所需的最小序列， 我们研究了系统取 代该范围内氨基酸的影响， 监测稳定表达人 gpr-54 的细胞中的 IP 生成。因为在这个巨大 而古老肽家族中 C- 末端序列的 RF.NH2 是保守的， 我们推断这对于受体结合来说是必须的， 并将我们的注意力集中于在前的八个氨基酸。我们截去 N- 末端的 5 个氨基酸， 并引入不同 的 D- 氨基酸取代。 这导致 IP 生成效率降低和减弱了抑制 10nM- 亲吻肽 -10 刺激 IP 的能力 (图7； 表 1)。这表明最前的 5 个氨基酸与受体激活有关。然后我们在全长 10 个氨基酸肽 中取代单个或组合的残基， 并且监测所述取代对内在 IP 刺激的影响， 和这些取代对用 10nM 亲吻肽 -10 刺激 IP 的任何抑制作用。氨基酸的这一系统取代使得我们开发出对此受体具 有部分刺激和拮抗性质的一系列类似物 ( 表 1)。许多这些类似物加入了取代 Ser6 的甘氨 酸并与在 Leu8 位的 D- 氨基酸 ( 色氨酸或亮氨酸 ) 相组合。虽然这些取代单独显著抑制了 10nM 亲吻肽 -10 的刺激 IP(P ＜ 0.01)， 但是它们通常没将此刺激降低至基础水平 ( 图 8a， b； 表 1)。
为开发完全拮抗剂， 在 Tyr1、 Asn2 和 Trp3 位进一步进行 D- 氨基酸取代。在这些位 点取代中， 最有效的拮抗剂是肽 230、 232、 233、 234、 235 和 236， 它们单独几乎没有或没有刺 -8 激 IP， 但是具有＜ 10 M 的 IC50 和最大抑制 66-93％的亲吻肽刺激 IP( 图 8b-d ； 表 1)。用 1 D-Ala 取代 ( 表 1 中 234 ； 图 8d) 实现了最完全的抑制。这种取代组合抑制 93％的 10nM 亲 吻肽 -10 刺激 IP， 具有的 IC50 为 7nM， 并且没有内在 IP 刺激， 表明其高拮抗剂活性。这些 6 8 研究还突出显示了在 Ser 位的甘氨酸取代和在 Leu 位的 D-Trp 取代的重要意义， 因为从以 1 上类似物中将这些取代中的一个或两个都去除， 当在 D-Tyr 取代 Tyr 时降低了拮抗剂活性 ( 图 8e)， 或当 D-Ala 被取代时减小了拮抗作用 ( 图 8f)。这表明这些残基对于受体激活来 说具有重要意义。使用 125I- 亲吻肽 -10， 所述活性类似物显示高结合亲合力， 例如肽 234 具 有的结合亲合力为 2.7nM( 图 9)。肽 234 抑制亲吻肽 -10 刺激的 GnRH 神经元放电
如之前所证明 (23)(J.Pieleka-Fortuna， Z Chu， SM Meonter， EndocrineSociety Meeting 2006， Abstract P1-8)， 1nM 亲 吻 肽 -10 显 著 增 强 GnRH 神 经 元 放 电 活 动 ( 图 10a， c)。在这些实验条件下， 单独的肽 234 对 GnRH 神经元放电活动没有影响 (1nM 之 前 0.18±0.12Hz， 之 后 0.27±0.08Hz， n ＝ 5， P ＞ 0.05 ； 10nM 之 前 0.34±0.15Hz， 之后 0.29±0.17Hz， n ＝ 6， P ＞ 0.05 ； 100nM 之前 0.45±0.12Hz， 0.62±0.14Hz， n ＝ 7， P ＞ 0.05， 成对 t 检测 )。与肽 234 缺少对基础放电的作用相反， 与用亲吻肽 -10 单独处理细胞 ( 图 10b， c) 相比， 用肽 234 预处理阻断了对 1nM 亲吻肽 -10 的反应 ( 所有剂量 P ＜ 0.001)。
肽 234 抑制雌性恒河猴脉冲式 GnRH 释放
由于肽 234 抑制 GnRH 神经元放电， 我们使用之前描述的方法 (24)， 测试这是否导 致抑制青春期雌性恒河猴的 GnRH 释放。在 30min 内， 通过位于柄 - 中间隆起区域的微透析 探针输注 10nM 肽 234 迅速且持续地阻抑 GnRH 脉冲以及平均 GnRH 水平 ( 图 11a， c)。相反 地， 通过探针输注载体并未引起 GnRH 释放发生显著变化 ( 图 11b， d)。肽 234- 诱导的 GnRH 阻抑与在肽 234 输注之前以及载体对照的值具有显著差异 ( 两种情况下均为 p ＜ 0.05)。 基于我们之前的评估， 用相似尺寸的透析膜通过～ 10％的肽 (25)， 估计肽 234 在柄 - 中间 隆起区域中的浓度为 1nM。
肽 234 抑制完整雄性大鼠中亲吻肽 -10 刺激的 LH 并在阉割之后 LH 增加
使用成年雄性大鼠在体测试肽 234 的推定的亲吻肽拮抗剂活性作用。为了评估拮 抗剂对基础 LH 水平的可能作用， 药理学测试包括重复 (x3) 脑内注射化合物和连续取血样。 为了监测肽 234 抑制亲吻肽 -10 通过刺激 GnRH 而刺激 LH 和睾丸酮的能力， 第三次注射同 时还有亚最大剂量 (100pmol) 的亲吻肽 -10 和 1nmol 剂量的肽 234 共同施用。在注射 15、 60、 75 和 120min 之后， icv 施用 1nmol 肽 234 并没有显著改变基础 LH 水平 ； 向载体处理的 动物中央注射 1pmol 亲吻肽 -10( 在 120min) 引起预期的血清 LH 水平升高 ( 图 12a)。尽管 缺少对基础水平的作用， 共同施用肽 234 显著减弱由中央注射亲吻肽 -10 诱导的 LH 分泌反 应， 并且在共同注射肽 234 和亲吻肽 -10 之后 120min 的时间内显著 (P ＜ 0.01) 减少 LH 净 分泌量 (AUC)。与此一致的是， 联合注射肽 234 和亲吻肽 -10 之后 60min 时的睾丸酮水平显 著 (P ＜ 0.01) 低于单独注射亲吻肽 -10 的动物 ( 图 12a)。在 240min 监测期内， 阉割大鼠 的 LH 水平升高。在 0、 60 和 120min 向阉割雄性大鼠施用 1nmol 肽 234 有降低血清 LH 水平 的趋势 ； 降低在 240min 达到统计学显著性 ( 图 12b)。
肽 234 抑制卵巢切除母羊的 LH 脉冲频率和振幅
在肽 234 施用之前， 对照卵巢切除母羊和经处理母羊的 LH 主要分泌期是明显不同 的 ( 图 13)。在经心室施用肽 234 之后， 分泌脉冲数量减少。在鉴别出 LH 脉冲的情况下， 肽 234 输注后这些 LH 脉冲的振幅减小 (P ＜ 0.05， 表 2)。在输注之前和期间， 平均 LH 水平相 似， 但在肽 234 输注后减小 (P ＜ 0.05)。
输注肽 234 显著 (P ＜ 0.05) 增加 OVX 母羊中 GH 的平均浓度 ( 图 14 和表 2)。这 种作用仅在输注期间观察到， 而输注之前和之后， 对照母羊和肽 234 处理母羊之间的平均 GH 水平相似。有趣的是， 这种刺激作用似乎比对 LH 的抑制作用更直接。在输注之前、 期间 或之后， 肽 234 对催乳素或皮质醇的浓度没有影响 ( 图 15 和图 16)。
如图 15 所示， 令人惊奇地， 拮抗剂施用升高羊的生长激素水平。因此， 本发明的拮抗剂可以用于促进和 / 或诱导个体生长激素生成。例如， 本发明的拮抗剂可以与使用生长 激素疗法的现有治疗一起使用， 例如用于肾衰竭的治疗。
肽 234 抑制卵巢切除母羊中 LH 脉冲频率和振幅
使用从新生儿脐带分离的人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)， 因为它们内源性地表达 gpr-54， 而 gpr-54 被认为参与胎盘内的细胞迁移。使用稳定表达人 gpr-54 受体的中国仓 鼠卵巢 (CHO) 细胞作为创伤愈合试验的模型细胞系。
用移液管尖端从 12- 孔细胞培养板中的各孔中间刮下稳定表达人 gpr-54 的 WT HUVEC 或 CHO 细胞的单层细胞， 然后用 PBS 清洗细胞培养板， 以去除任何松散细胞。在各个 细胞类型中， 与完全培养基一起加入最佳浓度的亲吻肽 -10 以抑制细胞迁移 ( 创伤愈合 ) ： 对于 HUVEC 细胞， 在有和没有拮抗剂 233、 234、 273 和 276 存在下， 加入 1nM 亲吻肽 -10 ； 对于 CHO 细胞， 在有和没有拮抗剂 234 存在下， 加入 100nM 亲吻肽 -10。然后将细胞在 37℃下含 5％ CO2 的空气中孵育 22 小时。细胞在 axiovert 2000 显微镜上以 20x 倍放大率进行相差 拍照 (Hori et al.， 2001.Metastin suppresses the motility andgrowth of CHO cells transfected with its receptor.Biochem Biophys ResCommun 286， 958-963 ； Stafford et al.， 2002， Identification and characterizationof mouse metastasis-suppressor KiSS1 and its G-protein-coupled.Cancer Res 62， 5399-5404)。
在图 17(A) 中， 结果表明， 在 CHO 细胞中， 100nM 亲吻肽抑制 50％的细胞迁移， 而肽 234 完全消除了这种抑制。在图 17(B) 中， 结果表明， 在 HUVEC 中， 1nM 亲吻肽抑制 50％向伤 口的迁移。然而， 当肽 233、 234 或 273 存在时， 此抑制降低至仅为 10％。
基于此， 我们认为肽 233、 234 和 273 在这些细胞中作为对人 gpr-54 的拮抗剂起作 用， 因为它们几乎完全抑制了亲吻肽对迁移的作用。 因此， 本发明的拮抗剂可以用于诱导和 / 或促进创伤愈合。
向肽 234 的 N- 末端添加果蝇触足肽七肽
如上所述， 所述 R-R-M-K-W-K-K-Y 序列为来自果蝇触足肽的七肽序列。向肽 234 的 N- 末端添加所述肽序列 R-R-M-K-W-K-K-Y， 所得到的肽命名为肽 271。
因此， 肽 271 的序列为 ：
ac.R-R-M-K-W-K-K-Y-(D)A-N-W-N-G-F-G-(D)W-R-F.z
如表 1 所示， 包含 N- 末端果蝇触足肽七肽的肽 271 保持了亲吻肽拮抗剂的功能。
讨论
亲吻肽作为抗转移剂和在调节 HPG 轴以及可能调节植入、 血管收缩和 CNS 神经元 中的多效作用使得 gpr-54 受体成为引人注意的治疗靶。迄今主要的重点在于开发作为抗 转移剂的亲吻肽激动剂 (26-28)。然而， 大多数在亲吻肽在 HPG 轴、 植入和血管收缩中的治 疗干预作用需要开发拮抗剂。为实现这个目的， 我们系统地取代了生物活性所需的最小亲 吻肽结构 ( 亲吻肽 -10) 中的氨基酸， 并且开发在体外和体内具有高结合亲合力和效力的拮 抗剂。 寻求亲吻肽激动剂的研究已确定 Phe6、 Arg9 和 Phe10.NH2 构成结合药效团 (26)。 RF.NH2 部分在巨大而古老的肽家族中的进化保守性预示这些 C- 末端残基对于受体结合是必需 的， 这与其在药效团中的认定相一致。我们对亲吻肽氨基酸取代的初探研究证实 RF.NH2 部 分中的变化可减低结合。因此， 在寻找拮抗剂结构时， 我们将注意力集中于其它残基。我们 首先截去啮齿动物和人亲吻肽 -10 序列中的 N- 末端 5 个氨基酸， 并发现这降低激动剂活性和拮抗剂性能。在这些截短肽中取代 Phe6 或 Leu8 显示， 用 D-Trp 取代 Leu8 产生最有前景 的拮抗剂。在十肽全长序列中加入该取代产生更好的拮抗剂， 尤其是当同时用非手性氨基 5 酸 Gly 取代 Ser 的情况下， Gly 使肽的柔韧性更大， 并且能够避免其它具有庞大侧链的氨基 酸 ( 如 D-Trp) 取代的一些立体位阻。
进一步研究显示， 用 D- 氨基酸取代 N- 末端 Tyr1 对于拮抗活性来说也是可以接受 的， 但是若是 D-Tyr1 或 D-Trp1 同时还有 D-Trp8 取代则不可以。如所预期的， 药效团残基 6 Phe 的取代导致激动剂活性下降并产生一些拮抗剂活性 ( 如 211 和 212)。然而， 与单独用 8 6 6 8 8 D-Trp 取代相比， 用 D-Trp 取代 Phe 并与用 D-Trp 取代 Leu 相组合降低了拮抗作用 ( 用 210 与 213、 245 和 246 比较 )。 Asn2( 如 232 和 236) 和 Trp3( 如 231 和 235) 的某些取代与用 D-Trp8 取代 Leu8 组合对于拮抗作用来说也是可接受的。总的说来， 用于拮抗作用的共有序 1 2 3 8 1 2 列为 X -X -X -N-G-F-G-X -R-F.NH2， 其中 X 为 D-Tyr 或 D-Ala， X 为 Asn 或 D-Ala 或 D-Trp， 3 8 X 为 Trp 或 D-Trp 或 D-Ala 以及 X 为 D-Leu、 D-Phe 或 D-Trp。
我们的研究还鉴定出看起来参与受体激活的氨基酸， 因为 Ser6、 Leu8 的取代， 和某 1 2 3 种程度上 Tyr 、 Asn 和 Trp 的取代有助于拮抗作用。这是令人感兴趣的， 因为迄今的研究 数据表明 N- 末端包含活性结构域， 而 C- 末端包含结合结构域。然而， 我们的研究表明， 该 6 9 10 8 两个区域交叠， 因为已证明 Phe 、 Arg 和 Phe 构成用于结合的药效团 (26)， 因此 Leu 活性 残基位于结合位点中。
在显示较好的体外拮抗剂活性的类似物中， 我们选择肽 234 用于离体和体内研 究。由于认为亲吻肽在 HPG 轴的作用主要是通过刺激 GnRH 分泌 (10， 29)， 我们首先研究了 肽 234 抑制亲吻肽 -10 刺激 GnRH 神经元放电的能力， 使用新鲜制备的小鼠脑切片进行记 录。发现 100nM、 10nM， 甚至 1nM 肽 234 都阻断亲吻肽 -10 刺激的 GnRH 神经元放电， 所述浓 度与用于刺激 GnRH 神经元的亲吻肽 -10 浓度相同。
通过肽 234 抑制亲吻肽对 GnRH 神经元放电的作用表明， 所述拮抗剂可以在体内减 少下丘脑的 GnRH 释放。因此， 我们通过直接向青春期雌性恒河猴柄 - 中间隆起区域施用肽 234， 确定亲吻肽是否改变脉冲式 GnRH 释放。在肽 234 输注期间阻抑 GnRH 释放首次提供了 直接证据证明来自下丘脑中亲吻肽神经元的输入是 GnRH 释放的明显重要信号。亲吻肽在 GnRH 脉冲中的重要性进一步得到之前观察的支持， 其中表明亲吻肽 -54 释放是脉冲式的， 并且亲吻肽 -54 脉冲与 GnRH 脉冲有 75％的时间是一致的 (24)。 然而， 因为临床研究表明具 有 gpr-54 突变的患者表现具有近似正常脉冲频率的减弱 LH 脉冲 (4， 5)， (30)， 亲吻肽神经 元是否是 GnRH 脉冲产生的关键， 或其仅是 GnRH 脉冲幅度的调节剂的问题， 仍然有待研究。 因此， 完全消除猴模型的 GnRH 脉冲和卵巢切除羊的 LH 脉冲可以简单地反映对振幅而不是 频率的完全抑制。
肽 234 还在 2 小时期间内阻断成年雄性大鼠亲吻肽 -10 对 LH 和睾丸酮的刺激 ( 图 12a)， 估计是通过阻断亲吻肽 -10 对 GnRH 分泌的作用。用肽 234 抑制完整雌性恒河猴 GnRH 分泌表明， 前一种解释是最有可能的。在阉割雄性大鼠中， 肽 234 阻断了随阉割和去除负反 馈之后发生的 LH 增加。该发现表明， 去除性腺类固醇导致亲吻肽活性升高， 而这被转化成 增加的 GnRH 和 LH 分泌。以前证明， 性腺切除的雄性和雌性大鼠弓状核中 KiSS-1 基因表达 增加 (10， 29) 和用 GnRH 拮抗剂消除所导致的 LH 上升的能力 (10)， 与猜测亲吻肽形成神经 元是性类固醇反馈作用的靶标的假设相一致 (11)。 然而， mRNA 水平可能没有反映结合 GnRH神经元中 gpr-54 的亲吻肽的生物合成和分泌。我们现在用新亲吻肽拮抗剂的研究提供了 亲吻肽通过性腺负反馈调节 GnRH 神经元的直接证据， 并且强调了亲吻肽拮抗剂用于阐明 生理学机理的价值。
反复取血样 ( 每隔 10min) 以及在卵巢切除母羊中的拮抗剂处理允许我们探究内 源性亲吻肽对 LH 脉冲频率和振幅的作用。通过 icv 施用肽 234 显著降低 LH 脉冲的频率和 振幅， 表明 GnRH 分泌的振幅减小以及其频率也可能降低。这与我们验证的肽 234 抑制小鼠 GnRH 神经元放电频率和抑制恒河猴 GnRH 脉冲相一致。 这些发现暗示， 亲吻肽的内源性分泌 本质上是脉冲式的， 并且促使 GnRH 节律性分泌。用亲吻肽 -10 增加 GnRH 神经元放电的能 力和用亲吻肽拮抗剂降低 GnRH 神经元放电的能力表明亲吻肽类似物在与 LH 脉冲频率功能 失调有关的病理病症中的治疗潜力， 如多囊卵巢综合征特有的 LH 脉冲频率增加 (31) 和在 心理疾病、 应激 (32) 和营养不足 ( 如神经性厌食症 ) 中发现的 LH 脉冲频率降低 (33)。
肽 234 的作用看起来是特异性的， 因为它对卵巢切除母羊催乳素和皮质醇分泌没 有影响 ( 图 15 和图 16)， 并且不结合 GnRH 或 LH 受体 ( 数据未显示 )。全部 4 只母羊在输 注肽 234 期间生长激素看起来增加， 表明内源性亲吻肽抑制生长激素 ( 图 14)。 我们尚未深 入检测这种现象， 但是已观察到亲吻肽受体 (gpr-54) 唯一地表达于垂体中的生长激素细 胞中。在啮齿动物和羊中显示雌激素的正反馈诱导排卵的 LH 激增， 同时伴随着下丘脑特定 区域中 Kiss-1 基因表达的增加 (34-36)。 雌性大鼠 (37) 和女性 (38) 的研究还显示， 在排卵 LH 激增时 LH 对外源性亲吻肽有 更大的灵敏度， 表明增加亲吻肽输入介导雌激素的正反馈 (37)。这与雌激素治疗后 KiSS-1 基因表达增加的证明 (34， 35)， 以及在雌性大鼠中通过施用亲吻肽抗血清而消除的 LH 激增 相一致 (35)。我们目前利用肽 234 来确定亲吻肽在对 GnRH 和 LH 分泌正反馈中的作用。
我们通过 icv 施用拮抗剂的研究主要是为了使亲吻肽输入更直接干预 GnRH 神经 元， 并更清楚地阐述亲吻肽在 HPG 轴的生理调控中的作用。然而， 系统性给药是亲吻肽类似 物治疗应用的前提。由于静脉注射和皮下注射施用亲吻肽刺激男性 (39) 和女性 (38)LH 释 放， 因此所述肽显然进入了大脑， 或作用于血 - 脑屏障之外的位置如弓状核或中间隆起， 并 且作用于 GnRH 神经元。因此， 有理由认为系统性递送亲吻肽拮抗剂也会到达在中间隆起处 的 GnRH 神经元或它们的轴突， 由此提供了有效的和可行的治疗靶。
许多病理与 HPG 轴的功能失调有关， 并且性类固醇刺激使许多症状加重。这些包 括不育、 多囊卵巢综合征、 子宫内膜异位症、 子宫肌瘤、 月经出血过多、 青春期延迟和性早 特异且有效的亲吻肽拮抗剂将提供用于这些 熟、 以及乳癌、 前列腺癌和卵巢癌。获得强力、 病症的新疗法和用于探寻 HPG 轴的生理调节作用的可能性。除了这些主要的适应症， 亲吻 肽拮抗剂还可能具有调节血管收缩 (22)、 CNS 功能 (40) 和滋养层侵入以及形成充足的母体 血液供应 (19， 21， 41) 的潜力。
方法
肽
材料
人 亲 吻 肽 -10 以 及 肽 类 似 物 186-191、 200-203、 206-213 和 228-248(10μg) 由 EZBiolabs 按常规方法合成。其他全部试剂来源都在文中指明。
体外测试拮抗活性
细胞培养
稳定表达人 gpr-54 受体的中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞 (CHO/gpr-54) 由布鲁塞尔大 学 (Univ.Brussels)G.Vassart 教授提供。在 37℃， 5％ CO2， 加湿环境下， 将细胞保存于添 加 10％胎牛血清、 2％谷氨酰胺和 1％青霉素 (10,000 单位 /ml)/ 链霉素 (10,000mg/ml) 的 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基 (DMEM ； Sigma) 中。
肌醇磷酸 (IP) 刺激试验
在刺激 CHO/gpr-54 细胞之前， 用杜氏磷酸盐缓冲液 (DPBS ； 不含钙或镁 ) 冲洗细 3 胞两次， 然后在 37℃下用含有 1％青霉素 / 链霉素的 H- 肌醇标记的 HEPES 改良的 DMEM 孵 育过夜。向细胞添加 1％青霉素 / 链霉素和 1％氯化锂 (0.5ml) 的 HEPES 改良的 DMEM， 在 37℃下保持 30 分钟以阻止 IP 水解。然后， 用以 1 ∶ 100 的配比稀释于上述培养基的 0.5ml 亲吻肽 -10 和类似物 (10pM-1μM) 于 37℃下刺激细胞 1h， 再用 10mM 甲酸于 4℃下裂解细胞 1h。将裂解物转移至含有 0.5ml Dowex 树脂的塑料管中以结合放射性 IP， 再用 1ml 水冲洗 树脂。然后用 60mM 甲酸铵 /5mM 四硼酸钠冲洗树脂。接着用 1M 甲酸铵 /0.1M 甲酸冲洗树 脂， 以释放结合的放射物。然后将 800μl 放射性溶液转移至含 2.5ml 闪烁液的闪烁瓶中， 于 β- 粒子计数仪上进行放射性计数 60sec。重复实验 3-5 次。IP 产量以平均值 ±SEM 标 出， 并通过学生 t- 检验进行分析 (p ≥ 0.05)。
肌醇磷酸 (IP) 拮抗试验
单独用 0.25ml 亲吻肽 (10nM) 或与 0.25ml 肽类似物 (100pM-1μM) 组合刺激 CHO/ gpr-54 单层细胞， 以研究对亲吻肽刺激 IP 生成的抑制。重复实验 3-5 次。IP 产量以平均 值 ±SEM 标出， 并通过学生 t- 检验进行分析 (p ≥ 0.05)。
GnRH 神经元放电
动物
记录来自转基因雌性小鼠的脑切片中 GnRH 神经元的放电， 该小鼠中 GFP 遗传性地 靶向 GnRH 神经元 (42)。小鼠在 14 小时光照 /10 小时黑暗循环下饲养， 并有 1630 小时关 灯， 按 Harlan 2916 啮齿动物食谱 (Harlan) 喂食和随意饮水。所有方法均经维吉尼亚大学 动物关怀和应用委员会 (Animal Care andUse Committee of University of Virginia) 认可， 并按照美国国家研究委员会关于实验室动物的关怀和应用指南 (Nsyionsl Research Council’ s Guild for theCare and Use ofLaboratory Animals) 的准则进行。成年雌 性 GnRH-GFP 小鼠在异氟烷 (Abbott Laboratories) 麻醉下切除卵巢。用长效局部麻醉剂 (0.25％布比卡因 ； 7.5μl/ 位点 ； Abbott Laboratories) 提供术后无痛。 手术时， 小鼠接受 含有于芝麻油中的 0.625μg 雌二醇的硅橡胶 (Silastic)(Dow Corning) 胶囊。手术之后 2-4 日在 AM 时进行记录， 在 AM 时已证明雌二醇有负反馈作用 (43)。记录来自于单只动物 的不多于 4 个细胞， 全部在不同的切片中。
脑切片制作
使用之前描述的方法 (44) 制作脑切片。简要而言， 在整个试验过程中以及在接触 组织之前至少 15min， 向所有溶液中通入 95％ O2/5％ CO2 混合物使溶液起泡。迅速取下大 脑并置于冰冷的高糖盐溶液中， 该溶液含有 250mM 蔗糖、 3.5mM KCl、 26mM NaHCO3、 10mM 葡萄 糖、 1.25mM Na2HPO4、 1.2mM MgSO4 和 2.5mM MgCl2。 用 Vibratome 3000(Technical Products， International， Inc.， St.Louis， MO) 切取冠状 300-μm 脑切片。切片于 30-32℃下在溶液中孵育 30min， 所述溶液为 50％高糖盐溶液和 50％生理盐溶液 (NS)， 其含有 135mM NaCl、 3.5mM KCl、 10mM 葡萄糖、 1.3mM Na2HPO4、 1.2mM MgSO4 和 2.5mM CaCl2。然后将切片转移至 室温下的 100％ NS 溶液中， 并记录之前保持至少 30min， 但不超过 6h。
电生理记录
使用靶向细胞外记录 ( 又被称为松膜片 ) 来研究亲吻肽 -10 和肽 234 对 GnRH 神 经元放电活动的影响 (45)。 由于低阻封接 ( ＜ 50MΩ) 不会影响细胞膜， 这种方法是用于监 测单个细胞内源性电学活性的微创方法。虽然这些事件不是动作电位本身， 但是它们精确 地反映了动作电位放电频率的变化。简要而言， 我们使用词组放电频率、 放电模式和 / 或放 电活动来指代这些事件。
将个体脑切片置于用氧化 NS 溶液连续灌注的记录槽中， 并保持在 29-31 ℃。用 Olympus BX50WI 正置荧光显微镜和红外微分干涉相衬显微镜 (Opelco) 使细胞成像。通过 由 470nm 的短暂照明成像的 GFP 信号来鉴别 GnRH 神经元。用标准 HEPES 缓冲溶液装满范 围为 1.5-3ΩM 的膜片硼硅酸盐移液管 (World Precision Instruments)， 所述标准 HEPES 缓冲溶液含有 150mM NaCl、 10mM HEPES、 10mM 葡萄糖、 2.5mM CaCl2、 1.3mM MgCl2 和 3.5mM KCl。使用 MP-285 显微操纵器 (Sutter Instruments) 放置移液管， 使其与 GnRH 神经元相 接触。封接电阻范围从 8MΩ 开始并且在记录期间保持稳定或增加达到高达 50MΩ。使用 EPC-8 放大器 (HEKA) 获得电流追踪记录， 并用在 G4 Macintosh 计算机 (Apple Computer) 上的 Igor Pro 软件 (Wavemetrics) 运行的脉冲 Control XOP 软件 (Instrutech) 获得数据。 使用电压钳模式进行记录， 其中吸管的钳制电位 (holding potential) 为 0mV， 在 10kHz 进 行过滤， 并使用 ITC-18 获得界面 (ITC-18 acquisition interface， Instrutech) 进行数字 化。
实验设计
通过孵育池应用人亲吻肽 -10， 1nM(Phoenix Pharmaceuticals)。使用不同剂量 (1nM， 10nM， 100nM) 的肽 234 来检测它对亲吻肽 -10 活化的 gpr-54 的拮抗作用。对于阳性 对照细胞， 记录 10-min 的稳定基线， 然后用亲吻肽 -10 处理 5min， 接着冲洗 15-min。对于 实验细胞， 记录在 NS 中的 5-min 稳定基线， 接着在肽 234(1， 10 或 100nM) 中记录 10min， 然 后在亲吻肽 -10 和相同剂量的拮抗剂中记录 5min， 接着用 NS 清洗。 用含有拮抗剂的溶液清 洗产生相似结果 (1nM 肽 234， n ＝ 5 个细胞， 未显示 )。在 10nM 肽 234 组中的一个细胞显 示没有活性 ； 加入 15mM KCl 以确定细胞的生存能力和记录完整性。
数据分析
使用为 Igor Pro 编写的程序， 以 1-min 的间隔计数和储存细胞外记录的事件， 由 此确定 GnRH 神经元放电频率的变化。使用微软 Excel(MicrosoftCorp) 分析储存的事件数 据， 从而分析在亲吻肽 -10 处理之前 ( 基线， 注意在拮抗剂治疗组中， 这是在肽 234 处理细 胞期间 )、 亲吻肽 -10 应用 ( 处理 ) 期间和洗脱期间的平均放电频率。对于拮抗剂处理组的 细胞， 还比较了在亲吻肽 -10 应用之前在 NS 中与在拮抗剂中的放电频率。通过由检测到的 事件总数除以在每个条件下的记录期间确定平均放电频率 ； 药物变化之后略过两分钟以排 除过渡期。由于 GnRH 神经元放电活动随时间变化 (44， 45)， 计算各治疗组的倍数变化。先 后使用 ANOVA 和 Bonferroni 事后比较检验 (Bonferroni post hoctest) 对所述组进行比 较。肽 234 对雌性恒河猴 GnRH 释放的影响
动物
本研究中使用生长并喂养于威斯康星国家灵长类研究中心 (WisconsinNational Primate Research) 的四只雌性恒河猴。动物成对地喂养 ( 笼 172×86×86cm) 于 12h 光 照和 12h 黑暗， 并且控制温度 (22℃ ) 的房间。每日用 Harlan 20％蛋白质灵长动物饮食 (Protein Primate Diet) 的标准饮食饲喂动物两次， 每周补充几次新鲜水果。随意饮水。 本研究的协议经威斯康星大学动物关怀和应用委员会 (Animal Care and Use Committee， University of Wisconsin) 审阅和批准， 并且在 NIH 和 USDA 制定的准则下进行全部实验。
实验设计
使用微透析法检测肽 234 对 GnRH 释放的影响。如前所述 (25)， (24)， 这种方法允 许在肽 234 通过半透膜输注时， 收集用于 GnRH 测量的透析液样品。通过微透析探针将溶解 于 CNS 输注液的肽 234 输注入柄中间隆起区域， 输注 30min 同时连续收集透析液。对于对 照， 类似地输注载体。在同一实验中， 对每只动物按随机顺序检测肽 234(10nM 浓度 ) 或载 体， 在两次测试之间最小间隔为 2 小时。四只动物中的两只在单独的实验中检测两次， 总计 6 次实验。在整个实验期间， 猴子置于同伴猴附近， 持续供给食物和水， 并经常提供水果、 谷 物、 葡萄干和其他小吃。样本的平均年龄为 33.1±0.4 个月。
颅基架 (cranial pedestal) 植入
如前所述 (24)， 为了收集柄 - 中间隆起区域中的输注液， 我们使用微透析法。 实验 之前， 让年龄为 29.1±1.2 个月的猴子 ( 体重 ： 3.6±0.1kg) 充分适应灵长动物椅子、 实验 环境和研究者。使用类似于之前所述推挽式灌流法中的方法 (46)， 在异氟醚麻醉下向所述 动物植入颅基架。在实验之前， 允许动物恢复至少 1 个月。
微透析法
实 验 当 天，将 猴 子 在 氯 胺 酮 (ketamine， 15mg/kg b.w.) 和 美 托 咪 啶 (medetomidine， 0.03-0.05mg/kg b.w.) 麻醉下置于立体定位仪中。定制的导向套管 (CMA 12) 由不锈钢轴 ( 长 76.0mm， 外径 (o.d.)0.91mm) 和从导向套管末端伸出 20mm 的可移动不 锈钢通管针 ( 长 96.0mm， 外径 (o.d.)0.6mm) 组成。 用液压微驱动装置 (MO95-B) 将其插入至 颅骨 S-ME 上方 5mm 处。 该微驱动装置可以精确地调整末端的三维位置。 使用脑室造影术计 算 S-ME 的 x、 y 和 z 坐标， 并且在颅基架植入手术期间得到最终的射线照片。用射线拍照成 像确认套管放置。在放置导向套管后， 将猴子从立体定位仪移走， 并置于灵长动物椅子中。 如前所述 (25)， (24)， 当恰当的放置于椅子中时， 将内部的通管针从导向套管移出， 并将配 置有膜 ( 长 5mm， 外径 0.5mm) 的定制微透析探针 ( 不锈钢轴， 长 96.0mm， 外径 0.6mm) 通过导 向套管插入至 S-ME。为逆转美托咪啶的作用， 向动物注射 (i.v.) 阿替美唑 (atipamazole， 0.15-0.25mg/kg)。在探针插入之后 1h 内， 动物完全清醒。
用装配 1 或 2.5ml Hamilton 气密注射器 (Reno) 的 CMA/102 微透析泵以 2μl/min 的速度通过流入管道输注加入杆菌肽 (4U/ml) 的 CNS 输注液 ( 购自 CMA/Microdialysis)， 所述 CNS 输注液由 NaCl 147mM， KCl 2.7mM， CaCl21.2mM， MgCl20.85mM 组成。在冰上使用部 分收集器 (Model FC203B) 以 10min 的间隔将通过流出管道的输注液连续收集至 12×75mm 硼硅酸盐试管中， 连续收集达 12h。立即用干冰冷冻输注液样品， 并贮存于 -80℃。
GnRHRIA如 前 所 述 (46)，用 Dr.Terry Nett( 科 罗 拉 多 州 立 大 学， Colorado StateUniversity) 馈赠的抗血清 R42 进行 RIA。试验灵敏度为 0.02pg/ 管， 并且组内和组 间变异系数分别为 8.1％和 11.3％。
数据分析
如前所述 (47)， 使用 PULSAR 算法确定 GnRH 释放峰。计算各实验中在肽 234( 或载 体 ) 测试之前和之后 30min 时间内收集的 GnRH 的平均值。接着， 计算全部实验中各时间段 期间的平均值 (±sem)， 用于统计学比较。先后使用双因素方差分析和 Tukey 多重比较法 检验分析处理之前、 期间和之后 ( 治疗之内 )， 以及治疗 ( 肽 234vs. 载体 ) 之间的差异。P ＜ 0.05 被认为是差异显著。
肽 234 抑制雄性大鼠 LH 的动力学研究
实验设计
使用饲养于科尔多瓦大学 (University of Córdoba) 动物园的成年雄性大鼠 (BW ： 280-310g)。动物饲养于光照 (14h 光照， 从 0700h 开始 ) 和温度 (22℃ ) 恒定的条件下， 并 且在套管植入之前， 以每笼四只大鼠为一组饲养， 自由取食粒状食物和自来水。 实验步骤经 科尔多瓦大学动物实验道德委员会 (Córdoba University Ethical Committee for animal experimentation) 认可， 并且按照欧盟关于实验动物的关怀和应用规范 (European Union normative for careand use of experimental animals) 进行。
动物在轻度乙醚麻醉下植入 icv 套管， 此后单只分笼饲养。为了将化合物递送至 侧脑室， 套管低于颅骨表面下方 4mm 深度 ； 插入点为前囟后部 1mm 和侧向 1.2mm。在植入套 管至少 24-48h 之后进行功能测试。
完整雄性大鼠的药理学测试包括以 60min 间隔注射 (icv) 含 1nmol 剂量的肽 234 的 5μl 注射物。最后一次注射时， 同时注射有效剂量 ( 但为亚最大量 ) 的 100pmol 亲吻 肽 -10(Phoenix Pharmaceuticals Ltd)。用载体 ( 生理盐水 ) 注射的动物作为对照。在每 次 icv 注射之后 15-min 和 60-min， 通过颈部静脉穿刺采集血样 (250μL)。此外， 在开始实 验之前 ( 时间 ： 0-min) 和最后一次注射之后 120-min( 时间 ： 240-min) 立即采集血样。 基于 之前的研究 (16， 34， 48) 选择实验步骤和亲吻肽剂量。对于各时间点， 每组采集 10-12 份样 品。
此外， 还在睾丸切除 (ORX) 大鼠中进行肽 234 的重复 icv 注射。通过阴囊途径对 动物实施双侧 ORX， 并且在手术一周之后进行如前所述的套管植入。测试包括三次脑内注 射拮抗剂 (1nmol ； 在该方法中的 0-min、 60-min 和 120-min)， 并且在基础条件 (0-min) 和每 次 icv 注射之后 15-min 通过颈部静脉穿刺采集血样。在中央施用肽 234 之后 180-min 和 240-min 采集额外的血样。对于各时间点， 每组采集 10-12 份样品。
激素测量
使用双抗法和 NIH(Dr.AF Parlow， NIDDK) 提供的放射性免疫测定试剂盒测量 50μl 体积中的血清 LH 水平。参照制造商 (Pierce) 的说明书， 使用 Iodo-Gen 涂层试管用 125 I 标记大鼠 LH-I-10， 并且使用参照制剂 LH-RP-3 作为标准表示激素浓度。试验组内和组 间变异系数分别低于 8％和 10％。试验的灵敏度为 5pg/ 管。此外， 对在共施用 kp-10 和肽 234 之后 60-min( 时间 ： 180-min) 采集的血样选择性地进行血清睾丸酮 (T) 测量。为此， 参 照制造商的说明书， 使用购自 MP Biomedicals 的商业试剂盒。试验的灵敏度为 0.1ng/ 管，且试验组内变异系数为 4.5％。 对于各激素， 全部样品都在相同试验中测量。 通过评定大鼠 血清样品已知激素浓度作为外部对照， 证实激素确定的准确度。
数据分析
进行激素测定， 一式两份， 每组最少总计 10 份样品。适当时， 除单独的时间点测量 外， 按照梯形法则计算作为曲线下面积 (AUC) 的累积 LH 分泌反应。激素数据表示为平均值 ±SEM。 先后使用学生 t- 检验或 ANOVA 和 Student-Newman-Keuls 多重范围检验 (SigmaStat 2.0) 对结果进行统计学显著性差异分析。P ≤ 0.05 被认为是显著。
肽 234 对卵巢切除母羊 LH 的影响
实验过程
全 部 实 验 步 骤 都 在 莫 纳 什 学 院 生 物 医 学 动 物 道 德 委 员 会 (Monash SchoolofBiomedical Sciences Animal Ethics Committee) 认可的协议下进行。 在自然光 照下饲养成年考力代母羊， 并在任何实验操作前至少一个月对其进行双侧卵巢切除 (OVX)。 随后按照如前所述的外科手术步骤 (49) 植入永久存在于第三脑室 (3V) 的套管。 3V 外科手 术之后大约 2 周， 向一支颈外静脉插入套管以采集血样， 并将动物饲养于单独的圈内 ； 套管 用肝素化盐水保持通畅。母羊被分配成两个治疗组 (4/ 组 ) ； 肽 234( 用人工脑脊液稀释， aCSF ； 150mM NaCl、 1.2mM CaCl2、 1mM MgCl2、 2.8mM KCl) 或对照 ( 仅有 aCSF)。 第二天， 将输 注管道连接至 3V 套管， 在 07.00h 开始采集血样。每隔 10 分钟收集样品。取样 3h 之后， 在 1h 内以 40μg/h 的剂量将肽 234( 或对照 ) 输注至 3V， 初始剂量为 10μg。肽 234 和载体都 用 MS16A 输注泵 (Smith MedicalAustralasia Pty.Ltd.) 以 200μl/h 的速度 输注。输注之后， 3V 管道保持于原位， 并继续进一步采集血样 2h( 总计 6h)。立即从样品收 集血浆， 并在试验前冷冻于 -20℃。 测量血浆 LH 浓度， 一式两份， 使用 NIH-oLH-S18 作为标准 (49)。试验的灵敏度为 0.1ng/ml， 并且试验组间变异系数在 0.3-12.8ng/ml 范围之内小于 10％。 血浆 LH 数据的脉 冲分析如前所述 (36)。使用标准 NIDDK-oGH-I-4 和 NIDDK- 抗 -oGH-2 抗血清化验血浆样品 GH(50)， 一式两份。试验的灵敏度为 1ng/ml， 试验组间 CV 在 4-51ng/ml 之间小于 10％， 并 且试验组内 CV 为 20％。
测量血浆催乳素浓度， 一式两份， 使用 Sigma， Lot 114F-0558， NOL-7135 作为标准 (50)。试验的灵敏度为 1ng/ml。试验组间 CV 在 1-22ng/ml 之间小于 10％。
使 用 抗 血 清 no.3368(Bioquest Ltd) 和 125I- 标 记 皮 质 醇 (AmershamPharmacia Biotech Ltd) 化验血浆皮质醇浓度， 一式两份。试验的灵敏度为 3ng/ml。试验组间 CV 在 3-18ng/ml 之间小于 10％， 并且试验组内 CV 为 15％。
数据分析
对 于 LH、 GH、 催 乳 素 和 皮 质 醇 的 数 据 分 析， 计 算 输 注 之 前 (0-180min)、 期间 (180-240min) 和之后 (240-360min) 的时间段内各母羊的平均血浆值。 此外， 还计算注射之 前、 期间和之后各母羊的平均 LH 脉冲幅度。使用重复测量 ANOVA 来确定各时间段内肽 234 处理对激素水平的影响， 利用适当的单因素 ANOVA 评估各时间段内统计学差异。
实施例 3- 示例性药物制剂
尽管本发明的分子可以单独施用， 但是更优选与一种或更多种可接受的载体一起 作为药物制剂提供。载体必须是 “可接受的” ， 意指其与本发明的活性剂相容并且对其接受
者没有危害。通常， 载体为无菌和无热源的水或盐水。
以下实例举例说明了本发明的药物和药物组合物， 其中所述活性成分为本发明的 分子。
优选以 10μg 至 500mg 的量提供本发明的分子。应理解， 可以制备含有 10μg 至 500mg 量的本发明分子的以下示例性药物和药物组合物。 例如， 本发明的活性剂的存在量可 以为以下示例性药物和药物组合物中所示量的 1/10 或 1/100 或 1/200 或 1/500， 同时相应 地改变其余成分的量。
实例 A ： 片剂
活性成分 1mg
乳糖 200mg
淀粉 50mg
聚乙烯吡咯烷酮 5mg
硬脂酸镁 4mg
片剂通过以下方法制备 ： 用以上成分通过湿法制粒， 随后压制。
实例 B ： 眼用溶液
活性成分 1mg
氯化钠， 分析级 0.9g
硫柳汞 0.001g
加纯水至 100ml
pH 调节至 7.5
实例 C ： 片剂制剂
以下制剂 A 和 B 通过以下方法制备 ： 将所述成分和聚维酮溶液通过湿法
制粒， 接着加入硬脂酸镁并压制。
制剂 A
mg/ 片 mg/ 片
(a) 活性成分 1 1
(b) 乳糖 B.P. 210 26
(c) 聚维酮 B.P. 15 9
(d) 羟基乙酸淀粉钠 20 12
(e) 硬脂酸镁 5 3
251 51
制剂 B
mg/ 片 mg/ 片
(a) 活性成分 11
(b) 乳糖 150
(c)Avicel PH 101 60 26
(d) 聚维酮 B.P. 15 9
(d) 羟基乙酸淀粉钠 20 1244101861160 A CN 101861161
说5 251 mg/ 片 1 200 50 5 4明3 51书37/49 页(e) 硬脂酸镁制剂 C 活性成分 乳糖 淀粉 聚维酮 硬脂酸镁
260
以下制剂 D 和 E 通过直接压制混合成分制备。 制剂 E 中使用的乳糖为直接压制型。
制剂 D
mg/ 胶囊
活性成分 1
预胶化淀粉 NF15 150
151
制剂 E
mg/ 胶囊
活性成分 1
乳糖 150
Avicel 100
251
制剂 F( 控释制剂 )
所述制剂制备方法如下 ： 将 ( 以下 ) 成分和聚维酮溶液通过湿法制粒， 接着加入硬 脂酸镁并压制。
mg/ 片
(a) 活性成分 1
(b) 羟丙基甲基纤维素 112
(Methocel K4M Premium)
(c) 乳糖 B.P. 53
(d) 聚维酮 B.P.C. 28
(e) 硬脂酸镁 7
201
药物释放发生在大约 6-8 小时期间， 并在 12 小时之后完成。实例 D ： 胶囊制剂
制剂 A
胶囊制剂通过以下方法制备 ： 混合以上实施例 C 中制剂 D 的成分， 装入由两部分组 成的硬明胶胶囊中。以类似的方法制备 ( 以下 ) 制剂 B。
制剂 B
mg/ 胶囊
(a) 活性成分 1
(b) 乳糖 B.P. 143
(c) 羟基乙酸淀粉钠 25
(d) 硬脂酸镁 2
171
制剂 C
mg/ 胶囊
(a) 活性成分 1
(b) 聚乙二醇 4000BP 350
351
胶囊通过以下方法制备 ： 熔化聚乙二醇 4000 BP(Macrogol 4000 BP)， 将活性成分 分散于所述熔体中， 并将所述熔体装入由两部分组成的硬明胶胶囊中。
制剂 D
mg/ 胶囊
活性成分 1
卵磷脂 100
花生油 100
201
胶囊通过以下方法制备 ： 将活性成分分散于卵磷脂和花生油中， 并将分散体装入 弹性明胶软胶囊中。
制剂 E ( 控释胶囊 )
以下控释胶囊制剂通过以下方法制备 ： 使用挤压机挤出成分 a、 b 和 c， 接着滚圆挤 出物并干燥。然后用控释膜 (d) 包被干燥的丸粒， 并装入由两部分组成的硬明胶胶囊中。
mg/ 胶囊
(a) 活性成分 1
(b) 微晶纤维素 125
(c) 乳糖 BP 125
(d) 乙基纤维素 13
264实例 E ： 注射型制剂
活性成分 1mg
加入无菌无热源磷酸盐缓冲液 (pH7.0) 至 10ml
将活性成分溶解于大部分磷酸盐缓冲液中 (35-40℃ )， 然后定容并通过无菌微孔 过滤器过滤至无菌的 10ml 琥珀色玻璃小瓶 (1 型 ) 中， 用无菌盖和顶部封条密闭。
实例 F ： 肌内注射
活性成分 1mg
苯甲醇 0.10g
1.45g加入注射用水 q.s. 至 3.00ml
将活性成分溶解于四氢呋喃聚乙二醇醚 (glycofurol) 中。然后加入苯甲醇并溶 解， 并加入水至 3ml。然后通过无菌微孔过滤器过滤混合物， 并密封于无菌 3ml 玻璃小瓶 (1 型 )。
实例 G ： 糖浆混悬剂
活性成分 1mg
山梨糖醇溶液 1.5000g
甘油 2.0000g
可分散纤维素 0.0750g
苯甲酸钠 0.0050g
调味剂， Peach 17.42.3169 0.0125ml
加入纯水 q.s. 至 5.0000ml
将苯甲酸钠溶解于部分纯水中， 并加入山梨糖醇溶液。加入活性成分并分散。在 甘油中分散增稠剂 ( 可分散纤维素 )。混合两种分散物并加纯水定容至需要的体积。按需 要通过额外剪切悬浮液实现进一步增稠。
实例 H ： 栓剂
mg/ 栓剂 *
活性成分 (63μm) 1
固体脂肪 BP(Witepsol H15-Dynamit Nobel) 1770
1771 *
使用的活性成分为粉末， 其中至少 90％颗粒的粒径为 63μm 或更小。
在最高 45℃下将五分之一的 Witepsol H15 熔化于蒸汽夹套盘中。活性成分通过 200μm 筛， 在使用装配有刀头的 silverson 搅拌机混合下加入至熔化的基质中， 直至获得 均匀的分散体。混合物保持于 45℃， 将剩余的 Witepsol H15 加入至悬浮液中， 并搅拌确保 混合均匀。全部悬浮液通过 250μm 不锈钢丝网， 并连续搅拌， 并使其冷却至 40℃。在 38℃ 至 40℃的温度下， 将 2.02g 混合物装入合适的塑料模具中。使栓剂冷却至室温。
实例 I ： 阴道栓
mg/ 阴道栓
活性成分 1380
363
7
751
通过以下方法制备 ： 直接混合以上成分并直接压制所得到的混合物。
本发明的活性剂还可以按照用于诺雷德 (Zoladex)、 亮脯利特 (Leuprolide)、 替 维瑞克 (Teverelix)、 阿巴瑞克 (Abarelix)、 加尼瑞克 (Ganarelix)、 戈舍瑞林 (Goserelin) 等的方式进行制备。
实施例 4- 使用本发明的活性剂治疗增殖性疾病
对前列腺癌患者 ( 该患者对抗雄激素治疗没有反应 ) 每日肌内施用本发明的活性 剂 1mg， 或者根据本发明的方法递送该剂量的长效制剂 (depotpreparation)。该拮抗剂降 低雄激素。
实施例 5- 使用本发明的活性剂治疗增殖性疾病
对子宫内膜异位症或子宫肌瘤或乳癌患者每日肌内注射施用本发明的活性剂 1mg， 或者根据本发明的方法递送该剂量的长效制剂。
实施例 6- 使用本发明的活性剂治疗先兆子痫
对先兆子痫患者每日肌内注射施用本发明的活性剂 1mg， 或者根据本发明的方法 递送该剂量的长效制剂。
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<223> 具有 N 末端果蝇触足肽序列的亲吻肽变体序列 <220> <221>MISC_FEATURE <222>(11)..(11) <223>(D)W <400>27 Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Tyr Phe Gly Trp Arg Phe 1 5 10 <210>28 <211>49 <212>PRT <213> 人类 <220> <221>misc_feature69101861160 A CN 101861161序列表13/40 页<222>1..49 <223> 亲吻肽 1-45 序列 <400>28 Gly Thr Ser Leu 1 Pro Gly Leu Ser 20 Ala Val Leu Val 35 Ser <210>29 <211>10 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223> 亲吻肽变体序列 <220> <221>MISC_FEATURE <222>(1)..(1) <223>Y 或任意 D- 氨基酸 <220> <221>MISC_FEATURE <222>(2)..(2) <223>N 或任意 D- 氨基酸 <220> <221>MISC_FEATURE <222>(3)..(3) <223>W 或任意 D- 氨基酸 <220> <221>MISC_FEATURE <222>(5)..(5) <223>G 或 S 或任意 D- 氨基酸70Ser Pro Pro Pro Glu 5 Ala Pro His Ser Arg 25 Gln Arg Glu Lys Asp 40Ser Ser Gly Ser Arg 10 Gln Ile Pro Ala Pro 30 Leu Pro Asn Tyr Asn 45Gln Gln 15 Gln Gly Trp Asn101861160 A CN 101861161序列表14/40 页<220> <221>MISC_FEATURE <222>(6)..(6) <223>F 或 (D)W 或 (D)L <220> <221>MISC_FEATURE <222>(8)..(8) <223>W 或 L 或任意 D- 氨基酸 <400>29 Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Gly Xaa Arg Phe 1 5 10 <210>30 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<220> <223> 亲吻肽变体序列 <220> <221>MISC_FEATURE <222>(1)..(1)78101861160 A CN 101861161序列表22/40 页<223>(D)A <220> <221>MISC_FEATURE <222>(8)..(8) <223>(D)W <400>45 Ala Asn Trp Asn Gly Phe Gly Trp Arg Phe 1 5 10 <210>46 <211>10 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223> 亲吻肽变体序列 <220> <221>MISC_FEATURE <222>(3)..(3) <223>(D)A <220> <221>MISC_FEATURE <222>(8)..(8) <223>(D)W <400>46 Tyr Asn Ala Asn Gly Phe Gly Trp Arg Phe 1 5 10 <210>47 <211>10 <212>PRT <213> 人工序列 <220>79101861160 A CN 101861161序列表23/40 页<223> 亲吻肽变体序列 <220> <221>MISC_FEATURE <222>(2)..(2) <223>(D)A <220> <221>MISC_FEATURE <222>(8)..(8) <223>(D)W <400>47 Tyr Ala Trp Asn Gly Phe Gly Trp Arg Phe 1 5 10 <210>48 <211>10 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223> 亲吻肽变体序列 <220> <221>MISC_FEATURE <222>(1)..(1) <223>(D)W <220> <221>MISC_FEATURE <222>(8)..(8) <223>(D)W <400>48 Trp Asn Trp Asn Gly Phe Gly Trp Arg Phe 1 5 10 <210>49 <211>1080101861160 A CN 101861161序列表24/40 页<212>PRT <213> 人工序列 <220> <223> 亲吻肽 1-10 <220> <221>MISC_FEATURE <222>(1)..(1) 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末端果蝇触足肽序列的亲吻肽变体序列87101861160 A CN 101861161序列表31/40 页<220> <221>MISC_FEATURE <222>(16)..(16) <223>(D)W <400>62 Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Tyr Tyr Asn Trp Asn Gly Phe Gly Trp 1 5 10 15 Arg Phe <210>63 <211>18 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223> 具有 N 末端果蝇触足肽序列的亲吻肽变体序列 <220> <221>MISC_FEATURE <222>(11)..(11) <223>(D)W <220> <221>MISC_FEATURE <222>(16)..(16) <223>(D)W <400>63 Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Tyr Tyr Asn Trp Asn Gly Phe Gly Trp 1 5 10 15 Arg Phe <210>64 <211>18 <212>PRT <213> 人工序列 <220>88101861160 A CN 101861161序列表32/40 页<223> 具有 N 末端果蝇触足肽序列的亲吻肽变体序列 <220> <221>MISC_FEATURE <222>(10)..(10) <223>(D)N <220> <221>MISC_FEATURE <222>(16)..(16) <223>(D)W <400>64 Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Tyr Tyr Asn Trp Asn Gly Phe Gly Trp 1 5 10 15 Arg Phe <210>65 <211>18 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223> 具有 N 末端果蝇触足肽序列的亲吻肽变体序列 <220> <221>MISC_FEATURE <222>(10)..(10) <223>(D)A <220> <221>MISC_FEATURE <222>(16)..(16) <223>(D)W <400>65 Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Tyr Tyr Asn Trp Asn Ala Phe Gly Trp 1 5 10 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