瓜叶菊的快速繁殖方法.pdf

本发明公开了瓜叶菊(Senecio cruentus)的快速繁殖方法，属于植物组织培养领域。本发明方法包括以下步骤：1)以瓜叶菊种子作为外植体；2)丛生芽的诱导培养；3)壮苗培养；4)愈伤组织诱导培养；5)愈伤组织增殖培养；6)将不定芽分化培养；7)不定根诱导培养；8)炼苗移栽；其中，每个培养阶段所采用的基本培养基都是MS培养基，各个培养阶段所添加的生长调节剂，皆是采用正交设计实验后选择的最适宜的用量及配比。本发明方法所培育的瓜叶菊试管苗生长健壮，繁殖系数高，平均诱导生根率达到94.68％，移栽成活率达到100％，可进行规模化、工业化生产。

1.  一种瓜叶菊(Senecio cruentus)的快速繁殖方法，包括以下步骤：
1)以瓜叶菊种子作为外植体，接种于种子萌发培养基上萌生为无菌苗；
2)将去根无菌苗接种于丛生芽诱导培养基上诱导培养丛生芽；
3)将丛生芽切下后接种于壮苗培养基上进行壮苗培养；
4)将经过壮苗培养的芽苗的叶片、叶柄剪切后接种于愈伤组织诱导培养基上诱导生成愈伤组织；
5)将诱导的愈伤组织剪切后接种于愈伤组织增殖培养基上进行愈伤组织的增殖培养；
6)将增殖后的愈伤组织接种于不定芽分化培养基上进行不定芽的分化培养；
7)将不定芽接种于不定根生根培养基上诱导培养不定根；
8)炼苗移栽，即得。

2.  如权利要求1所述的繁殖方法，其特征是步骤1)中所述的种子萌发培养基是MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，pH值为6.1；步骤3)中所述壮苗培养基是：MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，pH值为6.1。

3.  如权利要求1所述的繁殖方法，其特征是步骤2)中所述丛生芽诱导培养基是：MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤0.5-2.0mg/L+萘乙酸0-0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1。

4.  如权利要求1所述的繁殖方法，其特征是步骤4)中所述愈伤组织诱导培养基是：MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤0.5-3.0mg/L+萘乙酸0-3.0mg/L+2，4-二氯苯氧基乙酸0-2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1。

5.  如权利要求1所述的繁殖方法，其特征是步骤5)中所述愈伤组织增殖培养基是：MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤0.5-1.0mg/L+萘乙酸0.5-1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1。

6.  如权利要求1所述的繁殖方法，其特征是步骤6)中所述不定芽分化培养基是：MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤0.5-3.0mg/L+萘乙酸0-3.0mg/L+2，4-二氯苯氧基乙酸0-2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1。

7.  如权利要求1所述的繁殖方法，其特征是步骤7)中所述不定根诱导培养基是：大量元素减半的1/2MS基本培养基+萘乙酸0.1-0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1。

8.  如权利要求1所述的繁殖方法，其特征是步骤7)中所述不定根诱导培养基是：大量元素减半的1/2MS基本培养基+3-吲哚丁酸0.1-0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1。

9.  如权利要求1所述的繁殖方法，其特征是步骤1)中所述接种之前先将瓜叶菊种子浸泡在质量百分比浓度为10％的过氧化氢溶液中消毒10-20分钟，然后用无菌水冲洗3-5次。

10.  如权利要求1所述的繁殖方法，其特征是步骤8)中所述的炼苗移栽包括顺序进行的步骤：移栽前打开培养瓶的封口膜在组培室内炼苗2-3天，然后将生根的小苗取出，用自来水洗去根部残留的琼脂培养基，移栽于装有蛭石基质的容器内，保持基质和空气中的相对湿度为40-50％，一个月后移栽至草炭与蛭石等体积混合的栽培基质中培养。

瓜叶菊的快速繁殖方法
技术领域
本发明涉及一种植物的组织培养方法，特别涉及瓜叶菊(Senecio cruentus)种子离体快速繁殖方法，属于植物组织培养领域。
背景技术
瓜叶菊(Senecio cruentus)又名千日莲、瓜叶莲，是菊科(Compositea)千里光属(Senecio)多年生草本植物，全株密布柔毛，叶片每三片一轮，成三角形，叶似黄瓜叶片，故名瓜叶菊。原产于西班牙加那利群岛，性喜冷寒，不耐高温和霜冻，好肥，喜疏松、排水良好的土壤。适宜生长的温度为10℃～20℃，高于25℃，低于10℃，生长缓慢，0℃以下极易受冻害。
瓜叶菊株丛紧密，盛开时花朵覆盖全株，花顶生，头状花序多数聚合成伞房花序，花序密集覆盖于枝顶，常呈锅底形，花色丰富艳丽，观赏价值很高。瓜叶菊的花期为每年12月至次年4月，正值少花的冬春季节，极具经济价值，是冬、春季盆栽用于布置居室、客厅、会议室及花坛装饰的理想花卉。目前市场上的瓜叶菊中，较著名的品种有“完美”、“小丑”、“惑星”、“礼品”等，颜色有红、粉红、蓝、紫以及许多复色。
用于大规模生产的瓜叶菊，全部采用种子繁殖。对于重瓣品种，为防止自然杂交或品质退化，也可采用分株法繁殖。瓜叶菊种子价格昂贵，寿命较短，发芽率低，系列变异率高，播种繁殖难以得到性状一致的种苗，从而限制了其产业化和商品化生产；而分株繁殖也普遍存在繁殖系数低，容易退化和传播病害的缺陷。
传统的育种方法虽然取得了一些成果，但还存在着很大的局限性。利用基因工程技术将目的基因定向导入植物细胞或组织中，培育成植株，可获得人们预期的新品种，为花卉的定向育种提供技术支持。目前，瓜叶菊花青素合成途径中的很多重要结构基因克隆已经完成，如CHS、CHI、F3H、ANS、F3’H、F3’5’H、DFR等，其中F3’5 ’H是重要的控制蓝色花形成的基因，这些基因工程技术为创造更多新奇花卉提供了可能。
然而，育种过程都需要一个稳定、高效的再生体系，这是决定遗传转化成败的关键。而一个稳定、高效的再生体系，必须具备以下条件：(1)外植体的组织细胞具有再生愈伤组织和完整植株的能力；(2)具有较高的芽分化率；(3)易于离体培养，具有高度可重复性；(4)体细胞无性系统变异小。
公开号为CN 101578959A的发明公开了一种离体培养除虫菊再生植株的方法及专用培养基，其步骤包括：1)将除虫菊的种子灭菌及离体培养后得到无菌苗，然后在MS基本培养基中继代培养；2)培养30天后，取顶端幼嫩叶片作为外植体，接种于含有2.0mg/L的6-BA、2.0mg/L的IBA及2.0mg/L的硝酸银的MS培养基中，先暗培养后光照培养，约30天后获得再生芽；3)将再生芽转移至MS基本培养基中继代培养，得到完整植株，但是，该方法的除虫菊的再生体系稳定性差，幼苗的成活率低。
公开号为CN 1653879A的发明公开了一种非洲菊切花种苗快繁方法，该方法将非洲菊花蕾的花托作为外植体，将其切成小块后置于含有0-2.0mg/L的AKT、0-0.2mg/L的NAA、0-1.0mg/L的BA以及0-0.5mg/L的IAAO的MS培养基中，在1000Lux、22-28℃下诱导出不定芽；再将不定芽切下置于含有0.2-2.0mg/L的BAO及0.2mg/L的NAA的MS培养基中，增殖培养形成丛芽；将丛芽切成单株芽苗后置于含有0.5mg/L的IBA的1/2MS培养基中，诱导其生根；最后将生根苗移栽到苗床。
上述两种方法虽然在一定程度上克服了传统育种所存在的缺陷，但其均采用直接再生方法，将外植体诱导发芽，而没有经过愈伤组织的诱导及分化途径。直接诱导法所得的体细胞胚胎发芽率低，并且由于培养基中营养不足或有毒代谢物的积累，会导致外植体停止生长，甚至老化变黑以及死亡，从而降低外植体的再生率，从而不利于离体组织的再生以及大规模培养。
湖南农业大学的于晓英等人，以瓜叶菊5个不同花色母株的单芽茎段为外植体进行了离体培养与快速繁殖研究，结果表明：1)以来自母株M1的外植体在含有0.1mg/LNAA+2mg/LBA的A5培养基的诱导率最高，芽萌动早且数目多；2)在继代培养中，在0～2.0mg/L范围内，随BA质量浓度的增加，瓜叶菊芽的增殖倍数增大，但当BA为3.0mg/L时，外植体茎叶随着时间推移逐渐变厚变脆，成愈伤组织状；3)C6培养基(1/2MS+0.5mg/LIBA+2％蔗糖)是瓜叶菊离体生根培养比较合适的培养基，培养到第16天时根系诱导率为100％，平均根数为18条，平均根粗为0.09cm；来自C6的试管苗移栽成活率可达95％，但是该繁殖方法没有经过脱分化过程、再分化得到再生苗(即没有愈伤组织的诱导及不定芽的获得)，再生体系的稳定行性差，繁殖系数低，不利于产业化生产，也无法用于分子育种研究。
发明内容
本发明的首要目的是针对上述现有技术存在的问题提供一种繁殖速度快、生根率高的瓜叶菊种子离体快速繁殖方法。该方法可以在短期内形成大量优良瓜叶菊试管苗，可进行规模化、工厂化生产，也可以用于分子育种研究。
为实现上述目的，本发明一方面提供一种瓜叶菊的快速繁殖方法，包括以下步骤：
1)以瓜叶菊种子作为外植体，接种于种子萌发培养基上萌生为无菌苗；
2)将去根无菌苗接种于丛生芽诱导培养基上诱导培养丛生芽；
3)将丛生芽切下后接种于壮苗培养基上进行壮苗培养；
4)将经过壮苗培养的芽苗的叶片、叶柄剪切后接种于愈伤组织诱导培养基上诱导生成愈伤组织；
5)将诱导的愈伤组织剪切后接种于愈伤组织增殖培养基上进行愈伤组织的增殖培养；
6)将增殖后的愈伤组织接种于不定芽分化培养基上进行不定芽的分化培养；
7)将不定芽接种于不定根生根培养基上诱导培养不定根；
8)炼苗移栽，即得。
其中，步骤1)中的种子萌发培养基是：MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，pH值为6.1。
步骤2)中丛生芽诱导培养基是：MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0.5-2.0mg/L+萘乙酸(NAA)0-0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1。丛生芽诱导培养基优选为：MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)2.0mg/L+萘乙酸(NAA)0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1。
步骤3)中壮苗培养基是：MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，pH值为6.1。
步骤4)中愈伤组织诱导培养基是：MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0.5-3.0mg/L+萘乙酸(NAA)0-3.0mg/L+2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)0-2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1。愈伤组织诱导培养基优选为：MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤0.5-3.0mg/L+萘乙酸(NAA)2.0-3.0mg/L+2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)0-1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1。愈伤组织诱导培养基进一步优选为：MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤2.0mg/L+萘乙酸(NAA)2.0mg/L+2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1。
步骤5)中愈伤组织增殖培养基是：MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤0.5-1.0mg/L+萘乙酸0.5-1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1。愈伤组织增殖培养基优选为：MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤1.0mg/L+萘乙酸1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1。
步骤6)中不定芽分化培养基是：MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0.5-3.0mg/L+萘乙酸(NAA)0-3.0mg/L+2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)0-2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1。不定芽分化培养基优选为：MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0.5-3.0mg/L+萘乙酸(NAA)2.0-3.0mg/L+2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)0-1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1。不定芽分化培养基进一步优选为：MS基本培养基+6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)2.0mg/L+萘乙酸(NAA)2.0mg/L+2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1。
步骤7)中不定根生根培养基是：大量元素减半的1/2MS基本培养基+萘乙酸(NAA)0.1-0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1；或大量元素减半的1/2MS基本培养基+3-吲哚丁酸(IBA)0.1-0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1。不定根生根培养基优选为：大量元素减半的1/2MS基本培养基+萘乙酸0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1；或大量元素减半的1/2MS基本培养基+3-吲哚丁酸(IBA)0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L，调节pH值为6.1。
特别是，步骤1)中接种之前先将瓜叶菊种子浸泡在质量百分比浓度为10％的过氧化氢溶液中消毒10-20分钟，然后用无菌水冲洗3-5次。
其中，步骤1)、步骤2)、步骤3)、步骤4)、步骤5)、步骤6)和步骤7)中的无菌苗培养、丛生芽诱导培养、壮苗培养、愈伤组织诱导培养、愈伤组织增殖培养、不定芽分化培养和不定根诱导培养在以下条件下进行：培养温度为25士1℃，光照强度为2000勒克斯(lux)，光照时间为10-16小时/天。
特别是，步骤2)中去根无菌苗在丛生芽诱导培养基中培养至诱导生成的丛生芽高度为1-2cm；
步骤3)中丛生芽在壮苗培养基中培养至植株高度达3-4cm，植株上的叶片、叶柄的长度为1-2cm；
步骤6)中愈伤组织在不定芽分化培养基中培养至不定芽长度达到1-1.5cm；
步骤7)中不定芽在不定根生根培养基中培养至不定根长度达到1-1.5cm。
其中，步骤8)中所述的炼苗移栽为：待生长健壮的无菌苗的不定根长至长约1-1.5cm时，打开培养瓶的封口膜，在组培室内炼苗2-3天，然后将生根的小苗取出，用自来水洗去根部残留的琼脂培养基，移栽于装有蛭石基质的容器内，保持基质和空气中的相对湿度为40-50％，一周以后进行常规培养，一个月后移栽至草炭与蛭石等体积的混合基质中培养，至植株生长健壮；最后定植在泥炭基质中。
本发明的瓜叶菊“小丑”的繁殖方法具有以下优点：
1、本发明利用瓜叶菊成熟种子进行离体快速繁殖，每个培养阶段所采用的基本培养基的都是MS基本培养基(除生根培养基外，生根培养的基本培养基是1/2MS)，具有无机盐浓度高，特别是硝酸盐、钾和铵的含量高，可以为组织生长提供所需矿质营养和促进愈伤组织生长，MS培养基的无机养分的数量和配比适当，不需额外添加氨基酸、酪蛋白水解物、酵母提取物及椰子汁等有机附加成分，节约了生产成本。
2、本发明的繁殖方法中瓜叶菊繁殖效率高，培养基中添加植物生长调节剂利于外植体的愈伤组织的诱导、增殖，不定芽的分化和生根，本发明中使用的瓜叶菊培养基中营养物质组成合理，用量和配比适宜，培育结果重复性高，再生体系稳定。
3、本发明方法培育的瓜叶菊苗生长健壮、繁殖系数高，诱导生根率高，达到79.17-100％，移栽成活率高(达到100％)，是工厂化大规模生产瓜叶菊幼苗的简便、快捷的技术体系。
附图说明
图1为瓜叶菊无菌苗；
图2为瓜叶菊丛生芽；
图3为瓜叶菊叶片诱导的愈伤组织；
图4为瓜叶菊叶片分化的不定芽；
图5为瓜叶菊不定根；
图6为第一次移栽的瓜叶菊穴盘苗；
图7为第二次移栽后的瓜叶菊小苗；
图8为瓜叶菊已开花的组培苗。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中数据采用Microsoft Excel和SPSS10.0软件进行方差分析与多重比较(邓肯式检验，P＝0.01)；百分数经反正弦(y＝arcsin x^1/2)转换后再进行分析和比较，邓肯式显著性检验结果存在显著差异。
实施例1
一、试验材料
1、成熟瓜叶菊‘小丑’种子来自于美国Gold Smith公司。
本发明实施例所用瓜叶菊‘小丑’5个花色品种分别为：蓝色、白色、粉色、猩红色及黄色。
2、植物生长调节剂
本发明中所使用的植物生长调节物质采用国产吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)。
3、培养基的配制：
(1)“MS基本培养基”的组成或配制方法；
表1MS培养基(Murashige and Skoog，1962)