可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束及其制备方法和用途 技术领域 本发明涉及由聚乙二醇链段、 聚己内酯链段和聚丙烯酸链段组成的可降解的双亲 性三嵌段共聚物及其自组装形成的可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束， 以及可降解的双亲 性三嵌段共聚物的制备方法和可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束的制备方法。 本发明还涉 及将该可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束作为药物的载体， 通过疏水作用和配位络合作用 负载抗肿瘤药物得到抗肿瘤纳米粒子， 并且将该抗肿瘤纳米粒子用作抗肿瘤剂。
背景技术 癌症是目前严重威胁人类健康和安全的疾病。 受到不良生活习惯和环境污染的影 响， 癌症的发病率和死亡率不断上升， 成为人类第二大疾病死因。 癌症的治疗方法主要包括 手术治疗、 放疗及化疗等。 其中手术治疗对人体创伤大、 风险高， 不能清除散在的癌细胞， 而 且复发性强， 还可能导致肿瘤细胞因手术刺激而扩散转移 ； 放疗和传统的化疗不具选择性 和靶向性， 很难在肿瘤局部形成有效药物浓度或治疗剂量， 效果差， 毒性大， 单纯提高药物 或放射剂量又受到全身毒性反应的限制。因此， 新型的癌症治疗方法亟待发展。
以聚合物参与的新型化疗方法， 称为聚合物疗法 (PolymerTherapeutics)。其中， 聚合物作为大分子前药 (prodrug， 指其在进入体内后经过相关反应释放出药物的物质 )、 药物或蛋白的载体， 其尺寸为 5-100 纳米。聚合物疗法目前成功用于临床治疗的有聚合物 负载蛋白体系， 聚合物负载抗肿瘤药物体系的临床实验也进展顺利。聚合物疗法的优势 在于， 聚合物作为前药或载体的尺寸远大于小分子抗肿瘤药物， 在细胞由于快速增殖而排 列疏松的肿瘤组织血管中， 大分子可以通过渗透作用进入肿瘤组织， 而肿瘤部位淋巴循环 功能弱， 因此大分子不易代谢排出而富集在肿瘤部位。这种通过大分子体积实现被动靶 向行为的作用， 称为 EPR 效应 (the enhancedpermeability and retention effect)。此 外， 还可以通过在聚合物上接入特异性靶向基团实现主动靶向， 提高药物的靶向性， 就可使 肿瘤局部达到有效药物浓度或治疗剂量， 而将药物对身体其他部位的毒性降至最小化 (1 ： K.L.Kiick， Science， Vol.317， 1182-1183(2007) ； 2： R.Duncan， Nat.Rev.DrugDiscovery， Vol.2， 347-360(2003) ； 3： H.Maeda 等 Adv PolymSci， Vol.193， 103-121(2005))。
双亲性嵌段共聚物可在水溶液中自组装为核 - 壳结构的纳米粒子， 在聚合物疗 法中可作为药物载体。这种纳米粒子的壳通常为亲水性嵌段， 在体内循环过程中可以有 效防止蛋白吸附和细胞黏附， 提高在血液中的循环时间， 以便将更多有效药物运输至肿 瘤部位而不被过早代谢排出体外， 并可大幅度降低小分子药物代谢造成的肾脏毒性和小 分子药物无靶向性而对其他脏器产生的毒性。纳米粒子核通常为疏水性嵌段， 可以通过 疏水作用包裹负载疏水性抗肿瘤药物， 如使用嵌段聚合物胶束负载疏水性抗肿瘤药物阿 霉素或紫杉醇 ； 还可以通过对嵌段的官能化达到对药物可控释放的目的， 如利用两嵌段 聚合物聚乙二醇 - 嵌段 - 聚氨基酸的羧酸根基团实现对顺铂或二氨基环己烷合铂的负 载 和 缓 释 (1 ： G.S.Kwon 等 Drug Development Research， Vol.67， 15-22(2006) ； 2： G.-H. Hsiue 等 Advanced Functional Materials， Vol.17， 2291-2297(2007) ； 3： Y.Y.Yang
等 Biomaterials， Vol.28， 1730-1740(2007) ； 4： Y.Matsumura， K.Kataoka 等 British Journal of Cancer， Vol.93， 678-687(2005) ； 5： H.Cabral， K.Kataoka 等 Journal of ControlledRelease， Vol.121， 146-155(2007))。
由于单药化疗常导致肿瘤细胞对药物的耐受性增加， 因此聚合物疗法的发展应从 单一功能向多功能方向转化。这就要求作为载体的聚合物具有多官能化特征， 并可通过不 同的负载方式分别负载相同或不同的抗肿瘤药物。 聚合物载体本身的生物相容性和在释药 之后的可代谢排出性， 也是对于实用型载体的基本要求。 发明内容
本发明的目的之一是针对现有聚合物载体载药功能单一的不足， 提供一种可降解 的双亲性三嵌段共聚物通过水溶液自组装得到可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束。
本发明的目的之二是提供可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束的制备方法。
本发明的目的之三是提供一种由聚乙二醇链段、 聚己内酯链段和聚丙烯酸链段组 成的多功能的可降解的双亲性三嵌段共聚物的制备方法。
本发明的目的之四是提供由聚乙二醇链段、 聚己内酯链段和聚丙烯酸链段组成的 可降解的双亲性三嵌段共聚物通过水溶液自组装得到的可降解的双亲性三嵌段共聚物胶 束的用途， 将该可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束作为药物的载体使用， 通过疏水作用和 配位络合作用在载体上负载抗肿瘤药物得到抗肿瘤纳米粒子， 该抗肿瘤纳米粒子可用作抗 肿瘤剂。 本发明的可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束是由聚乙二醇链段、 聚己内酯链段和 聚丙烯酸链段组成的多功能的可降解的双亲性三嵌段共聚物在水溶液中自组装后得到的， 该可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束为核壳结构， 其平均粒径为 20-200 纳米 ； 其中 ： 胶束 的外壳为聚乙二醇， 内核为聚己内酯， 聚丙烯酸位于内核外表面。
所述的可降解的双亲性三嵌段共聚物是由聚乙二醇链段、 聚己内酯链段和聚丙烯 酸链段组成， 其具有以下结构式 (A) ：
上式中， R1 来源于聚乙二醇链段的末端结构， R1 是氢原子、 羧基、 氨基、 氰基、 巯基、 甲酰基、 醛基、 或者是直链或支链的 C1-12 烷基中的一种 ； L 为连接基， 该连接基来源于卤代羧 酸、 卤代酰氯或卤代酰溴中的一种与聚乙二醇 - 嵌段 - 聚己内酯两嵌段共聚物反应后的残 基， 所述残基优选为 -CO-C(CH3)2-、 -CO-CH(CH3)-、 -CO-C6H4-CH2- 或 -CO-CH(CN)- ； R2 为卤素， 该卤素为卤代羧酸、 卤代酰氯或卤代酰溴中的一种与聚乙二醇 - 嵌段 - 聚己内酯两嵌段共 聚物反应后所得 ； m 为 45-120 的整数， n 为 5-60 的整数， y 为 10-100 的整数 ； x 为水解率， 水解率为 30％ -100％， 优选为 70％ -100％， 更优选为 100％。
所述的卤素为 Cl、 Br 或 I。
所述的 C1-12 烷基是甲基、 乙基、 正丙基、 异丙基、 正丁基、 仲丁基、 叔丁基、 正戊基、 正己基、 癸基或十一烷基等。
当水解率 x 为 100 ％时， 聚丙烯酸链段水解完全， 侧链完全为羧基 ； 当 30 ％≤ x ＜ 100％时， 聚丙烯酸链段水解不完全， 侧链的羧基与叔丁酯基无规排列。
本发明的可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束可通过如下方法制备得到 ： 将可降解 的双亲性三嵌段共聚物溶解于有机溶剂 ( 有机溶剂的量以完全溶解可降解的双亲性三嵌 段共聚物为宜， 优选可降解的双亲性三嵌段共聚物在有机溶剂中质量浓度为 1-20g/L) 中， 得到含有可降解的双亲性三嵌段共聚物的溶液， 将含有可降解的双亲性三嵌段共聚物的溶 液滴入水中， 或将水滴入含有可降解的双亲性三嵌段共聚物的溶液中， 其中， 水与有机溶剂 的体积比值大于 1， 优选水与有机溶剂 1 ＜体积比值≤ 100， 更优选水与有机溶剂的体积比 值为 10-100 ； 然后通过超滤法或透析法除去有机溶剂， 得到可降解的双亲性三嵌段共聚物 胶束。 其中， 有机溶剂优选对于可降解的双亲性三嵌段共聚物溶解性好的有机溶剂， 例如选 自四氢呋喃、 丙酮、 二甲基甲酰胺等所组成的组中的至少一种。 所形成的可降解的双亲性三 嵌段共聚物胶束通常分散性好， 其平均粒径为 20-200 纳米。 本发明的可降解的双亲性三嵌段共聚物可通过如下方法制备 ：
(1) 将一端为 R1， 另一端为羟基的聚乙二醇 (PEG) 与己内酯 (CL) 单体以摩尔比 为 1 ∶ 5-200 的比例混合， 然后将混合物作为反应物溶于干燥的甲苯中 ( 甲苯的量以完全 溶解反应物为宜， 优选反应物在甲苯中的质量浓度为 50-200g/L)， 加入催化剂量的 1， 5， 7-triazabicyclo-[4.4.0]dec-5-ene(TBD)， 在室温下反应， 反应时间根据所需聚合度控制 ( 一般为 1-200 小时 ) ； 或
将混合物作为反应物， 在反应物中加入催化剂辛酸亚锡， 其中， 辛酸亚锡的加入量 为 PEG 与辛酸亚锡的摩尔比值为 10-30 ； 在反应温度为 100-150℃下反应 ( 优选反应温度为 120℃ )， 反应时间根据所需聚合度控制 ( 一般为 1-200 小时 ) ；
反应得到的产物在沉淀剂 ( 沉淀剂选自乙醚、 正己烷、 石油醚中的一种 ) 中沉淀并 干燥得到聚乙二醇 - 嵌段 - 聚己内酯两嵌段共聚物 (PEGm-PCLn-OH， m 为 45-120 的整数， n 为 5-60 的整数 )， 其中聚乙二醇链段的端基为 R1(R1 的限定与前述相同 )， 聚己内酯链段的 端基为羟基 ；
(2) 将步骤 (1) 得到的聚乙二醇链段的端基为 R1， 聚己内酯链段的端基为羟基的 聚乙二醇 - 嵌段 - 聚己内酯两嵌段共聚物与卤代物以摩尔比为 1 ∶ 1-10 混合， 然后将混合 物作为反应物溶于干燥的二氯甲烷中 ( 二氯甲烷的量以完全溶解反应物为宜， 优选反应物 在二氯甲烷中的质量浓度为 50-200g/L)， 加入干燥的三乙胺 (TEA) 作为催化剂， 其中， 三乙 胺与卤代物的摩尔比值为 1， 在室温下反应 2-48 小时， 过滤除去反应生成的盐后在沉淀剂 ( 沉淀剂选自乙醚、 正己烷、 石油醚中的一种 ) 中沉淀并干燥得到聚乙二醇 - 嵌段 - 聚己内 酯两嵌段共聚物引发剂 (PEGm-PCLn-X， m 为 45-120 的整数， n 为 5-60 的整数 )， 其中聚乙二 醇链段的端基为 R1(R1 的限定与前述相同 )， 聚己内酯链段的端基为卤素 (X)， 卤素为 Cl、 Br 或I；
所述的卤代物选自 α- 卤代异丁酸、 α- 卤代异丁酰氯、 α- 卤代异丁酰溴、 α- 卤 代异丙酸、 α- 卤代异丙酰氯、 α- 卤代异丙酰溴、 卤化甲基苯甲酸、 卤化甲基苯甲酰氯、 卤
化甲基苯甲酰溴、 α- 卤化氰基乙酸、 α- 卤化氰基乙酰氯、 α- 卤化氰基乙酰溴中的一种 ；
(3) 将步骤 (2) 得到的聚乙二醇链段的端基为 R1， 聚己内酯链段的端基为卤素的 聚乙二醇 - 嵌段 - 聚己内酯两嵌段共聚物引发剂与丙烯酸叔丁酯 (tBA) 单体以摩尔比为 1 ∶ 10-300 的比例混合， 然后将混合物作为反应物溶于干燥的苯甲醚或丙酮中 ( 苯甲醚或 丙酮的量以完全溶解反应物为宜， 优选反应物在苯甲醚或丙酮中的质量浓度为 50-2000g/ L)， 加入溴化亚酮 (CuBr) 和五甲基二亚乙基三胺 (PMDETA)， 其中聚乙二醇 - 嵌段 - 聚己内 酯两嵌段共聚物引发剂∶ CuBr ∶ PMDETA 的摩尔比为 2 ∶ 1 ∶ 1， 在室温至 120℃之间的任 意一个恒定温度， 且在无氧条件下反应 ； 反应时间根据所需聚合度控制 ( 一般为 1-200 小 时)； 反应得到的产物加入二氯甲烷溶剂稀释 ( 二氯甲烷以稀释产物为目的， 加入的量无 特殊限制， 优选产物在二氯甲烷中的质量浓度为 2-3g/L) 并过碱性氧化铝柱后旋蒸除去溶 剂二氯甲烷， 在沉淀剂 ( 沉淀剂选自乙醚、 正己烷、 石油醚中的一种 ) 中沉淀并干燥得到聚 乙二醇 - 嵌段 - 聚己内酯 - 嵌段 - 聚丙烯酸叔丁酯三嵌段共聚物 (PEGm-PCLn-PtBAy， m为 45-120 的整数， n 为 5-60 的整数， y 为 10-100 的整数 )， 其中聚乙二醇链段的端基为 R1(R1 的限定与前述相同 )， 聚丙烯酸叔丁酯链段的端基为卤素， 卤素为 Cl、 Br 或 I ；
(4) 将步骤 (3) 得到的聚乙二醇 - 嵌段 - 聚己内酯 - 嵌段 - 聚丙烯酸叔丁酯三 嵌段共聚物溶于二氯甲烷中 ( 二氯甲烷的量以完全溶解聚乙二醇 - 嵌段 - 聚己内酯 - 嵌 段 - 聚丙烯酸叔丁酯三嵌段共聚物为宜， 优选聚乙二醇 - 嵌段 - 聚己内酯 - 嵌段 - 聚丙烯 酸叔丁酯三嵌段共聚物在二氯甲烷中的质量浓度为 10-200g/L)， 加入三氟乙酸 (TFA) 作 为催化剂， 其中 TFA 与聚乙二醇 - 嵌段 - 聚己内酯 - 嵌段 - 聚丙烯酸叔丁酯三嵌段共聚 物中的聚丙烯酸叔丁酯的叔丁基的摩尔比值为 3-10， 在室温下反应 10-200 小时， 将反应 后所得产物在沉淀剂 ( 沉淀剂选自乙醚、 正己烷、 石油醚中的一种 ) 中沉淀并干燥得到上 述式 (A) 的可降解的双亲性三嵌段共聚物聚乙二醇 - 嵌段 - 聚己内酯 - 嵌段 - 聚丙烯酸 【PEGm-PCLn-P(AAx-tBA1-x)y】 。其中， m 为 45-120 的整数， n 为 5-60 的整数， y 为 10-100 的整 数， x 代表水解率， 当 x 为 100％时， 聚丙烯酸链段水解完全， 侧链完全为羧基 ； 当 30％≤ x ＜ 100％时， 聚丙烯酸链段水解不完全， 侧链的羧基与叔丁酯基无规排列。聚乙二醇链段的 端基为 R1(R1 的限定与前述相同 )， 聚丙烯酸链段的端基为卤素， 卤素为 Cl、 Br 或 I。
所述的可降解的双亲性三嵌段共聚物三个链段之间可以采用任意的连接方式， 并 且只要出于本发明的目的， 则可以以任何连接基结合。对制造方法没有特别限定。除上述 方法外， 先分别合成三个链段， 再通过端基反应共价连接三个链段的方法， 也能制备出本发 明所述的可降解的双亲性三嵌段共聚物， 其结果与上述方法制备的物质具有基本相同的结 构， 区别可能在于连接基为反应性基团共价连接后的结构。
本发明所述的可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束可作为药物载体使用。
所述的作为药物载体是通过可降解的双亲性三嵌段共聚物的疏水性生物可降解 的聚己内酯链段的疏水作用负载疏水性抗肿瘤药物， 再通过聚丙烯酸链段的羧酸根与顺式 铂 (II) 类抗肿瘤药物中的铂的配位络合作用负载顺式铂 (II)(II 代表二价的铂 ) 类抗肿 瘤药物形成抗肿瘤纳米粒子。该抗肿瘤纳米粒子为核壳结构， 其平均粒径为 20-200 纳米 ； 其中 ： 抗肿瘤纳米粒子的外壳为聚乙二醇 ； 内核为通过疏水作用负载了疏水性抗肿瘤药物 的聚己内酯 ； 通过配位络合作用负载了顺式铂 (II) 类抗肿瘤药物的聚丙烯酸位于内核外 表面。本发明还可先通过聚丙烯酸链段的羧酸根与顺式铂 (II) 类抗肿瘤药物中的铂的 配位络合作用负载顺式铂 (II) 类抗肿瘤药物形成抗肿瘤纳米粒子， 再通过可降解的双亲 性三嵌段共聚物的疏水性生物可降解的聚己内酯链段的疏水作用负载疏水性抗肿瘤药物 形成抗肿瘤纳米粒子。
所述的抗肿瘤纳米粒子所负载的疏水性抗肿瘤药物的质量占抗肿瘤纳米粒子质 量的 1％ -50％； 所述的抗肿瘤纳米粒子所负载的顺式铂 (II) 类抗肿瘤药物的铂 (Pt) 相对 于可降解的双亲性三嵌段共聚物的羧酸根的摩尔比 (Pt/COO-) 值为 0.05-1， 优选为 0.3-1。
所述的聚己内酯链段的疏水作用负载疏水性抗肿瘤药物的制备过程， 是将可降解 的双亲性三嵌段共聚物和疏水性抗肿瘤药物同时溶解于有机溶剂 ( 可降解的双亲性三嵌 段共聚物与疏水性抗肿瘤药物的投料比无特定限制， 优选可降解的双亲性三嵌段共聚物与 疏水性抗肿瘤药物的投料质量比值为 1-10， 有机溶剂的量以完全溶解可降解的双亲性三 嵌段共聚物和疏水性抗肿瘤药物为宜， 优选可降解的双亲性三嵌段共聚物和疏水性抗肿瘤 药物在有机溶剂中的总质量浓度为 1-20g/L) 中， 得到含有可降解的双亲性三嵌段共聚物 和疏水性抗肿瘤药物的混合溶液， 将含有可降解的双亲性三嵌段共聚物和疏水性抗肿瘤药 物的混合溶液滴入水中， 或将水滴入含有可降解的双亲性三嵌段共聚物和疏水性抗肿瘤药 物的混合溶液中， 其中， 水与有机溶剂的体积比值大于 1， 优选水与有机溶剂 1 ＜体积比值 ≤ 100， 更优选水与有机溶剂的体积比值为 10-100 ； 然后通过超滤法或透析法除去有机溶 剂和未负载的疏水性抗肿瘤药物， 得到负载有疏水性抗肿瘤药物的抗肿瘤纳米粒子的中间 产物 ； 其中， 有机溶剂优选对于可降解的双亲性三嵌段共聚物和疏水性抗肿瘤药物溶解性 好的有机溶剂， 例如选自四氢呋喃、 丙酮、 二甲基甲酰胺等所组成的组中的至少一种。
所述的通过聚丙烯酸链段的羧酸根与顺式铂 (II) 类抗肿瘤药物中的铂的配位络 合作用负载顺式铂 (II) 类抗肿瘤药物的制备过程， 是将上述负载有疏水性抗肿瘤药物的 抗肿瘤纳米粒子的中间产物与顺式铂 (II) 类抗肿瘤药物作为反应物置于水中， 其中 ： 顺式 铂 (II) 类抗肿瘤药物中的铂相对于聚丙烯酸链段的羧酸根的投料摩尔比值为 0.1-2 ； 水的 量以溶解反应物为宜， 优选反应物的质量浓度为 1-20g/L， 在 20-50℃之间的任意一个恒定 温度下反应 24-96 小时， 然后通过超滤法或透析法除去未负载的顺式铂 (II) 类抗肿瘤药 物， 得到抗肿瘤纳米粒子。
所述的顺式铂 (II) 类抗肿瘤药物可以在水中与硝酸银室温避光反应 (Pt 与硝酸 银的投料摩尔比为 1) 至少 12 小时后， 过滤除去氯化银， 得到水合顺式铂 (II) 供给上述配 位络合反应。
所述的疏水性抗肿瘤药物， 只要出于本发明的目的， 可以选自任何疏水性抗肿瘤 药物， 优选在实验室及临床实验中证明具有良好抗肿瘤效果的疏水性抗肿瘤药物， 例如可 选自阿霉素、 表阿霉素、 柔红霉素、 紫杉醇、 喜树碱、 10- 羟基喜树碱、 5- 氨基喜树碱、 长春 碱、 长春新碱、 依托泊苷、 顺铂、 卡铂、 奥沙利铂等所组成的组中的至少一种。
所述的顺式铂 (II) 类抗肿瘤药物为铂类化合物， 选自顺铂、 卡铂、 环铂、 庚铂、 得 那铂、 环戊胺铂、 铂蓝、 环丙胺铂、 乙二胺丙二酸铂、 僧尼铂、 恩洛铂、 环硫铂、 顺螺铂、 右奥马 铂、 异丙铂、 洛铂、 米铂、 皮卡铂、 奈达铂、 奥马铂、 奥沙利铂、 司铂、 螺铂、 舒铂、 双环铂、 依铂、 甲啶铂、 西茜铂、 匹克铂、 折尼铂等所组成的组中的至少一种。
R1 来源于聚乙二醇链段的末端结构， 当 R1 为羧基、 氨基、 氰基、 巯基、 甲酰基或醛基基团时可如下利用 ： 例如在形成本发明所述的抗肿瘤纳米粒子后， 根据需要， 将上述基团与 适当的抗体或具有特异结合性的片段 ( 例如糖基、 叶酸、 cRGD) 共价结合， 从而使抗肿瘤纳 米粒子对肿瘤组织具有主动靶向性。
本发明所述的抗肿瘤纳米粒子中聚乙二醇链段作为外壳是亲水性链段， 作用是稳 定抗肿瘤纳米粒子并防止在将其用于体内时的蛋白吸附和细胞黏附， 同时增加抗肿瘤纳米 粒子在体内的循环时间。聚乙二醇是对患者 ( 哺乳动物， 特别是人 ) 无毒副作用的聚合物， 可代谢排出体外， 被广泛用于聚合物疗法中的聚合物载体或前药中。聚己内酯链段作为疏 水性链段， 具有双重功能 ： 第一， 抗肿瘤纳米粒子需要聚己内酯链段通过疏水作用负载疏水 性抗肿瘤药物， 药物进入患者体内后先通过扩散机理释放， 当聚己内酯链段在酶的作用下 降解后， 药物随抗肿瘤纳米粒子的解体而完全释放 ； 第二， 抗肿瘤纳米粒子体积较大， 不利 于代谢排出， 聚己内酯链段在患者 ( 哺乳动物， 特别是人 ) 的生理条件下可以降解断裂， 有 助于抗肿瘤纳米粒子的解体， 使其容易通过代谢排出体外。 聚丙烯酸链段具有亲水性， 在碱 性水溶液中溶解性较好， 但在中性水溶液中溶解性较差， 因此处在抗肿瘤纳米粒子核的外 表面。聚丙烯酸链段的羧酸根与顺式铂 (II) 类抗肿瘤药物形成配位络合物将顺式铂 (II) 类抗肿瘤药物负载于抗肿瘤纳米粒子中。顺式铂 (II) 的 2 个氯基中至少有 1 个被可降解 的双亲性三嵌段共聚物中聚丙烯酸链段侧链上的羧酸根取代， 剩下的氯基被水合 ( 指水分 子通过其氧原子的孤对电子对配位于铂的状态 )。 当 2 个上述氯基被 2 个羧酸根取代时， 这 2 个羧酸根可来源于单一的可降解的双亲性三嵌段共聚物分子的相邻或隔开一定间隔的羧 酸根， 或者来源于多个可降解的双亲性三嵌段共聚物分子， 并没有特殊限定。 只要出于本发明的目的， 抗肿瘤纳米粒子中聚丙烯酸链段所含有的羧酸根还可用 于通过配位络合作用负载其它与肿瘤治疗相关的药物或辅助药物， 并无特殊限定， 例如可 90 60 67 举出用于体内放射治疗肿瘤的放射性同位素 Y、 Co、 Cu， 用于体内磁共振成像 (MRI) 的 Gd(III) 和用于动态增强 MR 成像的超顺磁性氧化铁粒子 (SPIO)。
本发明所述抗肿瘤纳米粒子通过疏水作用和配位络合作用负载相同或不同种类 抗肿瘤药物的两种负载方式在制备时的先后顺序无特定限制。 优选首先通过疏水作用负载 疏水性抗肿瘤药物并形成纳米粒子后， 再通过配位络合反应负载顺式铂 (II) 类抗肿瘤药 物。
上述制备的含有抗肿瘤纳米粒子的溶液可以直接原样进行灭菌处理， 根据需要添 加作为注射剂适合的其本身已知的辅助剂制成注射剂 ； 或者将含有抗肿瘤纳米粒子的溶液 浓缩后， 例如进行冷冻干燥， 制成固体状的微小粉末， 该微小粉末能够再次溶解在可注射溶 液中， 并能够与制药学上可接受的、 制成一定形状的载体相混合， 加工成为适于各种给药形 式的剂型。这类载体的代表例可为去离子水、 缓冲为一定 pH 值的水溶液、 单糖或低聚糖、 糖 醇等， 但是， 优选作为适于非口服给药、 特别是静脉内或皮下给药的剂型的组合物提供。
本发明的抗肿瘤纳米粒子负载的抗肿瘤药物， 只要是在共同负载时不产生对药效 有不良影响的物质， 则可以是任何抗肿瘤药物组合。
本发明的抗肿瘤纳米粒子可与其它抗肿瘤剂联合使用。 这些抗肿瘤剂只要是在联 合使用时不产生不良影响的物质， 则可以是任何药剂， 如阿糖胞苷、 5-FU、 阿霉素、 紫杉醇、 喜树碱、 顺铂等。这些联合药物可以是在同时或在不同时间， 将联合的 2 种以上的药剂经由 相同或不同给药途径进行给药。
附图说明
图 1 为本发明实施例 1 中所述的可降解的双亲性三嵌段共聚物 A 的核磁谱图。 图 2 为本发明实施例 2 中所述的可降解的双亲性三嵌段共聚物 B 的核磁谱图。 图 3 为本发明实施例 3 中所述的可降解的双亲性三嵌段共聚物 C 的核磁谱图。 图 4 为本发明实施例 4 中所述的可降解的双亲性三嵌段共聚物 D 的核磁谱图。 图 5 为本发明实施例 5 中所述的可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束的结构示意图。 图 6 为本发明实施例 5 中所述的动态光散射给出的可降解的双亲性三嵌段共聚物 胶束的半径分布曲线。图 6(A) 为可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束 A 的半径分布曲线 ； 图 6(B) 为可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束 B 的半径分布曲线 ； 图 6(C) 为可降解的双亲性 三嵌段共聚物胶束 C 的半径分布曲线 ； 图 6(D) 为可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束 D 的半 径分布曲线。
图 7 为本发明实施例 6 中所述的抗肿瘤纳米粒子的结构示意图。
图 8 为本发明实施例 6 中所述的动态光散射给出的抗肿瘤纳米粒子的半径分布曲 线。图 8(A) 为抗肿瘤纳米粒子 A 的半径分布曲线 ； 图 8(B) 为抗肿瘤纳米粒子 B 的半径分 布曲线 ； 图 8(C) 为抗肿瘤纳米粒子 C 的半径分布曲线 ； 图 8(D) 为抗肿瘤纳米粒子 D 的半径 分布曲线。
图 9 为本发明实施例 7 中所述的抗肿瘤纳米粒子 A 在含有 160mM NaCl 的 10mM PBS(pH7.4) 缓冲溶液中的抗肿瘤药物释放曲线。图 9(A) 为阿霉素释放曲线， 图 9(B) 为顺 铂释放曲线。
图 10 为本发明实施例 8 中所述的可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束 A 在脂肪酶 Lipase PS 存在的水溶液中降解行为的图。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明进行具体说明， 但本发明不受这些具体实施例的限 定。
实施例 1 ： 可降解的双亲性三嵌段共聚物 A 的合成
本实施例中所合成可降解的双亲性三嵌段共聚物 A 的结构式如下所示 ：
(1.a.) 将 10.0g 聚乙二醇 (PEG， 一端为甲氧基， 一端为羟基， 数均分子量为 5000， 2mmol) 与 9.1g 己内酯 (CL， 分子量为 114， 80mmol) 溶于 125mL 干燥的甲苯中， 加入 30mg TBD(1， 5， 7-triazabicyclo-[4.4.0]dec-5-ene) 为催化剂， 在室温条件下反应 22 小时， 在 400mL 乙醚中沉淀并在真空条件下干燥得到白色粉末状产物 (PEG114-PCL28-OH， 数均分子量 为 8200)15.9g， 产率为 83％， CL 的单体转化率为 70％。
(1.b.) 将 14.8g 上述 (1.a.) 产物 ( 数均分子量为 8200， 1.8mmol) 与 1.2g 溴代异 丁酰溴 ( 分子量为 230， 5.4mmol) 溶于 100mL 干燥的二氯甲烷中， 以 0.75mL 干燥的三乙胺 (TEA， 分子量为 101， 5.4mmol) 为催化剂， 在室温下反应 48 小时， 过滤除去反应生成的盐后 在 400mL 乙醚中沉淀并在真空条件下干燥得到白色粉末状产物 (PEG114-PCL28-Br， 数均分子 量为 8300)14.1g， 产率为 93％。
(1.c.) 将 0.2g 上述 (1.b.) 产物 ( 数均分子量为 8300， 0.024mmol)、 0.4g 丙烯 酸叔丁酯 (tBA， 分子量为 128， 3.1mmol)、 1.7mg CuBr( 分子量为 143， 0.012mmol)、 2.5μL PMDETA( 分子量为 173， 0.012mmol) 溶于 0.5mL 苯甲醚中， 在 120 ℃无氧条件下反应 46 小 时， 加入 300mL 二氯甲烷稀释并过碱性氧化铝柱后旋蒸除去溶剂二氯甲烷， 在 400mL 乙 醚中沉淀并在真空条件下干燥得到白色固体产物 (PEG114-PCL28-PtBA25， 数均分子量为 11500)0.23g， 产率为 33％， tBA 的单体转化率为 19％。
(1.d.) 将 0.23g 上述 (1.c.) 产物 ( 数均分子量为 11500， 0.02mmol， 其中， 叔丁基 为 0.5mmol) 与 0.57g 三氟乙酸 (TFA， 分子量为 114， 5mmol) 溶于 5mL 二氯甲烷中， 在室温 下反应 120 小时， 在 400mL 乙醚中沉淀并在真空条件下干燥得到白色固体产物 0.2g， 即为 所述可降解的双亲性三嵌段共聚物 A(PEG114-PCL28-PAA25， 数均分子量为 10100)， 水解率为 1 100％， 产率为 100％。 图 1 为可降解的双亲性三嵌段共聚物 A 的核磁谱图。 H NMR(400MHz， DMSO-d6)δ1.30(m， 56H， -CH2CH2CH2- 来源于聚己内酯 )， 1.55(m， 162H， -CH2CH2CH2- 来源于 聚己内酯， -CH2CH(COO-)- 来源于聚丙烯酸 )， 2.27(m， 81H， -CH2C( ＝ O)O- 来源于聚己内 酯， -CH2CH(COO-)- 来源于聚丙烯酸 )， 3.51(s， 456H， -OCH2CH2O- 来源于聚乙二醇 )， 3.98(t， 56H， -C( ＝ O)OCH2- 来源于聚己内酯 )， 12.25.(s， 25H， -CH2CH(COOH)- 来源于聚丙烯酸 )。
实施例 2 ： 可降解的双亲性三嵌段共聚物 B 的合成
本实施例中所合成可降解的双亲性三嵌段共聚物 B 的结构式如下所示 ：
(2.a.) 将 10.0g PEG( 一端为甲氧基， 一端为羟基数均分子量为 2000， 5mmol)、 11.4g CL(100mmol) 和 69mg 辛酸亚锡 ( 分子量为 405， 0.17mmol) 为催化剂， 在 120 ℃无 氧条件下反应 24 小时， 在 400mL 石油醚中沉淀并在真空条件下干燥得到白色粉末状产物 (PEG45-PCL8-OH， 数均分子量为 2900)16.3g， 产率为 76％， CL 的单体转化率为 40％。
(2.b.) 将 8.7g 上述 (2.a.) 产物 ( 数均分子量为 2900， 3mmol) 与 1.4g 溴代异丁 酰溴 (6mmol) 溶于 100mL 干燥二氯甲烷中， 以 0.9mL 干燥的 TEA(6mmol) 为催化剂， 在室温 下反应 2 小时， 过滤除去反应生成的盐后在 400mL 石油醚中沉淀并在真空条件下干燥得到 白色粉末状产物 (PEG45-PCL8-Br， 数均分子量为 3100)8.1g， 产率为 93％。
(2.c.) 将 0.17g 上 述 (2.b.) 产 物 ( 数 均 分 子 量 为 3100， 0.06mmol)、 0.77g tBA(6mmol)、 4.3mg CuBr(0.03mmol)、 6.2μL PMDETA(0.03mmol) 溶于 3mL 丙酮中， 在 60℃
无氧条件下反应 80 小时， 加入 400mL 二氯甲烷稀释并过碱性氧化铝柱后旋蒸除去溶剂二氯 甲烷， 在 400mL 石油醚中沉淀并在真空条件下干燥得到白色固体产物 (PEG45-PCL8-PtBA30， 数均分子量为 6900)0.4g， 产率为 43％， tBA 的单体转化率为 30％。
(2.d.) 将 0.4g 上述 (2.c.) 产物 ( 数均分子量为 6900， 0.06mmol， 其中， 叔丁基 为 1.8mmol) 与 1.2gTFA(10.2mmol) 溶于 8mL 二氯甲烷中， 在室温下反应 96 小时， 在 400mL 石油醚中沉淀并在真空条件下干燥得到白色固体产物 【PEG45-PCL8-P(AA83 ％ -tBA17 ％ )30， 数均分子量为 5500】 0.3g， 即为所述可降解的双亲性三嵌段共聚物 B。水解率为 83 ％， 产 率 为 93 ％。 图 2 为 可 降 解 的 双 亲 性 三 嵌 段 共 聚 物 B 的 核 磁 谱 图。1H NMR(400MHz， DMSO-d6)δ1.29(m， 16H， -CH2CH2CH2- 来源于聚己内酯 )， 1.37(s， 45H， -OC4H9 来源于聚丙烯 酸 )， 1.49-1.56(m， 92H， -CH2CH2CH2- 来源于聚己内酯， -CH2CH(COO-)- 来源于聚丙烯酸 )， 2.27(m， 46H， -CH2C( ＝ O)O- 来源于聚己内酯， -CH2CH(COO-)- 来源于聚丙烯酸 )， 3.51(s， 180H， -OCH2CH2O- 来源于聚乙二醇 )， 3.98(t， 16H， -C( ＝ O)OCH2- 来源于聚己内酯 )， 12.24. (s， 25H， -CH2CH(COOH)- 来源于聚丙烯酸 )。
实施例 3 ： 可降解的双亲性三嵌段共聚物 C 的合成
本实施例中所合成可降解的双亲性三嵌段共聚物 C 的结构式如下所示 ：
(3.a.) 将 10.0g PEG( 一端为甲氧基， 一端为羟基， 数均分子量为 5000， 2mmol) 与 9.1g CL(80mmol) 溶于 125mL 干燥的甲苯中， 以 30mgTBD 为催化剂， 在室温下反应 22 小时， 在 400mL 正己烷中沉淀并在真空条件下干燥得到白色粉末状产物 (PEG114-PCL28-OH， 数均分 子量为 8200)15.9g， 产率为 83％， CL 的单体转化率为 70％。
(3.b.) 将 14.8g 上述 (3.a.) 产物 ( 数均分子量为 8200， 1.8mmol) 与 1.2g 溴代异 丁酰溴 (5.4mmol) 溶于 100mL 干燥二氯甲烷中， 以 0.75mL 干燥的 TEA(5.4mmol) 为催化剂， 在室温下反应 28 小时， 过滤除去反应生成的盐后在 400mL 正己烷中沉淀并在真空条件下干 燥得到白色粉末状产物 (PEG114-PCL28-Br， 数均分子量为 8300)14.1g， 产率为 93％。
(3.c.) 将 0.4g 上 述 (3.b.) 产 物 ( 数 均 分 子 量 为 8300， 0.05mmol)、 0.3gtBA(2.5mmol)、 3.6mg CuBr(0.025mmol)、 5.2μL PMDETA(0.025mmol) 溶 于 0.5mL 苯 甲醚中， 在 120℃无氧条件下反应 48 小时， 加入 350mL 二氯甲烷稀释并过碱性氧化铝柱后 旋蒸除去溶剂二氯甲烷， 在 400mL 正己烷中沉淀并在真空条件下干燥得到白色固体产物 (PEG114-PCL28-PtBA11， 数均分子量为 9700)0.3g， 产率为 43％， tBA 的单体转化率为 22％。
(3.d.) 将 0.2g 上述 (3.c.) 产物 ( 数均分子量为 9700， 0.02mmol， 其中， 叔丁基 为 0.2mmol) 与 0.1gTFA(1.0mmol) 溶于 3mL 二氯甲烷中， 在室温下反应 72 小时， 在 400mL 正己烷中沉淀并在真空条件下干燥得到白色固体产物 【PEG114-PCL28-P(AA70％ -tBA30％ )11， 数均分子量为 9300】 0.18g， 即为所述可降解的双亲性三嵌段共聚物 C， 水解率为 70 ％，
产 率 为 98 ％。 图 3 为 可 降 解 的 双 亲 性 三 嵌 段 共 聚 物 C 的 核 磁 谱 图。1H NMR(400MHz， DMSO-d6)δ1.24(m， 56H， -CH2CH2CH2- 来 源 于 聚 己 内 酯 )， 1.29(s， 27H， -OC4H9 来 源 于 聚 丙 烯 酸 )， 1.54(m， 78H， -CH2CH2CH2- 来 源 于 聚 己 内 酯， -CH2CH(COO-)- 来 源 于 聚 丙 烯 酸 )， 2.27(m， 67H， -CH2C( ＝ O)O- 来源于聚己内酯， -CH2CH(COO-)- 来源于聚丙烯酸 )， 3.51(s， 456H， -OCH2CH2O- 来源于聚乙二醇 )， 3.98(t， 56H， -C( ＝ O)OCH2- 来源于聚己内酯 )， 12.26. (s， 8H， -CH2CH(COOH)- 来源于聚丙烯酸 )。
实施例 4 ： 可降解的双亲性三嵌段共聚物 D 的合成
本实施例中所合成可降解的双亲性三嵌段共聚物 D 的结构式如下所示 ：
(4.a.) 将 10.0g PEG( 一端为甲氧基， 一端为羟基数均分子量为 5000， 2mmol)、 45.6g CL(400mmol) 和 81mg 辛酸亚锡 ( 分子量为 405， 0.2mmol) 为催化剂， 在 120 ℃无氧 条件下反应 48 小时， 在 400mL 石油醚中沉淀并在真空条件下干燥得到白色粉末状产物 (PEG114-PCL57-OH， 数均分子量为 11500)20.2g， 产率为 36％， CL 的单体转化率为 29％。
(4.b.) 将 11.5g 上述 (4.a.) 产物 ( 数均分子量为 11500， 1mmol) 与 2.3g 溴代异 丁酰溴 (10mmol) 溶于 100mL 干燥二氯甲烷中， 以 1.5mL 干燥的 TEA(10mmol) 为催化剂， 在 室温下反应 10 小时， 过滤除去反应生成的盐后在 400mL 石油醚中沉淀并在真空条件下干燥 得到白色粉末状产物 (PEG114-PCL57-Br， 数均分子量为 11600)10.9g， 产率为 93％。
(4.c.) 将 0.7g 上 述 (4.b.) 产 物 ( 数 均 分 子 量 为 11600， 0.06mmol)、 2.3g tBA(18mmol)、 4.3mg CuBr(0.03mmol)、 6.2μL PMDETA(0.03mmol) 溶 于 3mL 丙 酮 中， 在室温无氧条件下反应 120 小时， 加入 1000mL 二氯甲烷稀释并过碱性氧化铝柱后旋 蒸除去溶剂二氯甲烷， 在 400mL 石油醚中沉淀并在真空条件下干燥得到白色固体产物 (PEG114-PCL57-PtBA100， 数均分子量为 24400)1.4g， 产率为 47％， tBA 的单体转化率为 33％。
(4.d.) 将 1.2g 上述 (4.c.) 产物 ( 数均分子量为 24400， 0.05mmol， 其中叔丁基 为 5mmol) 与 1.7gTFA(15mmol) 溶于 20mL 二氯甲烷中， 在室温下反应 24 小时， 在 400mL 石 油醚中沉淀并在真空条件下干燥得到白色固体产物 【PEG114-PCL57-P(AA30％ -tBA70％ )100， 数 均分子量为 22800】 1.1g， 即为所述可降解的双亲性三嵌段共聚物 D。水解率为 30％， 产率 1 为 93％。图 4 为可降解的双亲性三嵌段共聚物 D 的核磁谱图。 H NMR(400MHz， DMSO-d6) δ1.29(m， 114H， -CH2CH2CH2- 来源于聚己内酯 )， 1.39(s， 630H， -OC4H9 来源于聚丙烯酸 )， 1.49-1.57(m， 428H， -CH2CH2CH2- 来 源 于 聚 己 内 酯， -CH2CH(COO-)- 来 源 于 聚 丙 烯 酸 )， 2.27(m， 214H， -CH2C( ＝ O)O- 来源于聚己内酯， -CH2CH(COO-)- 来源于聚丙烯酸 )， 3.51(s， 456H， -OCH2CH2O- 来源于聚乙二醇 )， 3.98(t， 114H， -C( ＝ O)OCH2- 来源于聚己内酯 )， 12.24. (s， 30H， -CH2CH(COOH)- 来源于聚丙烯酸 )。
实施例 5 ： 可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束的制备
(5.a.) 可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束 A 的制备
将 10.0mg 实施例 1 得到的可降解的双亲性三嵌段共聚物 A 溶于 1mL 丙酮中， 缓慢 滴加 4mL 去离子水 ( 滴加速度为 0.3mL/min)， 搅拌 10 小时， 将溶液装入透析袋中 【截流分 子量 (MWCO) ＝ 3500】 ， 用去离子水透析 48 小时， 每 4 小时换水一次， 得到浓度约为 2g/L 的 可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束 A 的水溶液。
该可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束 A 为核壳结构， 其平均粒径为 26 纳米 ； 其中 ： 胶束的外壳为聚乙二醇， 内核为聚己内酯， 聚丙烯酸位于内核外表面。图 6(A) 为动态光散 射测定的可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束 A 的半径分布曲线， 其平均半径值为 13 纳米。
(5.b.) 可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束 B 的制备
将 10.0mg 实施例 2 得到的可降解的双亲性三嵌段共聚物 B 溶于 0.5mL 四氢呋喃 中， 缓慢滴加 5mL 去离子水 ( 滴加速度为 0.3mL/min)， 搅拌 10 小时， 将溶液装入透析袋中 【截流分子量 (MWCO) ＝ 3500】 ， 用去离子水透析 48 小时， 每 4 小时换水一次， 得到浓度约为 2g/L 的可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束 B 的水溶液。
该可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束 B 为核壳结构， 其平均粒径为 23.6 纳米 ； 其 中： 胶束的外壳为聚乙二醇， 内核为聚己内酯， 聚丙烯酸位于内核外表面。 图 6(B) 为动态光 散射测定的可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束 B 的半径分布曲线， 其平均半径值为 11.8 纳 米。 (5.c.) 可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束 C 的制备
将 10.0mg 实施例 3 得到的可降解的双亲性三嵌段共聚物 C 溶于 1mL 二甲基甲酰 胺中， 将上述双亲性三嵌段共聚物 C 的二甲基甲酰胺溶液缓慢滴入 100mL 去离子水中 ( 滴 加速度为 0.3mL/min)， 通过超滤法除去二甲基甲酰胺， 浓缩后得到浓度约为 2g/L 的可降解 的双亲性三嵌段共聚物胶束 C 的水溶液。
该可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束 C 为核壳结构， 其平均粒径为 30 纳米 ； 其中 ： 胶束的外壳为聚乙二醇， 内核为聚己内酯， 聚丙烯酸位于内核外表面。图 6(C) 为动态光散 射测定的可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束 C 的半径分布曲线， 其平均半径值为 15 纳米。
(5.d.) 可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束 D 的制备
将 10.0mg 实施例 4 得到的可降解的双亲性三嵌段共聚物 D 溶于 10mL 四氢呋喃 中， 缓慢滴加 20mL 去离子水 ( 滴加速度为 0.3mL/min)， 搅拌 10 小时， 将溶液装入透析袋中 【截流分子量 (MWCO) ＝ 3500】 ， 用去离子水透析 48 小时， 每 4 小时换水一次， 浓缩后得到浓 度约为 2g/L 的可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束 D 的水溶液。
该可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束 D 为核壳结构， 其平均粒径为 184 纳米 ； 其 中： 胶束的外壳为聚乙二醇， 内核为聚己内酯， 聚丙烯酸位于内核外表面。图 6(D) 为动态 光散射测定的可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束 D 的半径分布曲线， 其平均半径值为 92 纳 米。
对上述可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束的水溶液进行动态光散射测试的过程 为： 将上述可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束的水溶液分别取样并通过 0.45μm 的滤膜进 行纯化除尘， 利用激光光散射仪 ( 型号为 ALV/DLS/SLS-5022F， 德国 ALV 公司生产 ) 在 25℃ 下、 90°角度测定可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束在水溶液中的流体力学半径。
实施例 6 ： 抗肿瘤纳米粒子的制备
(6.a.) 抗肿瘤纳米粒子 A 的制备
将 10.0mg 实施例 1 得到的可降解的双亲性三嵌段共聚物 A( 数均分子量为 10100， 其中 COO 为 0.025mmol) 与 2.0mg 阿霉素溶于 0.1mL 二甲基甲酰胺与 1mL 四氢呋喃混合溶 液中， 缓慢滴加 4mL 去离子水 ( 滴加速度为 0.3mL/min)， 搅拌 10 小时， 旋蒸除去四氢呋喃 后将溶液装入透析袋中 【截流分子量 (MWCO) ＝ 3500】 ， 用去离子水透析 48 小时， 每 4 小时 换水一次， 得到浓度约为 3g/L 的负载有阿霉素的抗肿瘤纳米粒子 A 的中间产物 ； 将 7.4mg 顺铂 ( 分子量为 300.23， 0.025mmol) 与 4.2mg 硝酸银 ( 分子量为 170， 0.025mmol) 悬浮于 2mL 去离子水中在室温避光条件下搅拌 24 小时， 过滤除去氯化银， 得到水合顺铂溶液 ； 将负 载有阿霉素的抗肿瘤纳米粒子 A 的中间产物和水合顺铂溶液混合 (Pt/COO 为 1)， 在 37℃下 避光搅拌 72 小时后装入透析袋中 【截流分子量 (MWCO) ＝ 3500】 ， 用去离子水透析 24 小时， 每 4 小时换水一次， 得到浓度约为 2g/L 的抗肿瘤纳米粒子 A 的水溶液。
该抗肿瘤纳米粒子 A 为核壳结构， 其平均粒径为 30 纳米 ； 其中 ： 抗肿瘤纳米粒子 A 的外壳为聚乙二醇 ； 内核为聚己内酯， 聚己内酯通过疏水作用负载阿霉素 ； 聚丙烯酸位于 内核外表面并通过羧酸根与顺铂中的铂的配位络合作用负载顺铂。图 8(A) 为动态光散射 测定的抗肿瘤纳米粒子 A 的半径分布曲线， 其平均半径值为 15 纳米。抗肿瘤纳米粒子 A 所 负载的阿霉素的质量占抗肿瘤纳米粒子 A 质量的 6.3％ ； 抗肿瘤纳米粒子 A 所负载的顺铂 的铂 (Pt) 相对于可降解的双亲性三嵌段共聚物 A 的羧酸根的摩尔比 (Pt/COO-) 值为 0.2。 (6.b.) 抗肿瘤纳米粒子 B 的制备
将 10.0mg 实施例 2 中所得可降解的双亲性三嵌段共聚物 B( 数均分子量为 5500， 其中 COO 为 0.045mmol) 与 1.0mg 阿霉素溶于 0.1mL 二甲基甲酰胺与 1mL 四氢呋喃混合溶 液中， 缓慢滴加 10mL 去离子水 ( 滴加速度为 0.3mL/min)， 搅拌 10 小时后用超滤法除去二甲 基甲酰胺、 四氢呋喃及未负载的阿霉素， 浓缩后得到浓度约为 3g/L 的负载有阿霉素的抗肿 瘤纳米粒子 B 的中间产物 ； 将负载有阿霉素的抗肿瘤纳米粒子 B 的中间产物和 6.8mg 顺铂 (0.023mmol) 混合 (Pt/COO 为 0.5)， 在 25℃下避光搅拌 72 小时后用超滤法除去未负载的 顺铂， 得到浓度约为 2g/L 的抗肿瘤纳米粒子 B 的水溶液。
该抗肿瘤纳米粒子 B 为核壳结构， 其平均粒径为 25 纳米 ； 其中 ： 抗肿瘤纳米粒子 B 的外壳为聚乙二醇 ； 内核为聚己内酯， 聚己内酯通过疏水作用负载阿霉素 ； 聚丙烯酸位于 内核外表面并通过羧酸根与顺铂中的铂的配位络合作用负载顺铂。图 8(B) 为动态光散射 测定的抗肿瘤纳米粒子 B 的半径分布曲线， 其平均半径值为 12.5 纳米。抗肿瘤纳米粒子 B 所负载的阿霉素的质量占抗肿瘤纳米粒子 A 质量的 1％ ； 抗肿瘤纳米粒子 B 所负载的顺铂 的铂 (Pt) 相对于可降解的双亲性三嵌段共聚物 B 的羧酸根的摩尔比 (Pt/COO-) 值为 0.1。
(6.c.) 抗肿瘤纳米粒子 C 的制备
将 10.0mg 实施例 3 中所得可降解的双亲性三嵌段共聚物 C( 数均分子量为 9300， 其中 COO 为 0.0086mmol) 与 5.0mg 阿霉素溶于 1mL 二甲基甲酰胺中， 缓慢滴加 15mL 去离子 水 ( 滴加速度为 0.3mL/min)， 搅拌 10 小时后将上述溶液装入透析袋中 【截流分子量 (MWCO) ＝ 3500】 ， 用去离子水透析 48 小时， 每 4 小时换水一次， 浓缩后得到浓度约为 3g/L 的负载 有阿霉素的抗肿瘤纳米粒子 C 的中间产物 ； 将 5.2mg 顺铂 (0.017mmol) 与 2.9mg 硝酸银 (0.017mmol) 悬浮于 2mL 去离子水中在室温避光条件下搅拌 24 小时， 过滤除去氯化银， 得到 水合顺铂溶液 ； 将负载有阿霉素的抗肿瘤纳米粒子 C 的中间产物和水合顺铂溶液混合 (Pt/
COO- 为 2)， 在 50℃下避光搅拌 96 小时后装入透析袋中 【截流分子量 (MWCO) ＝ 3500】 ， 用去 离子水透析 24 小时， 每 4 小时换水一次， 得到浓度约为 2g/L 的抗肿瘤纳米粒子 C 的水溶液。
该抗肿瘤纳米粒子 C 为核壳结构， 其平均粒径为 54 纳米 ； 其中 ： 抗肿瘤纳米粒子 C 的外壳为聚乙二醇 ； 内核为聚己内酯， 聚己内酯通过疏水作用负载阿霉素 ； 聚丙烯酸位于 内核外表面并通过羧酸根与顺铂中的铂的配位络合作用负载顺铂。图 8(C) 为动态光散射 测定的抗肿瘤纳米粒子 C 的半径分布曲线， 其平均半径值为 27 纳米。抗肿瘤纳米粒子 C 所 负载的阿霉素的质量占抗肿瘤纳米粒子 C 质量的 10％ ； 抗肿瘤纳米粒子 C 所负载的顺铂 (Pt) 的铂相对于可降解的双亲性三嵌段共聚物 C 的羧酸根的摩尔比 (Pt/COO-) 值为 0.9。
(6.d.) 抗肿瘤纳米粒子 D 的制备
将 10.0mg 实施例 4 中所得可降解的双亲性三嵌段共聚物 D( 数均分子量为 22800， 其中 COO 为 0.013mmol) 与 10.0mg 阿霉素溶于 1mL 二甲基甲酰胺中， 缓慢滴加 20mL 去离子 水 ( 滴加速度为 0.3mL/min)， 搅拌 10 小时后将上述溶液装入透析袋中 【截流分子量 (MWCO) ＝ 3500】 ， 用去离子水透析 48 小时， 每 4 小时换水一次， 浓缩后得到浓度约为 3g/L 的负载有 阿霉素的抗肿瘤纳米粒子 D 的中间产物 ； 将负载有阿霉素的抗肿瘤纳米粒子 D 的中间产物 和 0.4mg 顺铂 (0.0013mmol) 混合 (Pt/COO- 为 0.1)， 在 20℃下避光搅拌 48 小时后装入透 析袋中 【截流分子量 (MWCO) ＝ 3500】 ， 用去离子水透析 24 小时， 每 4 小时换水一次， 得到浓 度约为 2g/L 的抗肿瘤纳米粒子 D 的水溶液。
该抗肿瘤纳米粒子 D 为核壳结构， 其平均粒径为 176 纳米 ； 其中 ： 抗肿瘤纳米粒子 D 的外壳为聚乙二醇 ； 内核为聚己内酯， 聚己内酯通过疏水作用负载阿霉素 ； 聚丙烯酸位于 内核外表面并通过羧酸根与顺铂中的铂的配位络合作用负载顺铂。图 8(D) 为动态光散射 测定的抗肿瘤纳米粒子 D 的半径分布曲线， 其平均半径值为 88 纳米。抗肿瘤纳米粒子 D 所 负载的阿霉素的质量占抗肿瘤纳米粒子 D 质量的 50％ ； 抗肿瘤纳米粒子 D 所负载的顺铂的 铂 (Pt) 相对于可降解的双亲性三嵌段共聚物 D 的羧酸根的摩尔比 (Pt/COO-) 值为 0.05。
对上述抗肿瘤纳米粒子的水溶液进行动态光散射测试的过程为 ： 将上述抗肿瘤 粒子的水溶液分别取样并通过 0.45μm 的滤膜进行纯化除尘， 利用激光光散射仪 ( 型号为 ALV/DLS/SLS-5022F， 德国 ALV 公司生产 ) 在 25℃下、 90°角度测定抗肿瘤纳米粒子在水溶 液中的流体力学半径。
实施例 7 ： 抗肿瘤药物阿霉素和顺铂从抗肿瘤纳米粒子 A 中的释放
在 37℃条件下， 利用透析法 【透析膜的 (MWCO) ＝ 3500】 评价在含有 160mMNaCl 的 10mM PBS(pH ＝ 7.4) 溶液 ( 模拟哺乳动物， 尤其是人体液的酸碱性及含盐量 ) 中， 抗肿瘤药 物阿霉素和顺铂从实施例 (6.a) 中所述抗肿瘤纳米粒子 A 中的释放行为。以特定时间间隔 对透析袋的外液进行取样， 利用紫外分光光度计分别对阿霉素和顺铂的浓度进行测定。
图 9(A) 为阿霉素释放曲线， 在 80 个小时的检测时间内， 阿霉素的释放率达 80％以 上。图 9(B) 为顺铂释放曲线， 在 250 个小时的检测时间内， 顺铂的释放率达 65％以上。结 果表明抗肿瘤药物在模拟体内环境的缓冲溶液中有大部分可以释放出来并实现了药物缓 释。
实施例 8 ： 可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束 A 的生物可降解性
将荧光探针分子芘的丙酮溶液 ( 质量浓度为 0.005g/L)60μL 置于玻璃瓶中， 待丙 酮挥发后加入实施例 (5.a) 中所述的可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束 A 的水溶液 3mL， 超声 0.5 小时并静止 24 小时。将上述溶液置于 37℃水浴中， 加入脂肪酶 Lipase PS 使溶液中 酶浓度为 0.01g/L， 以特定时间间隔对此水溶液进行荧光强度测定 ( 激发波长为 335nm， 检 测波长为 350-500nm)。
图 10 为可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束 A 的降解实验结果 ： 在脂肪酶 Lipase PS 作用下， 可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束中 A 的聚己内酯链段由于酯键水解断裂而降 解， 导致可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束 A 的核破裂， 将包裹在可降解的双亲性三嵌段 共聚物胶束 A 的核中的荧光探针芘释放进入水中， 被水中的氧等小分子淬灭荧光而使荧光 检测强度降低。如图 10 所示， 荧光探针芘的荧光强度从 0 分钟时的 142， 降低至 80 分钟时 的 112。
实施例 9 ： 可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束 A 和抗肿瘤纳米粒子 A 的细胞毒性
利用 MTT 法评价可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束 A 和抗肿瘤纳米粒子 A 对人膀 胱癌细胞的毒性。在 96 孔板 ( 每孔 3000 个细胞 ) 中 50μL 含质量浓度为 10％胎牛血清的 RPMI1640 培养基中培养人膀胱癌细胞， 分别加入可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束 A 或抗 肿瘤纳米粒子 A 使各自浓度均为 150mg/L， 将细胞在 37℃、 体积浓度为 5％二氧化碳的潮湿 环境下保温 48 小时或 72 小时后， 加入 MTT 溶液， 保温 4 小时后置换为二甲基亚砜溶液， 用 酶标仪 ( 型号为 MULTISCAN MK-III， 美国热电公司生产 ) 测定 570nm 处的吸光度来确定细 胞存活率 (％ ) 并将结果归纳于表 1。
表1
在实施例 9 涉及时间内， 可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束 A 对人膀胱癌细胞生 长无抑制性表现， 表明可降解的双亲性三嵌段共聚物胶束 A 对人膀胱癌细胞是无毒性或基 本无毒性的。负载抗肿瘤药物后， 抗肿瘤纳米粒子 A 对人膀胱癌细胞表现出较高的抑制性。
产业实用性 ：
本发明的抗肿瘤纳米粒子可通过疏水作用和配位络合作用负载一种或多种抗肿 瘤药物， 具有生物可降解性， 可以用于人肿瘤的化学疗法中。