IL-4 在制备治疗重症肝炎的药物中的用途 【技术领域】
本发明属于医药领域， 具体涉及白细胞介素 -4(IL-4) 在治制备治疗重症肝炎的 药物中的用途。背景技术
重型乙肝病情发展迅速， 预后差， 是严重危害人类健康的一种疾病。 其发病机制复 杂， 至今尚未完全阐明， 但多数学者认同二次打击学说， 认为第一次打击导致肝损伤而使肝 脏屏障功能障碍， 其后导致的肠源性内毒素血症， 激活了单核吞噬细胞系统， 释放大量细胞 因子和炎性介质， 形成第二次打击， 进一步损伤肝脏、 加重肝细胞坏死， 导致肝衰竭发生。 所 以内毒素主要的致毒成分脂多糖 (lipopolysaccharide， LPS)， 是肝衰竭的重要致病机制的 核心分子。
小鼠经 D- 半乳糖胺 (D-galactosamine， D-GalN) 致敏后， 再注射小剂量的 LPS， 可 导致严重的实验性重型肝炎， 肝脏生化和代谢改变与临床病毒性重型肝炎较为相似， 可同 时引起内、 外源性内毒素血症。因此， 能应用 LPS/GalN 诱发的小鼠实验性重型肝炎模型， 筛 选重症肝炎的治疗药物。
IL-4 是 一 种 主 要 由 Th2 细 胞 分 泌 的 细 胞 因 子， 它 具 有 促 进 Th 细 胞 O 型 (T helper0， Th0) 细胞发育、 分化为 Th2 细胞的功能， 被认为是 Th2 转化的必需因子。 目前 IL-4 主要用于肿瘤的临床治疗， 它能诱导肿瘤免疫并排斥已形成的恶性肿瘤 ： 粒细胞巨噬细胞 集落刺激因子 (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor， GM-CSF) 与 IL-4 联合用药可以治疗癌症。用量为 2.5mg/kg/d GM-CSF 加上 0 ～ 6.0ug/kg/d IL-4， 给药方 式为全身给药， 治疗周期为 14 天。其中 IL-4 的最大耐受剂量为 6.0ug/kg/d， 最适剂量为 4.0ug/kg/d。 IL-4 对 Th1 诱导的器官特异性自身免疫病具有普遍的治疗作用。 此外， 还有研 究发现， 对于严重的顽固性银屑病患者， 应用重组人类白细胞介素 -4(Recombinant Human IL-4， rhIL-4) 具有明显的临床治疗作用 [。在 IL-4 重组蛋白药物治疗的 20 名银屑病病 人的 6 周临床实验研究中， 所有病人的银屑病面积与严重程度都有所降低， 其中 15 名病人 病情改善了 68％以上。其治疗机理在于 IL-4 能够诱导 Th2 应答， 保持 Th1 与 Th2 的平衡， 改善 Th1 致炎性细胞因子造成的组织损伤 (Nat Med.2003Jan ； 9(1) ： 40-6)。目前， 并没有 IL-4 能有效治疗重症肝炎的相关报道。 发明内容 本发明所要解决的技术问题是提供白细胞介素 -4 的一种新用途。IL-4 的这种新 用途是用于制备治疗重症肝炎的药物组合物。
其中， 上述用途中， IL-4 的制备的治疗重症肝炎的药物中的 IL-4 的用量为 0.1 ～ 5ug/kg/d。优选的， IL-4 的用量为 0.5ug/kg/d ～ 5ug/kg/d。
其中， 上述治疗重症肝炎的药物的给药途径为皮下注射给药。
其中， 上述治疗重症肝炎的药物的使用时间为 1 个月。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种重症肝炎的药物组合物。 该治疗重 症肝炎的药物组合物是由 IL-4 添加药学上可接受的辅助性成分制备而成。
其中， 上述 IL-4 的用量为 0.1ug/kg/d ～ 5ug/kg/d。 优选的 IL-4 的用量为 0.5ug/ kg/d ～ 5ug/kg/d。
其中， 上述治疗重症肝炎的药物组合物的给药途径为皮下注射给药， 使用时间为 1 个月。
本发明实施例表明 ： 上述实验结果表明 ： IL-4 治疗可以降低重型肝炎模型小鼠血 清 ALT、 AST、 LDH、 BILT 水平， 治疗后重症肝炎模型小鼠的肝脏病理损伤程度明显减轻 ； IL-4 治疗能够降低重型肝炎小鼠血清和肝脏中炎症因子水平， 肝内炎症因子的 mRNA 水平也明 显下调 ； IL-4 治疗能够改善重型肝炎小鼠肝脏细胞凋亡情况， 治疗以后的重肝小鼠其肝脏 的凋亡明显减少 ； IL-4 治疗还能够提高重型肝炎小鼠肝内还原型谷胱甘肽的含量， 这对于 保护肝损伤具有重要的作用 ； IL-4 治疗也能降低重型肝炎小鼠肝诱导性一氧化氮合成酶 的水平， 减弱 NO 对肝脏的损伤程度。由此可见， 以 IL-4 为为活性成分制备治疗重型肝炎的 药物， 具有很好的应用前景。 附图说明 图 1 为 IL-4 治疗重症肝炎模型小鼠的肝脏病理切片 HE 染色 (×200) 结果 ； 其中 A： 正常对照组 ； B： 模型对照组 ； C： 大剂量治疗组 ； D： 小剂量治疗组。
图 2 为 IL-4 治疗重症肝炎模型小鼠对血清和肝脏 TNF-α 的影响。
图 3 为 IL-4 治疗重症肝炎模型小鼠对血清和肝脏 IL-1β 的影响。
图 4 为 IL-4 治疗重症肝炎模型小鼠对血清和肝脏 IL-6 的影响。
图 5 为 IL-4 治疗重症肝炎模型小鼠对血清和肝脏 IFN-γ 的影响。
图 6 为 IL-4 治疗对小鼠肝脏炎症因子 mRNA 转录水平的影响 ； 其中 1 ： 正常对照组 ； 2： 模型对照组 ； 3： 大剂量治疗组 ； 4： 小剂量治疗组。
图 7 为 IL-4 治疗对小鼠肝细胞凋亡情况的影响。
A： 正常对照组 ； B： 模型对照组 ； C： 大剂量治疗组 ； D： 小剂量治疗组。
图 8 为 IL-4 治疗对小鼠肝脏 iNOS 水平的影响。1 ： 正常对照组 ； 2： 模型对照组 ； 3： 大剂量治疗组 ； 4： 小剂量治疗组。
具体实施方式
实施例一用 IL-4 治疗重症肝炎
( 一 ) 材料
1. 实验动物
BALB/c 小鼠 (7-8 周， 雌性 ) 购自四川大学动物研究中心， 体重 18-22g ；
2. 主要试剂、 材料及试剂盒
1)IL-4( 购自 PROSPEC 公司， 以色列， 货号 .CYT-282)
2)D-GalN， LPS ： 购自 Sigma。
3)IL-1β， TNF-α， IL-6， IL-10， IFN ELISA 试剂盒 ： 购自欣博盛公司。
4)TUNEL 检测试剂盒 (DeadEnd Fluorometric TUNEL System) ： 购自 Promega 公司。 5)ERK1， ERK2， P-ERK， iNOS 抗体 ： 购自中衫金桥公司。
6) 辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的兔抗小鼠 IgG(H+L) ： 购自北京中山生物公司。
7)DAB 显色试剂盒 ： 购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
8)Western blotting 化学发光检测试剂盒 ： 购自 PIERCE 公司。
9) 其他试剂均为进口或国产分析纯产品。
3. 试剂配制
3.1RIPA 裂 解 液 (RIPA Lysis Buffer) ： 50mMTris-Hcl PH ＝ 7.4， 150mM NaC， 1mmol/LPMSF ； 1mMEDTA ； 1％ Tritox-100 ； 1％脱氧胆酸钠 ； 0.1％ SDS
3.2 免疫组化试剂配制
1)TBS ： Tris-HCl 缓冲液 (0.5M， pH7.6)100ml， NaCl 8.5g， 定容至 1000ml。
2) 枸橼酸盐缓冲液 ：
储存液 ： A液： 0.1M 枸橼酸溶液 ： 称取 21.01g 枸橼酸 (C6H5O7· H2O) 溶于 1000ml 蒸 馏水中。B 液 ： 0.1M 枸橼酸钠溶液 ： 称取 29.41g 枸橼酸钠 (C6H5Na7O2· 2H2O) 溶于 1000ml 超 纯水中。
工作液 ： 取 9ml A 液和 41ml B 液加入 450ml 蒸馏水中， 溶液 pH 值应为 6.0±0.1， 0.01M 柠檬酸缓冲液用于抗原修复。
3.3EMSA 试剂配制
1)Sucrose Buffer ： 0.32M Sucrose ； 10mM Tris HCl pH 8.0 ； 3mM CaCl2 ； 2mMMgOAc ； 0.1mM EDTA ； 0.5％ NP-40 ； 1mM DTT ； 0.5mM PMSF
2)Low Salt Buffer ： 20mM HEPES(pH 7.9) ； 1.5mM MgCl2 ； 20mM KCl ； 0.2mMEDTA ； 25％ glycerol(v/v) ； 0.5mM DTT ； 0.5mM PMSF ；
3)High Salt Buffer ； 20mM HEPES(pH 7.9) ； 1.5mM MgCl2 ； 800mM KCl ； 0.2mMEDTA ； 25 ％ glycerol(v/v) ； 1 ％ NP-40 ； 0.5mM DTT ； 0.5mM PMSF ； 4.0 μ g/ mlleupeptin， aprotinin， pepstatin
4)5X Binding Buffer ： 50mM Tris HCl(pH 8.0) ； 750mM KCl ； 2.5mM EDTA ； 0.5％ Triton-X 100 ； 62.5％ glycerol(v/v) ； 1mM DTT
4. 实验仪器及设备
1) 超低温冰箱 ： SANYO 公司， 型号 ： MDF-382E
2) 酶标仪 ： Bio-Rad 公司， 型号 ： 550
3) 纯水仪 ： Millipore 公司， 型号 ： EASYpure UF 07412
4) 低速离心机 ： Heraeus Heraeus， 型号 ： Varifuge 3.0 ； Megafuge 1.0
5) 病理切片机 ： RM2125， LEICA
6) 病理组织漂烘处理仪 ： PHY-III， 常州中威电子仪器厂
7) 图像采集系统 ： 显微镜 Nikon ECLIPSE E600， 摄像仪 SPOT ； ZEISS 荧光显微镜。
( 二 )、 实验方法
1. 动物处理
1.1 小鼠重型肝损伤模型的制备
D-GalN 和 LPS 均用无菌生理盐水溶解， D-GalN 浓度为 70mg/mL， LPS 浓度为 1mg/
mL。7-8 周龄雌性 BalB/C 小鼠， D-GalN700mg/kg 腹腔注射， 同时 LPS 1μg/kg 腹腔注射， 制 备小鼠免疫性肝损伤模型。
1.2 动物的分组与用药治疗
建模后的小鼠随机分为 3 组， 每组 6 只， 分别为 LPS/GalN 模型对照组， IL-4 给药 5μg/kg 组 ( 大剂量组 )， IL-4 给药 0.5μg/kg 组 ( 小剂量组 )。给药组在建模结束以后， 给于相应剂量的 IL-4 于皮下进行治疗。模型对照组于同一时间点给予生理盐水 0.2ml 皮 下注射。正常组采用正常老鼠， 在所有相应的时间点均予生理盐水 0.2ml 腹腔注射或皮下 注射。
1.3 标本收集
8 小时后摘除小鼠眼球取血， 分离血清待检 ； 同时， 脱颈椎处死小鼠， 取肝脏左叶 相同部位， 用 10％福尔马林溶液固定， 作病理检查。选肝脏右叶用冷生理盐水漂洗去除积 血， 置于去酶 EP 管中并保存于速冻液氮内， 再转存于一 70℃冰箱， 以待提取总 RNA、 总蛋白、 核蛋白等下一步生理生化测定。
2、 生化指标检测
血清的谷丙转氨酶 (alanine aminotransferase， ALT)、 谷草转氨酶 (aspartate aminotransferase， AST)、 乳酸脱氢酶 (lactate dehydrogenase， LDH)、 总胆红素 (total bilirubin， TBIL)， 全自动生化仪测定。 3、 小鼠炎症相关细胞因子水平分析
3.1 血清和肝脏组织炎症相关水平测定 (ELISA 法 )
1) 组织匀浆液的制备 ： 量取预冷的生理盐水于 EP 管中， 体积总量应该是组织块重 量的 9 倍。将冻存的组织放入研钵中， 加液氮进行研磨， 研磨成粉状， 倒入加有生理盐水的 EP 管中， 置于冰上 30 分钟后在 4℃， 12000g 离心 10 分钟， 上清液即为组织匀浆液， 分装小 管， 进行测定。
2) 待检样品包括血清和组织匀浆液。在做 ELISA 之前， 血清和组织匀浆液经过不 同比例的稀释后， 进行细胞因子测定浓度和实验 OD 值结果相关性分析， 确定样本最佳稀释 比例。做 ELISA 之前， 每份样品严格进行蛋白定量， 保证样品之间总蛋白的一致性
3) 采用双抗体夹心 ELISA 法测定。 96 孔板每孔加 50μl 待检样品。 轻轻混匀， 37℃ 孵育 90 分钟。吸取每孔液体弃去， 用 400μl 洗涤液洗板共洗 5 次并用吸水纸吸干。每孔 加 100μl 生物素酶结合物溶液， 37℃孵育 60 分钟。用 400μl 洗涤液洗板子， 共洗 5 次并 用吸水纸吸干。每孔加入 100μl 酶结合工作液， 37℃孵育 30 分钟， 400μl 洗涤液洗板子， 共洗 5 次并用吸水纸吸干。每孔加 100μl 显色底物， 37℃孵育 15 分钟， 加入终止液 100μl 每孔， 混匀。在 3 分钟内， 于酶标仪检测 OD450nm。
3.2 肝脏组织炎症因子 mRNA 表达检测 (RT-PCR)
1) 取冻存的肝组织， 于研钵中加入液氮研磨成粉状， 迅速置盛有 1ml Trizol 的 EP 管中， 室温静置 5 分钟， 10,000g 4℃离心 10 分钟。取上清加入三氯甲烷 0.2ml， 振荡， 室温 静置 3 分钟， 12,000g 4℃离心 15 分钟。取上层水相， 加异丙醇 0.5ml， 室温静置 10 分钟， 12,000g 4℃离心 10 分钟。弃上清， 75％乙醇清洗 RNA 沉淀， 7,500g 4℃离心 5 分钟， 晾干 RNA。以 30μlDEPC 水溶解， 分光光度计测浓度， RNA 电泳。 TM
2) 按照 SuperScript First-Strand Synthesis System(invitrogen 公司 ) 试剂
盒说明书合成 cDNA。 取 cDNA2μl 做半定量 PCR， 用相应细胞因子上游及下游引物各 50pmol， GAPDH 上游及下游引物各 50pmol。取反应结束产物 8μl 加样于 2％琼脂糖凝胶上电泳。引 物由上海英骏生物工程公司合成 ( 见表 1)。
表 1 引物序列
4.HE 染色
肝组织标本用 10 ％中性甲醛固定， 石腊包埋， 切片。切片后二甲苯脱蜡， 2 次， 10min ； 100％酒精去二甲苯， 2 次， 2min ； 95％酒精， 1 次， 1min ； 85％酒精， 1 次， 1min ； 70％酒 精， 1 次， 1min ； 自来水洗 ； Mayer 氏苏木素染色 3min， 自来水洗 1min ； 1％盐酸酒精分化 20s， 自来水洗 1min ； 1％稀氨水返蓝 30s， 自来水洗 1min ； 伊红染色 2min， 自来水洗 30s ； 70％酒 精 20s， 80％酒精 30s ； 95％酒精， 2 次， 1min ； 100％酒精， 2 次， 2min ； 二甲苯， 2 次， 5min ； 中性 树胶封片。
5. 免疫组化
免疫组化方法按试剂盒操作说明进行， 基本步骤如下 ：
1) 石蜡切片常规脱蜡水化 ；
2) 蒸馏水清洗 5min( 摇床 ) ；
3)3％ H2O2 封闭内源性的过氧化氢酶约 15min， 避光 ；
4) 蒸馏水清洗 2 次， 每次 5min ；
5) 抗原热修复 ； 采用热修复的高压锅处理技术 ： 枸橼酸钠缓冲液， 淹没切片， 滴加 一滴 EDTA 盖上锅盖， 高压锅内煮沸， 上汽 3min 后缓慢冷却 ( 可用自来水在高压锅外冲， 以 助冷却 ) ；
6) 在脱色摇床上以 PBS 洗 3 次， 每次 5min ；
7) 在玻片上用蜡块画圈后使用 5％ BSA 封闭液封闭 (37℃孵育， 约 15min) 在玻片 上滴加一抗， 置湿盒内 (4℃， 过夜 ) 在脱色摇床上以 PBS 洗 4 次， 每次 5min ；
8) 在玻片上滴加稀释的生物素标记的二抗， 置湿盒内 (37℃孵育， 40min) ；
9)PBS 清洗 4 次， 每次 5min ；
10) 在玻片上滴加 SAB 复合物 (37℃孵育， 40min) ；
11)PBS 清洗 5-6 次， 每次 5min ；
12)DAB 底物显色液显色， 镜下观察， 适时终止显色， 流水充分冲洗 ；
13) 苏木素复染 ；
14) 利用图像分析系统进行灰度扫描分析。
6 原位末端标记 (TUNEL) 检测细胞凋亡
采用 Promega 公司的 In Situ Cell Death Detection Kit 检测， 按试剂盒说明进 行。基本步骤如下 ：
1) 将石蜡切片置于 60℃孵箱中加温 1 小时， 随后二甲苯脱蜡 15min X2 次 ； 先后用 100％、 95％、 80％、 70％酒精浸泡各 2 分钟 ； 蒸馏水洗涤 5min X2 次 ； 室温干燥 15min ；
2)PBS 漂洗切片 5min， 用滤纸吸去切片周围液体， 滴加蛋白酶 K 溶液 (10μg/mL 溶 于 0.01M Tris·Cl， pH7.4 ～ 8)， 置湿盒内于 37℃消化 60min ； PBS 漂洗切片 5min， 2次；
3) 用滤纸吸去切片周围液体， 滴加 50μl TUNEL 反应混合液， 置湿盒内于 37℃孵 育 60 分钟 ； PBS 漂洗切片 5 分钟 X3 次 ；
4) 荧光显微镜下观察， 激发光波长 450 ～ 500nm， 检测光波长 515 ～ 565nm( 绿色荧光 )。 7. 统计学分析
数据均采用 EXCEL 软件分析， 实验结果以均数加减标准差表示。计量资料采用 Student’ sT 检验 ； P ＜ 0.05 有统计学意义。
( 二 ) 实验结果
1.IL-4 治疗重型肝炎模型小鼠的一般情况
小鼠腹腔注射 D-GalN/LPS 后， 全身活动活动减少， 饮食下降、 反应迟钝或抽搐， 全 身毛直立且无光泽。建模 8 小时后开始会出现死亡。解剖时， 肉眼观察肝脏表面呈酱紫色 或红白相间的大片花斑样改变， 表面粗糙， 可见细小颗粒， 质韧， 边缘变钝， 见明显的淤血、 坏死， 建模成功 ； 正常组对照组小鼠肝脏色泽红润， 表面光滑， 质脆柔软， 边缘锐利， 无淤血、 坏死。 IL-4 治疗组小鼠肝脏色泽接近正常组， 淤血情况明显好转， 病变程度较模型对照组明 显减轻。
2.IL-4 治疗对重型肝炎模型小鼠血清 ALT、 AST、 LDH、 BILT 水平的影响
1)IL-4 治疗降低重肝模型小鼠的血清 ALT、 AST 水平， 结果见表 2
血清 ALT、 AST 水平是临床反映肝细胞损伤和坏死程度的常用检测指标。ALT 位于 肝细胞浆内， 而 AST 位于肝细胞浆和线粒体内， 当肝细胞损伤， 两种酶释放至血清， 会引起 异常增高。重肝模型组小鼠的血清 ALT， AST 明显高于正常对照组 (P ＜ 0.05)。经 IL-4 治 疗后， 大剂量治疗组 ALT， AST 水平明显降低 (P ＜ 0.05)， 小剂量治疗组 ALT， AST 水平虽然 也有降低的趋势， 但没有统计学意义 (P ＞ 0.05)。
表 2 IL-4 对重型肝炎小鼠模型血清 ALT、 AST 水平的影响
注： # 表示与正常对照组相比， P ＜ 0.05， 差异有显著意义
* 表示与模型对照组相比， P ＜ 0.05， 差异有显著意义
2)IL-4 治疗降低重肝模型小鼠的血清 LDH 的水平， 结果见表 3
由于肝脏中的 LDH 的浓度比血浆中高很多倍， 所以即使肝细胞的轻微损伤也将导 致血清中 LDH 水平的显著增加。LDH 是肝损伤非常灵敏的指标。重肝模型组小鼠的血清 LDH 明显高于正常对照组 (P ＜ 0.05)。经 IL-4 治疗后， 大剂量治疗组 LDH 水平明显降低 (P ＜ 0.01)， 小剂量治疗组 LDH 水平虽然也有降低的趋势， 但没有统计学意义 (P ＞ 0.05)
表 3IL-4 对重型肝炎小鼠模型血清 LDH 水平的影响
组别 正常对照组 模型对照组 大剂量治疗组 小剂量治疗组
N 6 6 6 6LDH(U/L) 386±20.57 3572±2397 ＝ 1025±239.91** 1859.33±1021.85注： # 表示与正常对照组相比， P ＜ 0.05， 差异有显著意义
** 表示与模型对照组相比， P ＜ 0.01， 差异有非常显著意义
3)IL-4 治疗降低重肝模型小鼠的血清 BILT 的水平， 结果见表 4
在机体胆红素的代谢过程中， 肝细胞承担着重要任务， 具有摄取、 结合、 排泄胆红 素的功能。当重肝模型小鼠肝脏功能障碍， 肝细胞受损坏死， 血液中胆红素水平明显增高， 形成黄疸。重肝模型组小鼠的血清 BILT 水平明显高于正常对照组 (P ＜ 0.05)。IL-4 大剂 量治疗组 BILT 水平明显降低 (P ＜ 0.05)， 小剂量治疗组 ALT， AST 水平的降低的趋势没有 统计学意义 (P ＞ 0.05)。表 4IL-4 对重型肝炎小鼠模型血清 BILT 水平的影响 组别 正常对照组 模型对照组 大剂量治疗组 小剂量治疗组 N 6 6 6 6 BILT(U/L) 7.13±2.59 13.67±4.41 ＝ 8.95±1.11* 9.15±2.33注： # 表示与正常对照组相比， P ＜ 0.05， 差异有显著意义
* 表示与模型对照组相比， P ＜ 0.05， 差异有显著意义
3.IL-4 治疗减少重症肝炎模型小鼠的肝脏病理损伤
肝组织病理切片 HE 染色结果见图 1 ： 正常对照组小鼠肝组织细胞质呈嗜酸性， 细 胞核被染成蓝色， 大而圆， 居中央， 染色质丰富， 核膜清楚， 肝细胞静脉周围呈放射状排列， 中央静脉完整。 重肝模型对照组小鼠肝组织中肝细胞大片崩解坏死， 肝索解离， 小叶结构模 糊不清， 肝窦明显扩张充血并出血， 残存肝细胞固缩， 胞体变小， 胞质致密， 细胞核浓缩或消 以广泛的肝细胞变性为主， 坏 失。大剂量和小剂量 IL-4 治疗后， 小鼠肝组织结构趋于正常， 死较少， 肝细胞肿胀不明显， 肝细胞损伤程度较对照组明显减轻， 淤血情况明显改善， 炎性 细胞浸润明显减少。
肝损害病理分级按肝组织炎症、 坏死及出血程度分五级 (0-IV) ： “0” 无坏死 ； “I” 肝小叶中央静脉周围有点状坏死， 散在炎细胞浸润及嗜酸小体形成 ； “II” 肝细胞坏死呈 灶状或片状， 占 1/3 以内， 炎细胞浸润呈灶状 ； “III”肝细胞坏死呈广泛坏死伴出血， 占 1/3-2/3， 炎症浸润呈片状 ； “IV” 肝细胞坏死占 2/3 以上伴严重出血， 大量炎细胞浸润。对 照组和治疗组肝损伤程度的组织病理评分见表 5， 治疗组较模型对照组差异有显著性意义。 大剂量治疗效果与小剂量之间没有显著性差异。
表 5IL-4 治疗重症肝炎模型小鼠的肝脏病理评价
4.IL-4 治疗降低重型肝炎小鼠血清和肝脏中炎症因子水平 1)IL-4 治疗降低重型肝炎小鼠体内炎症因子表达水平 在重型肝炎小鼠肝衰竭过程中， TNF-α、 IFN-γ 是关键损伤因子， 在小鼠重型肝炎的发展过程中起重要作用。与病毒性肝炎所致急性肝衰竭的发病机制相似， TNF-α 可以通 过上调免疫应答， 促进炎症细胞因子如 IL-1β、 IL-6 等的释放， 介导和增强对肝组织的炎 性损伤。 而 IFN-γ 主要由活化的 Th1 细胞分泌， 可以通过激活单核巨噬细胞， 促进 CTL 成熟 及活性发挥， 增强细胞毒作用。小鼠在发生重型肝炎以后， 体内的炎症因子水平明显上升， 与正常组有显著性差异 (P ＜ 0.05 或 P ＜ 0.01)， IL-4 治疗的重型肝炎小鼠模型其体内的 炎症细胞因子 TNF-α( 图 2)、 IL-1β( 图 3)、 IL-6( 图 4)、 IFN-γ( 图 5) 表达明显降低， 与 模型组相比均有显著性差异 (P ＜ 0.05 或 P ＜ 0.01)， 说明 IL-4 治疗减轻了肝脏炎症反应， 阻止了肝细胞的坏死和凋亡， 阻断了肝衰竭的发展。
2)IL-4 治疗降低重型肝炎小鼠肝脏炎症因子 mRNA 转录水平
如图十所示， 小鼠发生重型肝炎以后， 肝脏内的炎症因子 mRNA 水平明显升高。由 正常情况下的炎症因子 mRNA 转录水平的。不表达或低表达， 变为有表达或高表达。在有效 剂量的 IL-4 的治疗情况下， 炎症因子的 mRNA 水平明显下降， 说明 IL-4 能够抑制炎症因子 的表达。而随着 IL-4 治疗剂量的降低， 抑制作用也明显减弱， 见图 6。
5.IL-4 治疗改善重型肝炎小鼠肝细胞凋亡情况
肝细胞凋亡是重型肝炎小鼠模型的发病机制不可缺少的一步。正常小鼠对照组 肝脏细胞凋亡很少， 或几乎没有 ； 重型肝炎模型组肝组织有大量凋亡细胞及凋亡小体， 核染 色质凝聚 ； IL-4 大剂量及小剂量治疗组小鼠肝脏的 Tunnel 阳性细胞明显减少， 与模型组比 较， 具有明显统计学差异。 6.IL-4 治疗增加重型肝炎小鼠肝内 GSH 含量， 结果见表 6
肝细胞初始和后续损伤过程中， 线粒体氧自由基的生成量增多， 启动脂质过氧化 反应， 过氧化反应产物可通过与肝线粒体膜磷脂、 肝线粒体蛋白以及肝线粒体 mtDNA 的相 互作用， 导致肝线粒体发生损伤 ； 同时， 脂质过氧化物的急剧增多， 再次诱发生成更多的氧 自由基， 导致细胞功能失异常、 凋亡或死亡。
GSH 是由谷氨酸、 半胱氨酸、 甘氨酸组成的三肽， 它可直接通过提供 H+ 拮抗氧自由 基毒性， 清除体内的超氧离子及其它自由基， 当肝线粒体内 GSH 被耗竭时， 肝细胞迅速发生 死亡。实验发现， 在小鼠发生重型肝炎以后， 肝内的 GSH 含量降低， 而 IL-4 治疗以后， 肝内 GSH 的含量明显升高， 与正常对照和重肝模型对照相比， 有显著性差异 (P ＜ 0.05)。
表 6IL-4 治疗对小鼠肝内 GSH 含量的影响
组别 正常对照组 模型对照组 大剂量治疗组 小剂量治疗组
N 3 3 3 3GSH(0D420) 0.16±0.015 0.13±0.011 0.21±0.025* 0.17±0.021注： * 表示与模型对照组相比， P ＜ 0.05， 差异有显著意义7.IL-4 治疗降低重型肝炎小鼠肝脏 iNOS 的水平
NO 参与了重症肝炎的发病机制， 是肝细胞损伤过程中的重要介质之一。重型肝炎 发生时， 肝细胞大量表达诱导性一氧化氮合成酶 (Inductible Nitric Oxide Synthase， iNOS) 的 mRNA， 使自身得以合成 iNOS， 促进 NO 的产生。NO 作为一种自由基， 可直接导致细 胞的损伤， 也可以破坏细胞的呼吸链， 耗竭细胞， 损伤并增强细胞对氧自由基的敏感性， 促 进炎症的发生发展。实验结果见图 8， 大剂量 IL-4 治疗组小鼠的肝脏内， iNOS 的 mRNA 水平 和蛋白水平都较模型对照组低， 和正常组水平相当。
上述实验结果表明 ： IL-4 治疗可以降低重型肝炎模型小鼠血清 ALT、 AST、 LDH、 BILT 水平， 肝脏病理切片显示， 治疗后重症肝炎模型小鼠的肝脏病理损伤程度明显减轻。 经 过 ELISA 方法检测， IL-4 治疗能够降低重型肝炎小鼠血清和肝脏中炎症因子水平， RT-PCR 检测， 肝内炎症因子的 mRNA 水平也明显下调。 IL-4 治疗能够改善重型肝炎小鼠肝脏细胞凋 亡情况， 治疗以后的重肝小鼠其肝脏的凋亡明显减少。IL-4 治疗能够提高重型肝炎小鼠肝 内还原型谷胱甘肽的含量， 这对于保护肝损伤具有重要的作用。5.IL-4 治疗降低重型肝炎 小鼠肝诱导性一氧化氮合成酶的水平， 减弱 NO 对肝脏的损伤程度。综合实验结果来看， 用 量 5ug/kg/dIL-4 最佳， 可使用范围为 4ug/kg/d ～ 5ug/kg/d IL-4 较好。 由上述实例可知， IL-4 在具有好的重型肝炎的作用， 以其为活性成分制备治疗重 型肝炎的药物， 具有很好的应用前景。