联合使用痘病毒载体HIV疫苗与腺病毒载体HIV疫苗的方法及其应用.pdf

本发明提供了一种联合使用痘病毒载体HIV疫苗与腺病毒载体HIV疫苗的方法，具体为联合使用痘病毒载体HIV疫苗与腺病毒载体HIV疫苗免疫机体。该方法可以先使用痘病毒载体HIV疫苗免疫机体，再使用腺病毒载体HIV疫苗免疫机体；也可以先使用腺病毒载体HIV疫苗免疫机体，再使用痘病毒载体HIV疫苗免疫机体。本发明还提供了上述联合使用痘病毒载体与腺病毒载体的方法应用在预防性和治疗性HIV疫苗领域，以预防和治疗艾滋病以及预防和控制乙肝、埃博拉病毒和肿瘤中。本发明的方法能诱发更强烈、更广谱和多功能性的T淋

1、  联合使用痘病毒载体HIV疫苗与腺病毒载体HIV疫苗的方法，其特征在于，联合使用痘病毒载体HIV疫苗与腺病毒载体HIV疫苗免疫机体。

2、  根据权利要求1所述的联合使用痘病毒载体HIV疫苗与腺病毒载体HIV疫苗的方法，其特征在于，先使用痘病毒载体HIV疫苗免疫机体，再使用腺病毒载体HIV疫苗免疫机体。

3、  根据权利要求1所述的联合使用痘病毒载体HIV疫苗与腺病毒载体HIV疫苗的方法，其特征在于，先使用腺病毒载体HIV疫苗免疫机体，再使用痘病毒载体HIV疫苗免疫机体。

4、  根据权利要求1所述的联合使用痘病毒载体HIV疫苗与腺病毒载体HIV疫苗的方法，其特征在于，所述的痘病毒载体HIV疫苗含HIVgag，pol和env基因。

5、  根据权利要求4所述的联合使用痘病毒载体HIV疫苗与腺病毒载体HIV疫苗的方法，其特征在于，所述的痘病毒载体HIV疫苗还可含辅助调控蛋白基因，所述辅助调控蛋白基因包括nef、vpx、vpr、vif、rev和tat基因。

6、  根据权利要求1所述的联合使用痘病毒载体HIV疫苗与腺病毒载体HIV疫苗的方法，其特征在于，所述的腺病毒载体HIV疫苗含HIVgag，pol和env基因。

7、  根据权利要求6所述的联合使用痘病毒载体HIV疫苗与腺病毒载体HIV疫苗的方法，其特征在于，所述的腺病毒载体HIV疫苗还可含辅助调控蛋白基因，所述辅助调控蛋白基因包括nef、vpx、vpr、vif、rev和tat基因。

8、  根据权利要求1所述的联合使用痘病毒载体HIV疫苗与腺病毒载体HIV疫苗的方法，其特征在于，所述免疫机体的途径包括粘膜途径、肌肉注射途径和静脉注射途径。

9、  根据权利要求1所述的联合使用痘病毒载体HIV疫苗与腺病毒载体HIV疫苗的方法，其特征在于，所述的腺病毒载体为5型腺病毒载体。

10、  根据权利要求1所述的联合使用痘病毒载体HIV疫苗与腺病毒载体HIV疫苗的方法，其特征在于，所述的痘病毒载体为改良型天坛株痘病毒载体。

11、  权利要求1-10之一所述的联合使用痘病毒载体HIV疫苗与腺病毒载体HIV疫苗的方法在防治艾滋病中的应用。

12、  根据权利要求1-10之一所述的联合使用痘病毒载体HIV疫苗与腺病毒载体HIV疫苗的方法在预防和控制乙肝、埃博拉病毒以及肿瘤中的应用。

联合使用痘病毒载体HIV疫苗与腺病毒载体HIV疫苗的方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及联合使用痘病毒载体HIV疫苗和腺病毒载体HIV疫苗预防和治疗艾滋病的新方法及其应用。
背景技术
艾滋病(Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS)已成为全球公共卫生的最重大挑战之一，严重危害了社会进步与经济增长。世界卫生组织(WHO)和联合国艾滋病规划署(UNAIDS)在2008年底公布，目前全球HIV感染者总人数约为3300万，已经死亡的艾滋病病人累计超过了3000万名；仅2007年，全球就有210万人死于艾滋病，270万人感染艾滋病病毒；亚洲和东欧已经成为艾滋病毒传播最为迅速的地区(UNAIDS report，2008)。我国的HIV流行趋势也相当严重，截至2007年10月底，全国累计报告艾滋病病毒感染者和艾滋病病人22.4万多例，全国流行病调查估计全国存活HIV感染者总数约70万人，其中2007年新感染者约5万人。因此防治艾滋病药物与疫苗的研究将是我国科技部“十一五”计划的重中之重。
在过去的一、二十年里在药物治疗控制艾滋病方面虽然取得了多项进展，在发达国家的艾滋病病死率显著下降，出现了一些可以治疗和控制HIV的新药物(如抗逆转录病毒药物、蛋白酶抑制物等)和新疗法(联合鸡尾酒法)，但机体一旦感染后就无法根除HIV病毒，而且由于高变异性，HIV病毒的耐药情况日趋严重，并且药物治疗给HIV感染者带来了很大的不良反应以及病人的经济承受能力等问题使得这些疗法的前景不尽人意，因此研制有效的HIV疫苗仍是最迫切的需要。在HIV疫苗领域，一般认为HIV疫苗的研究可分为经历了三个阶段：
第一阶段：起始于1984年的艾滋病疫苗研究集中在以诱导抗体以预防病毒感染为主要目标，没有考虑细胞免疫的作用。2003年在欧美和泰国结束的两个艾滋病疫苗III期临床试验，即实际意义上的艾滋病疫苗第一发展阶段研究成果的临床验证，结果表明单纯诱导抗体产生的疫苗不具真正的保护效果。
第二阶段：艾滋病疫苗研究则强调细胞免疫反应作用。该阶段以诱导细胞免疫反应的重组病毒载体疫苗为主(痘苗、腺病毒、金丝雀痘病毒等)，因为理论上细胞免疫反应可以有效控制HIV病毒的复制与感染，而且数学模型也显示，病毒载量降低1个log值就可以有效降低人群的传播率，这让临床试验看到了这种疫苗的应用前景。这其中最显著的成果之一就是默克(Merck)公司组织开发的以人腺病毒5型为载体的艾滋病疫苗，在SHIV89.6P模型证明了诱导产生针对HIV的CD8T细胞免疫反应有较好的保护作用。随之Merck公司将该疫苗推入到临床实验，到2004年已经进入临床IIb阶段，但据2007年9月公布的临床试验结果来看，单纯的强调细胞免疫应答也不能产生保护作用。
目前较为流行的观点，即第三阶段的观点认为，有效的艾滋病疫苗需要同时诱导出均衡的体液和细胞免疫反应。在病毒感染时抗体作为第一道防线可以中和部分病毒，这给后续的细胞介导的记忆应答争取了激活时间，而强烈的细胞免疫应答可清除感染病毒的细胞，降低病毒载量，从而可以降低HIV病毒在人群的传播率。
McElrath等较系统地分析了Merck的HIV临床实验数据，结果发现虽然没有起到保护作用，但该疫苗在大多数受试人群中(77％)产生了较强的免疫应答，而且分析还发现这些人群中的特异CD8+T细胞主要以单独分泌IFN-γ细胞因子为主(73％)，也有一些分泌TNF-a，但极少有分泌IL-2细胞因子的细胞或者同时分泌多种细胞因子的淋巴细胞。此外，最新的资料表明相比于单独用Ad5载体免疫两次印度恒河猴，通过不同血清型的腺病毒载体(rAd26/rAd5)联合免疫后，诱发了更强更广的细胞免疫应答。而且还产生了更多的同时分泌多种细胞因子(IFN-γ/TNF-a/IL-2)的多功能性的CD8+和CD4+T淋巴细胞。更有意义的是，在通过静脉方式感染SIVmac251病毒后，相比与只免疫两次Ad5载体，rAd26/rAd5联合免疫组更有效地控制了病毒的复制与感染，这组猴子体内的SIVmac251病毒的峰值载量降低了1.4个log值，在平台期(setpoint)的病毒载量更是降低了2.4个log值。而且在整个实验期间(500多天)该组的猴子都没有死于AIDS或者发生明显的AIDS症状，但其他组猴子都有不同程度的发病死亡。
总之，结合最近的研究成果与Merck疫苗的失败经验，这个领域的科研工作者们普遍认为基于HIV疫苗的发展方向应该是能够诱导更强烈，更广谱和多功能性的T淋巴细胞反应，同时诱发一定的体液免疫应答，这样才有可能产生对HIV病毒有效的免疫保护。为了寻找到最终有效的HIV疫苗，科研工作者们应该尝试多种不同类型的疫苗联合使用以期找到最佳组合。
腺病毒载体具有感染效率和外源基因表达水平高、高滴度重组病毒制备简单、容量大等优点，因而Ad载体作为哺乳动物细胞表达载体、重组疫苗和基因治疗载体备受青睐。目前全球范围内以腺病毒作为载体治疗传染性疾病、癌症、心血管疾病、单基因疾病等的临床实验有342例之多，在各类载体中占首位(24.8％)。
天坛株痘病毒(VTT)作为预防天花的疫苗，在中国大量人群中长期使用过，具有非常好的安全性，是个非常理想的疫苗载体。本研究中用到的痘病毒载体是进一步减毒的MVTT毒株，实验证明它的神经毒性大大降低。因此既可以作为安全的天花疫苗，也可以作为针对其他病原体疫苗的活载体。而且实验还表明这个载体可以通过黏膜途径，例如鼻腔和口服等，而诱导出全身性的黏膜反应。
目前，还没有将重组腺病毒载体HIV/SIV疫苗与改良型痘病毒天坛株(MVTT)载体HIV/SIV疫苗联合使用的报道。
发明内容
为了研制新型的安全有效的HIV疫苗以预防和治疗艾滋病，本发明提供了一种联合使用痘病毒载体与腺病毒载体的方法，该方法能用于预防和治疗HIV及其它传染性疾病和肿瘤。
本发明的联合使用痘病毒载体HIV疫苗与腺病毒载体HIV疫苗的方法，具体为联合使用痘病毒载体HIV疫苗与腺病毒载体HIV疫苗免疫机体，以诱发更强烈更广谱和多功能性的T淋巴细胞反应和体液免疫应答，从而对HIV病毒感染起到有效的预防和治疗效果。
该方法可以先使用痘病毒载体HIV疫苗免疫机体，再使用腺病毒载体HIV疫苗免疫机体。
该方法也可以先使用腺病毒载体HIV疫苗免疫机体，再使用痘病毒载体HIV疫苗免疫机体。
优选的，该方法中，痘病毒载体HIV疫苗含HIVgag，pol，env基因。
优选的，痘病毒载体HIV疫苗还含辅助调控蛋白基因，所述辅助调控蛋白基因包括nef、vpx、vpr、vif、rev和tat基因。
优选的，该方法中，腺病毒载体HIV疫苗含HIVgag，pol，env基因。
优选的，腺病毒载体HIV疫苗还含辅助调控蛋白基因，所述辅助调控蛋白基因包括nef、vpx、vpr、vif、rev和tat基因。
优选的，所述免疫机体的途径是指通过粘膜途径免疫机体，例如鼻腔，口腔等；通过肌肉注射途径免疫机体；通过静脉注射途径以及其它所有的疫苗使用途径。
优选的，上述腺病毒载体指本领域技术人员已知的任何腺病毒亚型，分离株或其他动物来源的腺病毒。具体地，可以是5型或2型腺病毒载体。
优选的，上述痘病毒载体指本领域技术人员已知的任何痘病毒亚型，分离株。具体地，可以是改良型天坛株痘病毒载体。
本发明还提供了上述联合使用痘病毒载体与腺病毒载体的方法应用在预防性和治疗性HIV疫苗领域，以预防和治疗艾滋病，以及在预防和控制乙肝、埃博拉病毒和肿瘤中的应用。
相比与单独使用痘病毒载体或腺病毒载体的HIV疫苗，联合使用携带HIVgag，pol，env基因的痘病毒载体和腺病毒载体免疫机体后诱发了更强烈、更广谱和多功能性的T淋巴细胞反应，而且对直肠方式感染的SIVmac239病毒表现出很强的保护和控制作用。资料已经表明，强烈、广谱和多功能性的T淋巴细胞反应，尤其是杀伤性T淋巴细胞反应在控制各种感病毒性传染疾病以及肿瘤方面都发挥着非常重要的作用，因此本发明中的增强机体产生更强烈、更广谱和多功能性的T淋巴细胞反应的策略同样适合于防治各种感病毒性传染疾病，例如乙肝，埃博拉病毒等，以及各种肿瘤。此外由于痘病毒载体和腺病毒载体已广泛应用于临床实验，因此它们具有良好的安全性，使得这种策略的临床应用前景非常光明。发明人的试验数据为这种疫苗策略进入临床试验奠定了坚实的基础。本发明可以普遍用于预防和治疗艾滋病，以及预防和控制其它传染性疾病和肿瘤。
下面将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
附图说明
图1是用western-blot方法检测重组腺病毒蛋白表达水平的检测结果图；
图2是重组腺病毒在小鼠中的初次免疫和加强免疫后的免疫原性比较图；图2A是重组腺病毒在小鼠中的初次免疫后的免疫原性比较图；图2B是重组腺病毒在小鼠中的加强免疫后的免疫原性比较图；
图3是联合使用痘病毒载体(MVTT)SIV疫苗和腺病毒(Ad5)载体SIV疫苗在恒河猴中的免疫和攻毒方案；
图4是ELISPOT检测联合使用MVTT载体和Ad5载体在恒河猴中的免疫原性；图4A是距最后一次免疫6周的ELISPOT检测数据，图4B是距最后一次免疫21周的ELISPOT检测数据；
图5是MVTT与Ad5载体HIV疫苗联合对恒河猴进行加强免疫后6周，用多色流式技术对Gag肽刺激的CD8+T细胞分泌细胞因子的检测结果；
图6是MVTT与Ad5载体HIV疫苗联合对恒河猴进行加强免疫后16周后，用多色流式技术检测外周血中的记忆性T细胞分泌细胞因子的检测结果；图6A是检测效应性CD8T细胞分泌各种细胞因子的试验数据；图6B是检测中枢性CD8T细胞分泌各种细胞因子的试验数据；
图7是MVTT与Ad5载体HIV疫苗联合对恒河猴进行加强免疫后16周后，用活细胞染料羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)染色检测T淋巴细胞的增殖能力的结果图；图7A是CD4T细胞的增殖情况；图7B是CD8T细胞的增殖情况；
图8是实验猴经SIVmac239攻毒后针对SIV各个抗原的细胞免疫应答；图8A是针对结构蛋白(Gag，Pol和Env)的免疫应答；图8B是针对辅助调控蛋白(Nef，Vpx，Vpr，Vif，Rev和Tat)的免疫应答；
图9是通过ELISA技术检测SIVmac239感染实验猴前后的SIV特异的抗体反应水平；
图10是通过定量PCR技术检测实验猴体内的病毒载量峰值的数据结果图。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
实施例一：携带SIVgag、pol和env基因的腺病毒和痘病毒疫苗的构建和在小鼠中的免疫原性
1、SIVmac239基因的获得
通过全基因合成得到实验所需要的各个基因，本实施例涉及SIVmac239病毒的全部3个基因，即SIVmac239gag、pol和env。从NCBI数据库中得到这些蛋白的氨基酸序列，然后在保证其氨基酸序列不发生任何改变的情况下按照人源密码子反向翻译为DNA序列，使得这些抗原在灵长类细胞中高效表达。
1.1本实施例中用到的SIVmac239gag基因优化序列如下：
cgaagcttac catgggcgtg aggaactctg tgctgtctgg caagaaggct gatgagctgg    60
agaagatcag gctgaggccc aatggcaaga agaagtacat gctgaagcat gtggtgtggg    120
ctgccaatga gctggacagg tttggcctgg ctgagtccct gctggagaac aaggagggct    180
gccagaagat cctgtctgtg ctggcccccc tggtgcccac aggctctgag aacctgaagt    240
ccctgtacaa cacagtgtgt gtgatctggt gcatccatgc tgaggagaag gtgaagcaca    300
cagaggaggc caagcagatt gtgcagaggc acctggtggt ggagacaggc accacagaga    360
ccatgcccaa gacctccagg cccacagccc cctcctctgg cagggggggc aactaccctg    420
tgcagcagat tgggggcaac tatgtgcacc tgcccctgtc ccccaggacc ctgaatgcct    480
gggtgaagct gattgaggag aagaagtttg gggctgaggt ggtgcctggc ttccaggccc    540
tgtctgaggg ctgcaccccc tatgacatca accagatgct gaactgtgtg ggggaccacc    600
aggctgctat gcagatcatc agggacatca tcaatgagga ggctgctgac tgggacctgc    660
agcaccccca gcctgccccc cagcagggcc agctgaggga gccctctggc tctgacattg    720
ctggcaccac ctcctctgtg gatgagcaga tccagtggat gtacaggcag cagaacccca    780
tccctgtggg caacatctac aggaggtgga tccagctggg cctgcagaag tgtgtgagga    840
tgtacaaccc caccaacatc ctggatgtga agcagggccc caaggagccc ttccagtcct    900
acgtggacag gttctacaag tccctgaggg ctgagcagac agatgctgct gtgaagaact    960
ggatgaccca gaccctgctg atccagaatg ccaaccctga ctgcaagctg gtgctgaagg    1020
gcctgggggt gaaccccacc ctggaggaga tgctgacagc ctgccagggg gtggggggcc    1080
ctggccagaa ggccaggctg atggctgagg ccctgaagga ggccctggcc cctgtgccca    1140
tcccctttgc tgctgcccag cagaggggcc ccaggaagcc catcaagtgc tggaactgtg    1200
gcaaggaggg ccactctgcc aggcagtgca gggcccccag gaggcagggc tgctggaagt    1260
gtggcaagat ggaccatgtg atggccaagt gccctgacag gcaggctggc ttcctgggcc    1320
tgggcccctg gggcaagaag cccaggaact tccccatggc ccaggtgcac cagggcctga    1380
tgcccacagc cccccctgag gaccctgctg tggacctgct gaagaactac atgcagctgg    1440
gcaagcagca gagggagaag cagagggagt ccagggagaa gccctacaag gaggtgacag    1500
aggacctgct gcacctgaac tccctgtttg ggggggacca gtaaagtaaa gcccgggtct    1560
agagg                                                                1565
1.2本实施例中用到的SIVmac239pol基因优化序列如下：
gatccaccat ggtgctggag ctgtgggaga ggggcaccct gtgcaaggcc atgcagtccc    60
ccaagaagac aggcatgctg gagatgtgga agaatggccc atgctatggc cagatgccca    120
ggcagacagg cggcttcttc aggccatggt ccatgggcaa ggaggccccc cagttccccc    180
atggctcctc tgcctctggc gctgatgcca actgctcccc caggggccca tcctgtggct    240
ctgccaagga gctgcatgct gtgggccagg ctgctgagag gaaggctgag aggaagcaga    300
gggaggccct gcagggcggc gacaggggct ttgctgcccc ccagttctcc ctgtggagga    360
ggcctgtggt gacagcccac attgagggcc agcctgtgga ggtgctgctg gacacaggcg    420
ctgatgactc cattgtgaca ggcattgagc tgggccccca ctacaccccc aagattgtgg    480
gcggcattgg cggcttcatc aacaccaagg agtacaagaa tgtggagatt gaggtgctgg    540
gcaagaggat caagggcacc atcatgacag gcgacacccc catcaacatc tttggcagga    600
acctgctgac agccctgggc atgtccctga acttccccat tgccaaggtg gagcctgtga    660
aggtggccct gaagcctggc aaggatggcc ccaagctgaa gcagtggccc ctgtccaagg    720
agaagattgt ggccctgagg gagatctgtg agaagatgga gaaggatggc cagctggagg    780
aggccccccc caccaaccca tacaacaccc ccacctttgc catcaagaag aaggacaaga    840
acaagtggag gatgctgatt gacttcaggg agctgaacag ggtgacccag gacttcacag    900
aggtgcagct gggcatcccc catcctgctg gcctggccaa gaggaagagg atcacagtgc    960
tggacattgg cgatgcctac ttctccatcc ccctggatga ggagttcagg cagtacacag    1020
ccttcaccct gccatctgtg aacaatgctg agcctggcaa gaggtacatc tacaaggtgc    1080
tgccccaggg ctggaagggc tcccctgcca tcttccagta caccatgagg catgtgctgg    1140
agccattcag gaaggccaac cctgatgtga ccctggtgca gtacatggat gacatcctga    1200
ttgcctctga caggacagac ctggagcatg acagggtggt gctgcagtcc aaggagctgc    1260
tgaactccat tggcttctcc acccctgagg agaagttcca gaaggacccc ccattccagt    1320
ggatgggcta tgagctgtgg cccaccaagt ggaagctgca gaagattgag ctgccccaga    1380
gggagacctg gacagtgaat gacatccaga agctggtggg cgtgctgaac tgggctgccc    1440
agatctaccc tggcatcaag accaagcatc tgtgcaggct gatcaggggc aagatgaccc    1500
tgacagagga ggtgcagtgg acagagatgg ctgaggctga gtatgaggag aacaagatca    1560
tcctgtccca agagcaggag ggctgctact accaggaggg caagcccctg gaggccacag    1620
tgatcaagtc ccaggacaac cagtggtcct acaagatcca tcaggaggac aagatcctga    1680
aggtgggcaa gtttgccaag atcaagaaca cccacaccaa tggcgtgagg ctgctggccc    1740
atgtgatcca gaagattggc aaggaggcca ttgtgatctg gggccaggtg cccaagttcc    1800
atctgcctgt ggagaaggat gtctgggagc agtggtggac agactactgg caggtgacct    1860
ggattcctga gtgggacttc atctccaccc cccccctggt gaggctggtc ttcaacctgg    1920
tgaaggaccc cattgagggc gaggagacct actacacaga tggctcctgc aacaagcagt    1980
ccaaggaggg caaggctggc tacatcacag acaggggcaa ggacaaggtg aaggtgctgg    2040
agcagaccac caaccagcag gctgagctgg aggccttcct gatggccctg acagactctg    2100
gccccaaggc caacatcatt gtggactccc agtatgtgat gggcatcatc acaggctgcc    2160
ccacagagtc tgagtccagg ctggtgaacc agatcattga ggagatgatc aagaagtctg    2220
agatctatgt ggcctgggtg cctgcccaca agggcattgg cggcaaccag gagattgacc    2280
atctggtctc ccagggcatc aggcaggtgc tgttcctgga gaagattgag cctgcccagg    2340
aggagcatga caagtaccac tccaatgtga aggagctggt cttcaagttt ggcctgccca    2400
ggattgtggc caggcagatt gtggacacct gtgacaagtg ccatcagaag ggcgaggcca    2460
tccatggcca ggccaactct gacctgggca cctggcagat ggactgcacc catctggagg    2520
gcaagatcat cattgtggct gtgcatgtgg cctctggctt cattgaggct gaggtgatcc    2580
cccaggagac aggcaggcag acagccctgt tcctgctgaa gctggctggc aggtggccca    2640
tcacccatct gcacacagac aatggcgcca actttgcctc ccaagaggtg aagatggtgg    2700
cctggtgggc tggcattgag cacacctttg gcgtgccata caacccccag tcccagggcg    2760
tggtggaggc catgaaccat catctgaaga accagattga caggatcagg gagcaggcca    2820
actctgtgga gaccattgtg ctgatggctg tgcactgcat gaacttcaag aggaggggcg    2880
gcattggcga catgacccct gctgagaggc tgatcaacat gatcaccaca gagcaggaga    2940
tccagttcca gcagtccaag aactccaagt tcaagaactt cagggtctac tacagggagg    3000
gcagggacca gctgtggaag ggccctggcg agctgctgtg gaagggcgag ggcgctgtga    3060
tcctgaaggt gggcacagac atcaaggtgg tgcccaggag gaaggccaag atcatcaagg    3120
actatggcgg cggcaaggag gtggactcct cctcccacat ggaggacaca ggcgaggcca    3180
gggaggtggc tgactacaag gatgatgatg acaagtaaat ctagagg                  3227
1.3本研究中用到的SIVmac239env基因优化序列如下：
cgggatccac catgggctgc ctgggcaacc agctgctgat tgccatcctg ctgctgtctg    60
tctatggcat ctactgcacc ctgtatgtga cagtcttcta tggcgtgcct gcctggagga    120
atgccaccat ccccctgttc tgtgccacca agaacaggga cacctggggc accacccagt    180
gcctgcctga caatggcgac tactctgagg tggccctgaa tgtgacagag tcctttgatg    240
cctggaacaa cacagtgaca gagcaggcca ttgaggatgt ctggcagctg tttgagacct    300
ccatcaagcc atgtgtgaag ctgtcccccc tgtgcatcac catgaggtgc aacaagtctg    360
agacagacag gtggggcctg accaagtcca tcaccaccac agcctccacc acctccacca    420
cagcctctgc caaggtggac atggtgaatg agacctcctc ctgcattgcc caggacaact    480
gcacaggcct ggagcaggag cagatgatct cctgcaagtt caacatgaca ggcctgaaga    540
gggacaagaa gaaggagtac aatgagacct ggtactctgc tgacctggtc tgtgagcagg    600
gcaacaacac aggcaatgag tccaggtgct acatgaacca ctgcaacacc tctgtgatcc    660
aggagtcctg tgacaagcac tactgggatg ccatcaggtt caggtactgt gccccccctg    720
gctatgccct gctgaggtgc aatgacacca actactctgg cttcatgccc aagtgctcca    780
aggtggtggt ctcctcctgc accaggatga tggagaccca gacctccacc tggtttggct    840
tcaatggcac cagggctgag aacaggacct acatctactg gcatggcagg gacaacagga    900
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agacagtgct gcctgtgacc atcatgtctg gcctggtctt ccactcccag cccatcaatg    1020
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tgaagcagac cattgtgaag catcccaggt acacaggcac caacaacaca gacaagatca    1140
acctgacagc ccctggcggc ggcgaccctg aggtgacctt catgtggacc aactgcaggg    1200
gcgagttcct gtactgcaag atgaactggt tcctgaactg ggtggaggac aggaacacag    1260
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acaagctggt ggagatcacc cccattggcc tggcccccac agatgtgaag aggtacacca    1560
caggcggcac ctccaggaac aagaggggcg tctttgtgct gggcttcctg ggcttcctgg    1620
ccacagctgg ctctgccatg ggcgctgcct ccctgaccct gacagcccag tccaggaccc    1680
tgctggctgg cattgtgcag cagcagcagc agctgctgga tgtggtgaag aggcagcagg    1740
agctgctgag gctgacagtc tggggcacca agaacctgca gaccagggtg acagccattg    1800
agaagtacct gaaggaccag gcccagctga atgcctgggg ctgtgccttc aggcaggtct    1860
gccacaccac agtgccatgg cccaatgcct ccctgacccc caagtggaac aatgagacct    1920
ggcaggagtg ggagaggaag gtggacttcc tggaggagaa catcacagcc ctgctggagg    1980
aggcccagat ccagcaggag aagaacatgt atgagctgca gaagctgaac tcctgggatg    2040
tctttggcaa ctggtttgac ctggcctcct ggatcaagta catccagtat ggcgtctaca    2100
ttgtggtggg cgtgatcctg ctgaggattg tgatctacat tgtgcagatg ctggccaagc    2160
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ggacagagct gacctacctg cagtatggct ggtcctactt ccatgaggct gtgcaggctg    2520
tctggaggtc tgccacagag accctggctg gcgcctgggg cgacctgtgg gagaccctga    2580
ggaggggcgg caggtggatt ctggccatcc ccaggaggat caggcagggc ctggagctga    2640
ccctgctgga ctacaaggat gatgatgaca agtaaatcta gagc                     2684
2、重组腺病毒的构建，扩增，纯化与鉴定
按照常规的重组腺病毒构建方法将上述基因分别到腺病毒载体中，其中的腺病毒载体为缺失了E1和E3区域的人五型腺病毒，然后拯救得到携带目的基因的重组腺病毒，少量扩增后进行表达和基因组酶切鉴定，接着在Trex293细胞中大量扩增，并采用氯化铯梯度密度离心进行纯化，对纯化的病毒再次鉴定正确后测定其感染滴度TCID₅₀和物理颗粒浓度，然后分装冻存备用(相关方法的具体操作步骤可参见本申请人的专利，申请号为200710026295.X)。图1是用western-blot方法检测重组腺病毒蛋白表达水平的检测结果图；如图1所示，纯化的重组腺病毒可以高水平的表达目的蛋白，并且这些蛋白可被进一步加工成天然形式的各种蛋白组分。如Ad5-gag可以表达P55和P27，Ad5-pol可以表达P66/51，P31，P10等，Ad5-env可以表达gp160，gp120，gp41。
3、携带腺病毒载体SIV全抗原组疫苗在小鼠中的免疫原性
进一步，这些疫苗的免疫原性在小鼠中得到了验证，每组10只6-8龄雌性C57BL/6小鼠。免疫剂量为1×10¹⁰vp重组腺病毒/只/100μL，分别在小鼠两侧的股四头肌各注射50μL。共免疫2次，间隔2周。图2是重组腺病毒在小鼠中的初次免疫和加强免疫后的免疫原性比较图；图2A是重组腺病毒在小鼠中的初次免疫后的免疫原性比较图；图2B是重组腺病毒在小鼠中的加强免疫后的免疫原性比较图；如图2A和2B所示，初次免疫和加强免疫后取出小鼠的脾脏，按组混合在一起，制备脾脏细胞进行ELISPOT检测，在各个免疫组，小鼠都可以检测到较强的IFN-γELISPOT免疫应答，其中产生针对SIV Gag和Pol的应答水平相对更高。更有意义地是在第5组，即同时免疫SIVgag，pol和env的小鼠体内可同时产生针对这3个SIV抗原的免疫反应。相比于单独免疫一种抗原，这组的免疫应答水平有所下降，这可能与在机体中同时高水平表达多个抗原，会导致抗原间的相互竞争有关。虽然针对单独某个抗原的反应有所下降，但我们也可看到针对各个抗原的整体反应水平更趋向一致，即针对各抗原的反应更协调，避免产生了针对一些抗原的过度应答，这可能更利于控制SIV病毒的复制。在对照组小鼠中检测不到针对任何SIV抗原的免疫反应。
表达SIVgag、pol和env的痘病毒载体MVTT-gpe(改良型痘病毒天坛株)由香港大学李嘉诚医学院艾滋病研究所陈志伟教授构建并提供，其表达情况和抗原性均由他们得到了证实(Huang X等.Vaccine.2007)。
实施例二：联合使用痘病毒载体SIV疫苗和腺病毒载体SIV疫苗在恒河猴中的免疫反应
1、实验材料
1.1实验动物
16只中国恒河猴购自中国科学院广州生物医药与健康研究院与华南濒危动物研究所合作建立的非人灵长类动物疾病模型研究基地，体重为3-5kg，年龄为3-6岁，雌雄各半。实验前已经对这些猴子进行各项检测，确定结核杆菌、志贺菌、沙门氏菌、STLV-1、SIV、SRV等均为阴性。动物实验的操作符合实验动物使用的相关规定。
1.2病毒
表达SIVgag、pol和env的痘病毒载体MVTT-gpe由香港大学李嘉诚医学院艾滋病研究所陈志伟教授构建并提供；上述构建的表达SIVgag、pol和env的重组腺病毒(Ad5-SIVgag、Ad5-SIVpol和Ad5-SIVenv)。
1.3流式抗体
所用单克隆抗体(抗人CD3-pacific blue(太平洋兰)、抗NHP CD4-FITC、抗人CD4-AmCyan，抗人CD8-PerCP、抗人CD8-APC-Cy7(SK1)，抗人CD28-FITC，抗人CD95-PE-Cy5，抗人TNFa-PE-CY7、抗人IFNγ-PE、抗人IL2-APC)购自BD公司。
1.4SIV各个抗原的多肽
所有的多肽均由美国国立健康研究所艾滋病研究和参考试剂项目(NIHAIDS Research & Reference Reagent Program)提供，大部分肽由15个氨基酸组成，两两之间有11个氨基酸重叠.纯度＞80％。用二甲基亚砜(DMSO)溶解配制成0.4mg/ml/肽的储存液，分装后-70℃保存。
1.5其他试剂
ELISPOT板(品牌：Millipore；货号：MSIPS4510)购自达科为生物科技有限公司，SIV病毒颗粒裂解产物为自己制备，TMB/E底物(货号：ES001)购自美国Chemicon公司。BCIP/NBT底物(品牌：Pierce；货号：34042)购自广州吉泰生物科技有限公司。细胞染料CFSE购自美国分子探针(Molecule Probe)公司。链霉素偶联的碱性磷酸酶(品牌：BD PharMingen，货号：554065)购自基因有限公司。
2、买验方法
2.1动物分组与免疫策略
将16只猴子分为4组，每组4只猴子，如图3所示联合使用痘病毒载体(MVTT)SIV疫苗和腺病毒(Ad5)载体SIV疫苗在恒河猴中的免疫和攻毒方案。检测指标包括ELISPOT，多功能T细胞，细胞增殖与抗体滴度等。其中腺病毒采用肌肉注射的方式免疫，剂量为10¹¹vp/猴。痘病毒的用量为1×10⁸PFU/ml/猴，采用鼻腔免疫和舌下免疫。
2.2多色流式技术检测多功能T细胞
1)分离好的PBMC细胞计数后调整至2×10⁶/ml，加入到24孔培养板，每孔1mL。培养基为R10。
2)在上述细胞悬液中加入特异性抗原肽，阴性对照孔加入相应浓度的DMSO，阳性对照加入佛波酯(PMA)(20ng/ml)+离子霉素(1000ng/ml)。
3)37℃，5％CO₂培养1-2h。
4)加入布雷菲德菌素(BFA)(10μg/ml)混匀。
5)37℃，5％CO₂培养16h。
6)吹打均匀细胞，转移至流式管中(12×75mm聚苯乙烯管)。加入3ml流式洗液。混匀后300g室温离心10分钟。
7)弃上清。分别加入细胞表明标记抗体，如CD3-pacific blue(太平洋兰)，CD4-AmCyan，CD8-APC-Cy7，CD28-FITC，CD95-PE-Cy5，振荡2-3秒。
8)室温避光放置25-30分钟。
9)加入3ml FACS洗液。混匀后300g室温离心10分钟。
10)重复洗涤一次。
11)振荡均匀细胞，然后加入250μl细胞固定/通透液(cytofix/cytoperm，品牌：BD；货号：554722)，混匀。
12)4℃，避光反应20min。
13)加入1ml1×细胞通透/洗涤液(perm/wash，品牌：BD Biosciences；货号：554723。产品为10倍，用之前用无菌蒸馏水稀释至1倍)，400g，离心8min。弃上清。
14)重复一次。
15)弃上清，加入IFNγ-PE/TNFa-PE CY7/IL2-APC(各10ul抗体)，混匀。
16)4℃避光30-60分钟。
17)加入1ml1×细胞通透/洗涤液(perm/wash)，400g，离心8min。
18)弃上清，加入3ml流式洗液。混匀后400g室温离心10分钟。
19)吸走大部分上清，约留300μl。振荡混匀后上机。
20)在FACSAria流式细胞仪上检测，用Cell Quest软件获取数据，然后用Modfit软件分析。
2.3IFN-γ酶联免疫斑点技术
第一天：
取一管包被抗体(抗猴IFN-γ抗体对其中包含有这个抗体，品牌：U-Cytech，克隆号为MD-1)用无菌PBS(pH7.2-7.4)1∶100稀释，100μl/孔加入到96孔PVDF膜板，4℃包被过夜。
第二天：
①甩去液体，用无菌PBS洗涤3次，每孔加入200μl R10完全培养基，37℃封闭2小时。
②封闭期间分离PBMC。采用95％稀释的淋巴细胞分离液(商品名为opti-prep)分离淋巴细胞。
③弃去封闭液，每孔加入100μl PBMC。
④实验中设阳性对照组(ConA组)，特异肽，空白对照(DMSO)。在37℃5％CO2培养箱中孵育。
第三天：
⑤24h后，弃去细胞悬液，用无菌PBST 220μl/well洗涤6次。
⑥甩去洗液，在无菌干燥纸上扣干。
⑦用含5％FBS的PBST按1∶400稀释检测抗体(生物素标记的抗猴IFN-γ抗体)，100μl/well，4℃过夜。
第四天：
①用无菌PBST 220μl/孔洗涤4次。
②甩去洗液，在无菌干燥纸上扣干。
③配置链霉素偶联的碱性磷酸酶：用含5％FBS的PBST按1∶2500稀释链霉素偶联的碱性磷酸酶，100μl/孔，37℃，2小时。
④处理BCIP/NBT底物(Pierce，Cat：34042)，37℃温浴30min。
⑤用无菌PBST 220μl/孔洗涤5次，甩去洗液，在无菌干燥纸上扣干。
⑥加入BCIP/NBT底物，100μl/孔，避光反应7min。
⑦弃去底物，用水洗涤2次。风干读板。
2.4CFSE检测淋巴细胞增殖情况
1)分离恒河猴的PBMC细胞。
2)细胞计数后300g离心10分钟。弃上清，加入0.1％FBS/PBS液体重悬，洗涤一次，再用合适体积数目的0.1％FBS/PBS重悬，得到4×10⁶/ml的细胞悬液。
3)用0.1％FBS/PBS稀释CFSE储存液至2μmol/L。以下操作尽量避光操作。
4)各取0.25ml上述细胞悬液和CFSE稀释液，轻柔混匀。(此时细胞脆弱，动作要尽量轻柔！)
5)37℃放置10min。
6)加入冰冷的RPMI 1640完全培养液，冰浴5分钟以中止染色。
7)300g室温离心5分钟。弃上清，加入冰冷的含10％FBS的完全1640培养液洗2次。最后用1ml R10培养基重悬。
8)将上述细胞悬液加入24孔培养板，每孔1ml，分别用SEB(终浓度1ug/ml)和特异性多肽库(2μg/ml)刺激。
9)37℃，5％CO2避光培养5-6天。
10)吹打均匀细胞，转移至流式管中(12×75mm聚苯乙烯管)。再加入4mlFACS洗液。混匀后250g室温离心10分钟。
11)真空泵抽吸掉上清。漩涡振荡仪上振荡2-3秒。
12)分别加入20ul CD4-PE，CD8-Percp，CD3-APC。振荡2-3秒。
13)室温避光放置25-30分钟。
14)加入4ml FACS洗液。混匀后300g室温离心10分钟。
15)吸走大部分上清，约留300ul。振荡混匀。直接上机。或继续第15步。
16)加入30ul 10％福尔马林(品牌：Polysciences；货号：04018)，振荡10-20秒。
17)4℃避光保存，24小时内上机检测。
18)在FACScalibur流式细胞仪上检测，用Cell Quest软件获取数据，然后用Modfit软件分析。
2.5数据分析
使用FlowJo软件分析多色流式细胞数据。用JMP version 6.0.3软件进行数据统计分析和作图，比较各组间的差异采用非参数Wilcoxon rank检验。
3、实验结果
3.1MVTT/Ad5联合免疫策略在中国恒河猴中诱发更强更持久的的细胞免疫应答
我们比较了单独使用或者联合使用MVTT载体和Ad5载体在猴子中的免疫原性，结果表明单独免疫一次Ad5载体诱发的免疫反应要远远高于MVTT载体，而联合使用这两种载体的免疫效果又远远强于单独使用任何一种载体。图4是ELISPOT检测联合使用MVTT载体和Ad5载体在恒河猴中的免疫原性；图4A是距最后一次免疫6周的ELISPOT数据，图4B是距最后一次免疫21周的ELISPOT数据。如图4所示，我们观察到单独免疫一次改良型痘病毒天坛株(MVTT)载体，在猴子体内诱发了一定强度的细胞免疫应答，针对其携带的目的抗原的刺激平均产生了237个斑点(百万个PBMC细胞)；单独免疫一次我们构建的5型腺病毒载体，则在猴子体内产生了较强的细胞免疫应答，针对其携带的目的抗原的刺激平均产生了2643个斑点(百万个PBMC细胞)。而用MVTT载体初免，间隔6周后再用Ad5载体加强，则在猴子体内诱发了很高水平的细胞免疫应答，针对其携带的目的抗原的刺激平均产生了7383个斑点(百万个PBMC细胞)。因此这种策略比单独使用一次MVTT载体诱发的细胞免疫的应答水平平均要强31倍之多，而比单独使用一次Ad5载体的应答水平也要强2.8倍。这种策略不仅在猴子体内很快就诱发了很高水平的细胞免疫应答，更重要的是这种反应持续时间很长。在距离最后一次免疫21周后联合免疫组的猴子依然可以检测到很高水平的ELISPOT反应。
3.2MVTT/Ad5联合免疫策略在中国恒河猴中诱发了更多的多功能性的记忆淋巴细胞
虽然IFN-γELISPOT技术已经成为评价HIV疫苗的比较通用且被广泛认可的指标，但当今较被认可的观点是免疫保护和具有多种功能的淋巴细胞数量更有相关性，所谓的多功能的淋巴细胞是指同时分泌包括IFN-γ在内的多种细胞因子的淋巴细胞，这些细胞因子包括IL-2，TNFa，MIP1β等。评价多功能T淋巴细胞将逐渐成为评价HIV疫苗效果的重要指标，为此我们发展和完善了多色流式技术来测定这种策略所产生的多功能性的T淋巴细胞反应情况。结果如图5所示，图5是MVTT与Ad5载体联合对恒河猴进行加强免疫后6周，用多色流式技术对Gag肽刺激的CD8+T细胞分泌细胞因子的检测结果；在MVTT与Ad5载体联合免疫6周后，联合免疫组的猴子中不仅单独分泌某种细胞因子的能力大大加强，更为重要的是检测到了更多同时分泌IFN-γ/TNF-a/IL-2细胞因子的多功能CD8+T淋巴细胞。具体地，在MVTT与Ad5载体联合免疫的猴子中有0.2464±0.2770％的CD8+T淋巴细胞同时分泌IFN-γ/TNF-α/IL-2这3种细胞因子，1.4668±1.1845％的CD8+T淋巴细胞同时分泌IFN-γ/TNF-α这2种细胞因子；而单独免疫Ad5载体的猴子中只有0.0320±0.0472％的CD8+T淋巴细胞同时分泌IFN-γ/TNF-α/IL-2这3种细胞因子，0.1587±0.2035％的CD8+T淋巴细胞同时分泌IFN-γ/TNF-α这2种细胞因子。即相比单独Ad5载体免疫，MVTT与Ad5载体联合免疫后产生了7.7倍多的能同时分泌IFN-γ/TNF-α/IL-2这3种细胞因子的多功能性CD8+T淋巴细胞和9倍多的能同时分泌IFN-γ/TNF-α这2种细胞因子的多功能性CD8+T淋巴细胞。
我们进一步检测了MVTT与Ad5载体联合免疫后的特异性记忆细胞的产生和分泌细胞因子的能力。结果如图6所示，图6是MVTT与Ad5载体联合对恒河猴进行加强免疫后16周后，用多色流式技术检测外周血中的记忆性T细胞分泌细胞因子的检测结果；图6A是检测效应性CD8T细胞分泌各种细胞因子的试验数据；图6B是检测中枢性CD8T细胞分泌各种细胞因子的试验数据。这些猴子体内SIV抗原特异性记忆CD4+T细胞和CD8+T细胞的产生和分泌细胞因子的能力都明显更强。相比于其他组，MVTT和Ad5联合免疫组的猴子外周血中的效应性记忆CD8+细胞分泌细胞因子的能力明显更强，这些细胞以同时分泌IFN-γ/TNF-a两种细胞因子为主。虽然各组实验猴的中枢性记忆CD8+细胞分泌细胞因子的能力差异不大，但相比与效应性记忆T细胞，这些细胞分泌IL-2的能力明显更强。总之，我们检测到了MVTT和Ad5联合免疫可以在恒河猴体内诱发更多的多功能记忆性T淋巴细胞。进一步分析表明这种方法同时诱导产生了中枢性记忆和效应性记忆T细胞，其中以效应性记忆CD8+T细胞为主。
3.3MVTT/Ad5联合免疫策略在中国恒河猴中诱发了更强的淋巴细胞增殖能力
研究表明，HIV长期不进展患者的CD4+T细胞和CD8+T细胞具有很强的针对HIV抗原的体外增殖能力，而HIV发病患者的CD4+T细胞和CD8+T细胞针对HIV抗原的体外增殖能力很弱。而且这种增殖能力和患者血浆中的病毒拷贝数存在着一定程度的负相关性，以及与CD4+T细胞的数量成正相关性。因此检测T淋巴细胞的增殖能力可以较好地反映机体对HIV病毒复制的控制程度。
图7是MVTT与Ad5载体联合对恒河猴进行加强免疫后16周后，用CFSE染色检测T淋巴细胞的增殖能力的结果图；图7A是CD4T细胞的增殖情况；图7B是CD8T细胞的增殖情况。如图7A所示，MVTT与Ad5载体联合免疫猴的PBMC在体外用SIV Gag刺激后有(4.2725±4.5516)％的CD4+细胞为CFSElow，即分裂增殖的子代细胞；而单独Ad5载体免疫猴的PBMC用SIV Gag刺激后有(3.2350±1.7008)％的CD4+T细胞为CFSElow。因此相比于单独Ad5载体，MVTT与Ad5载体联合免疫后针对抗原刺激的CD4+T淋巴细胞增殖能力略有增强。而如图7B所示，用SIV Gag刺激后有(7.4825±5.8550)％的CD8+T细胞为CFSElow，即分裂增殖的子代细胞；而单独Ad5载体免疫猴的PBMC中只有(2.9475±1.6951)％的CD8+T细胞为CFSElow。因此相比于单独Ad5载体，MVTT与Ad5载体联合免疫后针对抗原刺激的CD8+T淋巴细胞增殖能力增强了2.5倍多。
总之MVTT载体初免，Ad5载体加强的免疫方法在中国恒河猴中产生了更强烈，更广谱和更多功能性的T细胞反应，这非常符合最近评价有效疫苗的指标。这种策略所值得进一步研究。
实施例三：联合使用痘病毒载体和腺病毒载体SIV疫苗在恒河猴中的免疫保护试验
1实验材料：
1.1实验动物同实施例2。
1.2病毒
SIVmac239病毒为发明人拯救得到，所用的SIVmac239phage分子克隆由美国国立健康研究所艾滋病研究和参考试剂项目提供。
1.3抗体
所用单克隆抗体(抗人CD3-pacific blue、抗NHP CD4-FITC、抗人CD4-AmCyan，抗人CD8-PerCP、抗人CD8-APC-Cy7(SK1)，抗人CD28-FITC，抗人CD95-PE-Cy5，抗人TNFa-PE-CY7、抗人IFNγ-PE、抗人IL2-APC)购自BD公司。HRP-抗猴IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.4其他试剂
荧光定量RT-PCR检测试剂盒(QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit，货号：：204243)购自Qiagen公司，红细胞裂解液(FACS lysis solution)，绝对计数管(BDTruCOUNT Tubes，货号340334)购自BD Biosciences公司。其他试剂参见实施例2。
2实验方法
2.1动物分组与攻毒实验
将16只猴子分为4组，每组4只猴子，各组的免疫程序如图3所示，在最后一次免疫22周直肠感染SIVmac239病毒，剂量为10⁵TCID₅₀。具体方法为猴子禁食24h，保持臀高位，用小儿胃管插入肛门4-7cm，打入病毒，并打入少量空气。保持这种体位至少20min。
2.2定量PCR测定SIV病毒载量
1)常规方法分离血浆。
2)提取血浆中的SIV病毒RNA。
3)进行一步法荧光定量RT-CR，每次试验都做标准曲线。
4)配置反应体系(使用QuantiTect的SYBR Green RT-PCR试剂盒，货号：204243)：
2x QuantiTect SYBR Green RT-PCR主反应液    25μl
QuantiTect RT mix                          0.5μl
试剂盒自带引物1(10μM)                     0.5μl
试剂盒自带引物2(10μM)                     0.5μl
RNA模板                                    2μl
RNase-free水                               21.5μl
总体积                                     50μl
5)根据样品数量合理安排试验布局。然后按照下列条件进行RT-PCR反应条件：
a)50℃    30min
b)95℃    15min
c)94℃    15s
d)60℃    30s
e)72℃    30s
f)读板；
g)3)-6)循环45周；
h)65-95度做融解曲线，每隔0.5℃读数，保持1秒钟；
i)保持在24℃；
6)根据标准曲线，利用Opticon Monitor 3软件得到各样品的病毒拷贝数，然后根据稀释倍数还原得到每毫升血液中的病毒拷贝数。
2.3SIV病毒颗粒裂解物ELISA方法检测结合抗体
1)包被抗原：96孔板每孔滴加100μl抗原(1μg/ml，用pH7.4的PBS或者pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释)，4℃包被过夜。
2)洗板：次日倒掉抗原，甩干，PBS洗涤3次。
3)封闭：加入含5％脱脂奶粉的PBST，每孔250μl，37℃封闭1h。
4)洗板：每孔加入200μl PBST，3min/次，洗3次，保湿保存备用。
5)加入待测标本：每孔加入100μl，每个样品做双孔测定，37℃反应2h。(如果需要稀释，用封闭液)
6)洗板：每孔加入200μl PBST，3min/次，洗6次。
7)结合第二抗体：每孔加入100μl适当稀释度HRP-抗鼠IgG(1∶8000)抗体或者抗人IgG(1∶4000)，37℃孵育1h。(用封闭液稀释)
8)洗板：每孔加入200μl PBST，3min/次，洗6次。
9)显色：每孔加入100μl酶反应底物TMB，室温放置5-10分钟。
10)加入等体积的1M的H₂SO₄终止反应。
11)结果测定：用酶标板分光光度仪在450nm波长测定OD₄₅₀值
2.4其他方法参见实施例2。
3、实验结果
3.1恒河猴攻毒后针对各个抗原的细胞免疫应答情况
图8是实验猴经SIVmac239攻毒后针对SIV各个抗原的细胞免疫应答；图8A是针对结构蛋白(Gag，Pol和Env)的免疫应答；图8B是针对辅助调控蛋白(Nef，Vpx，Vpr，Vif，Rev和Tat)的免疫应答。如图8A所示，在受到SIVmac239病毒攻击后，联合免疫疫苗组的猴子体内针对疫苗携带的免疫原(gag/pol/env)的反应迅速升高，而对照组的反应则比较缓慢，而且反应强度也相对较弱。这表明本发明的免疫方法有效地诱发了记忆T细胞，这些细胞在遇到相同抗原刺激后迅速被激活并产生相应的免疫应答。更有意思的是在联合免疫组的猴子体内针对疫苗没有携带的免疫原(nef/vpx/vpr/vif/rev/tat)的反应明显比对照组要弱，我们推测这是由于SIV病毒在这些猴子体内被有效地控制在比较低的水平或者没被感染，这样针对病毒本身携带的抗原的反应水平就比较低。这种猜测在接下来的病毒载量测定实验中得到了证实。
3.2恒河猴攻毒后针对SIV的抗体免疫应答情况
我们也对这些实验猴子不同时期血清中的抗体进行了检测，如图9所示，通过ELISA技术检测SIVmac239感染实验猴前后的SIV特异的抗体反应水平，无论是MVTT载体还是Ad5载体，初次免疫后大部分猴子的抗体水平都很低，但在加强免疫后大部分猴子的抗体水平迅速升高。更有意义地是，免疫组的猴子在受到病毒攻击后抗体水平迅速升高到了很高水平。而对照组的实验猴在攻毒前检测不到抗体，攻毒后抗体产生的时间相对缓慢，并且滴度较低。
3.3恒河猴体内的病毒载量测定
攻毒后，所有猴子的病毒载量在10-14天达到峰值。从图10中可以看出，联合免疫组的猴体内病毒载量峰值比对照组有明显减少。联合免疫组4只猴子中有1只至今还没检测到SIV病毒，另外3只的病毒载量比对照组相比降低了1.37log值。这表明我们的联合策略在急性感染期有效地控制了SIV病毒感染和复制，该方法的长期免疫保护效果需要更长的观测时间来证实。有一点需要特别说明，我们是用更难中和的SIVmac239毒株高剂量粘膜感染，而之前别人的研究大部分用毒力相对较弱的毒株。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<120>联合使用痘病毒载体HIV疫苗与腺病毒载体HIV疫苗的方法及其应用
<160>3
<210>1
<211>1565
<212>DNA
<213>SIVmac239gag
<222>(1)...(1565)
<400>1
cgaagcttac catgggcgtg aggaactctg tgctgtctgg caagaaggct gatgagctgg    60
agaagatcag gctgaggccc aatggcaaga agaagtacat gctgaagcat gtggtgtggg    120
ctgccaatga gctggacagg tttggcctgg ctgagtccct gctggagaac aaggagggct    180
gccagaagat cctgtctgtg ctggcccccc tggtgcccac aggctctgag aacctgaagt    240
ccctgtacaa cacagtgtgt gtgatctggt gcatccatgc tgaggagaag gtgaagcaca    300
cagaggaggc caagcagatt gtgcagaggc acctggtggt ggagacaggc accacagaga    360
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tgcagcagat tgggggcaac tatgtgcacc tgcccctgtc ccccaggacc ctgaatgcct    480
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tgtctgaggg ctgcaccccc tatgacatca accagatgct gaactgtgtg ggggaccacc    600
aggctgctat gcagatcatc agggacatca tcaatgagga ggctgctgac tgggacctgc    660
agcaccccca gcctgccccc cagcagggcc agctgaggga gccctctggc tctgacattg    720
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acgtggacag gttctacaag tccctgaggg ctgagcagac agatgctgct gtgaagaact    960
ggatgaccca gaccctgctg atccagaatg ccaaccctga ctgcaagctg gtgctgaagg    1020
gcctgggggt gaaccccacc ctggaggaga tgctgacagc ctgccagggg gtggggggcc    1080
ctggccagaa ggccaggctg atggctgagg ccctgaagga ggccctggcc cctgtgccca    1140
tcccctttgc tgctgcccag cagaggggcc ccaggaagcc catcaagtgc tggaactgtg    1200
gcaaggaggg ccactctgcc aggcagtgca gggcccccag gaggcagggc tgctggaagt    1260
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tgggcccctg gggcaagaag cccaggaact tccccatggc ccaggtgcac cagggcctga    1380
tgcccacagc cccccctgag gaccctgctg tggacctgct gaagaactac atgcagctgg    1440
gcaagcagca gagggagaag cagagggagt ccagggagaa gccctacaag gaggtgacag    1500
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agagg                                                                1565
<210>1
<211>3227
<212>DNA
<213>SIVmac239pol
<222>(1)...(3227)
<400>2
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ccaagaagac aggcatgctg gagatgtgga agaatggccc atgctatggc cagatgccca    120
ggcagacagg cggcttcttc aggccatggt ccatgggcaa ggaggccccc cagttccccc    180
atggctcctc tgcctctggc gctgatgcca actgctcccc caggggccca tcctgtggct    240
ctgccaagga gctgcatgct gtgggccagg ctgctgagag gaaggctgag aggaagcaga    300
gggaggccct gcagggcggc gacaggggct ttgctgcccc ccagttctcc ctgtggagga    360
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gcggcattgg cggcttcatc aacaccaagg agtacaagaa tgtggagatt gaggtgctgg    540
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acctgctgac agccctgggc atgtccctga acttccccat tgccaaggtg gagcctgtga    660
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ttgcctctga caggacagac ctggagcatg acagggtggt gctgcagtcc aaggagctgc    1260
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ggatgggcta tgagctgtgg cccaccaagt ggaagctgca gaagattgag ctgccccaga    1380
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<210>1
<211>2684
<212>DNA
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<400>3
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cctggaacaa cacagtgaca gagcaggcca ttgaggatgt ctggcagctg tttgagacct    300
ccatcaagcc atgtgtgaag ctgtcccccc tgtgcatcac catgaggtgc aacaagtctg    360
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