猪肺炎支原体p52基因重组腺病毒及其构建方法和应用 【技术领域】
本发明涉及一种重组病毒，尤其涉及一种猪肺炎支原体p52基因重组腺病毒及其构建方法，本发明还涉及该重组腺病毒在预防或治疗猪肺炎支原体中的应用，属于猪肺炎支原体的防制领域。
背景技术
猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)是引起猪支气管肺炎(Mycoplasmal pneumoniae of swine，Mps)，又称猪地方性流行性肺炎(SwineEnzootic Pneumoniae，SEP)的主要病原(ROSS R F.Disease ofSwine[M].Iowa：Iowa State University Press，1986：469～483.)。Mhp是猪特有的一种接触性传染病，一旦传入猪群，可连续发生，很难清除，而且广泛存在于世界各国，严重危害着养猪事业的发展。
Mhp结构简单，无细胞壁，仅有3种细胞器，即细胞膜、核糖体和原核细胞核。Mhp主要通过膜蛋白吸附于猪呼吸道上皮细胞表面的纤毛顶端，影响纤毛运动，并使纤毛顶端折断和脱落，导致纤毛功能丧失，引起猪出现喘气症状。由于Mhp能够破坏呼吸道黏膜-纤毛屏障而继发其他致病菌的感染，使死亡率大大提高，给养猪业造成巨大的经济损失。Mhp耐药株的普遍增多，致使抗生素治疗效果不佳，所以除了用抗生素和良好的动物管理程序，通过疫苗来防治Mps也是必要的。目前所使用的疫苗中，国产弱毒疫苗能产生有效的细胞免疫，保护率可达80％左右，但该疫苗采用胸腔注射，注射难度大，不易推广。而灭活疫苗虽然注射技术要求不高，应激反应较小，但由于很难激发有效的细胞免疫和黏膜免疫而使保护率大为降低(TAJIMA M，YAGIHASHIT.Isolation of Mycoplasma hyopneumoniae with porcine respiratoryepithelium as observed by electron microspy[J].Infect Immun，1982，37(4)：1162-1169；辛九庆，王亮，李媛.猪支原体肺炎的研究进展[J].猪业科学，2006，34(11)，19～22.XIN Jiu-qing，WANG Liang，LI Yuan.The researchprogression of Mycoplasmal pneumoniae of swine[J].Swine IndustryScience，2006，34(11)，19～22.(in Chinese))。Mhp的培养基成本高，培养时间长，培养物滴度低(大多在107-108PFU·mL-1)，使生产成本高，基因工程疫苗能有效的克服Mhp培养困难的问题，利用外援载体大量表达Mhp的相关抗原，从而作为候选疫苗的方向之一，具有很好的前景。
Geary等发现Mhp的致病因子位于细胞膜上，而不是细胞质中。Tracey等研究表明P159蛋白是Mhp细胞膜表面的一种重要粘附素，其中P52蛋白是P159蛋白C末端区域，在不同株的Mhp中序列比较保守，抗P52蛋白血清能减弱Mhp对真核细胞的黏附能力，表明P52蛋白在P159蛋白黏附真核细胞中起重要作用(MINION F C，LEFKOWITZ E J，MADSEN M L，et al.The genome sequence ofMycoplasma hyopneumoniae strain 232，the agent of swinemycoplasmosis[J].J Bacteriol，2004，186(10)：7123-7133；TRACEY AB，KATRIN D，MANFRED R，et al.P159 is a proteolytically processed，surfaceadhesin of Mycoplasma hyopneumoniae：defined domains of P159 bindheparin and promote adherence to eukaryote cells[J].MolecularMicrobiology，2006，60(3)，669-686.)，因此p52基因可以作为研制Mhp新型疫苗的候选基因。重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂，它可在任何细胞或组织中用来研究表达重组蛋白。
目前已知在支原体表面存在P97，P102，P159三个与Mhp致病性相关的高分子量膜蛋白。P97蛋白是最典型的黏附因子，经证实Mhp细胞粘附作用的缺失与其P97的缺失相关，在其下游有一段与之相邻的基因P102，由于它与P97相邻，人们预测它也有细胞黏附或辅助P97的细胞黏附作用。P159蛋白是Mhp表面粘多糖，不能在大肠杆菌中表达，通过蛋白组学发现P27、P110、P52三段蛋白是P159前体蛋白翻译后经蛋白酶水解而成，其中P52蛋白是其主要免疫活性部分。电镜下观察Mhp能黏附于猪肾上皮细胞(PK15 cells)，而一定量的肝磷脂或抗P52蛋白血清能明显减弱Mhp黏附PK15 cells的能力，因此对P159C末端区域蛋白功能研究有重要意义。
腺病毒是重组病毒疫苗的有效载体之一，E1/E3区缺失复制缺陷型腺病毒载体系统在安全性、高效性和操作性上都有其独特的优势，故受到普遍重视。
【发明内容】
本发明的目的之一是提供一种表达猪肺炎支原体p52基因的重组腺病毒；
本发明的目的之二是提供一种构建上述重组腺病毒的方法；
本发明的目的之三是将上述重组腺病毒应用于猪肺炎支原体的预防或治疗；
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
猪肺炎支原体p52基因重组腺病毒rAd-P52，其微生物保藏号是：CGMCCNO.2986；其分类命名是：腺病毒；保藏地址是：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是：2009年3月26日；
一种构建上述猪肺炎支原体p52基因重组腺病毒的方法，包括以下步骤：
(1)将猪肺炎支原体p52基因克隆到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中得到重组质粒pShuttle-CMV-P52；(2)将重组质粒pShuttle-CMV-P52用PmeI线性化后，电转化入已含有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的BJ5183细菌内，进行同源重组；筛选获得重组病毒DNA；(3)提取重组病毒DNA，用Pac I酶切后与脂质体混合转染AD293细胞，培养，待细胞完全病变后反复冻融，收集上清，即得；
本发明为了构建携带猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)p52基因的重组腺病毒，首先从Mhp J株扩增p52基因，将其克隆到穿梭载体pShuttle-CMV中，经Pme I线性化后，电转化入BJ5183菌内与其含有的骨架载体pAdEasy-1同源重组，再与脂质体混合转染AD-293细胞，包装成完整的腺病毒，经RT-PCR、间接免疫荧光鉴定后扩增病毒，收集病毒液，免疫Balb/c小鼠，并从体液免疫、黏膜免疫和细胞免疫三方面分析了免疫效果。结果表明，重组质粒pShuttle-CMV-P52插入片段为1202bp；同源重组成功；重组腺病毒可以正确表达目的蛋白，效价达106TCID50/ml。重组病毒经肌肉注射和滴鼻均可诱导小鼠产生血清和肺匀浆液特异性IgG、sIgA，但不能诱导特异的淋巴细胞增值。证实，成功构建了表达p52基因的重组腺病毒，该病毒可诱发小鼠产生特异的体液免疫和黏膜免疫，但不产生细胞免疫应答。
本发明选用的AdEasyXL系统将穿梭载体转化到BJ5183-AD-1感受态细胞，直接与其含有的骨架载体发生同源重组，明显提高了重组成功率和目的基因在AD293细胞中的表达能力，两个载体的重组率可达到90％，RT-PCR和间接免疫荧光鉴定出P52蛋白在AD293细胞中转录和表达。此外，本发明用的AD293细胞比传统使用的HEK293细胞具有更好的贴壁性能和生产病毒的能力。
动物实验中，肌肉注射组产生地特异性体液免疫应答反应早于滴鼻组，而且三次免疫后肌肉注射组特异性IgG值高于滴鼻组，但是滴鼻组的肺匀浆液中特异性SIgA抗体值明显高于肌肉注射组，说明本发明重组腺病毒rAd-P52通过肌肉注射途径免疫小鼠产生的体液免疫优于滴鼻途径，滴鼻途径产生黏膜反应优于肌肉注射途径，但是两种途径产生的体液免疫和黏膜免疫水平均不高，可能由于Mhp核酸中(G+C)％含量(23％～29％)比一般细菌低，且基因密码子的表达有时不同于一般细菌的密码子含义，以至于其表达量不够而不能引起动物体高水平的免疫应答。
本发明成功构建了表达P52蛋白的重组腺病毒，并通过动物实验证明其可以产生低水平的特异性体液免疫和黏膜免疫应答反应，但均不诱导产生细胞免疫应答反应，为下一步猪肺炎支原体新型疫苗的研制奠定基础。
【附图说明】
图1p52基因PCR扩增结果和pshuttle-CMV-P52双酶切鉴定结果；M1：DNA2000分子质量标准；1：p52基因的扩增产物；2：重组质粒pShuttle-CMV-P52 Kpn I+Xho I双酶切产物；3：pShuttle-CMV Kpn I+XhoI双酶切产物；M2：DNA15000分子质量标准。
图2重组腺病毒rAd-P52的酶切鉴定结果；M：DNAλ-Hind III分子质量标准；1：重组病毒pAd-P52 PacI酶切鉴定结果；
图3感染重组腺病毒rAd-P52后病变的AD293细胞图(100×)；A：正常AD293细胞；B：感染重组病毒rAd-P52后病变的AD293细胞。
图4重组腺病毒rAd-P52的RT-PCR鉴定结果；1：感染重组腺病毒rAd-P52的AD293细胞的RT-PCR；2：正常AD293细胞的RT-PCR；3：阳性对照；4：阴性对照；M：DNA2000分子质量标准。
图5重组腺病毒rAd-P52的间接免疫荧光鉴定结果(100×)；A：感染重组病毒rAd-P52 AD293细胞的间接免疫荧光；B：正常AD293细胞的间接免疫荧光。
图6重组腺病毒rAd-P52免疫小鼠后第2、4、6周的血清IgG的测定结果。
图7小鼠肺匀浆液SIgA和IgG的测定结果。
【具体实施方式】
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例
1材料与方法
1.1菌株、载体及细胞
猪肺炎支原体J株购自ATCC。AD-293细胞由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所猪病实验室提供。腺病毒表达载体系统(AdEasyTM XL Adenoviral VectorSystem)购自Stratagene公司，其中包括腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV及含骨架载体pAdeasy-1的BJ5183细菌。
1.2酶、试剂
限制性内切酶Xho I、Kpn I，ExTap酶，PyrobestTM DNA聚合酶为FermentasMBI公司产品，Pme I、Pac I为New England Biolabs公司产品；小量质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒均为上海华舜生物技术公司产品；大量质粒提取试剂盒购自Promega公司；转染试剂lipofectamineTM2000、TRIzol试剂购自Invitrogen公司；山羊抗小鼠IgG/辣根酶标记二抗、山羊抗兔IgG/FITC标记二抗为北京中杉金桥生物技术公司产品；DNA，蛋白分子质量Marker为宝生物工程(大连)有限公司产品；兔抗P52蛋白血清由本实验室制得。
1.3目的基因扩增与重组穿梭质粒的构建
参照MHP国际标准株232株的全基因序列设计引物P52-a：5′-CAGGGTACCATGGAAAA-3′(下划线为Kpn I位点)；P52-4′：5′-CCGGCTCGAGTTATTTATCGCCTTTAAA-3′(下划线为Xho I位点)。以J株为模板，利用Ex-taq酶和引物P52-a、P52-4′克隆P52基因，循环参数为：94℃预变性5min；94℃变性45s，52℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环后，72℃延伸8min。产物于10g/L琼脂糖凝胶中电泳30min(100V)，用胶回收试剂盒回收PCR产物。回收产物经Kpn I和Xho I双酶切后克隆到同样酶切处理的穿梭载体pShuttle-CMV中，经PCR、酶切鉴定后的重组质粒pShuttle-CMV-P52测序。
1.4细菌内同源重组获得重组病毒DNA
将重组质粒pShuttle-CMV-P52用Pme I线性化后，电转化(2.5KV、200Ω、25μF)入已含有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的BJ5183细菌内，进行同源重组。用卡那霉素筛选获得重组病毒DNA，通过PCR、Pac I酶切鉴定。将鉴定正确的重组病毒DNA热转化入E.coli DH5α细胞中大量扩增。
1.5在AD293细胞中包装重组腺病毒rAd-P52
用PureYieldTM Plasmid Midiprep System提取重组病毒DNA，Pac I酶切，酶切体系经酚氯仿抽提无水乙醇浓缩后，浓度达到1μg/μL，与lipofectamineTM2000混合转染AD293细胞，培养10～15d，待细胞完全病变后反复冻融(-40℃/37℃)三次，收集上清获得重组腺病毒rAd-P52。
1.6RT-PCR鉴定重组腺病毒rAd-P52在AD-293细胞中的转录
收取病变细胞，TRIzol法提取总RNA，以P52-4′为引物，在逆转录酶作用下合成cDNA第一链。以制备的cDNA为膜板，P52a和P52-4′为引物进行PCR扩增，检测目的基因的转录。正常AD-293细胞作对照。
1.7IFA鉴定重组腺病毒rAd-P52在AD-293细胞中的表达
长满单层AD293细胞的96孔板上接种重组腺病毒rAd-P52，待细胞病变后，弃去营养液后PBS洗涤细胞；加入100μl/孔预冷的丙酮、甲醇体积比为1∶1混合液，4℃固定30min；抗兔P52蛋白血清(效价达105)1∶80倍稀释后，每孔加入100μl，在湿盒内37℃温育1h后PBS洗涤3次；每孔加入50μl的1∶100稀释的FITC标记山羊抗兔IgG为二抗，作用后于荧光显微镜下观察。正常AD-293细胞作对照。
1.8重组腺病毒的浓缩及滴度测定
经PCR、IFA鉴定为阳性的重组腺病毒感染AD-293细胞大量扩增，-40℃/37℃反复冻融收集高浓度的病毒液作10倍倍比稀释，接种96孔AD-293细胞板中，置37℃，50mL/LCO2培养箱中培养7d，计数每个稀释度的CPE数，按Reed-Muench法[7]计算病毒滴度。
1.9动物实验
以肌注和滴鼻两种方法免疫6～8周龄雌性Balb/c小鼠[8]，每组5只，剂量均为5×106TCID50/只，以接种PBS组为对照。首免后每隔两周加强免疫一次，共加强免疫两次，并在首免第二、四、六周后采集血清，并在第六周制备肺匀浆液，以pET-30a为载体表达的P52蛋白为抗原，以抗小鼠IgG，IgA为二抗进行间接ELISA；六周后小鼠处死后取脾以P52蛋白、ConA为刺激物用MTT法进行淋巴细胞增值试验。
2实验结果
2.1P52基因PCR扩增结果和重组质粒pShuttle-CMV-P52的酶切鉴定结果
根据国际标准株232的全基因序列设计引物P52-a和P52-4′，以Mhp国内分离株J株为模板，进行PCR扩增，10g/L琼脂糖凝胶电泳结果得到大小为1202bp左右的条带(见图1)。用Kpn I和xho I双酶切鉴定重组质粒pShuttle-CMV-P52，结果显示，双酶切片段的大小与预测结果一致，为7500bp和1202bp左右的两条带(见图1)。测序结果表明P52基因插入的位置、大小和读码框均正确。
2.2在BJ5183-AD-1感受态细胞中获得重组腺病毒质粒rAd-P52的酶切鉴定结果
Pme I线性化的穿梭载体pShuttle-CMV-P52与腺病毒骨架载体pAdEasy-1在BJ5183感受态细胞内同源重组获得重组腺病毒rAd-P52，Pac I酶切后经电泳得到两条大约30kb的大片段和4.5kb的小片段(见图2)
2.3rAd-P52腺病毒在AD293细胞中的包装
鉴定正确的rAd-P52经Pac I线性化后转染AD293细胞，10～15天后细胞出现肿胀、变圆、聚团成葡萄样等典型的细胞病变，待15天后细胞完全病变脱壁，收获病变细胞，反复冻融(-40℃/37℃)后取上清获得重组腺病毒原液，将原液感染AD293细胞可产生明显病变(图3)。
2.4RT-PCR鉴定重组病毒rAd-P52在AD293细胞的转录
收取病变细胞，TRIzol法提取总RNA，进行RT-PCR检测目的基因的转录，以正常AD-293细胞作对照(见图4)。
2.5IFA鉴定重组腺病毒rAd-P52在AD-293细胞中表达
在长满单层AD293细胞的96孔板上接种重组腺病毒rAd-P52，以P52蛋白抗血清为一抗，FITC标记羊抗兔IgG为二抗进行间接免疫荧光试验，以正常AD-293细胞作对照，试验结果见图5。
2.5重组病毒rAd-P52的TCID50
Reed-Muench法计算重组病毒的效价为106TCID50/mL。
2.6重组腺病毒免疫小鼠可产生特异性的IgG和SIgA抗体
重组腺病毒经肌肉注射和滴鼻两种途径免疫小鼠均可以刺激小鼠产生P52蛋白的特异性血清IgG抗体，肌注组首免两周后即可检出并在两次加强免疫后达到高峰，滴鼻组在加强免疫一周后检出，再次加强免疫后没有出现明显变化(图6)。而在首免六周后制备的肺匀浆液中，肌注组和滴鼻组都可以检出特异性的IgG和SIgA抗体(图7)。
2.7重组腺病毒不刺激小鼠产生特异的细胞免疫
淋巴细胞增值实验结果显示，ConA可非特异的诱导各组小鼠产生明显的淋巴细胞增值反应，5.1＜SI＜9.8，平均为6.9，而P52-30a则不诱导任何实验组产生小鼠淋巴细胞增值反应，0.95＜SI＜1.23，平均为1.1。这表明：rAd-P52重组腺病毒以滴鼻和肌注两种方式免疫小鼠都不能产生特异的细胞免疫应答。