乙酰肝素酶与热休克蛋白的复合物及其制备方法和应用.pdf

本发明公开了乙酰肝素酶与热休克蛋白的复合物及其制备方法和应用，该复合物由乙酰肝素酶与热休克蛋白110以非共价键结合而成，乙酰肝素酶具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，热休克蛋白110具有SEQ ID No.8所示的氨基酸序列；本发明复合物能够诱导强有力的抗肿瘤免疫，不需要任何佐剂，在同种间应用不受MHC的限制，肿瘤治疗谱广，制备方法简单，可以用于制备肿瘤疫苗，在肿瘤免疫治疗领域有着良好的开发应用前景。

1、  乙酰肝素酶与热休克蛋白的复合物，其特征在于：由乙酰肝素酶与热休克蛋白110以非共价键结合而成，所述乙酰肝素酶具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，热休克蛋白110具有SEQ ID No.8所示的氨基酸序列。

2、  根据权利要求1所述的乙酰肝素酶与热休克蛋白的复合物，其特征在于：由乙酰肝素酶与热休克蛋白110以摩尔比为1∶1结合而成。

3、  权利要求1所述的乙酰肝素酶与热休克蛋白的复合物的制备方法，其特征在于：在浓度为0.01mol/L、pH为7.2～7.4的PBS中，分别加入乙酰肝素酶和热休克蛋白110，混合均匀，在43℃孵育30分钟，再在37℃孵育1小时，即得乙酰肝素酶与热休克蛋白的复合物。

4、  权利要求3所述的乙酰肝素酶与热休克蛋白的复合物的制备方法，其特征在于：按摩尔比为1∶1分别加入乙酰肝素酶和热休克蛋白110，使乙酰肝素酶和热休克蛋白110的终浓度为3～6μg/mL。

5、  权利要求1所述的乙酰肝素酶与热休克蛋白的复合物在制备肿瘤疫苗中的应用。

乙酰肝素酶与热休克蛋白的复合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种蛋白复合物，特别涉及乙酰肝素酶与热休克蛋白的复合物，还涉及该复合物的制备方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤是严重危害人类健康的常见疾病。目前，恶性肿瘤的三大常规治疗方法：手术治疗、放射治疗和化学治疗已取得较大发展，但是，手术治疗为局部治疗手段，而恶性肿瘤呈浸润性生长且易经过血管和/或淋巴管发生远处转移，中晚期恶性肿瘤患者单纯依靠手术治疗很难达到完全清除肿瘤细胞的目的；放射治疗也是以局部治疗为主，同样存在手术治疗的缺陷，且许多恶性肿瘤对放射治疗不敏感；化学治疗为全身治疗手段，但存在耐药和毒副作用大等缺点。近年来，免疫治疗作为恶性肿瘤的第四种治疗方法受到各国肿瘤学研究者的广泛关注，肿瘤疫苗的开发成为研究热点之一。
乙酰肝素酶(Heparanase，Hpa)是目前发现的唯一能降解硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)的酶，能破坏细胞外基质(ECM)及基底膜(BM)，并参与肿瘤血管生成，与肿瘤的侵袭转移密切相关。其主要机制在于：(1)ECM和BM是限制肿瘤转移的屏障，乙酰肝素酶通过降解ECM和BM中的HSPG，破坏ECM和BM的完整性，从而促进肿瘤细胞的浸润及转移；(2)Hpa通过直接和间接两种方式发挥促血管生成作用：直接作用于内皮细胞以出芽方式促进血管生成；同时，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)作为最强的血管生成诱导因子，平时以无活性形式与硫酸乙酰肝素(HS)结合贮存于ECM中，当Hpa降解HSPG时，有高度活性的HS-bFGF复合物被释放出来，间接诱发血管生成；此外，被固化在HSPG上无活性的血管内皮生成因子(VEGF)在Hpa降解HSPG的过程中也得到释放并被激活，与bFGF共同诱导肿瘤血管生成。越来越多的研究表明，Hpa在正常组织中不表达，但在几乎所有中晚期恶性肿瘤中高表达，与肿瘤患者的不良预后密切相关。因此，Hpa逐渐成为引人注目的抗肿瘤治疗新靶点。但是，单独以Hpa作为肿瘤疫苗时，需要与免疫佐剂联合应用，而佐剂为外源性物质且诱导的天然免疫应答特异性低，可能引起一系列的毒副反应；此外，由于主要组织相容性复合体(MHC)的限制，其使用对象也相当有限。
热休克蛋白(HSP)是一类在生物进化中高度保守，广泛存在于原核和真核生物中的蛋白质，具有“分子伴侣”作用，参与胞内蛋白质的折叠、装配和转运等过程。HSP按分子量大小分为以下几个家族：HSP110、HSP90、HSP70、HSP60和小HSP家族。每个家族又由多个成员组成，如HSP70家族成员有HSP70、热休克同源蛋白(HSC)70、糖调蛋白(GRP)78和GRP75等，HSP90家族成员有HSP90和糖蛋白(GP)96等。许多研究结果证实，从肿瘤组织中提取的HSP可以诱导机体产生针对该肿瘤的免疫应答，达到治疗肿瘤的目的。进一步研究表明，从肿瘤组织中提取的HSP实际为结合了抗原多肽的HSP多肽复合物，其可通过以下几方面诱导机体的抗肿瘤免疫：(1)HSP多肽复合物作为完整抗原，被抗原递呈细胞摄取、加工后，与MHC结合并递呈到细胞表面，从而活化T细胞，包括CD4+和CD8+T细胞，特别是细胞毒性T细胞，产生抗肿瘤的特异性细胞免疫；HSP在此处起到载体或佐剂的作用，诱导免疫应答的是其结合的抗原多肽；(2)HSP本身具有活化巨噬细胞和树突状细胞(抗原递呈细胞)的作用，从而增加共刺激因子和MHC的表达，加强机体的抗肿瘤免疫；(3)自然杀伤细胞和γδT细胞是体内重要的抗肿瘤免疫细胞，对肿瘤细胞的杀伤效应不受MHC的限制，HSP可直接作为抗原递呈分子，将抗原多肽递呈至细胞表面，从而活化自然杀伤细胞和γδT细胞，产生抗肿瘤的非特异性免疫。以HSP多肽复合物为基础的肿瘤疫苗具有以下独特优势：(1)由于HSP结构上的高度保守，不具有多态性，可在同种内相互使用，不受MHC的限制；(2)HSP具有免疫佐剂的作用，省略了常规蛋白免疫需要免疫佐剂的麻烦。近年来研究发现，HSP110是HSP70家族的成员，是一种对较大的抗原多肽也具有伴侣作用的高分子量HSP，具有强大的免疫佐剂效应，因此，其在肿瘤免疫治疗中的应用颇受瞩目。目前，以HSP多肽复合物为基础的肿瘤疫苗多采用HSP70、HSP90和GP96进行构建，尚未见采用HSP110构建肿瘤疫苗的研究报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种Hpa与HSP的复合物。
为达到此目的，本发明提供了一种Hpa与HSP的复合物，由Hpa与HSP110以非共价键结合而成，所述Hpa具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，HSP110具有SEQ ID No.8所示的氨基酸序列。
进一步，由Hpa与HSP110以摩尔比为1∶1结合而成。
本发明的目的之二在于提供所述Hpa与HSP的复合物的制备方法。
为达到此目的，本发明提供了所述Hpa与HSP的复合物的制备方法，在浓度为0.01mol/L、pH为7.2～7.4的PBS中，分别加入Hpa和HSP110，混合均匀，在43℃孵育30分钟，再在37℃孵育1小时，即得Hpa与HSP的复合物。
进一步，按摩尔比为1∶1加入Hpa和HSP110，使Hpa和HSP110的终浓度为3～6μg/mL。
本发明的目的之三在于提供所述Hpa与HSP的复合物的应用。
为达到此目的，本发明提供了所述Hpa与HSP的复合物在制备肿瘤疫苗中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明提供的Hpa与HSP的复合物，能够诱导强有力的抗肿瘤免疫，不需要任何佐剂，在同种间应用不受MHC的限制，肿瘤治疗谱广，制备方法简单，可以用于制备肿瘤疫苗，在肿瘤免疫治疗领域有着良好的开发应用前景。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：
图1为蛋白免疫印迹(Western Blot)鉴定Hpa；
图2为Western Blot鉴定HSP110；
图3为Western Blot鉴定Hpa-HSP110复合物；
图4为酶联免疫斑点(ELISPOT)法检测Hpa-HSP110复合物激发细胞毒性T淋巴细胞(CTL)分泌IFN-γ的能力；
图5为⁵¹Cr释放法检测Hpa-HSP110复合物激发CTL对结肠癌细胞CT26的特异性杀伤效应。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
一、Hpa-HSP110复合物的制备
1、Hpa的制备
(1)Hpa全长编码基因的克隆
根据GenBank登录号为NM 001098540.1的Hpa基因序列，设计并合成如下PCR引物以扩增Hpa全长编码基因：引物F1：5’-atgctgctgcgctcgaagcctgcgct-3’(SEQ ID No.3)，引物R1：5’-tcagatgcaagcagcaactttggcat-3’(SEQ ID No.4)；以人胎盘cDNA文库为模板进行PCR，PCR条件为：94℃预变性3分钟，然后94℃变性30秒、56℃退火30秒，72℃延伸30秒，共30个循环，最后72℃延伸5分钟；PCR产物经浓度为8g/L的琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与克隆载体pGEM-T连接，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，委托上海生工公司测定基因序列，将序列正确的阳性克隆质粒命名为pGEM-T/Hpa。
琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR产物在约1600bp处呈单一特异性条带，与预期结果相符；测序结果显示插入基因序列与Hpa全长编码基因序列一致。
(2)Hpa基因重组真核表达载体的构建
根据Hpa全长编码基因序列和真核表达载体pCDNA4/Myc-His的多克隆位点，设计并合成如下PCR引物以扩增Hpa cDNA片段：引物F2：5’ctgcagatgctgctgcgctcgaagcctgcgct-3’(SEQ ID No.5)，下划线部分为Pst I酶切位点；以引物R2：5’-ctcgagtcagatgcaagcagcaactttggcat-3’(SEQ ID No.6)，下划线部分为XhoI酶切位点；以步骤(1)所得质粒pGEM-T/Hpa为模板进行PCR，PCR条件与步骤(1)相同；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，用限制性内切酶PstI和XhoI进行双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经PstI和XhoI双酶切的真核表达载体pCDNA4/Myc-His在T4DNA连接酶的作用下进行连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，用PstI和XhoI进行双酶切鉴定，并委托上海生工公司测定基因序列，序列和阅读框架正确的阳性克隆质粒即为构建成功的Hpa基因重组真核表达载体，命名为pCDNA4/Myc-His/Hpa。
双酶切鉴定结果显示双酶切产物在约5100bp和1600bp处出现两条电泳带，与预期结果相符；测序结果显示阳性克隆质粒的插入基因序列(如SEQ ID No.1所示)无突变，阅读框架正确，无移码。
(3)Hpa基因工程菌的构建
将步骤(2)所得Hpa基因重组真核表达载体pCDNA4/Myc-His/Hpa用限制性内切酶Sal I酶切使线性化，用电穿孔法转化毕赤酵母GS115感受态细胞，转化产物涂布于MD平板，30℃培养3～4天，挑取白色酵母菌落，分别点接于MD和MM平板，30℃培养3～6天(每天向MM平板中添加甲醇100μL)，挑取MD平板上生长明显快于MM平板的酵母菌落，点接于含有浓度为4mg/mL的G418的YPD平板，30℃培养7天，所得酵母菌即为高拷贝Hpa基因工程菌。
(4)Hpa的诱导表达
将步骤(3)所得高拷贝Hpa基因工程菌于30℃培养至OD600为2，按10％接种量接入BMGY培养基中，30℃培养24小时，5000g离心5分钟，弃上清，菌体用无菌水洗涤2次后，重悬于等体积的BMMY培养基中，30℃诱导表达3天(每24小时补加诱导剂甲醇至最终体积百分浓度为0.5％)，4℃、6000g离心5分钟，收集上清，加入质量百分浓度为80％的硫酸铵溶液使蛋白质沉淀，离心弃上清，蛋白质沉淀用浓度为0.02mol/L、pH为8.0的磷酸盐缓冲液(PBS)透析脱盐，离心，收集上清，用琼脂糖凝胶(Q-Sepharose)柱进行分离纯化，用浓度为1mol/L的氯化钠溶液线性梯度洗脱，收集洗脱液，适当浓缩后用葡聚糖凝胶(Sephdex G-25)柱脱盐，即得纯化的Hpa(序列如SEQ ID No.2所示)，取样进行Western Blot鉴定。
Western Blot鉴定：取纯化的Hpa，加入内参β-actin和上样缓冲液，100℃加热3～5分钟，用质量百分浓度为12％的分离胶、质量百分浓度为5％的积层胶进行SDS-PAGE，电泳完毕后，将分离产物电转移至PVDF膜上，用质量百分浓度为5％的脱脂奶粉溶液封膜，加入鼠抗人Hpa单克隆抗体和鼠抗人β-actin单克隆抗体，温度37℃孵育1小时，洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG，温度37℃孵育1小时，洗膜，显色；同时设置阴性对照(不加入纯化的Hpa)；结果见图1，其中1泳道为纯化的Hpa，2泳道为阴性对照，可见1泳道除内参β-actin条带外，还有一明显蛋白条带，而2泳道未见相应条带。
2、HSP110的制备
(1)HSP110基因的克隆
根据GenBank登录号为AB003333.1的HSP110基因序列和酵母表达载体pPICZa的多克隆位点，设计并合成如下PCR引物以扩增HSP110cDNA片段：引物F3：5’-gtatctctcgagaagagaatgtcggtggtgggg-3’(SEQ ID No.9)，下划线部分为XhoI酶切位点；引物R3：5’-atttaaggtaccctagtccaagtccatattaa-3’(SEQ ID No.10)，下划线部分为KpnI酶切位点；以含有HSP110全长cDNA的质粒pBacPAK为模板进行PCR，PCR条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃变性30秒、58℃退火30秒，72℃延伸2.5分钟，共30个循环，最后72℃延伸10分钟；PCR产物经浓度为8g/L的琼脂糖凝胶电泳鉴定后，用凝胶回收试剂盒进行切胶回收纯化。
琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR产物在约2600bp处呈单一特异性条带，与预期结果相符。
(2)HSP110基因重组酵母表达载体的构建
将步骤(1)所得纯化的PCR产物用限制性内切酶XhoI和KpnI进行双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经XhoI和KpnI双酶切的酵母表达载体pPICZa在T4DNA连接酶的作用下进行连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，用含有博莱霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，用XhoI和KpnI进行双酶切鉴定，并委托上海生工公司测定基因序列，序列和阅读框架正确的阳性克隆质粒即为构建成功的HSP110基因重组酵母表达载体，命名为pPICZa/HSP110。
双酶切鉴定结果显示双酶切产物在约5100bp和2600bp处出现两条电泳带，与预期结果相符；测序结果显示阳性克隆质粒的插入基因序列(如SEQ ID No.7所示)无突变，阅读框架正确，无移码。
(3)HSP110基因工程菌的制备
将步骤(2)所得HSP110基因重组酵母表达载体pPICZa/HSP110用限制性内切酶SalI酶切使线性化，用电穿孔法转化毕赤酵母GS115感受态细胞，转化产物涂布于MD平板，30℃培养3～4天，挑取白色酵母菌落，分别点接于MD和MM平板，30℃培养3～6天(每天向MM平板中添加甲醇100μL)，挑取MD平板上生长明显快于MM平板的酵母菌落，点接于含有浓度为4mg/mL的G418的YPD平板，30℃培养7天，所得酵母菌即为高拷贝HSP110基因工程菌。
(4)HSP110的诱导表达
将步骤(3)所得高拷贝HSP110基因工程菌于30℃培养至OD600为2，按10％接种量接入BMGY培养基中，30℃培养24小时，5000g离心5分钟，弃上清，菌体用无菌水洗涤2次后，重悬于等体积的BMMY培养基中，30℃诱导表达3天(每24小时补加诱导剂甲醇至最终体积百分浓度为0.5％)，4℃、6000g离心5分钟，收集上清，加入质量百分浓度为80％的硫酸铵溶液使蛋白质沉淀，离心弃上清，蛋白质沉淀用浓度为0.02mol/L、pH为8.0的PBS透析脱盐，离心，收集上清，用Q-Sepharose柱进行分离纯化，用浓度为1mol/L的氯化钠溶液线性梯度洗脱，收集洗脱液，适当浓缩后用Sephdex G-25柱脱盐，即得纯化的HSP110(序列如SEQ ID No.8所示)，取样进行Western Blot鉴定。
Western Blot鉴定：取纯化的HSP110，加入内参β-actin和上样缓冲液，100℃加热3～5分钟，用质量百分浓度为12％的分离胶、质量百分浓度为5％的积层胶进行SDS-PAGE，电泳完毕后，将分离产物电转移至PVDF膜上，用质量百分浓度为5％的脱脂奶粉溶液封膜，加入鼠抗人HSP110单克隆抗体和鼠抗人β-actin单克隆抗体，温度37℃孵育1小时，洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG，温度37℃孵育1小时，洗膜，显色；同时设置阴性对照(不加入纯化的HSP110)；结果见图2，其中1泳道为纯化的HSP110，2泳道为阴性对照，可见1泳道除内参β-actin条带外，还有一明显蛋白条带，而2泳道未见相应条带。
3、Hpa-HSP110复合物的制备
在浓度为0.01mol/L、pH为7.2～7.4的PBS(由浓度为137mmol/L的NaCl、浓度为2.7mmol/L的KCl、浓度为4.3mmol/L的Na₂HPO₄和浓度为1.4mmol/L的KH₂PO₄组成)中，按摩尔比为1∶1加入步骤1所得纯化的Hpa和步骤2所得纯化的HSP110，使Hpa和HSP110的终浓度为3～6μg/mL，混合均匀，在43℃孵育30分钟，再在37℃孵育1小时，即得Hpa-HSP110复合物，取样进行Western Blot鉴定。
Western Blot鉴定：取Hpa-HSP110复合物，冰上匀浆裂解30分钟，加入鼠抗人HSP110单克隆抗体，4℃漩涡混合过夜，加入IgG Beads，4℃漩涡混合5小时，4℃、5000r/min离心10分钟，收集上清，加入内参β-actin和上样缓冲液，95℃加热5分钟，用质量百分浓度为12％的分离胶、质量百分浓度为5％的积层胶进行SDS-PAGE，电泳完毕后，将分离产物电转移至PVDF膜上，用质量百分浓度为5％的脱脂奶粉溶液封膜，加入鼠抗人Hpa单克隆抗体和鼠抗人β-actin单克隆抗体，温度37℃孵育1小时，洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG，温度37℃孵育1小时，洗膜，显色；同时设置阴性对照(不加入Hpa-HSP110复合物)；结果见图3，其中1泳道为Hpa-HSP110复合物，2泳道为阴性对照，可见1泳道除内参β-actin条带外，还有一明显蛋白条带，而2泳道未见相应条带。
二、Hpa-HSP110复合物的抗肿瘤活性研究
效应细胞的制备：将30只6～8周龄雌性Babl/c小鼠随机分为3组：实验组、对照组和空白组，每组10只；将Hpa-HSP110复合物和OVA-HSP110复合物(卵清蛋白与HSP110按前述步骤3方法制得的复合物)分别用浓度为0.1mol/L、pH为7.4的PBS溶解制成浓度为0.5mg/mL的溶液；实验组以浓度为0.5mg/mL的Hpa-HSP110复合物溶液为免疫原，对照组以浓度为0.5mg/mL的OVA-HSP110溶液为免疫原，空白组以浓度为0.1mol/L、pH为7.4的PBS为免疫原；各组于小鼠背侧尾根部皮下注射免疫原，每只100μL，之后每间隔1周，以同样方法加强免疫1次，共免疫3次；末次免疫后1周，断颈处死小鼠，在无菌条件下取脾脏，用100目筛网碾磨，收集细胞悬液，用聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法分离脾淋巴细胞，用含有质量百分浓度为10％的胎牛血清的RPMI 1640培养基调节细胞密度为1×10⁶个/mL，作为后续实验的效应细胞。
1、ELISPOT法检测Hpa-HSP110复合物激发CTL分泌IFN-γ的能力
采用ELISPOT检测试剂盒进行检测，具体操作参照试剂盒说明书：在96孔培养板中，每孔加入体积百分浓度为70％的乙醇100μL，室温放置10分钟，PBS洗涤，加入IFN-γ捕获抗体(稀释度为1∶100)100μL，温度4℃孵育过夜，PBS洗涤，加入质量百分浓度为2％的脱脂奶粉溶液100μL，室温封闭2小时，PBS洗涤，加入效应细胞100μL，温度37℃孵育48小时，PBST(即含有质量百分浓度为0.1％的吐温20的PBS)洗涤，加入生物素标记的抗IFN-γ抗体(稀释度为1∶100)100μL，温度37℃孵育1.5小时，PBST洗涤，加入链霉亲和素标记的碱性磷酸酶(稀释度为1∶5000)100μL，温度37℃孵育1小时，PBST洗涤，拍干培养板，加入即用型BCIP/NBT底物反应液100μL，室温避光显色2～10分钟至斑点形成，用蒸馏水终止反应，干燥后检测斑点数；同时设置阴性对照组(不加入效应细胞)，各组斑点数以3个复孔的均值表示。
结果见图4，实验组的斑点数(291个/10⁵细胞)明显高于其它3组(对照组为184个/10⁵细胞，空白组为12个/10⁵细胞，阴性对照组为2个/10⁵细胞)，表明本发明的Hpa-HSP110复合物具有良好的免疫原性，能够有效激发CTL分泌IFN-γ。
2、⁵¹Cr释放法检测Hpa-HSP110复合物激发CTL对肿瘤细胞的特异性杀伤效应
靶细胞的制备：将结肠癌细胞CT26用含有质量百分浓度为10％的胎牛血清的RPMI 1640培养基体外培养，收集细胞，离心洗涤2次后，用含有质量百分浓度为10％的胎牛血清的RPMI1640培养基调节细胞密度为1×10⁶个/mL，取1mL置10mL血清瓶中，加入100μCi Na⁵¹CrO₄，温度37℃孵育90分钟，充分洗涤细胞除去未结合的⁵¹Cr，再用含有质量百分浓度为10％的胎牛血清的RPMI1640培养基调整细胞密度为1×10⁵个/mL，作为靶细胞。
在96孔U型板中，每孔分别按效靶比(E/T)为100∶1、50∶1和25∶1加入效应细胞与靶细胞，每种效靶比设3个复孔，同时设最大释放组(用浓度为2mol/L的盐酸替代效应细胞)和最小释放组(用含有质量百分浓度为10％的胎牛血清的RPMI 1640培养基替代效应细胞)；将96孔板500r/min离心30秒后，温度37℃孵育4小时，1000r/min离心10分钟，各孔取上清100μL，用γ计数器测定每分钟放射活性(cpm值)，按下述公式计算杀伤率：杀伤率(％)＝[(实验组cpm均值-最小释放组cpm均值)/(最大释放组cpm均值-最小释放组cpm均值)]×100％，杀伤率大于15％判为特异性杀伤。
结果见图5，实验组在各效靶比对CT26细胞均有特异性杀伤作用，且随着效靶比增大，特异性杀伤作用逐渐增强，当E/T为100∶1时，杀伤率为56.3％，而对照组和空白组对CT26细胞无特异性杀伤作用，表明本发明的Hpa-HSP110复合物能够有效激发CTL产生对肿瘤细胞的特异性杀伤效应。
基于以上实验结果，可得出如下结论：本发明的Hpa-HSP110复合物能够诱导强有力的抗肿瘤免疫，不需要任何佐剂，在同种间应用不受MHC的限制，可以作为活性成分，按照药学领域的常规方法制成肿瘤疫苗，在肿瘤免疫治疗领域有着良好的开发应用前景。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
序列表
<110>中国人民解放军第三军医大学
<120>乙酰肝素酶与热休克蛋白的复合物及其制备方法和应用
<160>10
<210>1
<211>1632
<212>DNA
<213>智人(homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)......(1632)
<400>1
atg ctg ctg cgc tcg aag cct gcg ctg ccg ccg ccg ctg atg ctg ctg    48
Met Leu Leu Arg Ser Lys Pro Ala Leu Pro Pro Pro Leu Met Leu Leu
  1               5                  10                  15
ctc ctg ggg ccg ctg ggt ccc ctc tcc cct ggc gcc ctg ccc cga cct    96
Leu Leu Gly Pro Leu Gly Pro Leu Ser Pro Gly Ala Leu Pro Arg Pro
             20                  25                  30
gcg caa gca cag gac gtc gtg gac ctg gac ttc ttc acc cag gag ccg   144
Ala Gln Ala Gln Asp Val Val Asp Leu Asp Phe Phe Thr Gln Glu Pro
         35                  40                  45
ctg cac ctg gtg agc ccc tcg ttc ctg tcc gtc acc att gac gcc aac   192
Leu His Leu Val Ser Pro Ser Phe Leu Ser Val Thr Ile Asp Ala Asn
     50                  55                  60
ctg gcc acg gac ccg cgg ttc ctc atc ctc ctg ggt tct cca aag ctt   240
Leu Ala Thr Asp Pro Arg Phe Leu Ile Leu Leu Gly Ser Pro Lys Leu
 65                  70                  75                  80
cgt acc ttg gcc aga ggc ttg tct cct gcg tac ctg agg ttt ggt ggc   288
Arg Thr Leu Ala Arg Gly Leu Ser Pro Ala Tyr Leu Arg Phe Gly Gly
                 85                  90                  95
acc aag aca gac ttc cta att ttc gat ccc aag aag gaa tca acc ttt   336
Thr Lys Thr Asp Phe Leu Ile Phe Asp Pro Lys Lys Glu Ser Thr Phe
            100                 105                 110
gaa gag aga agt tac tgg caa tct caa gtc aac cag gat att tgc aaa    384
Glu Glu Arg Ser Tyr Trp Gln Ser Gln Val Asn Gln Asp Ile Cys Lys
        115                 120                 125
tat gga tcc atc cct cct gat gtg gag gag aag tta cgg ttg gaa tgg    432
Tyr Gly Ser Ile Pro Pro Asp Val Glu Glu Lys Leu Arg Leu Glu Trp
    130                 135                 140
ccc tac cag gag caa ttg cta ctc cga gaa cac tac cag aaa aag ttc    480
Pro Tyr Gln Glu Gln Leu Leu Leu Arg Glu His Tyr Gln Lys Lys Phe
145                 150                 155                 160
aag aac agc acc tac tca aga agc tct gta gat gtg cta tac act ttt    528
Lys Asn Ser Thr Tyr Ser Arg Ser Ser Val Asp Val Leu Tyr Thr Phe
                165                 170                 175
gca aac tgc tca gga ctg gac ttg atc ttt ggc cta aat gcg tta tta    576
Ala Asn Cys Ser Gly Leu Asp Leu Ile Phe Gly Leu Asn Ala Leu Leu
            180                 185                 190
aga aca gca gat ttg cag tgg aac agt tct aat gct cag ttg ctc ctg    624
Arg Thr Ala Asp Leu Gln Trp Asn Ser Ser Asn Ala Gln Leu Leu Leu
        195                 200                 205
gac tac tgc tct tcc aag ggg tat aac att tct tgg gaa cta ggc aat    672
Asp Tyr Cys Ser Ser Lys Gly Tyr Asn Ile Ser Trp Glu Leu Gly Asn
    210                 215                 220
gaa cct aac agt ttc ctt aag aag gct gat att ttc atc aat ggg tcg    720
Glu Pro Asn Ser Phe Leu Lys Lys Ala Asp Ile Phe Ile Asn Gly Ser
225                 230                 235                 240
cag tta gga gaa gat ttt att caa ttg cat aaa ctt cta aga aag tcc    768
Gln Leu Gly Glu Asp Phe Ile Gln Leu His Lys Leu Leu Arg Lys Ser
                245                 250                 255
acc ttc aaa aat gca aaa ctc tat ggt cct gat gtt ggt cag cct cga    816
Thr Phe Lys Asn Ala Lys Leu Tyr Gly Pro Asp Val Gly Gln Pro Arg
            260                 265                 270
aga aag acg gct aag atg ctg aag agc ttc ctg aag gct ggt gga gaa    864
Arg Lys Thr Ala Lys Met Leu Lys Ser Phe Leu Lys Ala Gly Gly Glu
        275                 280                 285
gtg att gat tca gtt aca tgg cat cac tac tat ttg aat gga cgg act    912
Val Ile Asp Ser Val Thr Trp His His Tyr Tyr Leu Asn Gly Arg Thr
    290                 295                 300
gct acc aag gaa gat ttt cta aac cct gat gta ttg gac att ttt att    960
Ala Thr Arg Glu Asp Phe Leu Asn Pro Asp Val Leu Asp Ile Phe Ile
305                 310                 315                 320
tca tct gtg caa aaa gtt ttc cag gtg gtt gag agc acc agg cct ggc    1008
Ser Ser Val Gln Lys Val Phe Gln Val Val Glu Ser Thr Arg Pro Gly
                325                 330                 335
aag aag gtc tgg tta gga gaa aca agc tct gca tat gga ggc gga gcg    1056
Lys Lys Val Trp Leu Gly Glu Thr Ser Ser Ala Tyr Gly Gly Gly Ala
            340                 345                 350
ccc ttg cta tcc gac acc ttt gca gct ggc ttt atg tgg ctg gat aaa    1104
Pro Leu Leu Ser Asp Thr Phe Ala Ala Gly Phe Met Trp Leu Asp Lys
        355                 360                 365
ttg ggc ctg tca gcc cga atg gga ata gaa gtg gtg atg agg caa gta    1152
Leu Gly Leu Ser Ala Arg Met Gly Ile Glu Val Val Met Arg Gln Val
    370                 375                 380
ttc ttt gga gca gga aac tac cat tta gtg gat gaa aac ttc gat cct    1200
Phe Phe Gly Ala Gly Asn Tyr His Leu Val Asp Glu Asn Phe Asp Pro
385                 390                 395                 400
tta cct gat tat tgg cta tct ctt ctg ttc aag aaa ttg gtg ggc acc    1248
Leu Pro Asp Tyr Trp Leu Ser Leu Leu Phe Lys Lys Leu Val Gly Thr
                405                 410                 415
aag gtg tta atg gca agc gtg caa ggt tca aag aga agg aag ctt cga    1296
Lys Val Leu Met Ala Ser Val Gln Gly Ser Lys Arg Arg Lys Leu Arg
            420                 425                 430
gta tac ctt cat tgc aca aac act gac aat cca agg tat aaa gaa gga    1344
Val Tyr Leu His Cys Thr Asn Thr Asp Asn Pro Arg Tyr Lys Glu Gly
        435                 440                 445
gat tta act ctg tat gcc ata aac ctc cat aat gtc acc aag tac ttg    1392
Asp Leu Thr Leu Tyr Ala Ile Asn Leu His Asn Val Thr Lys Tyr Leu
    450                 455                 460
cgg tta ccc tat cct ttt tct aac aag caa gtg gat aaa tac ctt cta    1440
Arg Leu Pro Tyr Pro Phe Ser Asn Lys Gln Val Asp Lys Tyr Leu Leu
465                 470                 475                 480
aga cct ttg gga cct cat gga tta ctt tcc aaa tct gtc caa ctc aat    1488
Arg Pro Leu Gly Pro His Gly Leu Leu Ser Lys Ser Val Gln Leu Asn
                485                 490                 495
ggt cta act cta aag atg gtg gat gat caa acc ttg cca cct tta atg    1536
Gly Leu Thr Leu Lys Met Val Asp Asp Gln Thr Leu Pro Pro Leu Met
            500                 505                 510
gaa aaa cct ctc cgg cca gga agt tca ctg ggc ttg cca gct ttc tca    1584
Glu Lys Pro Leu Arg Pro Gly Ser Ser Leu Gly Leu Pro Ala Phe Ser
        515                 520                 525
tat agt ttt ttt gtg ata aga aat gcc aaa gtt gct gct tgc atc tga    1632
Tyr Ser Phe Phe Val Ile Arg Asn Ala Lys Val Ala Ala Cys Ile
    530                 535                 540
<210>2
<211>543
<212>PRT
<213>智人(homo sapiens)
<400>2
Met Leu Leu Arg Ser Lys Pro Ala Leu Pro Pro Pro Leu Met Leu Leu
  1               5                  10                  15
Leu Leu Gly Pro Leu Gly Pro Leu Ser Pro Gly Ala Leu Pro Arg Pro
             20                  25                  30
Ala Gln Ala Gln Asp Val Val Asp Leu Asp Phe Phe Thr Gln Glu Pro
         35                  40                  45
Leu His Leu Val Ser Pro Ser Phe Leu Ser Val Thr Ile Asp Ala Asn
     50                  55                  60
Leu Ala Thr Asp Pro Arg Phe Leu Ile Leu Leu Gly Ser Pro Lys Leu
 65                  70                  75                  80
Arg Thr Leu Ala Arg Gly Leu Ser Pro Ala Tyr Leu Arg Phe Gly Gly
                 85                  90                  95
Thr Lys Thr Asp Phe Leu Ile Phe Asp Pro Lys Lys Glu Ser Thr Phe
            100                 105                 110
Glu Glu Arg Ser Tyr Trp Gln Ser Gln Val Asn Gln Asp Ile Cys Lys
        115                 120                 125
Tyr Gly Ser Ile Pro Pro Asp Val Glu Glu Lys Leu Arg Leu Glu Trp
    130                 135                 140
Pro Tyr Gln Glu Gln Leu Leu Leu Arg Glu His Tyr Gln Lys Lys Phe
145                 150                 155                 160
Lys Asn Ser Thr Tyr Ser Arg Ser Ser Val Asp Val Leu Tyr Thr Phe
                165                 170                 175
Ala Asn Cys Ser Gly Leu Asp Leu Ile Phe Gly Leu Asn Ala Leu Leu
            180                 185                 190
Arg Thr Ala Asp Leu Gln Trp Asn Ser Ser Asn Ala Gln Leu Leu Leu
        195                 200                 205
Asp Tyr Cys Ser Ser Lys Gly Tyr Asn Ile Ser Trp Glu Leu Gly Asn
    210                 215                 220
Glu Pro Asn Ser Phe Leu Lys Lys Ala Asp Ile Phe Ile Asn Gly Ser
225                 230                 235                 240
Gln Leu Gly Glu Asp Phe Ile Gln Leu His Lys Leu Leu Arg Lys Ser
                245                 250                 255
Thr Phe Lys Asn Ala Lys Leu Tyr Gly Pro Asp Val Gly Gln Pro Arg
            260                 265                 270
Arg Lys Thr Ala Lys Met Leu Lys Ser Phe Leu Lys Ala Gly Gly Glu
        275                 280                 285
Val Ile Asp Ser Val Thr Trp His His Tyr Tyr Leu Asn Gly Arg Thr
    290                 295                 300
Ala Thr Arg Glu Asp Phe Leu Asn Pro Asp Val Leu Asp Ile Phe Ile
305                 310                 315                 320
Ser Ser Val Gln Lys Val Phe Gln Val Val Glu Ser Thr Arg Pro Gly
                325                 330                 335
Lys Lys Val Trp Leu Gly Glu Thr Ser Ser Ala Tyr Gly Gly Gly Ala
            340                 345                 350
Pro Leu Leu Ser Asp Thr Phe Ala Ala Gly Phe Met Trp Leu Asp Lys
        355                 360                 365
Leu Gly Leu Ser Ala Arg Met Gly Ile Glu Val Val Met Arg Gln Val
    370                 375                 380
Phe Phe Gly Ala Gly Asn Tyr His Leu Val Asp Glu Asn Phe Asp Pro
385                 390                 395                 400
Leu Pro Asp Tyr Trp Leu Ser Leu Leu Phe Lys Lys Leu Val Gly Thr
                405                 410                 415
Lys Val Leu Met Ala Ser Val Gln Gly Ser Lys Arg Arg Lys Leu Arg
            420                 425                 430
Val Tyr Leu His Cys Thr Asn Thr Asp Asn Pro Arg Tyr Lys Glu Gly
        435                 440                 445
Asp Leu Thr Leu Tyr Ala Ile Asn Leu His Asn Val Thr Lys Tyr Leu
    450                 455                 460
Arg Leu Pro Tyr Pro Phe Ser Asn Lys Gln Val Asp Lys Tyr Leu Leu
465                 470                 475                 480
Arg Pro Leu Gly Pro His Gly Leu Leu Ser Lys Ser Val Gln Leu Asn
                485                 490                 495
Gly Leu Thr Leu Lys Met Val Asp Asp Gln Thr Leu Pro Pro Leu Met
            500                 505                 510
Glu Lys Pro Leu Arg Pro Gly Ser Ser Leu Gly Leu Pro Ala Phe Ser
        515                 520                 525
Tyr Ser Phe Phe Val Ile Arg Asn Ala Lys Val Ala Ala Cys Ile
    530                 535                 540
<210>3
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物F1
<400>3
atgctgctgc gctcgaagcc tgcgct                                      26
<210>4
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物R1
<400>4
tcagatgcaa gcagcaactt tggcat                                      26
<210>5
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物F2
<400>5
ctgcagatgc tgctgcgctc gaagcctgcg ct                               32
<210>6
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物R2
<400>6
ctcgagt cagatgcaagcag caactttggcat                     32
<210>7
<211>2577
<212>DNA
<213>智人(homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)......(2577)
<400>7
atg tcg gtg gtg ggg ttg gac gtg ggc tcg cag agc tgc tac atc gcg   48
Met Ser Val Val Gly Leu Asp Val Gly Ser Gln Ser Cys Tyr Ile Ala
  1               5                  10                  15
gta gcc cgg gcc ggg ggc atc gag acc atc gcc aat gag ttc agc gac   96
Val Ala Arg Ala Gly Gly Ile Glu Thr Ile Ala Asn Glu Phe Ser Asp
             20                  25                  30
cgg tgc acc ccg tca gtc ata tca ttt gga tca aaa aat aga aca atc  144
Arg Cys Thr Pro Ser Val Ile Ser Phe Gly Ser Lys Asn Arg Thr Ile
         35                  40                  45
gga gtt gca gcc aaa aat cag caa atc act cat gca aac aat acg gtg  192
Gly Val Ala Ala Lys Asn Gln Gln Ile Thr His Ala Asn Asn Thr Val
     50                  55                  60
tct aac ttc aaa aga ttt cat ggc cga gca ttc aac gac ccc ttc att  240
Ser Asn Phe Lys Arg Phe His Gly Arg Ala Phe Asn Asp Pro Phe Ile
 65                  70                  75                  80
caa aag gag aag gaa aac ttg agt tac gat ttg gtt cca ttg aaa aat  288
Gln Lys Glu Lys Glu Asn Leu Ser Tyr Asp Leu Val Pro Leu Lys Asn
                 85                  90                  95
ggt gga gtt gga ata aag gta atg tac atg ggt gaa gaa cat cta ttt  336
Gly Gly Val Gly Ile Lys Val Met Tyr Met Gly Glu Glu His Leu Phe
            100                 105                 110
agt gtg gag cag ata aca gcc atg ttg ttg act aag ctg aag gaa act    384
Ser Val Glu Gln Ile Thr Ala Met Leu Leu Thr Lys Leu Lys Glu Thr
        115                 120                 125
gct gaa aac agc ctc aag aaa cca gta aca gat tgt gtt att tca gtc    432
Ala Glu Asn Ser Leu Lys Lys Pro Val Thr Asp Cys Val Ile Ser Val
    130                 135                 140
ccc tcc ttc ttt aca gat gct gag agg cga tct gtg tta gat gct gca    480
Pro Ser Phe Phe Thr Asp Ala Glu Arg Arg Ser Val Leu Asp Ala Ala
145                 150                 155                 160
cag att gtt ggc cta aac tgt tta aga ctt atg aat gac atg aca gct    528
Gln Ile Val Gly Leu Asn Cys Leu Arg Leu Met Asn Asp Met Thr Ala
                165                 170                 175
gtt gct ttg aat tac gga att tat aag cag gat ctc cca agc ctg gat    576
Val Ala Leu Asn Tyr Gly Ile Tyr Lys Gln Asp Leu Pro Ser Leu Asp
            180                 185                 190
gag aaa cct cgg ata gtg gtt ttt gtt gat atg gga cat tca gct ttt    624
Glu Lys Pro Arg Ile Val Val Phe Val Asp Met Gly His Ser Ala Phe
        195                 200                 205
caa gtg tct gct tgt gct ttt aac aag gga aaa ttg aag gta ctg gga    672
Gln Val Ser Ala Cys Ala Phe Asn Lys Gly Lys Leu Lys Val Leu Gly
    210                 215                 220
aca gct ttt gat cct ttc tta gga gga aaa aac ttc gat gaa aag tta    720
Thr Ala Phe Asp Pro Phe Leu Gly Gly Lys Asn Phe Asp Glu Lys Leu
225                 230                 235                 240
gtg gaa cat ttc tgt gca gaa ttt aaa act aag tac aag ttg gat gca    768
Val Glu His Phe Cys Ala Glu Phe Lys Thr Lys Tyr Lys Leu Asp Ala
                245                 250                 255
aaa tcc aaa ata cga gca ctc cta cgt ctg tat cag gaa tgt gaa aaa    816
Lys Ser Lys Ile Arg Ala Leu Leu Arg Leu Tyr Gln Glu Cys Glu Lys
            260                 265                 270
ctg aaa aag cta atg agc tct aac agc aca gac ctt cca ctg aat atc    864
Leu Lys Lys Leu Met Ser Ser Asn Ser Thr Asp Leu Pro Leu Asn Ile
        275                 280                 285
gaa tgc ttt atg aat gat aaa gat gtt tcc gga aag atg aac agg tca    912
Glu Cys Phe Met Asn Asp Lys Asp Val Ser Gly Lys Met Asn Arg Ser
    290                 295                 300
caa ttt gaa gaa ctc tgt gct gaa ctt ctg caa aag ata gaa gta ccc    960
Gln Phe Glu Glu Leu Cys Ala Glu Leu Leu Gln Lys Ile Glu Val Pro
305                 310                 315                 320
ctt tat tca ctg ttg gaa caa act cat ctc aaa gta gaa gat gtg agt    1008
Leu Tyr Ser Leu Leu Glu Gln Thr His Leu Lys Val Glu Asp Val Ser
                325                 330                 335
gca gtt gag att gtt gga ggc gct aca cga att cca gct gtg aag gaa    1056
Ala Val Glu Ile Val Gly Gly Ala Thr Arg Ile Pro Ala Val Lys Glu
            340                 345                 350
aga att gcc aaa ttc ttt gga aaa gat att agc aca aca ctc aat gca    1104
Arg Ile Ala Lys Phe Phe Gly Lys Asp Ile Ser Thr Thr Leu Asn Ala
        355                 360                 365
gat gaa gca gta gcc aga gga tgt gca tta cag tgt gca ata ctt tcc    1152
Asp Glu Ala Val Ala Arg Gly Cys Ala Leu Gln Cys Ala Ile Leu Ser
    370                 375                 380
ccg gca ttt aaa gtt aga gaa ttt tcc gtc aca gat gca gtt cct ttt    1200
Pro Ala Phe Lys Val Arg Glu Phe Ser Val Thr Asp Ala Val Pro Phe
385                 390                 395                 400
cca ata tct ctg atc tgg aac cat gat tca gaa gat act gaa ggt gtt    1248
Pro Ile Ser Leu Ile Trp Asn His Asp Ser Glu Asp Thr Glu Gly Val
                405                 410                 415
cat gaa gtc ttt agt cga aac cat gct gct cct ttc tcc aaa gtt ctc    1296
His Glu Val Phe Ser Arg Asn His Ala Ala Pro Phe Ser Lys Val Leu
            420                 425                 430
acc ttt ctg aga agg ggg cct ttt gag cta gaa gct ttc tat tct gat    1344
Thr Phe Leu Arg Arg Gly Pro Phe Glu Leu Glu Ala Phe Tyr Ser Asp
        435                 440                 445
ccc caa gga gtt cca tat cca gaa gca aaa ata ggc cgc ttt gta gtt    1392
Pro Gln Gly Val Pro Tyr Pro Glu Ala Lys Ile Gly Arg Phe Val Val
    450                 455                 460
cag aat gtt tct gca cag aaa gat gga gaa aaa tct aga gta aaa gtc    1440
Gln Asn Val Ser Ala Gln Lys Asp Gly Glu Lys Ser Arg Val Lys Val
465                 470                 475                 480
aaa gtg cga gtc aac acc cat ggc att ttc acc atc tct acg gca tct    1488
Lys Val Arg Val Asn Thr His Gly Ile Phe Thr Ile Ser Thr Ala Ser
                485                 490                 495
atg gtg gag aaa gtc cca act gag gag aat gaa atg tct tct gaa gct    1536
Met Val Glu Lys Val Pro Thr Glu Glu Asn Glu Met Ser Ser Glu Ala
            500                 505                 510
gac atg gag tgt ctg aat cag aga cca cca gaa aac cca gac act gat    1584
Asp Met Glu Cys Leu Asn Gln Arg Pro Pro Glu Asn Pro Asp Thr Asp
        515                 520                 525
gca aat gaa aaa aaa gtt gac cag cct cca gaa gct aaa aag ccc aaa    1632
Lys Asn Val Gln Gln Asp Asn Ser Glu Ala Gly Thr Gln Pro Gln Val
    530                 535                 540
ata aag gtg gtg aat gtt gag ctg cct att gaa gcc aac ttg gtc tgg    1680
Gln Thr Asp Ala Gln Gln Thr Ser Gln Ser Pro Pro Ser Pro Glu Leu
545                 550                 555                 560
cag tta ggg aaa gac ctt ctt aac atg tat att gag aca gag ggt aag    1728
Thr Ser Glu Glu Asn Lys Ile Pro Asp Ala Asp Lys Ala Asn Glu Lys
                565                 570                 575
atg ata atg caa gat aaa ttg gaa aaa gaa agg aat gat gct aaa aat    1776
Lys Val Asp Gln Pro Pro Glu Ala Lys Lys Pro Lys Ile Lys Val Val
            580                 585                 590
gca gtt gag gaa tat gtg tat gag ttc aga gac aag ctg tgt gga cca    1824
Asn Val Glu Leu Pro Ile Glu Ala Asn Leu Val Trp Gln Leu Gly Lys
        595                 600                 605
tat gaa aaa ttt ata tgt gag cag gat cat caa aat ttt ttg aga ctc    1872
Asp Leu Leu Asn Met Tyr Ile Glu Thr Glu Gly Lys Met Ile Met Gln
    610                 615                 620
ctc aca gaa act gaa gac tgg ctg tat gaa gaa gga gag gac caa gct    1920
Asp Lys Leu Glu Lys Glu Arg Asn Asp Ala Lys Asn Ala Val Glu Glu
625                 630                 635                 640
aaa caa gca tat gtt gac aag ttg gaa gaa tta atg aaa att ggc act    1968
Tyr Val Tyr Glu Phe Arg Asp Lys Leu Cys Gly Pro Tyr Glu Lys Phe
                645                 650                 655
cca gtt aaa gtt cgg ttt cag gaa gct gaa gaa cgg cca aaa atg ttt    2016
Ile Cys Glu Gln Asp His Gln Asn Phe Leu Arg Leu Leu Thr Glu Thr
            660                 665                 670
gaa gaa cta gga cag agg ctg cag cat tat gcc aag ata gca gct gac    2064
Glu Asp Trp Leu Tyr Glu Glu Gly Glu Asp Gln Ala Lys Gln Ala Tyr
        675                 680                 685
ttc aga aat aag gat gag aaa tac aac cat att gat gag tct gaa atg    2112
Val Asp Lys Leu Glu Glu Leu Met Lys Ile Gly Thr Pro Val Lys Val
    690                 695                 700
aaa aaa gtg gag aag tct gtt aat gaa gtg atg gaa tgg atg aat aat    2160
Arg Phe Gln Glu Ala Glu Glu Arg Pro Lys Met Phe Glu Glu Leu Gly
705                 710                 715                 720
gtc atg aat gct cag gct aaa aag agt ctt gat cag gat cca gtt gta    2208
Gln Arg Leu Gln His Tyr Ala Lys Ile Ala Ala Asp Phe Arg Asn Lys
                725                 730                 735
cgt gct cag gaa att aaa aca aaa atc aag gaa ttg aac aac aca tgt    2256
Asp Glu Lys Tyr Asn His Ile Asp Glu Ser Glu Met Lys Lys Val Glu
            740                 745                 750
gaa ccc gtt gta aca caa ccg aaa cca aaa att gaa tca ccc aaa ctg    2304
Lys Ser Val Asn Glu Val Met Glu Trp Met Asn Asn Val Met Asn Ala
        755                 760                 765
gaa aga act cca aat ggc cca aat att gat aaa aag gaa gaa gat tta    2352
Gln Ala Lys Lys Ser Leu Asp Gln Asp Pro Val Val  Arg Ala Gln Glu
    770                 775                 780
gaa gac aaa aac aat ttt ggt gct gaa cct cca cat cag aat ggt gaa    2400
Ile Lys Thr Lys Ile Lys Glu Leu Asn Asn Thr Cys Glu Pro Val Val
785                 790                 795                 800
tgt tac cct aat gag aaa aat tct gtt aat atg gac ttg gac tag ata    2448
Thr Gln Pro Lys Pro Lys Ile Glu Ser Pro Lys Leu Glu Arg Thr Pro
                805                 810                 815
acc tta aat tgg cct att cct tca att aat aaa ata ttt ttg cca tag    2496
Asn Gly Pro Asn Ile Asp Lys Lys Glu Glu Asp Leu Glu Asp Lys Asn
            820                 825                 830
tat gtg act cta cat aac ata ctg aaa cta ttt ata ttt tct ttt tta    2544
Asn Phe Gly Ala Glu Pro Pro His Gln Asn Gly Glu Cys Tyr Pro Asn
        835                 840                 845
agg ata ttt aga aat ttt gtg tat tat atg gaa                        2577
Glu Lys Asn Ser Val Asn Met Asp Leu Asp
    850                 855
<210>8
<211>858
<212>PRT
<213>智人(homo sapiens)
<400>8
Met Ser Val Val Gly Leu Asp Val Gly Ser Gln Ser Cys Tyr Ile Ala
  1               5                  10                  15
Val Ala Arg Ala Gly Gly Ile Glu Thr Ile Ala Asn Glu Phe Ser Asp
             20                  25                  30
Arg Cys Thr Pro Ser Val Ile Ser Phe Gly Ser Lys Asn Arg Thr Ile
         35                  40                  45
Gly Val Ala Ala Lys Asn Gln Gln Ile Thr His Ala Asn Asn Thr Val
     50                  55                  60
Ser Asn Phe Lys Arg Phe His Gly Arg Ala Phe Asn Asp Pro Phe Ile
 65                  70                  75                  80
Gln Lys Glu Lys Glu Asn Leu Ser Tyr Asp Leu Val Pro Leu Lys Asn
                 85                  90                  95
Gly Gly Val Gly Ile Lys Val Met Tyr Met Gly Glu Glu His Leu Phe
            100                 105                 110
Ser Val Glu Gln Ile Thr Ala Met Leu Leu Thr Lys Leu Lys Glu Thr
        115                 120                 125
Ala Glu Asn Ser Leu Lys Lys Pro Val Thr Asp Cys Val Ile Ser Val
    130                 135                 140
Pro Ser Phe Phe Thr Asp Ala Glu Arg Arg Ser Val Leu Asp Ala Ala
145                 150                 155                 160
Gln Ile Val Gly Leu Asn Cys Leu Arg Leu Met Asn Asp Met Thr Ala
                165                 170                 175
Val Ala Leu Asn Tyr Gly Ile Tyr Lys Gln Asp Leu Pro Ser Leu Asp
            180                 185                 190
Glu Lys Pro Arg Ile Val Val Phe Val Asp Met Gly His Ser Ala Phe
        195                 200                 205
Gln Val Ser Ala Cys Ala Phe Asn Lys Gly Lys Leu Lys Val Leu Gly
    210                 215                 220
Thr Ala Phe Asp Pro Phe Leu Gly Gly Lys Asn Phe Asp Glu Lys Leu
225                 230                 235                 240
Val Glu His Phe Cys Ala Glu Phe Lys Thr Lys Tyr Lys Leu Asp Ala
                245                 250                 255
Lys Ser Lys Ile Arg Ala Leu Leu Arg Leu Tyr Gln Glu Cys Glu Lys
            260                 265                 270
Leu Lys Lys Leu Met Ser Ser Asn Ser Thr Asp Leu Pro Leu Asn Ile
        275                 280                 285
Glu Cys Phe Met Asn Asp Lys Asp Val Ser Gly Lys Met Asn Arg Ser
    290                 295                 300
Gln Phe Glu Glu Leu Cys Ala Glu Leu Leu Gln Lys Ile Glu Val Pro
305                 310                 315                 320
Leu Tyr Ser Leu Leu Glu Gln Thr His Leu Lys Val Glu Asp Val Ser
                325                 330                 335
Ala Val Glu Ile Val Gly Gly Ala Thr Arg Ile Pro Ala Val Lys Glu
            340                 345                 350
Arg Ile Ala Lys Phe Phe Gly Lys Asp Ile Ser Thr Thr Leu Asn Ala
        355                 360                 365
Asp Glu Ala Val Ala Arg Gly Cys Ala Leu Gln Cys Ala Ile Leu Ser
    370                 375                 380
Pro Ala Phe Lys Val Arg Glu Phe Ser Val Thr Asp Ala Val Pro Phe
385                 390                 395                 400
Pro Ile Ser Leu Ile Trp Asn His Asp Ser Glu Asp Thr Glu Gly Val
                405                 410                 415
His Glu Val Phe Ser Arg Asn His Ala Ala Pro Phe Ser Lys Val Leu
            420                 425                 430
Thr Phe Leu Arg Arg Gly Pro Phe Glu Leu Glu Ala Phe Tyr Ser Asp
        435                 440                 445
Pro Gln Gly Val Pro Tyr Pro Glu Ala Lys Ile Gly Arg Phe Val Val
    450                 455                 460
Gln Asn Val Ser Ala Gln Lys Asp Gly Glu Lys Ser Arg Val Lys Val
465                 470                 475                 480
Lys Val Arg Val Asn Thr His Gly Ile Phe Thr Ile Ser Thr Ala Ser
                485                 490                 495
Met Val Glu Lys Val Pro Thr Glu Glu Asn Glu Met Ser Ser Glu Ala
            500                 505                 510
Asp Met Glu Cys Leu Asn Gln Arg Pro Pro Glu Asn Pro Asp Thr Asp
        515                 520                 525
Lys Asn Val Gln Gln Asp Asn Ser Glu Ala Gly Thr Gln Pro Gln Val
    530                 535                 540
Gln Thr Asp Ala Gln Gln Thr Ser Gln Ser Pro Pro Ser Pro Glu Leu
545                 550                 555                 560
Thr Ser Glu Glu Asn Lys Ile Pro Asp Ala Asp Lys Ala Asn Glu Lys
                565                 570                 575
Lys Val Asp Gln Pro Pro Glu Ala Lys Lys Pro Lys Ile Lys Val Val
            580                 585                 590
Asn Val Glu Leu Pro Ile Glu Ala Asn Leu Val Trp Gln Leu Gly Lys
        595                 600                 605
Asp Leu Leu Asn Met Tyr Ile Glu Thr Glu Gly Lys Met Ile Met Gln
    610                 615                 620
Asp Lys Leu Glu Lys Glu Arg Asn Asp Ala Lys Asn Ala Val Glu Glu
625                 630                 635                 640
Tyr Val Tyr Glu Phe Arg Asp Lys Leu Cys Gly Pro Tyr Glu Lys Phe
                645                 650                 655
Ile Cys Glu Gln Asp His Gln Asn Phe Leu Arg Leu Leu Thr Glu Thr
            660                 665                 670
Glu Asp Trp Leu Tyr Glu Glu Gly Glu Asp Gln Ala Lys Gln Ala Tyr
        675                 680                 685
Val Asp Lys Leu Glu Glu Leu Met Lys Ile Gly Thr Pro Val Lys Val
    690                 695                 700
Arg Phe Gln Glu Ala Glu Glu Arg Pro Lys Met Phe Glu Glu Leu Gly
705                 710                 715                 720
Gln Arg Leu Gln His Tyr Ala Lys Ile Ala Ala Asp Phe Arg Asn Lys
                725                 730                 735
Asp Glu Lys Tyr Asn His Ile Asp Glu Ser Glu Met Lys Lys Val Glu
            740                 745                 750
Lys Ser Val Asn Glu Val Met Glu Trp Met Asn Asn Val Met Asn Ala
        755                 760                 765
Gln Ala Lys Lys Ser Leu Asp Gln Asp Pro Val Val Arg Ala Gln Glu
    770                 775                 780
Ile Lys Thr Lys Ile Lys Glu Leu Asn Asn Thr Cys Glu Pro Val Val
785                 790                 795                 800
Thr Gln Pro Lys Pro Lys Ile Glu Ser Pro Lys Leu Glu Arg Thr Pro
                805                 810                 815
Asn Gly Pro Asn Ile Asp Lys Lys Glu Glu Asp Leu Glu Asp Lys Asn
            820                 825                 830
Asn Phe Gly Ala Glu Pro Pro His Gln Asn Gly Glu Cys Tyr Pro Asn
        835                 840                 845
Glu Lys Asn Ser Val Asn Met Asp Leu Asp
    850                 855
<210>9
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物F3
<400>9
gtatctctcg agaagagaat gtcggtggtg ggg                                33
<210>10
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物R3
<400>10
atttaaggta ccctagtcca agtccatatt aa                    32