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重组逆转录病毒载体
技术领域
本发明涉及一种新型重组逆转录病毒载体，其可应用于临床肿瘤免疫治疗，隶属于医学生物技术领域。
背景技术
恶性肿瘤是一种严重威胁人类健康的疾病。由于传统的化学疗法、放射性疗法以及手术疗法难以治疗患有转移瘤的肿瘤病人，肿瘤免疫学疗法受到免疫学家和医疗工作者的广泛关注与研究。在临床治疗领域，T细胞过继转移疗法作为重要的被动免疫疗法已经被成功地应用于血液系统来源的肿瘤疾病(1，2)。但是对于实体瘤的治疗，T细胞过继疗法近年来进展缓慢，仅有个别报道用该疗法治疗黑色素瘤患者(3)。目前，T细胞过继转移疗法的局限性在于：从肿瘤患者体内分离到的T淋巴细胞数量不足；其免疫活性、肿瘤特异性不高(4)。目前，临床上普遍的做法是在体外培养肿瘤特异性T淋巴细胞过程中加入重组白介素2(5)，但是其临床应用的效果不明显。主要原因如下：白介素2可以引起T淋巴细胞对于Fas受体介导的凋亡途径敏感而使特异性的T细胞凋亡(6)；白介素2还可以促进调节性T细胞的产生从而抑制肿瘤特异性T细胞功能，进而阻止免疫系统清除肿瘤(7、8)。过继转移免疫细胞进入肿瘤病人体内也有一定风险，即转入的免疫细胞可能会引起严重的自身免疫性疾病以及T细胞淋巴瘤。这种风险在将白介素2基因或白介素15基因转染入T细胞后会有所增加。
因此，为了克服T细胞过继转移疗法的上述缺点，本发明人进行了本发明。
发明内容
本发明的目的是为了克服T细胞过继转移疗法的上述缺点，提供一种新型重组逆转录病毒载体，所述重组逆转录病毒载体不但能够大量扩增肿瘤患者的T淋巴细胞并保持其肿瘤抗原特异性从而提高治疗效果，而且同时可以清除基因改造过的细胞，避免其在体内增殖所导致的自身免疫性疾病以及淋巴瘤，确保生物治疗的安全性。
因此，本发明提供一种新型重组逆转录病毒载体，其特征在于包括人白介素15基因(SEQ.ID.No.1，全长490bp，NCBI GeneBank序列登记号为：NM000585)和胸苷激酶基因(HSV-TK，SEQ.ID.No.3，全长序列：1131bp，NCBI GeneBank序列登记号为：AB178228)，以及真核启动子hEF1-HTLV序列，其中所述胸苷激酶基因是一种自杀基因。将该重组逆转录病毒载体命名为IL15-TK，本发明人已于2008年12月22日将携带该重组逆转录病毒载体IL15-TK的反转录病毒TK-L15 Retrovirus保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国北京朝阳区大屯路中科院微生物研究所，100101)，保藏登记号为：CGMCCNo.2810。
本发明的重组逆转录病毒载体IL15-TK可在体外大量扩增T淋巴细胞并且保持其肿瘤抗原特异性：该载体可将人白介素15基因导入T淋巴细胞中，使其自我分泌白介素15刺激自身增殖，同时也可保持其肿瘤抗原特异性。但是，自我分泌白介素15的T淋巴细胞有可能导致自身免疫性疾病以及T淋巴细胞瘤，而将自杀基因(胸苷激酶)一同导入T淋巴细胞能够避免这种情况发生，从而确保生物医学治疗的安全性。
本新型重组逆转录病毒载体IL15-TK含有人白介素15和胸苷激酶基因，可感染包括人源、鼠源的各种原代细胞(primary cells)以及细胞系列(cell lines)。在载体上强启动子的作用下，被感染细胞可大量表达白介素15和胸苷激酶。
在本发明的一个实施方案中，利用含有HSV-TK的重组逆转录病毒载体tgls(+)HyTkEF1a-mIL4(质粒图谱参见图1E)(该质粒由德国MDC实验室Thomas Blankenstein博士馈赠，构建方法参见参考文献16)，酶切去除插入片段mIL4后载体自连获得tgls(+)HyTkEF1a(在下文中也简称为TK载体)，在此基础上构建了本发明的重组逆转录病毒载体IL2-TK和IL15-TK，其中已将携带IL15-TK的反转录病毒TK-L15 Retrovirus于2008年12月22日保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.2810。本发明人重点研究IL15-TK，IL2-TK作为IL15-TK的功能研究的对照。
在本发明的另一个实施方案中，使用本发明构建的重组逆转录病毒载体IL15-TK和IL2-TK分别转染细胞，被转染的细胞分泌的白介素15或白介素2可有效促进鼠源原代T细胞的增殖(图4)。
在本发明的一个优选实施方案中，证明了自分泌白介素15可维持Ova抗原特异性CD4T淋巴细胞的存活。
在本发明的另一个优选实施方案中，证明了自分泌白介素15的肿瘤特异性T淋巴细胞可以更好地介导肿瘤排斥，而自分泌白介素2的肿瘤特异性T淋巴细胞不能达到上述效果。
在本发明的实施方案中，描述了本发明所述的重组逆转录病毒载体的应用，其可以用于制备提供临床肿瘤免疫辅助治疗的药物或试剂盒，可以配合传统的化学疗法、放射性疗法抑制肿瘤的复发以及转移。
在本发明的优选实施方案中，本发明提供一种试剂盒，其包括治疗有效量的本发明的重组逆转录病毒载体以及药用载体等。该试剂盒可以用于提供临床肿瘤免疫辅助治疗，可以配合传统的化学疗法、放射性疗法抑制肿瘤的复发以及转移。
自分泌白介素15能刺激T淋巴细胞自我增殖，帮助其摆脱对外界细胞因子的依赖，加强对肿瘤靶细胞的识别与杀伤能力，提高过继转移疗法的疗效。人白介素15与人白介素2一样同属νc受体家族，可有效刺激T淋巴细胞(Tlymphocytes)和天然杀伤细胞(Nature killer cells)等免疫细胞的增殖(9)，增强免疫细胞的免疫活性，并且能够维持免疫细胞的抗原特异性，不引起T淋巴细胞丢失肿瘤特异性以及分化凋亡等(10，11)。Greenberg发表在Nature上的文献证明：在动物体内实验中，人白介素15能打破肿瘤特异性T淋巴细胞的免疫耐受状态，使其遇到肿瘤抗原后表现出更高的细胞因子分泌、更强的靶细胞杀伤活性及更好的体内治疗效果(12，13)。
过继转移免疫细胞进入肿瘤病人体内也有一定风险，即转入的免疫细胞可能会引起严重的自身免疫性疾病以及T细胞淋巴瘤。这种风险在将白介素2基因或白介素15基因转染入T细胞后会有所增加。为了避免这种情况出现，我们将HSV-TK基因与白介素15基因一起转入免疫细胞。HSV-TK(herpes simplex virus thymidine kinase，单纯疱疹病毒胸苷激酶)是一种单纯疱疹病毒来源的自杀性基因，在遇见化学药物丙氧鸟苷(ganciclovir，GCV)后能将表达该基因的细胞杀死。GCV是一种化疗药物，已在临床上使用。白介素15基因与TK基因重组在一起导入免疫细胞中，将使免疫细胞过继转移疗法的安全性增加。
目前，有两种自杀系统被应用于临床治疗，分别是HSV-TK(GCV)系统和胞嘧啶脱氨酶CD(5-FC)系统。表达胞嘧啶脱氨酶(cytosinedeaminase)的可将细胞基因组内的5氟胞嘧啶转化为5氟尿嘧啶，最终诱导细胞凋亡。在本发明中，本发明人集中研究了HSV-TK(GCV)系统。
综上所述，本新型重组逆转录病毒载体的有益效果包括：使T淋巴细胞或NK细胞自分泌白介素15，能有效的刺激免疫细胞增殖并保持其抗肿瘤活性；同时，胸苷激酶(自杀基因)的引入又有效避免了T淋巴细胞的所导致的自身免疫性疾病以及T淋巴细胞瘤，确保了生物技术治疗的安全性。
附图说明
从下面结合附图对重组逆转录病毒载体的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：
图1显示本发明的重组逆转录病毒载体的示意图。其中：
A.重组逆转录病毒载体IL15-TK：1.5’端LTR；2.包装信号Ψ信号；3.RNA选择性剪切位点SD-SA；4.胸苷激酶基因HSV-TK；5.真核启动子hEF1-HTLV；6.人白介素15基因(hIL15)；7.3’端LTR。
B.重组逆转录病毒载体IL2-TK：1.5’端LTR；2.包装信号Ψ信号；3.RNA选择性剪切位点SD-SA；4.胸苷激酶基因HSV-TK；5.真核启动子hEF1a；6.人白介素2基因(hIL2)；7.3’端LTR。
C.携带人白介素15基因的InvivoGen公司商业化质粒pORF-hIL15的图谱，其上的真核启动子为hEF1-HTLV。
D.携带人白介素2基因的质粒载体pCDNA3-hIL2的图谱。
E.携带胸苷激酶TK自杀基因的重组逆转录病毒载体tgls(+)HyTKEF1a-mIL4的图谱，以此示意tgls(+)HyTKEF1a的图谱，前者与后者的区别在于前者插入了小鼠mIL4基因。
图2显示成功构建了IL2-TK，并且转染了IL2-TK的293T细胞可分泌人白介素2。A，构建的IL2-TK质粒的酶切消化测定，经过BamHI消化处理，IL2-TK可被切成两个片段(506bp的人白介素2基因与8200bp的其他载体组件)；B，转染了IL2-TK的293T细胞分泌人白介素2的ELISA测定，结果表明导入IL2-TK的293T可分泌大量的人重组白介素2。
图3显示成功构建了IL15-TK，并且转染了IL15-TK的293T细胞可分泌人白介素15。A，构建的IL15-TK质粒的酶切消化测定，经过BamHI消化处理，IL15-TK可被切成两个片段(512bp的人白介素2基因与8200bp的其他载体组件)；B，转染了IL15-TK的293T细胞分泌人白介素15的ELISA测定，结果表明导入IL15-TK的293T可分泌大量的人重组白介素15。
图4显示转染了IL15-TK以及IL2-TK的293T细胞分泌的白介素15与白介素2可有效促进鼠源原代Do11.10CD4T细胞的增殖。
图5显示转染了重组逆转录病毒载体以及包装载体的细胞可生产含有IL2-TK(A)与IL15-TK(B)的逆转录病毒。提取包装细胞培养上清中的RNA后，利用对人白介素15与人白介素2基因特异性的引物检测到含有白介素15与白介素2重组逆转录病毒载体。
图6显示含有IL2-TK以及IL15-TK的逆转录病毒可成功感染人JurkatT淋巴细胞系。感染逆转录病毒的Jurkat细胞可分泌人白介素2(A)和人白介素15(B)。6C和D显示胞内染色结果，同样也证明感染Re-IL2(IL2-TK)逆转录病毒的Jurkat细胞可产生人白介素2(6C)，以及感染Re-IL15(IL15-TK)逆转录病毒的Jurkat细胞可产生人白介素15(6D)。
图7显示转移到GCV细胞培养基(0uM，0.2uM，1uM以及5uM)中可以引起表达TK基因的293T细胞死亡。
图8显示自分泌白介素15可维持Ova抗原特异性Do11.10CD4T淋巴细胞的存活。在T细胞刺激信号aCD3和aCD28的作用下，自分泌人白介素15的抗原特异性CD4T细胞能够维持存活，而自分泌人白介素2的CD4T细胞则更容易凋亡。
图9显示自分泌白介素15的肿瘤特异性T淋巴细胞可更好地介导肿瘤排斥。A，在对小鼠模型注射J558-Ova肿瘤后第2天通过尾静脉注射过继体外培养的Ova特异性CD4T细胞，在第6天和第12天，观察并记录肿瘤生长情况。小鼠分为4组，每组分别注射自分泌白介素15的T细胞、自分泌白介素2的T细胞、对照病毒感染T细胞，在同一组中，相同的符号代表同一只小鼠在不同检测时间的肿瘤大小。结果表明，自分泌白介素15的Do11.10CD4T细胞在体内可更好的抑制J558-Ova肿瘤生长；B，分泌白介素2的T淋巴细胞没有上述效果；而且，在过继转移小鼠模型中，自分泌白介素15的Do11.10CD4T细胞可介导小鼠体内的J558-Ova肿瘤排斥。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。
实施例1：构建重组逆转录病毒载体
重组逆转录病毒载体IL15-TK和IL2-TK的示意图参考图1A和1B。
重组逆转录病毒载体的构建是基于携带TK自杀基因的逆转录病毒载体tgls(+)HyTKEF1a(简称TK载体)进行的。tgls(+)HyTKEF1a由tgLS(+)HyTK质粒(14)引入真核启动子EF1a改造获得。tgls(+)HyTKEF1a上携带的TyTK融合基因编码hph和HSV-1TK酶活性。
IL2-TK重组逆转录病毒载体构建：
a)获得hIL2基因片段：
以携带人白介素2基因的质粒载体pcDNA3-hIL2(质粒图谱见图1D，其序列为SEQ.ID.No.6，其中人白介素2基因位于碱基913-1374处)(该质粒由河北医科大学王永祥实验室馈赠，参见参考文献15)为模板，设计人白介素2基因引物，正向引物1(CgC ggATCC gCgATgTACAggATgC)和反向引物1(CgC ggATCC gCgCTCAAgTCAgTgT)，PCR扩增，PCR的条件为：94℃变性1分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，30个循环；72℃10分钟；由此获得hIL2基因片段。
b)人白介素2基因片段处理：
将步骤1中通过PCR获得的hIL2基因片段连接到promega公司的T载体上，而后用BamHI处理获得带有BamHI粘端的hIL2基因片段。
c)携带TK逆转录病毒载体tgls(+)HyTKEF1a的处理：
用BamHI酶切tgls(+)HyTKEF1a质粒，获得7.6Kb大小BamHI粘端TK逆转录病毒载体。
d)连接构建hIL2-TK逆转录病毒载体：
将步骤b)获得的带有BamHI粘端的基因片段与步骤c)获得的酶切的载体片段相连接，获得hIL2-TK重组逆转录病毒载体，其中连接的体系和条件如下：
T4DNA连接酶：2单位
10×连接酶缓冲液：2ul
酶切处理的hIL2片段：80ng
酶切处理的载体片段：1ug
双蒸水：总体积补到20ul
16℃连接过夜。
IL15-TK重组逆转录病毒载体构建：
我们在构建重组白介素2与白介素15重组逆转录病毒载体的过程中，发现在相同启动子EF1a下人白介素15的表达产量与白介素2相比较低得多(结果未显示)。为了解决这个问题，我们采用了启动子替换策略，即用hEF1-HTLV融合启动子替换EF1a启动子。本领域的技术人员应该理解，启动子替换的策略有很多方法可以实现。例如，可以先将hIL15基因片段克隆到具有hEF1-HTLV启动子的质粒中，然后利用特异性PCR引物通过PCR扩增获得hEF1-HTLV-hIL15的融合片段，最后经过标准分子克隆技术克隆到TK载体中。在本实施例中，我们试图利用购自InvivoGen公司的原始白介素15质粒(pORF-hIL15)上的hEF1-HTLV融合启动子进行启动子替换，提高人白介素15表达产量。
IL15-TK重组逆转录病毒载体构建过程如下：
a)获得包括hEF1-HTLV融合启动子以及人重组白介素15基因的PCR片段：
以携带hEF1-HTLV融合启动子以及人白介素15基因的质粒载体pORF-hIL15(质粒图谱见图1C，质粒序列为SEQ.ID.No.5)(InvivoGen公司，目录号：porf-hil15，其中人白介素15基因hIL15位于碱基690-1178处，hEF1-HTLV启动子位于碱基1-544处(SEQ.ID.No.4))为模板，设计正向引物2(CCCggg gCTCCggTgCCCgTC)和反向引物2(ggATCC TCAATT gCA ATC)，PCR扩增，PCR的条件为：94℃变性1分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，30个循环；72℃10分钟；由此获得包括hEF1-HTLV融合启动子以及人重组白介素15基因的PCR片段hEF1-HTLV-hIL15。
b)人白介素15基因片段处理：
将步骤1获得的hEF1-HTLV-hIL15片段连接到promega公司的T载体上，使用SmaI与BamHI双酶切处理质粒，获得SmaI平末端以及BamHI粘末端。
c)携带TK逆转录病毒载体tgls(+)HyTKEF1a的处理：
使用HindIII处理tgls(+)HyTKEF1a质粒，而后用T4DNA聚合酶补成平末端，而后BamHI处理获得粘末端。
d)连接构建hIL15-TK逆转录病毒载体：
将步骤b)获得的基因片段与步骤c)获得的载体片段相连接，获得hIL15-TK重组逆转录病毒载体。该hIL15-TK重组逆转录病毒载体携带hEF1-HTLV加强型启动子。
其中连接的体系和条件如下：
T4DNA连接酶：2单位
10×连接酶缓冲液：2ul
酶切处理的hEF1-HTLV-hIL15片段：80ng
酶切处理的载体片段：1ug
双蒸水：总体积补到20ul
16℃连接过夜
本发明人对携带IL15-TK的反转录病毒TK-L15 Retrovirus进行了保藏，保藏号为CGMCC No.2810，保藏日期为2008年12月22日。
本发明所用的基因序列说明见下表1。
表1：本发明所用的基因序列说明

  SEQ.ID.No.  名称  1  人IL-15(GeneBank序列登记号：NM000585)  2  人IL-2(GeneBank序列登记号：NM000586)  3  HSV-TK全长序列  4  启动子hEF1-HTLV  5  pORF-hIL15质粒  6  pcDNA3-hIL2质粒
然而，本领域的技术人员应该理解，插入的基因片段IL2和IL15还可以通过本领域公知的分子克隆方法获得，例如，从样品组织中提取总RNA，设计特异性引物，进行RT-PCR可获得目的插入片段。
因此，IL2-TK和IL15-TK分别采用两种不同的启动子，即EF1a和hEF1-HTLV。EF1a真核启动子源于人真核翻译延伸因子1a的启动子(Eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1)，EF1a启动子可在人类脑部、胎盘、肺部、肝脏、肾脏以及前列腺等部位大量启动表达下游基因。实际应用于生物技术领域后，该启动子无组织特异性，可在各种真核细胞中高水平启动表达，是目前真核表达最常用的启动子之一。hEF1-HTLV加强型启动子是将人T细胞白血病病毒(HTLV)的I型LTR序列中的R组件以及部分U5序列重组到EF1a启动子的后面，该融合型启动子可增强下游DNA与RNA序列的稳定性。因此，融合启动子也可通过加强RNA转录产物的稳定性增加下游基因的表达产物的量。
对于IL2-TK，IL2的表达受启动子EF1a的控制，而对于IL15-TK，hEF1-HTLV融合启动子替换了EF1a启动子，能够提高人白介素15表达产量。然而，实验结果证明：融合启动子能够将白介素15的产量提高，但是依然达不到白介素2的表达水平。
在Rosenberg先生2008年5月发表在Human Gene Therapy上的文章表明：自分泌人白介素2的肿瘤特异性CD8T细胞不能比未经改造过的T细胞更好的介导肿瘤排斥。这与我们的实验结果相一致(图9)。因此，本发明重点研究IL15-TK。
人白介素15在天然状态下转录产物RNA不稳定，在同等转录水平下蛋白翻译产物的量不高。可以换用其他真核启动子能够进一步提高人白介素15的表达水平，但是表达量的高低与实际医药治疗效果不成比例。这需要进一步检验。我们所能确定的是在目前的表达水平下，自分泌白介素15可有效加强特异性T细胞的肿瘤抑制效果。
实施例2：构建逆转录病毒包装载体细胞
1.将5*10⁵的人胚肾细胞系293T铺六孔板，每孔加入1ml无血清、无抗生素的1640培养基，在pH值7.2-7.4、温度37℃、相对湿度95％、5％CO2培养条件下孵育12小时。
2.在100ul无血清、无抗生素的1640培养基中加入3ul lipofectamine2000转染试剂，同时在100ul无血清、无抗生素的1640培养基中加入0.2ug重组逆转录病毒载体(IL2-TK，IL15-TK或TK)以及1ug病毒包装载体10A1，室温放置5分钟。
3.混合溶于培养基中的转染质粒与转染试剂，室温下放置15分钟。
4.用800ul无血清、无抗生素1640培养基更换原始293T细胞培养基。
5.将转染质粒、转染试剂的混合液加入293T细胞培养基中。37℃孵育4小时。
6.用含有10％小牛血清以及10％抗生素的1640培养基更换含有转染试剂的培养基。
7.在pH值7.2-7.4、温度37℃、相对湿度95％、5％CO2培养条件下孵育72小时。
8.加入75ug/ml潮霉素B进行阳性克隆筛选。
9.7天后，保存阳性克隆。收取细胞培养上清即可获得病毒。
实施例3：重组逆转录病毒载体感染人Jurkat细胞系
感染实验按照本领域技术人员已知的常规方法进行。简述感染步骤如下：
1.在直径8cm细胞培养皿中铺5*10⁶实施例2中获得的病毒包装细胞。加入5ml 1640培养基。在pH值7.2-7.4、温度37℃、相对湿度95％、5％CO2培养条件下中孵育48小时。
2.收集含有逆转录病毒的包装细胞培养上清，使用0.45μm滤膜过滤消除细胞碎片。
3.将步骤2收集的病毒滴度调整到2*10⁶/ml，加入polybrene(聚凝胺)到终浓度6ng/ml。
4.将2*10⁵Jurkat细胞重悬在1ml步骤3的病毒上清中(病毒∶靶细胞(个数比)＝10∶1)。
5.在1500g，30℃下离心90min，而后在培养箱中放置150min。
6.为感染过的Jurkat细胞更换新鲜1640培养基。
7.感染72小时后，可利用人白介素15与人白介素2胞内抗体染色检测细胞的感染率。
经过潮霉素(200ug/ml)两周的筛选，感染IL15-TK病毒的Jurkat细胞的上清中可以检测到白介素15的表达。同理，感染IL2-TK病毒的Jurkat细胞的上清中也可以检测到白介素2的表达。表明逆转录病毒成功感染了Jurkat细胞。
实施例4：重组逆转录病毒载体的效果检测
1.重组逆转录病毒载体上人白介素15与白介素2基因功能检测。
在直径8cm的培养皿中铺5*10⁶个293T细胞(包括四种293T细胞：转染了IL2-TK的、转染了IL15-TK的、转染了对照组载体的mock-TK以及没有转染载体的对照组)，加入7ml 1640培养基。60小时，收集细胞培养上清ELISA检测白介素2。结果表明导入重组逆转录病毒载体IL2-TK的293T细胞可分泌大量的人重组白介素2，分泌量达到32.3ng/ml(图2B)，导入重组逆转录病毒载体IL15-TK的293T细胞可分泌大量的人重组白介素15，分泌量达到1315pg/ml(图3B)。
分别收集上述四种293T细胞的培养上清(转染了IL2-TK的、转染了IL15-TK的、转染了对照组载体的mock-TK以及没有转染载体的对照组)。使用重组人白介素2或人白介素15(浓度分别为0u/ml，20u/ml以及50u/ml)作对照，用MTT的方法比较含有50％培养上清孵育原代CD4T(Do11.10)细胞增殖情况。在450nm下读取OD值，活细胞数越多，OD值越高。图4的结果表明，导入重组逆转录病毒载体的293T细胞分泌的白介素2或白介素15都可以促进原代Do11.10CD4T细胞的增殖。
参考图6，将2*10⁶/ml的Jurkat细胞悬液铺24孔板，60小时后收集细胞培养上清，ELISA检测细胞因子人白介素2与人白介素15的分泌。所述Jurkat细胞包括四种：感染IL15-TK的，感染IL2-TK的，感染TK病毒的，以及没有处理过的对照组Jurkat细胞。从图6可看出，含有IL2-TK以及IL15-TK的逆转录病毒可成功感染人Jurkat T淋巴细胞系。感染逆转录病毒的Jurkat细胞可分泌人白介素2(图6A)和人白介素15(图6B)。而胞内染色结果同样也证明了，感染Re-IL2(IL2-TK)逆转录病毒的Jurkat细胞可产生人白介素2(图6C)，以及感染Re-IL15(IL15-TK)逆转录病毒的Jurkat细胞可产生人白介素15(图6D)。
2.重组逆转录病毒载体上自杀基因TK基因的功能检测。
在96孔板每孔中铺3*10⁴个293T细胞(分别是转染了IL15-TK载体，IL2-TK载体以及未转染任何载体的对照293T细胞)，以包含四个浓度梯度的GCV(0uM，0.2uM，1uM以及5uM)的细胞培养基孵育上述293T细胞。在pH值7.2-7.4、温度37℃、相对湿度95％、5％CO₂的培养条件下培养60小时，用MTT法检测活细胞数目。
从图7的结果可以看出，与未转染任何载体的对照细胞相比较，将表达TK基因的293T细胞转移到含有GCV的培养基中可以引起表达TK基因的293T细胞死亡。这也说明，本发明实施例1中所构建的IL2-TK和IL15-TK重组逆转录病毒载体都成功转入了自杀基因TK基因。
3.体外实验证明自分泌白介素15可以促进激活的CD4T细胞存活。
参考图8，将来源于Do11.10的CD4T细胞以每孔5*10⁶/ml铺在24孔板的孔中。利用板结合的aCD3(500ng/ml)与游离的aCD28(300ng/ml)激活抗原特异性T细胞，72小时后用PI(FL2)与Annexin V FITC(FL1)双染色通过流式细胞计数法检测T细胞凋亡情况。实验表明：自分泌白介素15的T细胞46％存活而自分泌白介素2的T细胞只有9.8％存活。
图8的实验结果表明，在T细胞刺激信号aCD3和aCD28的作用下，自分泌人白介素15的Ova抗原特异性CD4T细胞能够维持存活，而自分泌人白介素2的CD4T细胞则更容易凋亡。
本领域的技术人员应该理解，因为白介素15是一种多功能的细胞生长因子，其在天然条件下可促进CD4T细胞、CD8T细胞以及NK细胞的存活，加强免疫反应中的特异性CD4、CD8T细胞的记忆效应，所以，结合图8的实验结果，本发明的重组逆转录病毒载体IL15-TK还可以促进CD4T细胞、CD8T细胞以及NK细胞的存活，加强免疫反应中的特异性CD4、CD8T细胞的记忆效应。
4.体内实验验证自分泌白介素15的Ova抗原特异性CD4T细胞的抗J558-Ova的作用。
体内实验通过小鼠T细胞过继转移实验模型进行。所述小鼠T细胞过继转移实验模型按下述方法构建：
a)第零天时在Balb/C鼠腹侧(野生型小鼠，年龄6至8周)接种2*10⁶J558-Ova细胞；
b)第二天时通过尾静脉注射过继转移体外培养的Ova特异性CD4T细胞，所述细胞分为四个组：自分泌白介素15的T细胞、自分泌白介素2的T细胞、对照病毒感染T细胞以及磷酸盐缓冲液对照组；
c)在J558-Ova肿瘤注射后第6天和第12天，观察并记录肿瘤生长情况。
实验结果表明，在小鼠体内自分泌白介素15的T淋巴细胞能够更好的抑制J558-Ova肿瘤的生长(图9A)，自分泌白介素2的T淋巴细胞没有上述效果；而且，在过继转移小鼠模型中，T淋巴细胞介导的肿瘤排斥能够有效地保护荷瘤小鼠(图9B)。
在J558-Ova与Ova特异性CD4T细胞模型中，我们证明了自分泌白介素15的CD4T细胞的抗肿瘤效果，但是在其他肿瘤模型中的自分泌白介素15的CD4T细胞以及CD8T细胞的作用还有待检验。
应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，可以在其中进行各种形式和细节的变化，而不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围。
参考文献：
1.Kolb，H.J.，C.Schmid，A.J.Barrett，and D.J.Schendel2004.Graft-versus-leukemia reactions in allogeneic chimeras.Blood103：767-776.
2.Kolb，H.J.，A.Schattenberg，J.M.Goldman，B.Hertenstein，N.Jacobsen，W.Arcese，P.Ljungman，A.Ferrant，L.Verdonck，D.Niederwieser，F.vanRhee，J.Mittermueller，T.de Witte，E.Holler，and H.Ansari.1995.Graft-versus-leukemia effect of donor lymphocyte transfusions in marrowgrafted patients.Blood 86：2041-2050.
3.Dudley，M.E.，J.R.Wunderlich，P.F.Robbins，J.C.Yang，P.Hwu，D.J.Schwartzentruber，S.L.Topalian，R.Sherry，N.P.Restifo，A.M.Hubicki，M.R.Robinson，M.Raffeld，P.Duray，C.A.Seipp，L.Rogers-Freezer，K.E.Morton，S.A.Mavroukakis，D.E.White，and S.A.Rosenberg.2002.Cancerregression and autoimmunity in patients after clonal repopulation withantitumor lymphocytes.Science 298：850-854.
4.Gattinoni，L.et al.Acquisition of full effector function in vitroparadoxically impairs the in vivo antitumour efficacy of adoptivelytransferred CD8+T cells.J.Clin.Invest.115，1616-1626(2005).
5.S A Rosenberg，and，M T Lotze Cancer Immunotherapy UsingInterleukin-2 and Interleukin-2-Activated Lymphocytes Annual Review ofImmunology.Volume 4，Page 681-709，Apr 1986
6.Yosef Refaeli，Luk Van Parijs，Cheryl A London，Jürg Tschopp，and AbulK Abbas Biochemical Mechanisms of IL-2-Regulated Fas-Mediated TCell Apoptosis Immunity 19988：615-623
7.Shimon Sakaguchi，Tomoyuki Yamaguchi，Takashi Nomura，and MasahiroOno Regulatory T Cells and Immune Tolerance Cell，Vol 133，775-787，30May 2008
8.Antony，P.A.et al.CD8+T cell immunity against a tumour/self-antigen isaugmented by CD4+T helper cells and hindered by naturally occurring Tregulatory cells.J.Immunol.174，2591-2601(2005).
9.Gattinoni，L.et al.Acquisition of full effector function in vitroparadoxically impairs the in vivo antitumour efficacy of adoptivelytransferred CD8+T cells.J.Clin.Invest.115，1616-1626(2005).
10.Opferman，J.T.et al.Development and maintenance of B and Tlymphocytes requires antiapoptotic MCL-1.Nature 426，671-676(2003).
11.Hsu，C.et al.Primary human T lymphocytes engineered with acodon-optimized IL-15gene resist cytokine withdrawal-induced apoptosisand persist long-term in the absence of exogenous cytokine.J.Immunol.175，7226-7234(2005).
12.Klebanoff，C.A.et al.Central memory self/tumour-reactive CD8+T cellsconfer superior antitumour immunity compared with effector memory Tcells.Proc.Natl Acad.Sci.USA 102，9571-9576(2005).
13.Teague，R.M.，B.D.Sather，J.A.Sacks，M.Z.Huang，M.L.Dossett，J.Morimoto，X.Tan，S.E.Sutton，M.P.Cooke，C.Ohlen，and P.D.Greenberg.2006.Interleukin-15rescues tolerant CD8+T cells for use inadoptive immunotherapy of established tumors.Nat Med 12：335-341.
14.ROBERT W.OVERELL Dominant Positive and Negative SelectionUsing a Hygromycin Phosphotransferase-Thymidine Kinase Fusion GeneMOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY，June 1991
15.方艳辉，金玉怀，王永祥，于丹军，金士香，谢立新，人IL-2信号肽基因增强柯萨奇病毒B3型VP1 DNA疫苗诱导的中和抗体应答，中华微生物学和免疫学杂志，2004年，第24卷，第3期
16.Gabriele Noffz，Zhihai Qin，Manfred Kopf，and Thomas Blankenstein，Neutrophils but Not Eosinophils Are Involved in Growth Suppression ofIL-4-Secreting Tumors.The Journal of Immunology，1998，160：345-350
SEQUENCE LISTING
<110>中国科学院生物物理研究所
<120>重组逆转录病毒载体
<130>IB089435
<160>6
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>489
<212>DNA
<213>智人
<400>1
atgagaattt cgaaaccaca tttgagaagt atttccatcc agtgctactt gtgtttactt   60
ctaaacagtc attttctaac tgaagctggc attcatgtct tcattttggg ctgtttcagt  120
gcagggcttc ctaaaacaga agccaactgg gtgaatgtaa taagtgattt gaaaaaaatt  180
gaagatctta ttcaatctat gcatattgat gctactttat atacggaaag tgatgttcac  240
cccagttgca aagtaacagc aatgaagtgc tttctcttgg agttacaagt tatttcactt  300
gagtccggag atgcaagtat tcatgataca gtagaaaatc tgatcatcct agcaaacaac  360
agtttgtctt ctaatgggaa tgtaacagaa tctggatgca aagaatgtga ggaactggag  420
gaaaaaaata ttaaagaatt tttgcagagt tttgtacata ttgtccaaat gttcatcaac  480
acttcttga                                                          489
<210>2
<211>462
<212>DNA
<213>智人
<400>2
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt   60
gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat  120
ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc  180
acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa  240
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta  300
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa  360
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga  420
tggattacct tttgtcaaag catcatctca acactgactt ga                     462
<210>3
<211>1131
<212>DNA
<213>单纯疱疹病毒
<400>3
atggcttctc acgccggcca acagcacgcg cctgcgttcg gtcaggctgc tcgtgcgagc   60
gggcctaccg acggccgcgc ggcgtcccgt cctagccatc gccagggggc ctccggagcc  120
cgcggggatc cggagctgcc cacgctgctg cgggtttata tagacggacc ccacggggtg  180
gggaagacca ccacctccgc gcagctgatg gaggccctgg ggccgcgcga caatatcgtc  240
tacgtccccg agccgatgac ttactggcag gtgctggggg cctccgagac cctgacgaac  300
atctacaaca cgcagcaccg tctggaccgc ggcgagatat cggccgggga ggcggcggtg     360
gtaatgacca gcgcccagat aacaatgagc acgccttatg cggcgacgga cgccgttttg     420
gctcctcata tcggggggga ggctgtgggc ccgcaagccc cgcccccggc cctcaccctt     480
gttttcgacc ggcaccctat cgcctccctg ctgtgctacc cggccgcgcg gtacctcatg     540
ggaagcatga ccccccaggc cgtgttggcg ttcgtggccc tcatgccccc gaccgcgccc     600
ggcacgaacc tggtcctggg tgtccttccg gaggccgaac acgccgaccg cctggccaga     660
cgccaacgcc cgggcgagcg gcttgacctg gccatgctgt ccgccattcg ccgtgtctac     720
gatctactcg ccaacacggt gcggtacctg cagcgcggcg ggaggtggcg ggaggactgg     780
ggccggctga cgggggtcgc cgcggcgacc ccgcgccccg accccgagga cggcgcgggg     840
tctctgcccc gcatcgagga cacgctgttt gccctgttcc gcgttcccga gctgctggcc     900
cccaacgggg acttgtacca catttttgcc tgggtcttgg acgtcttggc cgaccgcctc     960
cttccgatgc atctatttgt cctggattac gatcagtcgc ccgtcgggtg tcgagacgcc    1020
ctgttgcgcc tcaccgccgg gatgatccca acccgcgtca caaccgccgg gtccatcgcc    1080
gagatacgcg acctggcgcg cacgtttgcc cgcgaggtgg ggggagttta g             1131
<210>4
<211>544
<212>DNA
<213>人工的
<400>4
ggatctgcga tcgctccggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg     60
agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa    120
actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt    180
atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac    240
agctgaagct tcgaggggct cgcatctctc cttcacgcgc ccgccgccct acctgaggcc    300
gccatccacg ccggttgagt cgcgttctgc cgcctcccgc ctgtggtgcc tcctgaactg    360
cgtccgccgt ctaggtaagt ttaaagctca ggtcgagacc gggcctttgt ccggcgctcc    420
cttggagcct acctagactc agccggctct ccacgctttg cctgaccctg cttgctcaac    480
tctacgtctt tgtttcgttt tctgttctgc gccgttacag atccaagctg tgaccggcgc    540
ctac                                                                 544
<210>5
<211>4101
<212>DNA
<213>人工的
<400>5
ggatctgcga tcgctccggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg     60
agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa    120
actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt    180
atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac    240
agctgaagct tcgaggggct cgcatctctc cttcacgcgc ccgccgccct acctgaggcc    300
gccatccacg ccggttgagt cgcgttctgc cgcctcccgc ctgtggtgcc tcctgaactg    360
cgtccgccgt ctaggtaagt ttaaagctca ggtcgagacc gggcctttgt ccggcgctcc    420
cttggagcct acctagactc agccggctct ccacgctttg cctgaccctg cttgctcaac    480
tctacgtctt tgtttcgttt tctgttctgc gccgttacag atccaagctg tgaccggcgc    540
ctacgtaagt gatatctact agatttatca aaaagagtgt tgacttgtga gcgctcacaa    600
ttgatactta gattcatcga gagggacacg tcgactacta accttcttct ctttcctaca     660
gctgagatca ccggcgaagg agggccacca tgcgaatttc gaaaccacat ttgagaagta     720
tttccatcca gtgctacttg tgtttacttc taaacagtca ttttctaact gaagctggca     780
ttcatgtctt cattttgggc tgtttcagtg cagggcttcc taaaacagaa gccaactggg     840
tgaatgtaat aagtgatttg aaaaaaattg aagatcttat tcaatctatg catattgatg     900
ctactttata tacggaaagt gatgttcacc ccagttgcaa agtaacagca atgaagtgct     960
ttctcttgga gttacaagtt atttcacttg agtccggaga tgcaagtatt catgatacag    1020
tagaaaatct gatcatccta gcaaacaaca gtttgtcttc taatgggaat gtaacagaat    1080
ctggatgcaa agaatgtgag gaactggagg aaaaaaatat taaagaattt ttgcagagtt    1140
ttgtacatat tgtccaaatg ttcatcaaca cttcttgatt gcaattgagc tagcattatc    1200
cctaatacct gccaccccac tcttaatcag tggtggaaga acggtctcag aactgtttgt    1260
ttcaattggc catttaagtt tagtagtaaa agactggtta atgataacaa tgcatcgtaa    1320
aaccttcaga aggaaaggag aatgttttgt ggaccacttt ggttttcttt tttgcgtgtg    1380
gcagttttaa gttattagtt tttaaaatca gtacttttta atggaaacaa cttgaccaaa    1440
aatttgtcac agaattttga gacccattaa aaaagttaaa tgagaaacct gtgtgttcct    1500
ttggtcaaca ccgagacatt taggtgaaag acatctaatt ctggttttac gaatctggaa    1560
acttcttgaa aatgtaattc ttgagttaac acttctgggt ggagaatagg gttgttttcc    1620
ccccacataa ttggaagggg aaggaatatc atttaaagct atgggagggt ttctttgatt    1680
acaacactgg agagaaatgc agcatgttgc tgattgcctg tcactaaaac aggccaaaaa    1740
ctgagtcctt gggttgcata gaaagcttca tgttgctaaa ccaatgttaa gtgaatcttt    1800
ggaaacaaaa tgtttccaaa ttactgggat gtgcatgttg aaacgtgggt taattaagaa    1860
catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt    1920
tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg    1980
gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg    2040
ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag    2100
cgtggcgctt tctcaatgct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc    2160
caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa    2220
ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg    2280
taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc    2340
taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac    2400
cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg    2460
tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt    2520
gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt    2580
catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa    2640
atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga    2700
ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt    2760
gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg    2820
agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga    2880
gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga    2940
agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg    3000
catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc    3060
aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc    3120
gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca    3180
taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac    3240
caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg    3300
ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc    3360
ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg    3420
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aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat    3540
actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata    3600
catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa    3660
agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg    3720
tatcacgagg ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat    3780
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tttcattaca tctgtgtgtt ggttttttgt gtgaatcgta actaacatac gctctccatc    4020
aaaacaaaac gaaacaaaac aaactagcaa aataggctgt ccccagtgca agtgcaggtg    4080
ccagaacatt tctctatcga a                                              4101
<210>6
<211>5914
<212>DNA
<213>人工的
<400>6
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg     60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg    120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc    180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt    240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata    300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc    360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc    420
attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt    480
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aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg    780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca    840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gcttggtacc    900
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gtcacaaaca gtgcacctac ttcaagttct acaaagaaaa cacagctaca actggagcat   1020
ttactgctgg atttacagat gattttgaat ggaattaata attacaagaa tcccaaactc   1080
accaggatgc tcacatttaa gttttacatg cccaagaagg ccacagaact gaaacatctt   1140
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aactttcact taagacccag ggacttaatc agcaatatca acgtaatagt tctggaacta   1260
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tttctgaaca gatggattac cttttgtcaa agcatcatct caacactgac ttgaggatcc   1380
actagtaacg gccgccagtg tgctggaatt ctgcagatat ccatcacact ggcggccgct   1440
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cagcctcgac tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt   1560
ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat    1620
cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg    1680
gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atggcttctg    1740
aggcggaaag aaccagctgg ggctctaggg ggtatcccca cgcgccctgt agcggcgcat    1800
taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag    1860
cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc    1920
aagctctaaa tcggggcatc cctttagggt tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc    1980
ccaaaaaact tgattagggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt    2040
ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa    2100
caacactcaa ccctatctcg gtctattctt ttgatttata agggattttg gggatttcgg    2160
cctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaattaa ttctgtggaa    2220
tgtgtgtcag ttagggtgtg gaaagtcccc aggctcccca ggcaggcaga agtatgcaaa    2280
gcatgcatct caattagtca gcaaccaggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca    2340
gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccat agtcccgccc ctaactccgc    2400
ccatcccgcc cctaactccg cccagttccg cccattctcc gccccatggc tgactaattt    2460
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