工业化制备载高密度细胞的海藻酸钠微囊的方法 【技术领域】
本发明涉及微囊化细胞工程的生物医药领域，更具体地说，涉及一种工业化大量制备载高密度细胞的海藻酸钠微囊及改善囊形的新方法。
背景技术
利用微囊包裹具有特定功能的组织细胞，形成免疫隔离的人工细胞，以此植入患病动物或病人体内，可补充疾病体内缺乏的生理活性物质，从而达到治疗疾病的目的。采用海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)或海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠(ACA)制作的三层结构膜微囊，具有体积小(粒径范围：200～1000μm)，生物相容性好，表面积大，有利于微囊化细胞在动物体内较长时间存活的特点。大量的实验表明，APA微囊的囊膜可截留大于11万Kd的分子，从而使免疫球蛋白分子和免疫活性细胞不能透过囊膜而进入囊内破坏其中的动物细胞，因而具有较好的免疫保护作用。
利用海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)或海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠(ACA)为微囊囊材，包裹细胞或组织的微囊化细胞工艺，主要包括：细胞与海藻酸钠溶液混合、成球、包覆聚赖氨酸、包覆海藻酸钠和洗出游离海藻酸钠、微囊液化等步骤。首先将细胞或组织与适当浓度的海藻酸钠溶液混合均匀，然后用高压静电液滴法或气流切割法将混合液滴至固化溶液中(等渗的CaCl2溶液)形成海藻酸钙微球，然后再将微球先后投入到适当浓度的聚赖氨酸溶液(或壳聚糖溶液)和海藻酸钠溶液中包覆聚赖氨酸(或壳聚糖溶液)和海藻酸钠，最后将微球投入到柠檬酸钠溶液中洗出游离的海藻酸钠，液化微球的核心，即可获得APA、ACA微囊化的细胞或组织。
关于APA、ACA微囊化的细胞或组织的制备工艺，目前文献和专利报道的APA，ACA微囊的制备方法，一般采用高压静电液滴法(Electrostatic droplet generation)。例如，文献报道中，杨晓明等(杨晓明，毕好生，杨茂元等，微囊化人嗜铬细胞体外培养的研究[J].中华麻醉学杂志，2001；21(7)：410-413.)和李涛等(李涛，周道标，杜智等，用APA微囊牛肾上腺嗜铬细胞移植治疗疼痛的研究[J].中国生物医学工程学报，2002；21(2)：97-101.)分别利用加拿大产微囊静电仪，采用高压静电法制备了人和牛的肾上腺嗜铬细胞的海藻酸钠微囊。专利文献报道中，李涛(CN1454995，利用海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠微囊包埋细胞或组织的方法)采用高压静电液滴法制备不同孔径的ACA微囊化细胞或组织。该法制备的ACA微囊孔径容易控制且分布均匀，通透性能好，故可广泛用于包埋肝、肾上腺、甲状腺、甲状旁腺、性腺等细胞或胰岛等组织。薛毅珑(CN1345234，用于治疗疼痛的微囊化牛肾上腺髓质嗜铬细胞药物；CN1242197用于治疗帕金森病的微囊化牛肾上腺髓质嗜铬细胞药物)采用高压静电液滴法制备了微囊化牛肾上腺髓质嗜铬细胞，该细胞药物能在人体内长期地分泌镇痛物质和多巴胺，植入一次可以止痛数个月以上，可用于治疗疼痛和帕金森病。
高压静电液滴法的原理如下：在高压静电场下，海藻酸钠液滴表面带静电，由于电荷的排斥作用，可是注射器针头生成的液滴大小均匀，表面张力变大而使液滴收缩更为圆整，滴入CaCl2溶液的固化液后，就可获得粒径大小均匀的海藻酸钙微球，从而最终能够制备大小均匀的APA、ACA微囊。
高压静电液滴法具有简便易行、需样品量少等优点，但存在的主要问题是：(1)微囊的生产效率低，远不能适应工业化生产需要；(2)制备的海藻酸钠微囊粒径分布较宽，一般为100～600μm。
近来，为适应工业化生产要求，采用其他原理进行细胞微囊化的工艺应运而生。其中振动喷嘴法(Vibrating jet breakup)因具有生产效率高，粒径分布窄的优点，越来越广泛应用于细胞微囊化的实验应用和工业化生产中。
振动喷嘴法的原理同样也是利用了液体的表面张力作用和高压静电作用，但是为了加快液滴生产的速率，提高微囊的制备效率，利用电磁振动原理，快速生产液滴。这样海藻酸钠液滴，在电磁振动作用下快速生成液滴；高压静电场的作用下，液滴荷电，静电排斥力使液滴表面张力增大。在电磁振动和静电场的双重作用下，液滴的生成更加均匀，大小更为集中，这样就大大提高了微囊的制备效率。
但在实验和生产的过程中，我们发现振动喷嘴法制备海藻酸钠微囊，存在着包裹细胞密度低的缺点，达不到高密度微囊化细胞的要求，阻碍着该法微囊化细胞工程的中试、工业化生产中进一步的应用。该缺点主要表现如下：当细胞密度较低时，所得微囊大小均匀，囊形好；当细胞密度较高时，所得微囊囊形较差，粒径大小差异大，粒径范围分布广。在微囊化细胞的临床应用时，由于注射给药针管大小、给药体积等因素的限制，微囊中的细胞密度需要达到较高的密度，微球的粒径大小要符合要求，粒径分布应集中，因而有必要采取新的工艺来提高微囊化技术的细胞密度和改善囊形。
【发明内容】
针对现有技术地不足，本发明提供一种制备载高密度细胞的海藻酸钠微囊的方法、改善囊形和粒径分布，提高生产效率，满足细胞微囊化工业化生产大量制备的要求，从而为细胞微囊化工程提供一种细胞密度高、囊形圆整、粒径大小均匀，分布范围窄的微囊化细胞技术平台。
本发明人针对现有的技术状况进行了深入研究，通过大量的实验结果发现，采用下述技术方案即可达到上述目的，从而完成了本发明。
工业化制备载高密度细胞的海藻酸钠微囊的方法，是一种采用采用振动喷嘴法，以海藻酸钠-聚赖氨酸或壳聚糖-海藻酸钠为复合包裹材料，制备海藻酸钠微囊，包裹细胞的方法，其创新之处在于，且提高海藻酸钠微囊制备过程中海藻酸钠的浓度至1.5～5％，在微囊的固化溶液中加入表面活性剂，用以提高海藻酸钠微囊中细胞包裹密度、改善微囊形状和粒径分布。
前述的方法，在优选的方案中，海藻酸钠微囊制备过程中海藻酸钠的浓度为1.5～3％。规格为中粘度。
前述的方法，在优选的方案中，所述表面活性剂为：泊洛沙姆、吐温、人血白蛋白(HSA)、牛血白蛋白(BSA)、曲拉通(Triton X100)或十二烷基硫酸钠(SDS)。优选为吐温80、泊洛沙姆188(F68)或人血白蛋白。
前述的方法，在优选的方案中，所述表面活性剂的浓度分别为：吐温80：0.05～5％，泊洛沙姆188：0.1～5％，人血白蛋白：0.1～5％。更优选为：吐温80：0.1～0.5％，泊洛沙姆188：0.5～1％，人血白蛋白：0.5～1％。
本发明采用主要特点是：(1)微囊的制备方法采用振动喷嘴法。利用APA微囊和ACA微囊包裹动物细胞，制备成APA或ACA微囊化细胞。该法具有生产效率高，微囊粒径分布集中的特点，能够适应工业化生产大量制备的要求；而传统的高压静电液滴法生产效率低，不适应中试、工业化生产中大量制备微囊化细胞的要求。(2)在海藻酸钠微囊的制备过程中，提高海藻酸钠的浓度至适宜浓度，可明显提高包封细胞的密度，同时有助于改善囊形；(3)在微囊的固化溶液(CaCl2溶液)中加入泊洛沙姆、吐温、曲拉通、牛血白蛋白(BSA)、人血白蛋白(HSA)等水溶性表面活性剂，用来改善微囊形状，减少囊的聚集，使微囊粒径分布范围窄。其中，泊洛沙姆188(F68)、人血白蛋白已经被多个国家批准应用于注射途径的制剂中，安全性能好。同人血白蛋白(HSA)相比，泊洛沙姆188(F68)为人工合成的表面活性剂，具有化学稳定性好，其水溶液可耐受高压灭菌，价格低廉的优势。本发明通过以上新方法，可显著提高海藻酸钠微囊中细胞的密度，改善微囊的囊形，微囊粒径分布均匀，提高生产效率，以满足微囊工业化生产的要求。
【附图说明】
图1.实施例1所得微囊化BCC-APA微囊显微镜图。
【具体实施方式】
以下结合实施例和附图对本发明的技术方案作进一步的详细说明。但本发明不受这些具体实施例的限制。
各实施例中所用原料和设备均为市售商品。其中海藻酸钠为Sigma公司销售，规格为中粘度，配制的海藻酸钠溶液用0.22μm微孔滤膜加压过滤。泊洛沙姆、吐温、人血白蛋白、牛血白蛋白、曲拉通或十二烷基硫酸钠均购自中国医药集团上海化学试剂公司。所使用的微囊制备仪器选自Inotech公司的产品，型号为Inotech IE-50R。
本发明提供制备含有高密度细胞的海藻酸钠微囊及改善囊形的方法，采用振动喷嘴法，取代传统的高压静电液滴法，提高生产效率，满足微囊化细胞的中试和大量制备的要求，并且采取相应的措施，解决目前高压静电液滴法制备海藻酸钠微囊存在的细胞密度低，微囊粘连，囊形差的缺点。
本方法的关键步骤如下：(1)在上述微囊化工艺的细胞与海藻酸钠混合阶段，采用较高浓度的海藻酸钠；(2)在微囊化工艺成球阶段，在CaCl2溶液中加入一定浓度吐温(0.5～5％)、曲拉通(0.5～5％)、泊洛沙姆(0.1～5％)、牛血白蛋白(BSA，0.1～5％)、人血白蛋白(HAS，0.1～5％)等水溶性表面活性剂，其余微囊的具体操作同常见文献所述，即得到包裹细胞密度高、囊形圆整、粒径分布集中，细胞活性稳定的APA微囊。
实施例1：
(1)海藻酸钠溶液的制备
称取海藻酸钠20g，溶于100ml灭菌生理盐水中，0.22μm微孔滤膜无菌过滤，即得2％海藻酸钠溶液。
(2)细胞与海藻酸钠溶液混合
将细胞总数为5×107个牛肾上腺髓质嗜铬细胞(BCC)与10ml浓度为2％海藻酸钠溶液，用搅拌法将其制成混悬液。
(3)制备海藻酸钙微球
采用Inotech IE-50R Encapsulator微囊仪器，用振动喷嘴法(Vibrating jetbreakup)，通过调节喷嘴大小，控制流速、振动频率等工艺参数，将混悬液喷至300ml浓度为100mmol/L含有0.5％泊洛沙姆(F68)CaCl2溶液中，静置10min后获得直径在200-400μm范围内的海藻酸钙微球沉淀，待沉淀完全后抽去上清液。
(4)包覆聚赖氨酸
将海藻酸钙微球加入到100ml浓度为0.05％的聚赖氨酸溶液中，混合均匀，在室温下放置5-10min，待沉淀完全后抽去上清液。
(5)包覆海藻酸钠
将沉淀物加入到200ml浓度为0.2％海藻酸钠溶液中(2％海藻酸钠溶液，用灭菌生理盐水稀释10倍，即得)，混合均匀，在室温下放置10min，待沉淀完全后除去抽去上清液。
(6)液化微囊
将沉淀物加入到200ml浓度为55mmol/L的柠檬酸钠溶液中，室温下放置10min，待沉淀完全后除去上清液，即获得载有BCC的APA微囊。
本实施例所制备微囊的显微照片见附图1。经显微镜观察、计数，微囊的平均粒径为300μm，每个微囊中细胞的数量为80～100个，微囊中细胞包封密度有了很大的提高。由图1可以看出：微囊囊形圆整，微囊粒径大小均匀，没有粘连现象发生。
实施例2：
(1)海藻酸钠溶液的制备
称取海藻酸钠22g，溶于100ml灭菌生理盐水中，0.22μm微孔滤膜无菌过滤，即得2.2％海藻酸钠溶液。
(2)细胞与海藻酸钠溶液混合
将细胞总数为10×107个牛肾上腺髓质嗜铬细胞(BCC)与10ml浓度为2.2％海藻酸钠溶液，用搅拌法将其制成混悬液。
(3)制备海藻酸钙微球
Inotech IE-50R Encapsulator微囊仪器，用振动喷嘴法(Vibrating jet breakup)，通过调节喷嘴大小，控制流速、振动频率等工艺参数，将混悬液喷至300ml浓度为100mmol/L的含有0.2％HSA(注射用)CaCl2溶液中，静置10min后获得直径在200-400μm范围内的海藻酸钙微球沉淀，待沉淀完全后抽去上清液。
(4)包覆聚赖氨酸
将海藻酸钙微球加入到100ml浓度为0.05％的聚赖氨酸溶液中，混合均匀，在室温下放置5-10min，待沉淀完全后抽去上清液。
(5)包覆海藻酸钠
将沉淀物加入到200ml浓度为0.2％海藻酸钠溶液中(2％海藻酸钠溶液，用灭菌生理盐水稀释10倍，即得)，混合均匀，在室温下放置10min，待沉淀完全后除去抽去上清液。
(6)液化微囊
将沉淀物加入到200ml浓度为55mmol/L的柠檬酸钠溶液中，室温下放置10min，待沉淀完全后除去上清液，即获得载有BCC的APA微囊。
经显微镜观察、计数，微囊的平均粒径为300μm，每个微囊中细胞的数量为160-200个，微囊囊形圆整，粒径分布范围窄。
实施例3：各步骤等同于实施例1或2，但与其不同的是，步骤(1)海藻酸钠溶液的制备中所获得的海藻酸钠溶液浓度为3％。
实施例4：各步骤等同于实施例1或2，但与其不同的是，步骤(1)海藻酸钠溶液的制备中所获得的海藻酸钠溶液浓度为1.5％。
实施例5：各步骤等同于实施例1或2，但与其不同的是，步骤(3)制备海藻酸钙微球中是“将混悬液喷至300ml浓度为100mmol/L的含有0.5％HSA(注射用)CaCl2溶液中”。
实施例6：各步骤等同于实施例1或2，但与其不同的是，步骤(3)制备海藻酸钙微球中是“将混悬液喷至300ml浓度为100mmol/L的含有1％HSA(注射用)CaCl2溶液中”。
实施例7：各步骤等同于实施例1或2，但与其不同的是，步骤(3)制备海藻酸钙微球中是“将混悬液喷至300ml浓度为100mmol/L的含有0.1％的吐温80(注射用)的CaCl2溶液中”。
实施例8：各步骤等同于实施例1或2，但与其不同的是，步骤(3)制备海藻酸钙微球中是“将混悬液喷至300ml浓度为100mmol/L的含有0.5％的吐温80(注射用)的CaCl2溶液中”。
实施例9：各步骤等同于实施例1或2，但与其不同的是，步骤(3)制备海藻酸钙微球中是“将混悬液喷至300ml浓度为100mmol/L的含有0.5％的泊洛沙姆188(注射用)的CaCl2溶液中”。
实施例10：各步骤等同于实施例1或2，但与其不同的是，步骤(3)制备海藻酸钙微球中是“将混悬液喷至300ml浓度为100mmol/L的含有1％的泊洛沙姆188(注射用)的CaCl2溶液中”。
实施例11：各步骤等同于实施例1或2，但与其不同的是，步骤(3)制备海藻酸钙微球时在微囊的固化溶液(CaCl2溶液)中加入的表面活性剂为曲拉通(Triton X100)，其用量是1.5g，浓度为0.5％。
实施例12：各步骤等同于实施例1或2，但与其不同的是，步骤(3)制备海藻酸钙微球时在微囊的固化溶液(CaCl2溶液)中加入的表面活性剂为十二烷基硫酸钠，其用量是1.5g，浓度为0.5％。