降胆固醇乳酸菌的微胶囊化方法 【技术领域】
本发明涉及一种降胆固醇乳酸菌的微胶囊化方法。
背景技术
在人体肠道内栖息着数百种的细菌，其数量超过百万亿个。其中对人体健康的有益菌，以乳酸菌、双歧杆菌等为代表。乳酸菌的益生作用已被医学界所公认，长期研究结果表明，乳酸菌对人的健康与长寿非常重要。据最近几年研究资料表明，乳酸菌作为定居肠道中的有益菌群具有多种保健作用：能维持微生态平衡和肠道机能，改善肝功能，降低胆固醇，增强免疫功能以及抗肿瘤等作用。乳酸菌大量存在于酸乳及其它相关发酵乳制品中。20世纪70年代，科学家先后通过对大量饮用酸乳等发酵乳制品的非洲Massai人的血清胆固醇进行研究，并对常饮酸乳的美国人进行调查以及直接对酸乳进行研究等，均发现乳酸菌具有降低人体血清胆固醇的作用。随着人民生活水平的提高和膳食营养的增加，胆固醇的摄入量很容易超标。自上世纪30年代有国外研究者得出“血管壁增厚即动脉粥样硬化症是不正常胆固醇代谢的结果”这一结论以来，已有越来越多的实验和研究表明胆固醇与动脉粥样硬化、冠心病、脑中风等心脑血管疾病间的关系。因此研究出不限饮食，不影响食品风味，经济实用的降低食品及人体中血清胆固醇水平的方法已成为当前重要的研究课题。
第一个微胶囊产品是1936年大西洋海岸渔业公司在液体石蜡中制备的鱼肝油明胶微胶囊。1949年，Wurster发明了微胶囊的空气悬浮法，改进了药物的总包衣过程。1954年，Green成功的将微胶囊技术应用于无碳复写纸的生产，从而开始了微胶囊技术的工业化。20世纪50年代末到60年代，人们开始研究把合成高分子的聚合方法应用于微胶囊制备，70年代以后，微胶囊技术的工艺日益成熟，应用范围也逐渐扩大，已在化学、农业和医药工业中得到广泛应用、在食品工业中主要应用于制造食品添加剂，是21世纪食品工业重点开发的高新技术之一。就目前而言，微胶囊技术是保护菌体活力最为有效和实用的方法之一，将其应用于乳制品如酸奶、奶酪和冷冻乳制品、发酵乳制品及保健型口服微胶囊菌粉等方面的生产潜力巨大。总之，微胶囊化为乳酸菌等低抗逆性微生物制剂提供了一条适用的工业化途径。
但是，传统的乳酸菌微胶囊化方法不完全适用于降胆固醇乳酸菌，该类方法肠道定位释放性低，储存稳定性低，且成本较高。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种肠道定位释放性高，储存稳定性强，且成本较低的降胆固醇乳酸菌微胶囊化的方法。
本方法包括降胆固醇乳酸菌的活化、固定化降胆固醇乳酸菌的制备、以明胶和海藻酸钠为壁材制备成W/O/W复相乳液、冷冻干燥制备成降胆固醇乳酸菌微胶囊粉末的步骤，具体如下：
1、降胆固醇乳酸菌的活化
本发明所使用的降胆固醇乳酸菌系干酪乳杆菌干酪亚种(L.Casei subsp.casei)。
将分离纯化的上述降胆固醇乳酸菌，接种于含0.75wt％CaCO3 MRS斜面培养基，置4℃冰箱中保存。
所述的分离纯化过程优选使用改良KENJI选择性培养基为：取1号溶液1000mL，胆固醇1.0g，超声波细胞粉碎机600W振荡乳化20min，加入1mL·L-1的4％溴百里香草酚兰作指示剂，调pH至6.0，121℃灭菌20min。
所述的1号溶液配方：酵母酶解粉0.2g，NH4NO3 1.0g，KH2PO4 0.25g，MgSO4·7H2O 0.25g，FeSO4·7H2O 5mg，NaCl 5mg，蒸馏水1000mL。
首先菌种活化时，挑取斜面固体培养基上的菌落，经梯度稀释后加入到MRS液体培养基中混菌，37℃培养48小时，重复以上操作2～3次。然后取200μL培养液涂布在改良MRS培养基的平板上，37℃恒温培养48～72h。挑取单个菌落，斜面接菌得到活化的纯培养物。
2、固定化降胆固醇乳酸菌的制备
(1)活化后的降胆固醇乳酸菌发酵菌液，经2500～3500rpm/min离心8～12分钟后，去上清液；
(2)将收集到的菌体用无菌PBS缓冲液(pH 7.0)洗涤，再次离心。重复三次；
(3)以1∶4～6菌体和缓冲液的比例，用无菌PBS缓冲液(pH 7.0)重新悬浮菌体；
(4)将悬浮菌液以5mL∶1～2g硅藻土的比例，缓慢倒入活化后的硅藻土中，同时不断搅拌，然后静置1～3h。
所述的活化后的硅藻土是这样得到的：用1mol/L的盐酸溶液浸泡硅藻土48小时，然后用蒸馏水冲洗硅藻土直到pH为中性，抽干。将硅藻土放入160℃烘箱中烘干至恒重，放入干燥器中备用。
(5)1～3小时后待硅藻土充分吸附菌体后抽滤。
3、W/O/W复相乳液法制备微胶囊
(1)将含菌的硅藻土分散到内层水相中，两者的比例为1g含菌的硅藻土：30～40mL水相；所述的内层水相中含明胶3.5～4wt％，海藻酸钠2～2.5wt％；将该水相溶液在搅拌的条件下，按照1∶1～1.5体积比加入到含0.2wt～0.3wt％吐温80和0.4wt％～0.5wt％十二烷基磺酸钠的普通植物色拉油中，形成W/O乳液；
(2)将上述W/O乳液按照5∶3～3.5的体积比分散到10～12％(w/v)、pH4.0的明胶溶液中，形成W/O/W乳液；
(3)同时边搅拌边加入7.5％(w/v)多聚磷酸钠水溶液；多聚磷酸钠水溶液与明胶溶液体积比为3∶1～1.2；
(4)用25％的乙酸溶液调溶液pH到4.0；
(5)放入冰箱冷藏室，将温度降到5～8℃，并保持2小时；
4、冷冻干燥
将按步骤3)所得乳状液平铺于器皿中，厚度不超过3mm，预冷到乳状液冻结；打开密封管开关，搬开冷冻舱，将样品置于冷冻舱里地隔板上，关闭密封管开关；打开真空冷冻干燥机开关，等待20～30分钟，直到冷冻舱的温度低于-40℃；打开真空泵开关，等待10～15分钟，直到系统压力低于100millitorr；观察样品是否干燥完全，冻干后取出。一般干燥过程需要48小时左右。
所述的干酪乳杆菌干酪亚种(L.Casei subsp.casei)可以采用下述方法筛选得到的高胆固醇降解能力的菌株，但不局限于该方法所获得的该菌株，本领域普通技术人员所知的筛选方法所得的高胆固醇降解能力的干酪乳杆菌干酪亚种(L.Casei subsp.casei)，均可作为本发明所述的材料：
以益生菌酸乳、干酪等发酵乳制品(如：天然发酵干酪)为分离原料，过程如下：
(1)乳酸菌的富集培养：
称取10-20克干酪为富集样品，加入到100-200ml脱脂牛乳或MRS液体培养基中进行富集培养，37℃培养48h后，用作分离样品。
脱脂牛乳培养基：10克脱脂乳粉加入到100ml蒸馏水中，112℃灭菌20min。
MRS液体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5.0g，葡萄糖20.0g，K2HPO4 2.0g，NaOAC 5.0g，MgSO4 0.2g，吐温80 1.0g，柠檬酸三铵2.0g，蒸馏水1000mL。
(2)降胆固醇乳酸菌的初步分离和纯化：
无菌操作取0.5或1ml上述富集培养液，加在含4.5或9ml无菌的改良KENJI选择性培养基(含0.04％溴百里香草酚兰)的试管中，摇匀，37℃振荡培养1-2天，然后取培养液100μL加到同样的培养基里培养，为避免原培养基中的碳源干扰，共需三次转管培养。
根据培养基的比混浊度和指示剂颜色的变化，取第三次培养后的菌液200μL加入到pH2的MRS液体培养基，培养6h；取其100μL培养液转接到含0.30％猪胆盐MRS液体培养基中，培养24h；然后取200μL培养液，涂布在改良MRS平板上，37℃恒温培养48-72h。
挑取可产酸的典型菌落，制成涂片、革兰氏染色、镜检。凡是革兰氏阳性的菌株，继续进行反复的划线分离、纯化，至纯菌落为止。将所获菌落菌株编号、接种到含0.75％CaCO3的MRS斜面培养基培养后，置4℃冰箱中保存备用。
改良KENJI选择性培养基：取1号溶液1000mL，胆固醇1.0g，超声波细胞粉碎机600W振荡乳化20min，加入1mL·L-1的4％溴百里香草酚兰作指示剂，调pH至6.0，121℃灭菌20min。
1号溶液配方：酵母酶解粉0.2g，NH4NO3 1.0g，KH2PO4 0.25g，MgSO4·7H2O0.25g，FeSO4·7H2O 5mg，NaCl 5mg，蒸馏水1000mL。
改良MRS固体培养基：在普通的MRS液体培养基中加入3％的胆盐(牛磺胆酸钠)，1％的水溶性胆固醇，2％的CaCl2，最后加入2％的琼脂。
(3)胆盐水解酶(BSH)基因的菌落PCR快速筛选
①BSH基因特异引物设计
根据GeneBank现已收录的乳酸菌BSH基因全序列，用vectorNTI软件设计上下游一对引物BSHPf和BSHPr，
BSHPf：5’-GGTTA CGATT ACGCC TAGAA AATAT CC-3’
BSHPr 5’-TTAAT TCAGT CGTAT CCAAG TGCTC ATG-3’
②菌株PCR扩增
挑选已分离纯化的乳酸菌，用无菌牙签挑取单个菌落到0.2mLPCR管中，加入10μL无菌1×TE缓冲液混匀，100℃煮沸5min，-20℃冷冻5min(循环2次)，5000r/min离心1min，吸取8μL上清液作为PCR扩增的DNA模板。根据引物序列的GC比等因素确定退火温度，经过优化后的反应条件如下：
第一次变性反应 94℃ 5min
35个循环反应 变性 94℃ 1min
退火 58℃ 1min
聚合 72℃ 1min
末循环 72℃ 2min
PCR体系成分表如下：
③分析
BSH基因在乳酸菌中普遍存在，其编码的胆盐水解酶(BSH)可以水解结合型胆汁盐产生游离型胆汁盐，BSH酶对乳杆菌降胆固醇作用有很大影响，因此，可以利用BSH基因进行降胆固醇乳酸菌的筛选。该酶基因测序结果均为950bp左右，因此利用菌株PCR方法扩增，具有该酶的乳酸菌可扩增出大小为950bp的一条特异条带。
根据电泳图谱分析，可确定待检乳酸菌是否有胆盐水解酶(BSH)。
利用上述方法，通过菌株PCR技术快速确认BSH基因的阴阳性，进一步确定具有胆固醇降解能力的菌株，12小时即可确定乳酸菌胆盐水解酶的阴阳性。自天然发酵乳制品可分离出具有高胆固醇降解能力的干酪乳杆菌干酪亚种(L.Casei subsp.casei)。
本发明的有益效果是：本发明采用复相乳液法(W/O/W)制备的降胆固醇乳酸菌微胶囊，因其壁材均属于天然高分子材料，具有稳定、无毒等特性，除了能应用于乳制品如酸奶、奶酪和冷冻乳制品、发酵乳制品，其也可应用于保健型口服微胶囊菌粉等的生产；制得的降胆固醇乳酸菌微胶囊，在肠液中2h的释放率为87.4％以上，活菌数可达到7.03×109cfu/mL；置于50℃下3h，活菌数仍能达6.81×106cfu/mL，储存30d活菌数仍可达到6×108cfu/mL；体外降胆固醇试验中，胆固醇降解率为36.07％以上，此外具有较好的耐酸性、肠溶性、耐高温性及降胆固醇性，产率在86.62％左右。所用的囊材与载体材料价格低廉，降低了成本，解决了当今微胶囊制备价格高与效果好不能同时实现的难题，并为实现生产规模化提供了有力的依据。
【具体实施方式】
实施例1
1、降胆固醇乳酸菌的活化
经改良KENJI选择性培养基(含0.04％溴百里香草酚兰)分离纯化的待处理降胆固醇乳酸菌——高降胆固醇能力的干酪乳杆菌干酪亚种(L.Casei subsp.casei)，接种于含0.75wt％CaCO3MRS斜面培养基，置4℃冰箱中保存。
(1)挑取斜面固体培养基上的菌落，进行梯度稀释(如1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000......)，将稀释液分别加入到MRS液体培养基中混菌，37℃培养48小时，重复以上操作2～3次；
(2)挑取该单个菌落，革兰氏染色镜检观察，直到获得纯培养。
所述的干酪乳杆菌干酪亚种(L.Casei subsp.casei)是采用下述方法筛选得到的高胆固醇降解能力的菌株，但本发明所述的方法不局限于该方法所获得的该菌株，本领域普通技术人员所知的筛选方法所得的高胆固醇降解能力的干酪乳杆菌干酪亚种(L.Casei subsp.casei)，均可作为本发明所述的材料：
以益生菌酸乳、干酪等发酵乳制品(如：天然发酵干酪)为分离原料，过程如下：
(1)乳酸菌的富集培养：
称取10-20克干酪为富集样品，加入到100-200ml脱脂牛乳或MRS液体培养基中进行富集培养，37℃培养48h后，用作分离样品。
脱脂牛乳培养基：10克脱脂乳粉加入到100ml蒸馏水中，112℃灭菌20min。
MRS液体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5.0g，葡萄糖20.0g，K2HPO4 2.0g，NaOAC 5.0g，MgSO4 0.2g，吐温801.0g，柠檬酸三铵2.0g，蒸馏水1000mL。
(2)降胆固醇乳酸菌的初步分离和纯化：
无菌操作取0.5或1ml上述富集培养液，加在含4.5或9ml无菌的改良KENJI选择性培养基(含0.04％溴百里香草酚兰)的试管中，摇匀，37℃振荡培养1-2天，然后取培养液100μL加到同样的培养基里培养，为避免原培养基中的碳源干扰，共需三次转管培养。
根据培养基的比混浊度和指示剂颜色的变化，取第三次培养后的菌液200μL加入到pH2的MRS液体培养基，培养6h；取其100μL培养液转接到含0.30％猪胆盐MRS液体培养基中，培养24h；然后取200μL培养液，涂布在改良MRS平板上，37℃恒温培养48-72h。
挑取可产酸的典型菌落，制成涂片、革兰氏染色、镜检。凡是革兰氏阳性的菌株，继续进行反复的划线分离、纯化，至纯菌落为止。将所获菌落菌株编号、接种到含0.75％CaCO3的MRS斜面培养基培养后，置4℃冰箱中保存备用。
改良KENJI选择性培养基：取1号溶液1000mL，胆固醇1.0g，超声波细胞粉碎机600W振荡乳化20min，加入1mL·L-1的4％溴百里香草酚兰作指示剂，调pH至6.0，121℃灭菌20min。
1号溶液配方：酵母酶解粉0.2g，NH4NO3 1.0g，KH2PO4 0.25g，MgSO4·7H2O0.25g，FeSO4·7H2O 5mg，NaCl 5mg，蒸馏水1000mL。
改良MRS固体培养基：在普通的MRS液体培养基中加入3％的胆盐(牛磺胆酸钠)，1％的水溶性胆固醇，2％的CaCl2，最后加入2％的琼脂。
(3)胆盐水解酶(BSH)基因的菌落PCR快速筛选
②BSH基因特异引物设计
根据GeneBank现已收录的乳酸菌BSH基因全序列，用vectorNTI软件设计上下游一对引物BSHPf和BSHPr，
BSHPf：5’-GGTTA CGATT ACGCC TAGAA AATAT CC-3’
BSHPr 5’-TTAAT TCAGT CGTAT CCAAG TGCTC ATG-3’
②菌株PCR扩增
挑选已分离纯化的乳酸菌，用无菌牙签挑取单个菌落到0.2mLPCR管中，加入10μL无菌1×TE缓冲液混匀，100℃煮沸5min，-20℃冷冻5min(循环2次)，5000r/min离心1min，吸取8μL上清液作为PCR扩增的DNA模板。根据引物序列的GC比等因素确定退火温度，经过优化后的反应条件如下：
第一次变性反应 94℃ 5min
35个循环反应 变性 94℃ 1min
退火 58℃ 1min
聚合 72℃ 1min
末循环 72℃ 2min
PCR体系成分表如下：
③分析
BSH基因在乳酸菌中普遍存在，其编码的胆盐水解酶(BSH)可以水解结合型胆汁盐产生游离型胆汁盐，BSH酶对乳杆菌降胆固醇作用有很大影响，因此，可以利用BSH基因进行降胆固醇乳酸菌的筛选。该酶基因测序结果均为950bp左右，因此利用菌株PCR方法扩增，具有该酶的乳酸菌可扩增出大小为950bp的一条特异条带。
根据电泳图谱分析，可确定待检乳酸菌是否有胆盐水解酶(BSH)。利用上述方法，通过菌株PCR技术快速确认BSH基因的阴阳性，进一步确定具有胆固醇降解能力的菌株，12小时即可确定乳酸菌胆盐水解酶的阴阳性。从中筛选出具有高胆固醇降解能力的干酪乳杆菌干酪亚种(L.Casei subsp.casei)。
2、固定化降胆固醇乳酸菌的制备
(1)活化后菌液于2500rpm/min条件下离心12分钟，去上清液；
(2)将收集到的菌体用无菌PBS冲液(pH 7.0)洗涤，再次离心。重复三次；
(3)以1∶4菌体和缓冲液的体积比，用pH 7.0的无菌PBS缓冲液重新悬浮菌体；
(4)将5mL悬浮菌液缓慢倒入1g活化后的硅藻土中，同时不断搅拌，静置1h；
(5)待硅藻土充分吸附菌体后抽滤。
3、W/O/W复相乳液法制备微胶囊
(1)将1g含降胆固醇乳酸菌的硅藻土分散到30mL内层水相(明胶3.5wt％，海藻酸钠2.5wt％)；
(2)将该水相溶液在搅拌的条件下，加入到30mL植物油中，植物油中含适量乳化剂吐温0.2wt％、十二烷基磺酸钠0.5wt％，直到形成稳定的W/O乳液；
(3)在50℃下，将该W/O乳液边搅拌边加入到40mL 10wt％明胶溶液里(pH4.0)；
(4)同时边搅拌边加入20mL多聚磷酸钠水溶液(7.5％(w/v))；
(5)用25％的乙酸溶液调pH到4.0；
(6)将温度降到5～8℃并保持2h。
4、冷冻干燥
将样品(乳状液)平铺于器皿中，厚度不超过3mm，预冷到乳状液冻结。打开密封管开关，搬开冷冻舱，将样品置于冷冻舱里的隔板上。关闭密封管开关。打开真空冷冻干燥机开关，等待20～30分钟，直到冷冻舱的温度低于-40℃。打开真空泵开关，等待10～15分钟，直到系统压力低于100miLLitorr。-80℃冻干样品，观察样品是否干燥完全，冻干后取出。一般干燥过程需要48小时左右。
制得的降胆固醇乳酸菌微胶囊在肠液中2h的释放率为88.5％，活菌数可达到7.45×109cfu/mL，置于50℃下3h，活菌数仍能达7.20×106cfu/mL，储存30d活菌数仍可达到6.5×108cfu/mL，体外降胆固醇试验中，胆固醇降解率为37.32％，具有较好的耐酸性、肠溶性、耐高温性及降胆固醇性，产率在87.02％左右。
实施例2
1、降胆固醇乳酸菌的活化
具体步骤见例1
2、固定化降胆固醇乳酸菌的制备
(1)活化后菌液于3000rpm/min条件下离心10分钟，去上清液；
(2)将收集到的菌体用无菌PBS冲液(pH 7.0)洗涤，再次离心。重复三次；
(3)以1∶5菌体和缓冲液的体积比，用pH 7.0的无菌PBS缓冲液重新悬浮菌体；
(4)将5mL悬浮菌液缓慢倒入1.5g活化后的硅藻土中，同时不断搅拌，静置2h；
(5)待硅藻土充分吸附菌体后抽滤。
3、W/O/W复相乳液法制备微胶囊
(1)将1.0g含降胆固醇乳酸菌的硅藻土分散到35mL内层水相(明胶3.5wt％，海藻酸钠2wt％)；
(2)将该水相溶液在搅拌的条件下，加入到40mL植物油中，植物油中含适量乳化剂(吐温0.3wt％，十二烷基磺酸钠0.4wt％)，直到形成稳定的W/O乳液；
(3)在50℃下，将该W/O乳液边搅拌边加入到45mL 12wt％明胶溶液里(pH4.0)；
(4)同时边搅拌边加入20mL多聚磷酸钠水溶液(7.5％(w/v))；
(5)用25％的乙酸溶液调pH到4.0；
(6)将温度降到5～8℃并保持2h。
4、冷冻干燥
具体步骤见例1.
制得的降胆固醇乳酸菌微胶囊在肠液中2h的释放率为87.6％，活菌数可达到7.11×109cfu/mL，置于50℃下3h，活菌数仍能达6.85×106cfu/mL，储存30d活菌数仍可达到6×108cfu/mL；体外降胆固醇试验中，胆固醇降解率为36.24％，具有较好的耐酸性、肠溶性、耐高温性及降胆固醇性，产率在86.77％左右。
实施例3
1、降胆固醇乳酸菌的活化
具体步骤见例1
2、固定化降胆固醇乳酸菌的制备
(1)活化后菌液于3500rpm/min条件下离心8分钟，去上清液；
(2)将收集到的菌体用无菌PBS冲液(pH 7.0)洗涤，再次离心。重复三次；
(3)以1∶6菌体和缓冲液的体积比，用pH 7.0的无菌PBS缓冲液重新悬浮菌体；
(4)将5mL悬浮菌液缓慢倒入2g活化后的硅藻土中，同时不断搅拌，静置3h；
(5)待硅藻土充分吸附菌体后抽滤。
3、W/O/W复相乳液法制备微胶囊
(1)将1.0g含降胆固醇乳酸菌的硅藻土分散到40mL内层水相(明胶4wt％，海藻酸钠2wt％)；
(2)将该水相溶液在搅拌的条件下，加入到40mL植物油中，植物油中含适量乳化剂(吐温0.3wt％，十二烷基磺酸钠0.4wt％)，直到形成稳定的W/O乳液；
(3)在50℃下，将该W/O乳液边搅拌边加入到48mL 12wt％明胶溶液里(pH4.0)；
(4)同时边搅拌边加入20mL多聚磷酸钠水溶液(7.5％(w/v))；
(5)用25％的乙酸溶液调pH到4.0；
(6)将温度降到5～8℃并保持2h。
4、冷冻干燥
具体步骤见例1。
制得的降胆固醇乳酸菌微胶囊在肠液中2h的释放率为88.1％，活菌数可达到7.22×109cfu/mL，置于50℃下3h，活菌数仍能达6.87×106cfu/mL，储存30d活菌数仍可达到6.2×108cfu/mL；体外降胆固醇试验中，胆固醇降解率为36.07％，具有较好的耐酸性、肠溶性、耐高温性及降胆固醇性，产率在86.78％左右。
实施例4
1、降胆固醇乳酸菌的制备
具体步骤见例1
2、固定化降胆固醇乳酸菌的制备
(1)活化后菌液于3500rpm/min条件下离心12分钟，去上清液；
(2)将收集到的菌体用无菌PBS冲液(pH 7.0)洗涤，再次离心。重复三次；
(3)以1∶5菌体和缓冲液的体积比，用pH 7.0的无菌PBS缓冲液重新悬浮菌体；
(4)将5mL悬浮菌液缓慢倒入2g活化后的硅藻土中，同时不断搅拌，静置2h；
(5)待硅藻土充分吸附菌体后抽滤。
3、W/O/W复相乳液法制备微胶囊
(1)将1.0g含降胆固醇乳酸菌的硅藻土分散到35mL内层水相(明胶4wt％，海藻酸钠2wt％)；
(2)将该水相溶液在搅拌的条件下，加入到35mL植物油中，植物油中含适量乳化剂(吐温0.2wt％，十二烷基磺酸钠0.4wt％)，直到形成稳定的W/O乳液；
(3)在50℃下，将该W/O乳液边搅拌边加入到42mL 10％明胶溶液里(pH4.0)；
(4)同时边搅拌边加入20mL多聚磷酸钠水溶液(7.5％(w/v))；
(5)用25％的乙酸溶液调pH到4.0；
(6)将温度降到5～8℃并保持2h。
4、冷冻干燥
具体步骤见例1
制得的降胆固醇乳酸菌微胶囊在肠液中2h的释放率为87.4％，活菌数可达到7.07×109cfu/mL，置于50℃下3h，活菌数仍能达6.82×106cfu/mL，储存30d活菌数仍可达到6×108cfu/mL；体外降胆固醇试验中，胆固醇降解率为36.09％，具有较好的耐酸性、肠溶性、耐高温性及降胆固醇性，产率在86.64％左右。
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<110>大连工业大学
<120>降胆固醇乳酸菌的微胶囊化方法
<130>N/A
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
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<212>DNA
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