密毛兜兰的无菌种子萌发和幼苗增殖方法 所属领域：本发明属于植物生物技术领域，具体地，涉及密毛兜兰的无菌种子萌发和幼苗增殖方法。
背景技术：
兜兰又名拖鞋兰， 《濒危野生动植物种国际贸易公约》将所有兜兰列入附录I。兜兰种子由于胚发育不完全，自然状态下极难萌发，其无菌播种技术虽早有研究，但普遍存在萌发率低，成苗率低的困难，其无性繁殖更是待解决的世界难题，难以进行大规模的商品化生产。
发明内容：
本发明的目的旨在克服现有技术中存在的上述问题，提供密毛兜兰无菌种子萌发和幼苗增殖方法，利用无菌播种的方法获得大量试管苗，并利用试管苗进行增殖，通过生根培养能形成完整植株。具有萌发率高，出苗快，苗壮，种苗品质好生长快速等优势。
本发明的上述目的是通过下述的技术方案得以实现的：
密毛兜兰的无菌种子萌发和幼苗增殖方法，选取密毛兜兰开花母株进行人工授粉，取授粉后200天的果实，刮去果皮上的细毛，浸泡在75％的酒精30秒后置于0.1％的升汞溶液中消毒15分种，无菌水冲洗4-5次后切开果实，将白色胚接种到KC培养基添加20％葡萄糖和10％椰子汁的培养基里，40天种子萌发后再转接到VW培养基添加20％葡萄糖和10％土豆泥的培养基里，待形成整株后继代培养在1/4MS培养基添加20％葡萄糖以及6-苄基嘌呤5毫克/升和萘乙酸0.5毫克/升中，或者1/4MS培养基添加6-苄基嘌呤6毫克/升和萘乙酸0.1毫克/升中，当试管苗长至3-4厘米时，转移到自然光下炼苗10天，取出后洗净根部培养基，将幼苗转移至装有灭菌的泥炭藓的培养袋内，放置于湿度为70％-75％的温室1个月，最后移入2∶2∶1的火山石∶蕨根∶水苔的混合基质中，放置在湿度不低于70％的有遮阴网的温室里。
KC是Knudson C，VW是Vacin and went。
附图说明：
图1 密毛兜兰种子成熟度(200DAP授粉后天数)对萌发率的影响(实验为5个重复)；
图2 不同培养基对密毛兜兰萌发率的影响(从左至右：1/4 MS，1/2MS，KC，VW)；
图3 不同的碳源对密毛兜兰植株生长的影响(从左至右：麦芽糖，葡萄糖，蔗糖，甘露醇)；
图4 激素诱导兜兰植物的芽增殖；
图5 不同培养基化合物成分对密毛兜兰萌发率的影响；
图6 不同的碳源对密毛兜兰萌发和植株生长的影响；
图7 不同的有机添加物对密毛兜兰萌芽和植株生长的影响。
具体实施方式：
下面结合附图，用本发明实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但任何对本发明做出的非显而易见的非创造性改变，将视为落入本发明的技术方案之内。
实施例1：
选取密毛兜兰(Paphiopedilum villosum var.densissimum)开花母株进行人工授粉，取授粉后200天的果实，刮去果皮上的细毛，浸泡在75％的酒精30秒后置于0.1％的升汞溶液中消毒15分种，无菌水冲洗4-5次后切开果实，将白色胚接种到KC培养基添加20％葡萄糖和10％椰子汁的培养基里，40天种子萌发后再转接到VW培养基添加20％葡萄糖和10％土豆泥的培养基里，待形成整株后继代培养在1/4MS培养基添加20％葡萄糖以及6-苄基嘌呤5毫克/升和萘乙酸0.5毫克/升中，或者1/4MS培养基添加6-苄基嘌呤6毫克/升和萘乙酸0.1毫克/升中，当试管苗长至3-4厘米时，当试管苗长至3-4厘米时，转移到自然光下炼苗10天，取出后洗净根部培养基，将幼苗转移至装有灭菌的泥炭藓，直径10 cm培养袋内，放置于湿度为70％-75％温室内1个月，最后移入火山石、蕨根和水苔的混合基质(2∶2∶1)中。放置在湿度高于70％的有遮阴网的温室里。种子萌发实验：
材料与方法：
材料：本试验所用兜兰材料来自中国云南省的文山密毛兜兰(Paphiopedilumvillosum var.densissimum)。
方法：
开花时在同种异株间进行人工授粉。种子成熟度(从人工授粉到接种的时间)根据下面实验设计的要求而不同。蒴果采收后，先以70％乙醇进行表面灭菌30-60sec，再用氯化汞(0.1％)进行表面灭菌15-20 min，无菌水清洗5遍，于无菌操作台内将蒴果剖开后，用镊子将种子均匀地刮入培养基内。基本培养基采用1/4MS(Murashige&Skoog，1962)，琼脂粉6gl-1，用1N的KOH，HCl调节pH值至5.8±0.1。其它实验培养基如下文以及结果见图5，6，7：分别接入KC，VW，1/4 MS和1/2 MS四种不同培养基；分别添加四种碳源：蔗糖20 gl-1，葡萄糖20 gl-1，麦芽糖20 gl-1，甘露醇20gl-1以及分别添加五种有机添加物：马铃薯泥100gl-1，佛手瓜泥100gl-1与苹果泥100gl-1和LH水解乳蛋白4gl-1，椰子汁100 mll-1。于自动高压灭菌锅121℃灭菌、20分钟。每瓶培养基接种200-300粒种子。每种处理设5个重复。容器为200ml、高8cm×宽7cm的玻璃罐头瓶、1个培养瓶为1个实验单位。除了种子萌发实验将置于暗光培养1个月，所有实验的种子或外植体暗光培养2个星期，再置于光照强度为2000 lx 36 W的荧光灯下培养3个月，照明每天16 h，培养环境为22±2℃。
激素诱导芽繁殖实验：
将这个种的原球茎(来自种子萌发实验)，转移至新鲜基本培养基(与上述方法中的基本培养基相同)。继代后直至一年以后长成3-5 cm的幼苗，这些幼苗将用来做为芽繁殖的实验材料。每瓶3株幼苗。实验材料地幼苗叶子剪掉一半后接种，减少营养的吸收，以及以示区别长出来的新芽。然后接入添加了各种细胞分裂素和细胞生长素，共36种组合(见表2)。3个月以后统计芽数和芽长，见结果(表2)。
移栽：
芽繁殖实验2个月以后，在湿度70％条件下，打开瓶盖，炼苗10天后，在自来水下轻轻洗净琼脂。然后将幼苗转移至装有灭菌的泥炭藓，直径10cm培养袋内，放置于温室内，保持高湿条件，一个月后统计存活率。
栽培管理：
对于活植物的保存，将根据生态相似性原则，在室内模拟兜兰的自然生境，特别注意对光照、湿度的控制，选用适合兜兰栽培的基质。
数据分析：
采用SPSS 16.0软件LSD测试进行方差分析，P≤0.05。数据分析前进行正态性分布检测。凡不符合正态分布的数据，修正后再进行分析。绘图采用Sigmaplot9.0软件。
实验设计：
密毛兜兰种子成熟度试验：
目的：不同种子成熟度是否影响密毛种子萌发。
采密毛兜兰授粉后120、130、140、150、160、170、180、190、200 d和300 d的蒴果，平均每处理取2个蒴果，交叉试验，以降低蒴果间差异性所造成的影响。于无菌操作台内将蒴果剖开后，用镊子将种子均匀地刮入培养基内。培养基为基本培养基加蔗糖20gl-1，AC 1gl-1，椰子汁100 mll-1。种子分别在培养20、40、60d和80 d后随机采取100粒种子置于解剖显微镜下观察和统计胚的萌发率。萌发标准为胚吸水膨大，并形成白色原球体(protocorm)。大约100 d后原球茎转绿，重新测量原球茎大小，用来做下一步幼苗生长实验。200 d后，测量幼苗的叶片。
密毛兜兰培养基化合物成分实验：
目的：四种培养基里的不同化合物成分对密毛种子和原球茎生长萌发的影响。300 d种子置于KC，VW，1/4 MS和1/2 MS四种不同培养基。每种培养基添加蔗糖20 gl-1，AC1gl-1，椰子汁100 ml l-1。种子萌发率和原球茎生长数据的统计如上。
密毛兜兰碳源实验：
目的：不同的糖对密毛种子萌发和原球茎生长的影响。
以授粉后300 d之蒴果进行，基本培养基+椰子汁100 mll-1，再各添加四种碳源：蔗糖20 gl-1，葡萄糖20 gl-1，麦芽糖20 gl-1，甘露醇20 gl-1。种子萌发率和原球茎生长数据的统计如上。
密毛兜兰有机添加物实验：
目的：不同的有机添加物对密毛种子萌发和原球茎生长的影响。
以授粉后300d之蒴果进行，基本培养基+蔗糖20 gl-1，再分别添加：马铃薯泥100 gl-1，佛手瓜泥100 gl-1与苹果泥100 gl-1和LH水解乳蛋白4 gl-1，椰子汁100 ml l-1。
数据分析：
采用SPSS 16.0软件LSD测试进行方差分析，P≤0.05。数据分析前进行正态性分布检测。凡不符合正态分布的数据，进行修正后再分析。绘图采用Sigmaplot 9.0软件。
结果
密毛兜兰种子成熟度试验结果：
密毛兜兰授粉后120 d，130 d，140 d在接种40 d后种子仍未萌发。200 d的种子在接种40 d后萌发率为13％， 80 d已达到3 1.33％。300 d种子，在40 d时萌发率为0％，在80 d萌发率仅13.33％。从授粉到接种，密毛兜兰种子成熟度最少需达到150 d才能接种进行萌发(见表1、图1)。
表1 密毛兜兰种子成熟度对萌发率的影响(A，B，C)不同字母
表示处理间存在着极其显著差异，P≤0.01
培养基化合物成分试验结果：
a密毛兜兰的种子在较低氮、较低盐浓度下萌发，以KC培养基为佳，培养80 d达到56％，与其他三种培养基相比，效果极其显著，其次是VW，1/4 MS。1/2 MS培养基而相对较差，这三种培养基对种子萌发效果不显著。
b密毛兜兰的原球茎在100 d后观察到VW的原球茎大2.6 mm2，特别是根粗长，已见密布根毛。接入180 d的植株在VW培养基叶长已达到0.7 cm。VW的原球茎明显大于1/2 MS的，但是与1/4 MS、KC培养基原球茎的差别不大(图2、图5)。
图5不同培养基化合物成分对密毛兜兰萌发率的影响。a方差分析前先将原始数据进行平方根转换，以符合正态分布，方差分析后再转为原始数据作为图例说明。b(a，b，c)不同字母表示处理间存在着显著差异，P≤0.05， (A，B，C)不同字母表示处理间存在着极其显著差异，P≤0.01。刻度：平均值±标准偏差。
密毛兜兰碳源实验结果：
a接100 d后，密毛兜兰种子萌发率在葡萄糖培养基中达到最高(16％)，效果明显比其他三种好，萌发率几乎是蔗糖萌发率2倍。而甘露醇效果最差(0.08％)。
b在叶片生长方面，葡萄糖比甘露醇效果要显著；而葡萄糖、蔗糖、麦芽糖三者无显著区别(见图3，图6)。
图6不同的碳源对密毛兜兰萌发和植株生长的影响。a方差分析前先将萌发率原始数据进行平方根转换，叶长原始数据进行平方根倒数转换后进行开方，以符合正态分布，方差分析后再转为原始数据作为图例说明。b(a，b，c)不同字母表示处理间存在着显著差异，P≤0.05， (A，B，C)不同字母表示处理间存在着极其显著差异，P≤0.01。刻度：平均值±标准偏差。
有机添加物试验结果：
a密毛兜兰的种子在椰子汁培养基中萌发率最高。苹果泥和土豆泥的萌发率少于3％，佛手瓜汁和LH为0％。
b密毛兜兰的原球茎生长过程中，LH培养基里长的最慢，苹果泥和土豆泥效果比LH好，但是这四种之间的叶长宽并没有区别。佛手瓜泥与水解乳蛋白培养基效果均不理想(见图7)。图7不同的有机添加物对密毛兜兰萌发和植株生长的影响， (a，b，c)不同字母表示处理间存在着显著差异，P≤0.05。刻度：平均值±标准偏差。
2.2.8结果
2.2.8.2激素诱导芽增值实验
细胞分裂素和细胞生长素的配比影响兜兰芽增值的芽数和芽大小。3个月内统计芽数量翻倍的激素水平如下(每瓶3个小植株)：密毛兜兰——BA 3.0 mg l-1+NAA 1.0 mg l-1，BA 5.0 mg l-1+NAA 0.5 mgl-1，BA 6.0 mg l-1+NAA 0.1 mg l-1(见表2，图4激素诱导兜兰植物的芽增殖)。
实验结果证实了密毛兜兰种子成熟度、培养基、碳源、天然添加剂对密毛兜兰种子萌发、原球茎和植株生长有明显影响：120 d、130 d、140 d种子不能萌发；随着种子每推迟10 d成熟，种子萌发率随之提高；200 d的种子达到萌发最高点；在KC培养基接种40 d达到最高萌发率，而VW培养基的原球茎直径最长；葡萄糖有利于种子萌发和叶的生长，其次是蔗糖、麦芽糖和甘露醇；10％椰子汁是最好的种子萌发天然添加剂，而土豆泥、苹果泥有利于叶的生长，相对差的是佛手瓜泥和LH。证明了激素浓度对密毛兜兰的芽繁殖率有显著影响：密毛兜兰在BA 5.0mg l-1+NAA 0.5 mg l-1水平能达到增殖率100％。
接入培养基后3个月进行数据统计a方差分析前先原始数据进行自然对数转换，以符合正态分布，方差分析后再转为原始数据作为图例说明。b(a，b，c)不同字母表示处理间存在着显著差异，P≤0.05。刻度：平均值±标准偏差。
表2 不同的激素组合诱导芽增值实验