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胸腺五肽活性酯、含有它们的药物组合物及其用途
    【技术领域】

    本发明涉及胸腺五肽的酯化衍生物以及含有它们其中一种或几种的药物组合物及用途。

    背景技术

    胸腺生成素(thymopoietin)是由胸腺上皮细胞分泌的一种含有49个氨基酸残基的多肽激素，胸腺五肽(Thymopentin，TP‑5)是胸腺生成素的32‑36位氨基酸片段，其氨基酸序列为：Arg‑Lys‑Asp‑Val‑Tyr。TP‑5是胸腺生成素的活性部位，其功能与胸腺生成素相同，它是一种针对T淋巴细胞的免疫增强剂，能促进T细胞的成熟和分化，促使成熟的T细胞分泌多种淋巴因子(如白介素2和γ‑干扰素等)，还能促进白介素‑2受体的生成，提高外周血中SOD的活性。在免疫平衡受损的动物模型中，无论是免疫反应过高或过低，TP‑5均能实现平衡调节，该特点使之在免疫平衡失调相关的人类疾病治疗表现出潜力。

    胸腺五肽能诱导前胸腺细胞和活化外围T细胞，具有显著的临床相关免疫调节活性。临床研究表明，胸腺五肽在治疗肿瘤、某些病毒感染性疾病、自身免疫功能紊乱性疾病(如类风湿性关节炎、红斑狼疮、生殖器疱疹、慢性肾炎、变应性皮炎、糖尿病等与免疫缺陷、免疫功能低下有关的疾病)中都表现较好的疗效。它能降低严重复发性单纯疱疹病毒感染病人的复发率及推迟复发时间；它对抗肿瘤放、化疗及预防大手术后感染有明显的临床效果；能预防长期糖尿病患者的并发症并促进其康复；对慢性乙型肝炎、丙型肝炎及病毒性肝炎合并胆道感染、腹膜炎、肠炎、败血症及肝性脑病的治疗有明显效果，对实验指标：HBV‑DNA(+)、HBeAg(+)、HCV‑RNA(+)、抗‑HCV(+)等有明显的阴转作用。对早期获得性免疫缺损综合症的病人，胸腺五肽最大的益处是能增加病人的免疫能力。它安全性很好，大量的研究证实无明显的毒副作用。

    TP‑5为肽类药物，易被胃酸降解，必须胃肠外给药，在人血浆中很快由蛋白酶和氨肽酶降解为氨基酸，半衰期约为30秒，需要长期频繁用药。因此，对TP‑5进行修饰，增强其作用强度，延长其在体内的作用时间有较好的应用前景。积极生产开发胸腺素类高端产品，适时地淘汰老产品已是迫在眉睫，这无论是对社会或生产厂商都具有十分重大的意义。

    到目前为止，已有很多对胸腺五肽进行结构改造的探索。CN1626549A公开了胸腺五肽聚乙二醇化的衍生物，它是通过在胸腺五肽的氨基或羧基端一个连接基团，将聚乙二醇连接到胸腺五肽的分子上。美国有多项专利(美国专利No.4,361,673和4,420,424)公开了胸腺五肽的线状类似物，它们采用retro‑inverso技术对所用氨基酸进行了替换，并对结构替换后的C‑端羧基进行了甲酯修饰。

    虽然胸腺五肽研究比较广泛，但尚未见对胸腺五肽直接修饰成酯的报道。本发明采用成酯方法对胸腺五肽进行结构修饰，以达到提高体内稳定性，延长半衰期，增强其作用效果的目的，针对多肽类药物存在稳定性差，体内半衰期短等问题提供了新的研究思路和途径。

    【发明内容】

    本发明的一个目的是提供胸腺五肽的活性酯。

    本发明的另一个目的是提供包含胸腺五肽活性酯的组合物。

    本发明的还一个目的是提供胸腺五肽活性酯的用途。

    根据本发明的一方面，提供胸腺五肽活性酯，其为胸腺五肽的C‑端羧基和/或天冬氨酸侧链羧基与醇羟基结合所产生的酯。本发明的胸腺五肽活性酯，包括TP‑5中任意位点的羧基与醇羟基共价结合形成的酯。

    在一个实施方案中，本发明的胸腺五肽活性酯具有式(I)所示结构：

    

    其中，R和R’各自独立地为烷基，例如为饱和长链脂肪醇烷基，优选为C_nH_2n+1，其中n为1和20之间的整数，优选为2和12之间的整数，更优选为2和8之间的整数，最优选为2、6或12。

    在另一个实施方案中，本发明的胸腺五肽活性酯具有式(II)所示结构：

    

    其中，R为烷基，例如为饱和长链脂肪醇烷基，优选为C_nH_2n+1，其中n为1和20之间的整数，优选为2和12之间的整数，更优选为2和8之间的整数，最优选为2、6或12。

    在还一个实施方案中，本发明的胸腺五肽活性酯具有式(III)所示结构：

    

    其中，R为烷基，例如为饱和长链脂肪醇烷基，优选为C_nH_2n+1，其中n为1和20之间的整数，优选为2和12之间的整数，更优选为2和8之间的整数，最优选为2、6或12。

    根据本发明的另一方面，提供一种药物组合物，其含有有效量的本发明的胸腺五肽活性酯以及药用辅料。

    此处所称的“胸腺五肽活性酯的有效量”是指当被给予需要使用该腺五肽活性酯的患者时，能够产生所期望的临床疗效的该胸腺五肽活性酯的量。

    本发明中的胸腺五肽活性酯可以通过本领域中已知的各种方法获得，或通过商业途径从市场上购得。

    本领域的普通技术人员可以通过本领域中已知的各种方法，将本发明的药物组合物配制成各种药物剂型，例如固体、半固体和液体制剂。

    本发明的药物组合物可以经由本领域中已知的各种给药途径，全身或局部给药。

    根据本发明的再一方面，提供胸腺五肽活性酯在制备用于治疗或预防肿瘤、病毒感染性疾病、自身免疫性疾病的药物中的用途。

    根据本发明的用途，其中所述自身免疫性疾病为类风湿性关节炎、红斑狼疮、生殖器疱疹、慢性肾炎、变应性皮炎或糖尿病。

    本发明中胸腺五肽活性酯具有生物活性高，生物体内半衰期延长等特点，具有很好的应用前景。

    【附图说明】

    图1为不同修饰物的增强率结果。

    图2为血浆半衰期测定结果。

    【具体实施方式】

    我们提供以下实施例进一步阐述本发明，但这些实施例不以任何方式限制本发明。

     实施例1.胸腺五肽二乙酯

    

    无水乙醇20ml置反应瓶中，冰浴条件下加入二氯亚砜2ml，加入胸腺五肽200mg，搅拌至反应完全。减压下旋转蒸发除去过量的乙醇和二氯亚砜，得到白色产物。甲醇溶解后，HPLC‑MS测定，m/z736.4，368.8(基峰)。

     实施例2.胸腺五肽二己酯

    

    无水己醇20ml置反应瓶中，冰浴条件下加入二氯亚砜2ml，加入胸腺五肽200mg，搅拌条件下反应至达到平衡。采用旋转蒸发减压除去己醇，分离和纯化，得到白色产物。HPLC‑MS测定，m/z848.6，424.9。

     实施例3.胸腺五肽二月桂酯

    

    月桂醇(十二醇)50ml，与四氢呋喃50ml混合，冰浴条件下加入二氯亚砜2ml，加入胸腺五肽500mg，继续反应至达到平衡。反应完毕，采用旋转蒸发减压除去二氯亚砜和四氢呋喃。向残留反应液中加入醋酸溶液，待分层后，水层冻干，分离纯化，产物经HPLC‑MS分析，m/z为508.7，1016.4。

     实施例4.MTT法检测酯化物对小鼠脾淋巴细胞的增殖反应

    脾细胞悬液的制备：无菌条件下取出小鼠脾脏，将脾脏剪成小块并磨碎，过200目筛制成脾细胞悬液。裂解红细胞后，洗涤三次，计数。用含10％FBS(胎牛血清)的RPMI1640培养液将脾细胞浓度调为1×10⁷细胞/ml。

    于96孔板中加入100微升脾细胞悬液，50微升的样品，10微升ConA，40微升培养基，对照加50微升含10％血清的培养液，总体积为200微升。细胞于5％CO₂的37℃培养箱中培养，培养结束前6小时，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20微升，继续孵育至实验结束。96孔板离心，小心吸弃上清液，加入200微升二甲亚砜，37℃水平摇床100转/分振摇15分钟。在酶标仪上570nm波长处读取吸光度值，结果见表1。

    增强率的计算公式如下：增强率％＝(测定OD值‑对照OD值)/对照OD值＊100％

    表1.MTT法检测胸腺五肽酯化物对小鼠脾淋巴细胞的增殖

                                    吸光度对照                           0.2888空白                           0.1670胸腺五肽酯化物20ng/ml           0.2998胸腺五肽酯化物40ng/ml           0.3522胸腺五肽酯化物100ng/ml          0.3675胸腺五肽酯化物20ng/ml           0.4305胸腺五肽酯化物40ng/ml           0.4588胸腺五肽酯化物100ng/ml          0.4452胸腺五肽酯化物20ng/ml           0.4935胸腺五肽酯化物40ng/ml           0.5205胸腺五肽酯化物100ng/ml          0.5195胸腺五肽酯化物20ng/ml           0.5242胸腺五肽酯化物40ng/ml           0.4940胸腺五肽酯化物100ng/ml          0.5738

     实施例5.胸腺五肽乙酯对氢化可的松所致免疫抑制大鼠SOD活性的影响

    SD大鼠60只，雄性，体重180±20g左右，随机分为6组，即：正常组、模型组、酯化物高(2.5mg/kg)、中(0.5mg/kg)、低剂量组(0.1mg/kg)，阳性药组(TP‑5，0.5mg/ml)。药物粉末用生理盐水溶解，配成0.5mg/ml、0.1mg/ml、0.02mg/ml溶液，分别用于高、中、低剂量组，每只大鼠2ml。除正常对照组外，其余大鼠均每日皮下注射氢化可的松注射液10mg/只，连续7d，造成免疫抑制模型，此时大鼠血浆总SOD水平下降。造模后的大鼠怕冷、畏寒喜暖、蜷缩拱背、身体消瘦。自第8天开始皮下注射给药，正常对照组及模型组给予等体积的生理盐水，连续给药14d。末次给药后6h采血，分离血浆，测定血清中SOD含量。结果见表2。

    表2.胸腺五肽乙酯对氢化可的松所致免疫抑制大鼠SOD活性的影响

     编号  正常组    模型组    阳性药组  高剂量组  中剂量组   低剂量组1     293.454   84.866   78.056    180.756   124.764   95.3242     256.109   117.145  185.653   194.935   120.561   86.1813     253.523   75.888   100.124   198.347   180.442   96.3084     253.611   95.198   113.627   150.568   110.305   100.6615     249.447   76.235   198.213   169.245   97.853    84.4626     214.601   42.397   66.982    274.356   78.665    84.2357     232.484   85.079   119.223   176.345   94.340    119.9628     275.921   98.618   115.662   186.540   170.925   97.5689     253.655   57.290   89.261    163.478   112.901   89.73110    248.625   60.189   97.450    153.642   100.820   120.552

     实施例6.血浆半衰期测定

    由于药物的血浆半衰期较短，因此参照有关文献，将血浆用生理盐水1:1进行稀释，以稀释后的血浆进行如下测定。

    血浆100μl，置37℃水浴中孵育30min，加入药物100μl，涡漩混合5s，37℃水浴中孵育，在1，2，5，10min停止孵育，加入氨肽酶抑制剂邻二氮菲20μl，涡漩5s，加入乙腈800μl，涡漩30s，离心10min，上清真空干燥，80％甲醇复溶。

    HLPC条件：Waters HPLC色谱仪，2487紫外检测器，Venusil MP C₁₈柱(150*4.6mm)，甲醇‑磷酸盐缓冲液(pH3.0，内含0.2％三乙胺)作流动相，进样体积20μl，检测波长：220nm、275nm。流速：1.0min。

    由峰面积计算出药物浓度C，以药物浓度的对数(logC)对时间(t)进行线性回归，由回归方程计算得半衰期为TP‑5：1.3min；TP‑5‑二乙酯：2.0min，即酯化物比原药的半衰期有所延长。结果见图2。