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天冬酰胺和蛋白质增强的玉米植物和种子
    背景技术

    1.发明领域

    本发明主要涉及植物生物技术领域，更具体而言涉及增加植物和种子中的天冬酰胺和蛋白质。

    2.相关技术描述

    农民和消费者希望农作物具有改良的农学性状，例如增加的产率、增加的种子蛋白质产量和改良的营养组成。需要的农作物营养成分包括纤维、抗氧化剂(例如维生素E)、硒、铁、镁、锌、B族维生素、木酚素类、酚酸类、必需氨基酸和植物雌激素类等。尽管在植物培育方面的大量努力已经在这些希望的性状方面取得了一些进步，将特异性的非宿主DNA引入到植物基因组中的能力为产生具有这些性状的植物提供了进一步的机会。特别地，虽然常规玉米的产量逐年稳步提高，但是玉米作物更有效地同化氮或增加种子蛋白质含量的能力并没有相应地提高。

    氮的可用性对于植物的产量、生物量、以及农作物产率(包括种子蛋白质的生产)具有非常重要的正面影响。在植物中，无机氮是从土壤中同化，被还原为氨，并以氮转运氨基酸天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸的形式引入到有机氮中。天冬酰胺(Asn)是优选的酰胺转运分子，因为其具有高的氮∶碳比(2N∶4C，相对于2N∶5C)，以及因为它是相对惰性的。Asn和其它的氨基酸也可用作蛋白质合成的构件。

    在植物中，Asn是在一个由天冬酰胺合成酶(AsnS)催化的反应中通过谷氨酰胺、天冬氨酸和ATP合成的。谷氨酸、AMP和焦磷酸盐作为副产物形成。已经描述了两种形式的AsnS：谷氨酰胺依赖型和氨依赖型。谷氨酰胺依赖型AsnS可以催化谷氨酰胺依赖型和氨依赖型的反应，尽管谷氨酰胺是优选的氮源。

    高浓度的蛋白质被认为是大多数主要农作物(包括大豆、玉米和小麦)的重要质量性状。例如，高蛋白质的玉米、小麦和大豆的品种已经通过传统培育方法鉴定出来。但是，以这种方式形成的大多数高蛋白质品系具有低产率或其它的农学缺点。如果农作物(特别是玉米)的蛋白质含量能够增加到现有水平之上，那么对人们的消费和产物在动物饲料中的应用来说都是理想的。当农作物作为人们的食物和动物的饲料时，这将会极大地提高其营养价值。

    【发明内容】

    本发明提供了用于开发农作物和植物产品、以增加蛋白质和氨基酸含量的方法和组合物。该方法和组合物增加了植物组织中(特别是种子中)游离氨基酸和蛋白质的水平。更具体而言，本发明提供了包含异源DNA组合物的转基因植物和种子，该异源DNA组合物表达与增加的天冬酰胺和增加的蛋白合成有关的基因产物。该产物的表达提高了食物玉米和饲料玉米来源以及来自转基因玉米种子或其部分的加工产品的营养价值。

    在一方面，本发明提供了增加玉米植物中蛋白质含量的方法。本发明还提供了包含编码具有天冬酰胺合成酶活性的多肽的多核苷酸序列的DNA构建体。

    在另一个实施方案中，本发明包括用编码此处确定的天冬酰胺合成酶的异源DNA组合物转化的玉米植物细胞。在具体实施方案中，提供了玉米AsnS4(天冬酰胺合成酶同工酶4)多核苷酸分子的异源表达，例如，导致相对于不表达异源玉米AsnS2多核苷酸分子的相同品种的植物，在转基因植物(包括种子)中具有增多的天冬酰胺和/或蛋白质。

    在特定的实施方案中，提供了一种核酸序列及其使用方法，其中，该序列选自：(a)包含序列SEQ ID NO：50的核酸序列；(b)与序列SEQ ID NO：50至少大约90％相同的核酸序列，其中，该核酸序列编码具有天冬酰胺合成酶活性的多肽；(c)编码多肽序列SEQ ID NO：51的核酸序列；(d)编码与序列SEQ ID NO：51至少大约90％相同的多肽序列的核酸序列，其中，该多肽具有天冬酰胺合成酶活性；和(e)在大约0.2x SSC和65℃的高严格性条件下与(a)‑(d)的序列杂交的核酸序列，其中，该核酸序列编码具有天冬酰胺合成酶活性的多肽。在特定的实施方案中，提供与序列SEQ ID NO：50至少90％、93％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同的核酸。在进一步的实施方案中，提供编码与序列SEQ ID NO：51至少90％、93％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同的多肽序列的核酸。本发明还提供了包含SEQ IDNO：51的分离的多肽序列，以及与SEQ ID NO：51至少90％、93％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同的序列。

    本发明还涉及由本发明提供的具有增加的蛋白质和/或氨基酸含量的种子或由该种子的加工产物(例如粗粉(meal))制备的食物或动物饲料。因此，本发明还包括包含天冬酰胺合成酶的玉米种子，该酶是通过包含编码玉米天冬酰胺合成酶的DNA分子的异源DNA构建体表达产生的。这样的种子的一个实施方案是收获的谷粒(grain)，本发明还包括由这样的谷粒制成的粗粉、面筋(gluten)和其它玉米产品。

    本发明包括包含SEQ ID NOs：52‑59中的一个或多个或其互补序列的分离的核酸引物序列。本发明包括在转化的植物或其后代的基因组中检测或确定编码植物AsnS多肽或具有本发明AsnS活性的植物多肽的异源多核苷酸分子的方法，该异源多核苷酸分子包含选自SEQID NOs：52‑59的多核苷酸分子，其中，所述多核苷酸分子在DNA扩增方法中作为DNA引物使用。

    【附图说明】

    图1示出了pMON79706的质粒图。

    图2示出了pMON66229的质粒图。

    图3示出了pMON66230的质粒图。

    图4示出了pMON66231的质粒图。

    图5示出了pMON66239的质粒图。

    图6为pMON79706事件中的转基因表达。误差条代表95％置信区间，转基因事件n＝5，近交对照n＝10。

    图7为pMON92870事件中的转基因表达。误差条代表95％置信区间，转基因事件n＞3个植物，近交对照n＝8个植物。

     核酸和多肽序列的说明

    SEQ ID NO：1为编码玉米(Zea mays)AsnS1的多核苷酸序列。

    SEQ ID NO：2为玉米AsnS1多肽。

    SEQ ID NO：3为编码玉米AsnS2的多核苷酸序列

    SEQ ID NO：4为玉米AsnS2多肽。

    SEQ ID NO：5为编码玉米AsnS3的多核苷酸序列。

    SEQ ID NO：6为玉米AsnS3多肽。

    SEQ ID NO：7为编码大豆(Glycine max)AsnS的多核苷酸序列。

    SEQ ID NO：8为大豆AsnS多肽。

    SEQ ID NO：9为编码苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)AsnS的多核苷酸序列。

    SEQ ID NO：10为编码野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)AsnS的多核苷酸序列。

    SEQ ID NO：11为编码耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)AsnS的多核苷酸序列。

    SEQ ID NO：12为编码水稻(Oryza sativa)AsnS的多核苷酸序列。

    SEQ ID NO：13为编码Galdieria sulphuraria AsnS的多核苷酸序列。

    SEQ ID NO：14为编码Galdieria sulphuraria AsnS的多核苷酸序列。

    SEQ ID NO：15为编码Galdieria sulphuraria AsnS的多核苷酸序列。

    SEQ ID NO：16为编码Galdieria sulphuraria AsnS的多核苷酸序列。

    SEQ ID NO：17为编码酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGPG3913 AsnS的多核苷酸序列。

    SEQ ID NO：18为正向(f)AsnS PCR引物序列。

    SEQ ID NO：19为正向(f)AsnS PCR引物序列。

    SEQ ID NOs 20‑43为在通路克隆(Gateway cloning)过程中使用的初级和次级正向(f)和反向(r)AsnS PCR引物序列。

    SEQ ID NO：44为正向(f)AsnS PCR引物序列。

    SEQ ID NO：45为正向(f)AsnS PCR引物序列。

    SEQ ID NO：46为ZmAS有义引物。

    SEQ ID NO：47为ZmAS反义引物。

    SEQ ID NO：48为玉米AsnS3正向引物。

    SEQ ID NO：49为玉米AsnS3反向引物。

    SEQ ID NO：50为编码玉米AsnS4的多核苷酸序列。

    SEQ ID NO：51为玉米AsnS4多肽。

    SEQ ID NO：52为正向PCR引物，Zm‑AsnS1_for1。

    SEQ ID NO：53为反向PCR引物，Zm‑AsnS1_rev1。

    SEQ ID NO：54为正向PCR引物，Zm‑AsnS3_for2。

    SEQ ID NO：55为反向PCR引物，Zm‑AsnS3_rev2。

    SEQ ID NO：56为正向PCR引物，Zm‑AsnS4_for3。

    SEQ ID NO：57为反向PCR引物，Zm‑AsnS4_rev3。

    SEQ ID NO：58为正向PCR引物，Zm‑AsnS2_for4。

    SEQ ID NO：59为反向PCR引物，Zm‑AsnS2_rev4。

    【具体实施方式】

    以下是对本发明的详细描述，用于帮助本领域技术人员实施本发明。除非在本文中另外定义，应根据相关领域普通技术人员的常规使用来理解这些术语。分子生物学的普通术语的定义还可以参考Rieger等人，1991；和Lewin，1994中的描述。使用37 CFR§1.822中规定的DNA碱基的命名法。氨基酸残基使用标准的单字母或三字母命名法。此处所描述的实施方案的改变和变化是本领域普通技术人员可以实现的，而不会背离本发明的精神或范围。

    本发明提供了一种通过向玉米植物细胞的基因组中引入在转基因植物细胞中表达AsnS多肽的异源核苷酸来提高玉米植物中蛋白质含量的方法。本发明提供了包含(包含是指“包括但不局限于”)任选地与叶绿体转运肽可操作地连接的编码AsnS多肽的多核苷酸分子或其片段的DNA构建体。

    编码AsnS多肽的多核苷酸分子或其类似物或等位基因，或编码转运肽或标记/报道基因的多核苷酸分子是“分离的”，因为它们至少部分地是在体外进行制备的，例如从其天然状态、从细胞中分离出来的，纯化的和扩增的，例如，它们所结合的基因元件相对于那些通常与它们的天然状态相结合的基因元件来说是异源的。此处所使用的被引入宿主细胞的包含编码AsnS的多核苷酸分子的异源DNA构建体优选与天然未转化状态的细胞中存在的任何多核苷酸分子不同，并且相对于在宿主细胞基因组中存在的其它DNA分子是分离的。

    此处所使用的在转化的植物、植物组织或植物细胞中的天冬酰胺的“改变或增加的”水平是指比不包含本发明的DNA构建体的相应植物、植物组织或植物细胞中的水平更高的水平。

    本发明的试剂也可以是重组的。此处所使用的术语重组是指任何来自或间接地产生于多核苷酸分子人工操作的试剂(例如DNA、肽等)。

    正如此处的优选方面中所使用的，种子的营养质量的提高，例如种子蛋白质含量的提高，是由植物产生比没有蛋白质或营养质量提高的种子具有更高蛋白质或营养成分产率的种子的能力而确定的。在本发明的特别优选的方面，相对于与该营养增强植物具有相似遗传背景的植物检测其营养质量的提高，只是本发明的植物表达或过表达在本文关于异源DNA构建体部分描述的蛋白质或其片段。

    多核苷酸分子

    本发明包括和提供在其基因组中包含转基因的转基因玉米植物和种子，该转基因包含编码玉米天冬酰胺合成酶(Zm.AsnS4)的异源DNA分子，该DNA分子包含例如SEQ ID NO：50和与具有天冬酰胺合成酶活性的这些序列至少90％、95％或99％相同的序列。

    本发明的另一方面提供了一种通过向玉米细胞内引入DNA构建体来提高玉米植物中的蛋白质的方法，该DNA构建体提供了编码天冬酰胺合成酶的异源多核苷酸分子，例如SEQ ID NOs：1、3、5、7、9、10、11、12、13、14、15、16、17和50。多核苷酸可以与任何这些例子不同，但是又不会改变其编码的多肽。例如，能够编码这些保守氨基酸取代的密码子是本领域已知的。此外，本发明还涉及：本发明还可以使用其内一个或多个氨基酸被删除、取代或添加、而不改变天冬酰胺合成酶功能的多肽。

    在本发明的一方面中，本发明的多核苷酸被称为引入的多核苷酸分子。如果(无论多么间接地)将多核苷酸分子经过人工操作插入到细胞或有机体内，则多核苷酸分子被称为“引入的”。引入的多核苷酸分子的例子包括但不局限于经过转化、转染、注射和投射(projection)引入到细胞内的多核苷酸，以及那些经过接合、胞吞作用、吞噬作用等引入到有机体内的多核苷酸。优选地，多核苷酸插入细胞的基因组中。

    本发明的多核苷酸分子的一个子集是片段多核苷酸分子。片段多核苷酸分子可以由本发明的多核苷酸分子的主要部分或甚至大部分(例如具体公开的那些)组成。可选地，片段可以包含较小的寡核苷酸(具有大约15至大约400个核苷酸残基，更优选地具有大约15至大约30个核苷酸残基、或大约50至大约100个核苷酸残基、或大约100至大约200个核苷酸残基、或大约200至大约400个核苷酸残基、或大约275至大约350个核苷酸残基)。本发明的一种或多种多核苷酸分子的片段可以是探针，特别是PCR引物分子。PCR引物是在与另一个多核苷酸形成双链结构时能够启动聚合酶活性的多核苷酸分子。本领域中存在确定PCR探针的结构和PCR技术的各种方法。

    如此处所用的，如果两个分子能够形成反平行的、双链多核苷酸结构，则这两个多核苷酸分子被认为能够互相特异性杂交。

    如果两个多核苷酸具有完全的互补性，则一个多核苷酸分子被认为与另一个多核苷酸分子“互补”。如此处所用的，当一个分子的每一个核苷酸都与另一个分子的核苷酸互补时，这两个分子被称为具有“完全的互补性”。如果在至少是常规的“低严格性”条件下两个分子能够足够稳定地相互杂交从而保持相互退火，那么这两个分子被称为“最小互补的”。同样地，如果在常规的“高严格性”条件下两个分子能够足够稳定地相互杂交从而保持相互退火，那么这两个分子被称为“互补的”。常规的严格性条件在Sambrook等人，(2001)和Haymes等人，(1985)中有所描述。因此，偏离完全互补也是允许的，只要该偏离不会完全排除分子形成双链结构的能力即可。因此，为了使多核苷酸分子可以作为引物或探针使用，仅需在序列上足够互补，以在使用的特定溶剂和盐浓度下能够形成稳定的双链结构。

    促进DNA杂交的适当的严格性条件，例如在大约45℃下使用6.0X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，然后在20‑25℃下使用2.0X SSC进行清洗，是本领域技术人员已知的，或者可以参考Ausubel，等人，eds.(1989)，6.3.1‑6.3.6部分。例如，清洗步骤中的盐浓度可以选自低严格性的50℃大约2.0X SSC至高严格性的65℃大约0.2X SSC。此外，清洗步骤的温度可以从低严格性条件的室温大约22℃至高严格性的大约65℃。温度和盐都可以改变，或者温度或盐浓度中的任一个保持恒定，以使核酸能够与此处所提供的一种或多种多核苷酸分子(例如SEQ ID NOs 1、3、5、7、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18‑45和50所示)及其互补物在中等严格条件(例如大约2.0X SSC和大约65℃)下特异性杂交。

    在本发明的方法的一个实施方案中，本发明的任何多核苷酸序列或多肽序列或其片段都可用于检索相关序列。此处所使用的“检索相关序列”是指确定两个序列间相关性的任何方法，包括但不局限于对比序列同源性的检索，例如针对与单个多肽序列的相关性进行的数据库PBLAST检索。还可以使用基于图谱的方法进行其它的检索，例如由南达科他大学，SD维护的HMM(Hidden Markov模型)META‑MEME，以及由国家生物技术信息中心、国家医学图书馆和国家卫生研究院(NCBI)维护的PSI‑BLAST。

    多核苷酸分子可以编码基本上相同或基本上同源的多肽分子。相同或同源性的程度可以使用计算机软件(例如WISCONSINPACKAGE Gap程序)来确定。来自Genetics Computer Group，Inc.的10.0‑UNIX版本的WISCONSIN PACKAGE中的Gap程序是基于Needleman和Wunsch，1970中的方法。使用BLAST 2.2.1软件套装中的TBLASTN程序(Altschul等人，1997)或使用BLOSUM62矩阵(Henikoff和Henikoff，1992)。本发明的多核苷酸分子还可以编码同系多肽。此处所使用的同系多肽分子或其片段是在第二物种中的相应蛋白质分子或其片段(例如玉米核酮糖二磷酸羧化酶‑加氧酶小亚基是拟南芥核酮糖二磷酸羧化酶‑加氧酶小亚基的同系物)。还可以通过分子进化或DNA改组技术来产生同系物，从而该分子保留原多肽的至少一种功能或结构特征(参见例如美国专利5,811,238)。

    在优选实施方案中，本发明的任何多核苷酸分子都可以与在植物细胞中能够引起mRNA分子产生的启动子区可操作地连接，其中，与该启动子连接的多核苷酸分子相对于该启动子是异源的。此处所使用的“异源”DNA为在临近的DNA中不会天然出现的任何DNA序列。“天然的”是指天然存在的核酸序列。“异源”序列通常起源于外来的来源或物种，或者如果来自相同来源的话，由其基因组中的原始形式和/或位置修饰而成。

    此处所使用的术语“蛋白质”、“肽分子”或“多肽”包括包含五个或更多氨基酸的任何分子。本领域公知：蛋白质、肽或多肽分子可以经过修饰，包括翻译后修饰，例如但不局限于二硫键形成、糖基化、磷酸化或寡聚化。因此，此处所使用的术语“蛋白质”、“肽分子”或“多肽”包括通过任何生物学或非生物学方法修饰的任何蛋白质。术语“氨基酸”和“氨基酸类”是指所有天然存在的L‑氨基酸。这个定义意于包括正亮氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸、高半胱氨酸和高丝氨酸。

    “蛋白质片段”是其氨基酸序列包含该蛋白质的氨基酸序列的一部分的肽或多肽分子。包含另外一个或多个并非来自该蛋白质的肽区域的蛋白质或其片段是“融合”蛋白。这些分子可以衍生化从而包含碳水化合物或其它部分(例如匙孔血蓝蛋白)。本发明的融合蛋白或肽分子优选通过重组方式产生。

    植物构建体和植物转化体

    编码天冬酰胺合成酶的本发明的一种或多种DNA构建体可用于植物转化或植物转染中。外源基因材料可被转运到植物细胞中，植物细胞可再生成为完整的、能育的或不育的植物。外源基因材料可以为能够插入任何生物体的来自任何来源的任何遗传材料，无论是否是天然存在的。

    在本发明的另一方面，本发明的多核苷酸序列还编码参与细胞内定位、输出或翻译后修饰的肽，例如叶绿体转运肽。

    此处所使用的术语“基因”包括提供转录调节的核酸分子，包含在植物中发挥作用的启动子、5’非翻译分子(例如内含子和前导序列)、转录核酸分子和3’转录终止分子。

    编码本发明的多肽的多核酸分子可以与其它非天然的或异源序列通过多种方式相结合。“异源”序列是指未天然发现与编码本发明的多肽的核苷酸序列相连的任何序列，包括例如来自相同植物但并未天然连接在一起的核苷酸序列的组合，或者来自两种不同物种的序列的组合。此处所使用的术语“可操作地连接”是指调控性和结构性多核苷酸分子的物理和功能重排，其引起了可操作地连接的结构性多核苷酸分子的受调控的表达。

    DNA构建体或转基因的表达是指来自本发明的多核苷酸分子的有义或反义RNA或蛋白质的转录和稳定的蓄积或其翻译。“有义”RNA是指包含mRNA的RNA转录本，因此可以由细胞翻译为多肽或蛋白质。“反义RNA”是指与所有或部分目标初级转录本或mRNA互补的以及阻断靶基因表达的RNA转录本(美国专利5,107,065。在此引入作为参考)。反义RNA可以与特定的基因转录本的任何部分互补，即在5’非编码序列、3’非翻译序列、内含子或编码序列处。“RNA转录本”是指RNA聚合酶催化的DNA序列的转录产生的产物。当RNA转录本是DNA序列的完美互补拷贝时，其被称为初级转录本，或者其可以是初级转录本的转录后加工产生的RNA序列，并被称为成熟RNA。

    此处所使用的术语植物表达盒是指包含与靶分子可操作地连接的必需DNA调节分子以提供在植物细胞中表达的构建体。

    在一个实施方案中，本发明的DNA构建体包含引起本发明的多肽过表达的启动子，其中，“过表达”是指正常地在宿主细胞中不存在的，或者在所述宿主细胞中的存在水平高于由编码所述多肽的内源基因正常表达的水平的多肽表达。能够引起本发明的多肽过表达的启动子一般是本领域已知的，提供组成型表达模式的它们的例子包括花椰菜花叶病毒19S启动子和花椰菜花叶病毒35S启动子(美国专利5,352,605)、玄参花叶病毒35S启动子(美国专利6,051,753)、甘蔗杆状病毒启动子(美国专利5,994,123)、鸭跖草黄斑驳病毒启动子(Medberry等人，1992)、核酮糖‑1，5‑二磷酸羧化酶小亚基启动子、水稻胞质磷酸丙糖异构酶启动子、腺嘌呤磷酸核糖转移酶启动子、水稻肌动蛋白1启动子(美国专利5,641,876)、玉米泛素启动子、甘露碱合酶启动子和章鱼碱合酶启动子。

    这样的遗传构建体可以转运到单子叶或双子叶植物中，包括但不局限于苜蓿、苹果、拟南芥、香蕉、油菜、加拿大油菜、蓖麻子、咖啡、玉米、棉花、棉籽、菊花、海甘蓝、黄瓜、石斛、山药、桉树、牛毛草、亚麻、剑兰、百合科、亚麻子、栗、香瓜、芥末、燕麦、油椰子、芸苔、花生、多年生黑麦草、菜豆、油菜籽、水稻、高粱、大豆、裸麦、tritordeum、草皮草、小麦、红花、芝麻、甜菜、甘蔗、蔓越莓、番木瓜、红花和向日葵(Christou，1996)。在优选实施方案中，遗传材料被转运到玉米细胞中。

    编码蛋白质的多核苷酸分子的转运可以导致该多肽在转化的细胞或转基因植物中的表达或过表达。由本发明的多核苷酸分子编码的一种或多种蛋白质或其片段可以在转化的细胞或转化的植物中过表达。

    在一个实施方案中，本发明的DNA构建体包含编码多肽序列的多核苷酸分子，该多肽序列选自SEQ ID NOs 1、3、5、7、9、10、11、12、13、14、15、16、17和50。本发明提供了转化的玉米细胞，其中，相对于不包含这种DNA构建体的未转化的玉米植物而言，该细胞具有提高的天冬酰胺水平。

    在另一个实施方案中，本发明的DNA构建体包含与玉米天冬酰胺合成酶编码序列(例如SEQ ID NOs 1、3、5或50)可操作地连接的异源DNA分子，该DNA构建体转化到玉米细胞中。在一个实施方案中，包含SEQ ID NO：50或此处所述的相关序列的本发明的DNA构建体被提供到转化的玉米细胞中，该DNA构建体的表达使得相对于未用该DNA构建体转化的玉米植物而言，玉米植物组织的天冬酰胺增加，或者玉米植物种子的蛋白质增加。

    在一些实施方案中，AsnS的一种或多种产物的水平可以在整个植物中增加或者在植物的一个或多个特定的器官或组织中局部增加。并非限制本发明的范围，有几种启动子序列可用于表达上述酶的基因。例如，玉米C4型PPDK启动子(Glackin等人，1990)、玉米C4型PEPC启动子(Hudspeth和Grula，1989)、水稻核酮糖二磷酸羧化酶‑加氧酶小亚基启动子(Kyozuka等人，1993)和集光叶绿素a/b结合蛋白启动子(Sakamoto等人，1991)、P‑FDA启动子(美国20040216189A1，其多核苷酸序列在此引入作为参考)和P‑RTBV启动子(美国专利5,824,857，其多核苷酸序列在此引入作为参考)。例如，天冬酰胺或蛋白质的水平可以在植物的一个或多个组织和器官(包括但不局限于：根、块茎、茎、叶子、秆、果实、浆果、坚果、树皮、豆荚、种子和花)中增加。优选的器官是种子。

    为了在植物的来源组织(例如叶子、种子、根或茎)中表达，优选地，使用的启动子在这些特定的组织中具有相对高的表达。本发明的蛋白质的组织特异性表达是特别优选的实施方案。

    包含目的编码区的DNA构建体或载体还可以包括用来完全或部分地终止该编码区的转录的多核苷酸序列。已经分离了一些这样的序列，包括T‑NOS 3′区(Ingelbrecht等人，1989；Bevan等人，1983)。调控转录终止区也可以包含在本发明的植物表达构建体中。可以通过编码目的基因的DNA序列、或来自不同基因来源的方便的转录终止区(例如，与转录起始区天然相关的转录终止区)来提供转录终止区。本领域的技术人员知道：能够在植物细胞中终止转录的任何方便的转录终止区都可用于本发明的构建体中。

    载体或构建体还可以包含调节元件，例如内含子。其例子包括Adh内含子1(Callis等人，1987)、蔗糖合酶内含子(Vasil等人，1989)、hsp70内含子(美国专利5,859,347)和TMVω元件(Gallie等人，1989)。当适当时，可以包括这些和其它调节元件。

    载体或构建体还可以包含选择性标记。选择性标记还可以用于选择包含外源遗传材料的植物或植物细胞。其例子包括但不局限于：neo基因(Potrykus等人，1985)，其可以编码卡那霉素抗性，并可使用卡那霉素、nptII、G418、hpt等选择；bar基因，其编码双丙氨膦(bialaphos)抗性；突变EPSP合酶基因(Hinchee等人，1988；Reynaerts等人，1988；Jones等人，1987)，其编码草甘膦抗性；提供溴苯腈抗性的腈水解酶基因(Stalker等人，1988)；提供咪唑啉酮或磺脲抗性的突变乙酰乳酸合酶基因(ALS)(美国专利4,761,373；D′Halluin等人，1992)；和甲氨喋呤抗性DHFR基因(Thillet等人，1988)。

    植物转化

    最常用于转化植物细胞的方法为土壤杆菌介导的DNA转化方法和生物弹道(biolistics)或微粒轰击介导的方法(即基因枪)。典型地，核转化是所需的，但是如果希望特异性地转化质体，例如叶绿体或造粉体，可以使用微粒介导的所需多核苷酸的转运来转化植物质体。

    通过土壤杆菌介导的转化向植物内引入转基因的方法使用了T‑DNA(转运DNA)，T‑DNA引入了转基因的基因元件并将这些基因元件转运到植物的基因组中。一般而言，由右边界DNA分子(RB)和左边界DNA分子(LB)界定的转基因被转运到植物基因组的单个基因座上。“T‑DNA分子”是指通过土壤杆菌介导的转化方法整合到植物基因组内的DNA分子。T‑DNA分子的末端在本发明中被限定为其侧翼是来自土壤杆菌Ti质粒的T‑DNA的边界区域。这些边界区域通常被称为右边界(RB)和左边界(LB)区域，并且根据它们是来自土壤杆菌的胭脂碱或章鱼碱产生菌株，其核苷酸序列和长度会所有不同。通常在DNA构建体中使用的边界区域是为向植物中转运转基因设计的，通常其长度为几百个多核苷酸，并包含切口位点，在该位点上内切核酸酶消化DNA来提供用于插入植物基因组内的位点。T‑DNA分子通常包含一个或多个植物表达盒。

    关于微粒轰击(美国专利5,550,318；5,538,880；和5,610,042；它们中的每一个的全部内容都被特定地引入作为参考)，颗粒由多核苷酸包裹，并通过推进力被转运到细胞中。示例性的颗粒包括那些包含钨、铂和优选金的颗粒。通过颗粒加速来转运DNA到植物细胞内的有用的方法是生物弹道颗粒转运系统(BioRad，Hercules，California)，其可用于推进由DNA或细胞包裹的颗粒通过一个筛子(例如不锈钢或Nytex筛子)到达由在悬浮液中培养的单子叶植物细胞覆盖的滤网表面。微粒轰击技术广泛适用，并可用于转化事实上任何植物种。通过微粒轰击进行转化的种的例子包括单子叶植物种，例如玉米(PCT公布WO 95/06128)、大麦、小麦(美国专利5,563,055，其全部在此引入作为参考)、水稻、燕麦、裸麦、甘蔗和高粱；以及一些双子叶植物，包括烟草、大豆(美国专利5,322,783，其全部内容在此引入作为参考)、向日葵、花生、棉花、西红柿和豆类(美国专利5,563,055，其全部内容在此引入作为参考)。

    无论采用何种转化方法，为了选择转化的植物细胞或给其打分，引入到细胞内的DNA包含一个基因，该基因在可再生的植物组织中产生能够使植物组织具有毒性化合物抗性的化合物。用作可选择的、可筛选的或可打分的标记的目的基因包括但不局限于GUS、绿色荧光蛋白(GFP)、萤光素酶(LUX)和抗生素或除草剂抗性基因。抗生素抗性基因的例子包括那些提供卡那霉素(和新霉素、G418)和博来霉素抗性的基因。

    由各种转化的外植体再生、发育和培养植物是本领域已知的。这种再生和生长过程通常包括选择转化的细胞以及通过生根小植株阶段通过胚发育的普通阶段培养那些个体化细胞的步骤。转基因胚和种子的再生是相似的。产生的转基因生根苗继而种植在适当的植物生长培养基(例如土壤)中。与选择剂接触后存活的细胞或在筛选分析中被评分为阳性的细胞可以在支持植物再生的培养基中培养。在转移到温室或生长室中进行成熟之前，发育的小植株被转移到无土植物生长混合物中使其受冷耐寒。

    本发明可与任何可转化的细胞或组织一起使用。此处所使用的可转化的是指能够进一步繁殖以产生植物的细胞或组织。本领域的技术人员知道：有许多植物细胞或组织是可转化的，其中，在插入外源DNA之后，在适当的培养条件下，植物细胞或组织可以形成分化的植物。适用于这些目的的组织包括但不局限于未成熟的胚、盾片组织、悬浮细胞培养液、未成熟的花、苗分生组织、节点外植体、愈伤组织、胚轴组织、子叶、根和叶子。

    可以使用任何合适的植物培养基。合适的培养基的例子包括但不局限于补充了附加的植物生长调节物质(包括但不局限于生长素、细胞分裂素、ABA和赤霉素)的基于MS的培养基(Murashige和Skoog，1962)或基于N6的培养基(Chu等人，18：659，1975)。本领域的技术人员熟悉各种组织培养基，当适当补充时，它们可以维持植物组织生长和发育并适于植物转化和再生。这些组织培养基或者可以作为市售制剂购买，或者可以自行配制和改造。本领域的技术人员知道：转化和再生中使用的培养基和培养基补充物(例如营养物和生长调节物)，以及其它的培养条件(例如培养中的光照强度、pH和培养温度)可以根据特定的品种进行优化。

    本发明的任何多核苷酸分子可以与其它的基因元件(例如载体、启动子、增强子等)组合以永久的或暂时的方式引入到植物细胞中。此外，本发明的任何多核苷酸分子可以以允许多核苷酸分子编码的蛋白质或其片段表达或过表达的方式引入到植物细胞中。

    本发明还提供了本发明的植物的部分，特别是生殖或储存部分。植物部分包括但不局限于种子、胚乳、胚珠、花粉或块茎。在本发明特定的优选实施方案中，植物部分为玉米种子。在一个实施方案中，玉米种子(或谷粒)是动物饲料的组成成分。

    在一个优选实施方案中，玉米饲料或玉米粗粉或来自玉米种子的蛋白质设计用于家畜或人类或二者。生产饲料、粗粉和蛋白质的方法是本领域已知的。例如参见美国专利4,957,748；5,100,679；5,219,596；5,936,069；6,005,076；6,146,669；和6,156,227。在一个优选实施方案中，蛋白质制剂为高蛋白质含量的制剂。这样的高蛋白质含量的制剂优选具有大于大约5％(w/v)，更优选大于10％(w/v)，再更优选大于15％(w/v)的蛋白质含量。

    关于通常用于不同的性状和农作物的培育方法的说明可参考几本参考书(例如Hayward，1993；Richards，1997；Allard，1999)。

    其它生物体

    本发明的多核苷酸可以引入到任何细胞或生物体中，例如哺乳动物细胞、哺乳动物、鱼细胞、鱼、鸟细胞、鸟、藻类细胞、藻类、真菌细胞、真菌或细菌细胞。本发明的蛋白质可在适当的细胞或生物体中产生。优选的宿主和转化体包括：真菌细胞(例如曲霉属、酵母)、哺乳动物(特别是牛和猪)、昆虫、细菌和藻类。特别优选的细菌为根癌农杆菌和大肠杆菌。

    在本发明的一方面中，本发明的一种或多种核酸分子用于确定植物(优选为加拿大油菜、玉米、油菜、芸苔、油菜籽、大豆、芥末、海甘蓝、蓖麻子、花生、芝麻、棉籽、亚麻子、红花、油椰子、亚麻或向日葵)中部分或完全由本发明的一种或多种多核苷酸分子所编码蛋白质的表达水平(即样品中的mRNA浓度等)或表达模式(即表达动力学、分解速率、稳定性能等)。可以使用许多方法比较两个或多个细胞或组织样品之间的表达。这些方法包括杂交分析，例如RNA印迹法、RNA酶保护分析和原位杂交。可选地，该方法包括PCR型分析。在一个优选的方法中，表达是通过将来自两个或多个样品的多核苷酸与多核苷酸阵列进行杂交而评估的。该阵列包括多种已知存在于或怀疑存在于样品的细胞或组织中的怀疑序列。

    本文包括下面的实施例来证明本发明的各个方面，本领域的技术人员根据本公开内容应该理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对公开的具体实施方案进行许多改变。

     实施例

    本领域的技术人员可以理解本发明提供的方法和组合物的许多优点。本文包括下面的实施例来证明本发明的优选的实施方案。本领域的技术人员应该理解，下面的实施例中公开的技术代表了本发明人发现的在实施本发明中运用良好的技术，因此可被认为构成了实施本发明的优选方式。然而，本领域的技术人员根据本公开内容应该理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对公开的具体实施方案进行许多改变，而且仍然获得相同或类似的结果。本文引入在此引用的全部参考文献作为参考，以补充、解释、提供背景或教导在此使用的方法、技术或组合物。

    实施例1

    玉米和大豆植物cDNA和基因组文库的构建

    该实施例描述了来自玉米和大豆植物组织的cDNA文库的产生，本发明的玉米AsnS和大豆多核苷酸序列从该玉米和大豆植物组织中分离。使用本领域已知的技术(例如Alba，2004)从玉米和大豆组织产生cDNA文库。玉米cDNA文库是由两种不同的组织制成的。文库是由缓慢生长阶段(dilatory phase)从近交系90DDD5收获的初期核仁制成的。第二个玉米cDNA文库是由来自玉米近交系H99的抽丝生长阶段的丝组织和来自玉米近交系MO17的发芽花粉制成的。为了构建来自大豆(Glycine max)的cDNA文库，从再水化的品种A3237(Asgrow)干大豆种子中切除分生组织和部分下胚轴。通过首先在28℃和每天18小时光照下在固体组织培养基中使表面灭菌的种子发芽6天、然后转移发芽的种子到4℃中至少24小时来制备外植体。对于文库制备中使用的组织而言，去除子叶以富集特定的目的组织。使用0.5至2克组织制备总RNA和poly A+RNA。对于所有的cDNA文库而言，收集植物组织并立即置于液氮中冷冻。收集的组织储存在‑80℃下，直到制备总RNA。使用来自Invitrogen Corporation的Trizol试剂(Invitrogen Corporation，Carlsbad，California，U.S.A.)，基本上根据厂商推荐的方法纯化总RNA。使用磁性oligo dT珠子，基本上根据厂商(Dynabeads，Dynal Biotech，Oslo，Norway)推荐的方法纯化polyA+RNA(mRNA)。

    植物cDNA文库的构建是本领域公知的，并且存在许多克隆策略。有许多cDNA文库构建试剂盒可以商购获得。根据Superscript IIcDNA文库合成方案所述，使用Superscript^TM cDNA合成和质粒克隆质粒系统(Invitrogen Corporation)来制备cDNA文库。检查cDNA文库来确定适当的插入物：载体比例。

    根据下述修改的基因组DNA分离方法(Dellaporta等人，1983)，使用从玉米分离的基因组DNA来构建基因组DNA文库。玉米秧苗在土壤中或培养皿上生长，收获，并在液氮中冷冻保存直至提取。在用液氮使组织保持冷冻的同时，使用研钵和研杵将组织碾成细小粉末。将粉末组织转移到含有在临用前加入的200mL冷(0℃)DNA提取缓冲液(350mM山梨醇；100mM Tris；5mM EDTA；使用HCl调节pH至7.5；亚硫酸氢钠，3.8mg/mL)的Waring混合器中，并高速匀浆化30‑60秒。匀浆通过一层粗棉布(cheesecloth)过滤，并收集到一个离心瓶中。然后将样品在2500xg下离心20分钟，并弃去上清液和任何松散的绿色材料。然后将沉淀重悬浮于1.25mL DNA提取缓冲液中，并转移到50mL聚丙烯试管中。然后加入核裂解缓冲液(1.75mL，包含200mM Tris；50mM EDTA；2M NaCl；2.0％(w/v)CTAB；使用HCl调节pH至7.5)，再加入0.6mL 5％(w/v)肌氨酰。轻轻地混合试管，样品在65℃下温育20分钟。添加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，然后再次轻轻地混合试管。然后以2500xg离心试管15分钟，将得到的上清液转移到一个干净的试管中。将等体积的冰冷的异丙醇倾倒到样品上，颠倒样品几次直至形成沉淀。使用玻璃移液管从溶液中移出沉淀，使沉淀物风干2‑5分钟以去除残余的醇。将沉淀物重悬浮于400μL TE缓冲液(10mM Tris‑HCl，1mM EDTA，pH调节至8.0)中。

    实施例2

    通过连接独立克隆方法和Gateway克隆方法的AsnS多核苷酸序列分离，以及玉米转化。

    该实施例阐明了使用连接独立和Gateway克隆方法分离编码AsnS的多核苷酸分子以及构建本发明的DNA构建体，该构建体包含编码从表1所述的各种植物和微生物来源分离的AsnS多肽的多核苷酸分子。用于驱动连接的AsnS编码多核苷酸分子的表达的启动子分子为水稻肌动蛋白1启动子P‑Os.Act1(美国专利5,641,876，在此引入作为参考)；玉米PPDK(Matsuoka等人，1993)、P‑RTBV‑1(美国专利5,824,857，在此引入作为参考)和P‑Zm.NAS(编码来自玉米的烟胺合酶2多肽的基因组区的启动子分子)。

    表1.AsnS编码序列来源、启动子和DNA构建体。

       SEQ ID NO：  编码序列来源  启动子 示例性DNA构建体  3  玉米AsnS2  P‑Os.Act1 pMON79706  5  玉米AsnS3  P‑Os.Act1 pMON92870  7  大豆  P‑Os.Act1 pMON79700  17  酿酒酵母  P‑Os.Act1 pMON79653

    连接独立克隆(LIC)被开发用于克隆PCR产物，它是基于非回文单链末端的退火。LIC是一种有效的克隆方法，其不受限制性位点的限制或受需要限制性内切酶消化或连接反应的限制，形成无缝连接(Aslanidis和de Jong，1990)。

    使用“切口内切核酸酶”和限制性内切核酸酶在载体中产生末端单链DNA区段。切口内切核酸酶是一种内切核酸酶，其在多核苷酸双链的一条链上形成切口，以在克隆载体上产生单链尾巴。载体首先用标准的限制性内切核酸酶线性化。然后再使用切口内切核酸酶进行消化。在热处理之后，在载体中产生了末端单链DNA区段。推荐大约55％的GC含量用于下游PCR扩增和有效退火。启动子、标签或其它序列元件可被添加到PCR扩增产物的5’和3’末端，以产生可用于下游应用的线性构建体。

    DNA构建体pMON92870是由基础载体pMON82060和如SEQ IDNO：5所示的编码AsnS多肽的玉米AsnS3多核苷酸分子装配而成的。使用限制性内切核酸酶HpaI将质粒骨架pMON82060线性化。然后使用切口内切核酸酶N.BbvC IA(New England Biolabs，Beverly，MA)处理质粒骨架。消化以后，加热反应体系至65℃。这使得DNA的切口链与它们的互补DNA链解离。产生的线性化质粒骨架具有两个末端单链DNA区段，可用于装配。

    使用聚合酶链反应在编码AsnS的DNA分子中产生末端单链DNA区段。使用编码AsnS多肽的玉米AsnS3多核苷酸序列(SEQ IDNO：5)设计正向PCR引物(SEQ ID NO：48)和反向PCR引物(SEQID NO：49)：

    SEQ ID NO：48：GCAGTCGCTGTCGTTACCCGGCATCATGTGTGGCATC

    SEQ ID NO：49：GCGAGTACCGCTGGGTTCTAACGTACTCTCGTCAGACCGCG

    使用高保真度热聚合酶‑KOD热启动DNA聚合酶(Novagen，Madison，WI)来进行聚合酶链反应扩增。聚合酶链反应在25μL体积中进行，其中含有1X KOD热启动DNA聚合酶缓冲液、1M甜菜碱(Sigma，St.Louis，MO)、1mM MgSO₄、250μM dNTPs、各5pmols的每种引物和1单位的KOD热启动DNA聚合酶。聚合酶链反应在PTC‑225DNA Engine Tetrad^TM热循环仪(MJ Research Inc.，Waltham，MA)中进行，使用下述循环参数：

    1.94℃ 2分钟

    2.94℃ 15秒

    3.70℃ 30秒(每个循环‑1℃)

    4.72℃ 5分钟

    5.回到步骤2，循环9次

    6.94℃ 15秒

    7.60℃ 30秒

    8.72℃ 5分钟

    9.回到步骤6，循环24次

    10.72℃ 10分钟

    11.10℃ 维持

    12.结束

    进行第二轮聚合酶链反应，以在产生末端单链DNA区段的区域中引入尿苷残基。许多DNA聚合酶不能读取DNA的模板链上的尿苷残基，或者不能使用尿苷残基来聚合链。因此，使用能够引入和读取尿苷的酶(Expand High Fidelity^TM plus PCR System；Roche，Indianapolis，IN)来进行聚合酶链反应。对这种方法的修改以及使用能够提供预期结果的其它方法是本领域技术人员已知的。

    将装配的DNA构建体转化到ElectroMAX^TM DH10B大肠杆菌感受态细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。来自装配反应的0.5μL(微升)等分试样与20μL ElectroMAX^TM DH10B感受态细胞在冰上混合，并加载到MicroPulser 0.2mm电穿孔容器(Bio‑Rad Laboratories Inc.，Hercules CA)中进行电穿孔。使用165‑2100 MicroPulser电穿孔仪(Bio‑Rad Laboratories Inc.)在1.8kV下对细胞进行电穿孔。电穿孔的细胞在180μL SOC培养基(Invitrogen Inc.)中37℃培养1小时。然后将细胞涂布到包含壮观霉素(75mg/L)的LB琼脂平板上，在37℃生长过夜。选择菌落，并在LB培养基中在37℃生长过夜。使用QIAprepSpin Miniprep试剂盒(QIAgen Sciences，Valencia，CA)来分离质粒DNA构建体。使用BigDye终止子(Applied Biosystems，Foster City，CA)在ABI 3730x1 DNA分析仪上进行DNA测序。

    如厂商(Invitrogen Corp.)所述使用Gateway克隆方法来完成玉米AsnS2、大豆AsnS和酵母AsnS1等AsnS编码多核苷酸序列的克隆。Gateway克隆方法的目的在于制备表达克隆。这个两步法包括：首先克隆目的基因至一个进入载体中，然后再将该目的基因从进入载体亚克隆至目的载体中，以产生表达载体。该克隆技术是基于噬菌体λ使用的位点特异性重组系统来向大肠杆菌染色体中整合DNA。

    将在后续的重组克隆中使用的DNA构建体、两个attB或attR重组序列克隆到一个重组载体中，侧翼为壮观霉素/链霉素抗性基因(SPC/STR)和编码AsnS的多核苷酸序列。编码AsnS的多核苷酸序列是使用初级和次级引物序列(SEQ ID NOs 20‑43)从由它们相应的物种制备的cDNA或基因组文库中分离出来的。邻接的attB1/R1、SPC/STR基因、AsnS基因和attB2/R2序列作为单个多核苷酸分子被移动到重组构建体中用于在植物细胞中表达，这些双链DNA质粒被命名为pMON79706(玉米AsnS2)、pMON79700(大豆AsnS)或pMON79653(酿酒酵母AsnS)。这些DNA构建体包含土壤杆菌右边界(O‑OTH.‑RB)区域和左边界(LB)区域以及Herrera‑Estrella等人，1983、Bevan，1984、Klee等人，1985中公开的其它区域、e35S启动子(P‑CAMV.35S，串联重复增强子，美国专利5,322,938)、attB1/R1遗传元件(O‑Lam.attB1/R1)、SPC/STR基因、相应的AsnS编码区(CR)、attB2/R2遗传元件(O‑Lam.attB2/R2)、马铃薯蛋白酶抑制剂II终止子(St.Pis)、土壤杆菌NOS启动子(P‑AGRtu..nos，Fraley等人，1983)、土壤杆菌左边界(O‑OTH.‑LB)、卡那霉素抗性基因(CR‑OTH.‑Kan，美国专利6,255,560)和大肠杆菌复制起点(Ec.ori.ColE)。

    在对pMON79706、pMON79700或pMON79653的氯霉素选择(25μg/mL)和卡那霉素选择(50μg/mL)下，DNA构建体在LibraryEfficiencyDB3.1^TM细胞(Invitrogen Corporation)中进行扩增。使用QIAGEN Plasmid试剂盒(QIAGEN Inc.)从细菌培养物中纯化载体DNA。

    使用放电颗粒加速基因转运装置，如美国专利5,015,580中所述，将pMON79700、pMON79706和pMON79653的DNA引入到玉米胚中。对于LH59预培养的未成熟胚的微粒轰击而言，优选使用35％至45％的最大电压。微粒轰击之后，玉米组织在黑暗中在27℃下培养。用于制备本发明的转基因植物的转化方法和材料，例如，各种培养基和受体靶点细胞，未成熟胚的转化和后续的可育的转基因植物的再生，公开在美国专利6,194,636和6,232,526、美国专利申请公布20040216189中，在此引入作为参考。

    通过在适当的再生培养基中培养转化的愈伤组织来开始苗的发育和小植株的形成，由转化的玉米细胞产生可育的转基因玉米植物。当它们长到大约3英寸高并且生根的时候(转移到培养基后大约4至6周)，将小植株转移到土壤中。植物在26℃的生长室中放置2周，然后在温室的喷雾台(mist bench)上放置2周。然后将植物移植到5加仑的罐中，并在温室中生长成熟。使用玉米LH59近交系进行交互授粉。收集玉米植物的种子，并用于蛋白质分析和进一步的培育活动。

    实施例3

    使用AsnS多核苷酸序列的载体构建和玉米转化

    使用PCR(聚合酶链反应)扩增玉米AsnS2(SEQ ID NO：3，pMON79706，图1)。PCR的反应条件依照厂商(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)的方案进行。在1X LA PCR缓冲液II(Takara Bio INC，Shiga，Japan)中使用各30nmol的正向(f)引物(SEQ ID NO：32)和反向(r)引物(SEQ ID NO：33)、各10微摩尔的dATP、dCTP、dGTP和TTP、2.5单位的TaKaRaLA Taq扩增根据上述制备的大约100ng玉米DNA。在94℃初始温育1分钟以后，以94℃45秒，然后60℃退火45秒，72℃1分15秒进行35个PCR循环，然后是72℃7分钟的1个循环。

    制备了5个AsnS2DNA构建体。第一个玉米AsnS2构建体的制备过程是：如上所述通过PCR从pMON79706中分离1821个碱基对的AsnS2片段，然后使用XbaI和EcoRI限制性内切酶进行限制性消化。将产生的AsnS2基因连接到也经过XbaI和EcoRI消化的pMON61560中。使用NotI消化产生的穿梭载体(pMON66246)，将与PPDK启动子和RGLUT1终止子可操作地连接的包含AsnS2基因的插入物连接到也经过NotI消化的pMON30167中。包含EPSPS基因的pMON30167质粒允许用草甘膦选择。产生的最终质粒命名为pMON66230(图3)。

    第二个AsnS2构建体使用上述AsnS2(pMON79706)基因制备。该构建体的制备过程是：将XbaI/EcoRI消化的AsnS2基因插入到也经过XbaI和EcoRI消化的pMON61562中，产生与NAS启动子和RGLUT1终止子可操作地连接的AsnS2基因。使用NotI消化产生的质粒，并连接到经NotI消化的pMON30167中。产生的质粒命名为pMON66229(图2)。

    第三个AsnS2构建体使用上述AsnS2基因(pMON79706)制备。通过使用NotI和XbaI限制性内切酶消化pMON78810分离得到在该构建体中使用的P‑FDA启动子。然后将P‑FDA启动子连接到预先经过NotI和XbaI消化以去除其PPDK启动子的pMON66246中。使用NotI消化产生的质粒，并连接到经NotI消化的pMON30167中。产生的质粒命名为pMON66231(图4)。

    第四个AsnS2构建体使用上述AsnS2基因(pMON79706)制备。通过PCR从pMON74576产生在这个构建体中使用的P‑RTBV启动子。使用NotI和XbaI消化721bp的片段，并连接到预先经过NotI和XbaI消化的pMON66246中。使用NotI消化产生的含有与P‑RTBV启动子和RGLUT1终止子可操作地连接的AsnS2基因的质粒，并连接到经NotI消化的pMON30167中。产生的质粒命名为pMON66239(图5)。

    第五个AsnS2构建体使用上述AsnS2基因(pMON79706)制备。使得引物对ZmAS有义，

    5′TCCTAGACATGTCCGGCATACTTGCTG3′(SEQ ID NO：46)，和ZmAS反义，

    5′TGCAGAATTCTATCCCTCGATGG；(SEQ ID NO：47)，从pMON66240中扩增玉米AsnS2。PCR设置如下：在总体积50μl的PCR反应体系中，各1μl 10mM的ZmAS有义和ZmAS反义引物，0.2‑0.5μg(1μl)pMON66240质粒DNA，5μl 10X AccuPrime^Tm Pfx反应混合液，1μl ACCuPrime^Tm Pfx DNA聚合酶(Invitrogen)和41μl蒸馏水。使用下述循环参数进行PCR反应：94℃1分钟，然后进行30个循环的94℃15秒变性；58℃15秒退火和68℃4分钟；然后进行68℃10分钟延伸。使用QIAGEN(QIAGEN Inc.)的PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。使用NcoI和EcoRI限制性内切酶消化玉米AsnS2的PCR产物的等分试样，使用AflIII和NcoI消化PCR产物的另一等分试样。然后将NcoI和EcoRI片段克隆到pMON94901的NcoI和EcoRI位点。将玉米AsnS2的AflIII和NcoI 5’末端片段克隆到玉米AsnS2片段的NcoI和EcoRI的NcoI位点处。使用NotI消化得到的包含与e35S启动子和Hsp17终止子可操作地连接的玉米AsnS2的质粒(pMON74940)，并连接到经NotI消化的pMON53616中以构建pMON74946。

    上述每种构建体都包含一个用于表达草甘膦不敏感的II型EPSPS的表达盒，作为选择转基因事件的设置(美国专利5,633,435)。使用PE Applied Biosystems BigDye terminator v.3.0(PE AppliedBiosystems，Foster City，CA)中描述的标准方法来确定每种构建体的核酸序列，并确定克隆连接的完整性。pMON66229、pMON66230、pMON66231、pMON66239和pMON74946用于后续的玉米细胞的转化和从这些细胞再生成为完整的玉米植物。通过土壤杆菌介导的转化方法将目的构建体引入来自玉米系LH244的未成熟胚中，例如如美国公布专利申请20050048624中所描述的那样。

    实施例4

    玉米种子样品的蛋白质和氨基酸分析。

    该实施例描述了一种使用HPLC和近红外线测量的蛋白质和氨基酸分析方法，以选择具有增加的天冬酰胺和蛋白质的本发明的种子。对于种子蛋白质分析而言，使用近红外线透射光谱(Infratec 1221型，Tecator，Hoganas Sweden)检测每种处理由50‑100个种子组成的小批量样品。这种方法是基于观察近红外线辐射的吸收与典型的种子样品中包含的化学组分的含量之间存在的线性关系。在分析未知样品之前，收集校准样品的光谱数据，该校准样品随后使用初步分析技术进行分析。使用的初步分析技术为氮气燃烧(Murray和Williams，1987)。使用来自分光计的光谱数据和原始数据来建立多变量模型。在这个例子中，使用152个校准样品来构建PLS‑1(I型偏最小二乘法回归)多变量模型。每种未知的样品在分光计上扫描至少5次，每次扫描预测一次蛋白质含量。每次扫描样品后，都加回到样品比色杯中，以准确地表示测试样品。对多次扫描预测的蛋白质值取平均值，然后报告每种样品的值。

    使用HPLC对玉米组织进行游离氨基酸分析。对于每种样品，使用1.5mL 10％三氯乙酸在2mL微量离心管中提取20‑50mg冻干的组织。通过轻轻地摇动在室温下过夜提取样品。通过离心澄清提取的样品，移出上清液用于进一步分析。在带有荧光检测器和装备有Zorbax Eclipse AAA C18柱(4.6x 75mm，3.5微米，AgilentTechnologies，Palo Alto，CA)和Zorbax Eclipse AAA分析保护柱(4.6x 12.5mm，5微米)的96孔板自动进样器的Agilent Series 1100 HPLC上，通过HPLC进行游离氨基酸分析。在临分离之前，使用邻苯二醛预衍生化样品。使用40mM磷酸缓冲液pH 7.6/甲醇/乙腈梯度解析游离氨基酸，然后在340nm/450nm(激发/发射)进行荧光检测。基于外部氨基酸标准来定量游离的氨基酸，使用ChemStation软件(Agilent)进行峰的积分。相对标准差通常小于8％。

    实施例5

    转基因玉米植物中的天冬酰胺水平和谷粒蛋白质含量的田间评估。

    该实施例描述了玉米AsnS构建体(pMON79706和pMON92870)对转化的玉米植物和种子中的天冬酰胺和蛋白质水平的影响以及玉米AsnS构建体(pMON79700和pMON79653)对谷粒蛋白质含量的影响的田间评估结果。玉米组织中的游离天冬酰胺的相对浓度从由pMON79706或pMON92870转化的R₀玉米植物产生的近交系获得。对于pMON79706，R₀转化体与亲本近交体LH59回交，产生BC₁种子。将转基因分离的BC₁种子种植在田间苗圃中，对每个植物是否存在NPTII标记基因进行打分。从转基因阳性和转基因阴性植物收集叶子组织用于游离氨基酸分析，对每种转基因事件都进行游离氨基酸分析。对于每种事件，将pMON79706转基因植物叶子中的游离氨基酸与阴性等值线植物进行比较，并使用JMP 5.1软件(SAS Institute，Cary，NC)通过Student′s T检验进行统计学分析。对于pMON92870，R₀转化体与亲本近交体LH244进行回交以产生BC₁种子。将BC₁种子种植在田间苗圃中，并进行自花授粉来产生BC₁S₁种子，该BC₁S₁种子随后种植在第二近交苗圃中。对NPTII标记基因的存在进行打分以后，确定转基因阳性植物的每种转基因事件。从转基因阳性的BC₁S₁植物中收集叶子组织，在苗圃中以规律的间隔种植亲本近交地。通过使用SAS 9.1软件进行Student′s T检验以进行方差分析以及对比转基因项和亲本对照，来统计学分析pMON92870叶子中的游离氨基酸。对于两种构建体的游离氨基酸分析，通过在开花期取上端完全展开的叶子、随后在干冰上冷冻来收集叶子组织。叶子样品进行磨碎冷冻、冻干并通过HPLC测定其游离氨基酸含量。

    观察到pMON79706和pMON92870的多转基因事件，显示其叶子中的天冬酰胺含量显著增加(表2)。如根据0.05或更小的p值所示，检测的pMON79706的七种事件中的四种事件显示叶子中的天冬酰胺含量显著增加。在表达第二玉米天冬酰胺合成酶基因的pMON92870的转基因事件中，五种事件中的四种事件显示叶子中的天冬酰胺含量显著增加(表2)。这些数据显示，分别在pMON79706和pMON92870中在水稻肌动蛋白启动子下，玉米AsnS2和玉米AsnS3的转基因表达可以导致游离天冬酰胺的特定增加，这与活性天冬酰胺合成酶的过表达是一致的。

    玉米种子中的蛋白质的相对浓度是从来自pMON79706或pMON92870转化的R₀玉米植物的近交系获得的。pMON79706的BC₁转基因植物(上述)自花授粉，产生的BC₁S₁谷粒生长至成熟，并通过单穗(single ears)测定其蛋白质含量。测定的蛋白质表示为在0％湿度时干重量的百分比。对于每种事件，将pMON79706转基因植物的谷粒蛋白质与阴性等值线植物进行对比，并使用SAS 9.1软件通过Student′s T检验进行统计学分析。对于pMON98270，BC₁S₁植物自花授粉，并生长至成熟，通过单穗测定其蛋白质含量。通过进行旁位置分析(by‑location analysis)使用定制开发的空间方法来统计学分析pMON92870的谷粒蛋白质。旁位置分析是一种两步方法。该分析的第一步包括通过使用被系统地置于田间(每第六块样地)的所有的空间对照样地来拟合各向异性球形半变量图模型，来估计田间的空间自相关。该分析的第二阶段包括使用在分析的第一阶段估计的空间自相关结构，来调节转基因项的空间变异性值。调节空间自相关之后，进行平均值比较，其中，转基因项的平均值与亲本对照进行比较，以检验转基因与对照平均值之间的差异的统计学显著性。

    pMON79706和pMON92870的多种事件显示近交谷粒蛋白质含量的显著增加(表3)。进行统计学分析的pMON79706的五种事件中的三种显示谷粒蛋白质含量显著增加(p＜0.05)，另两种事件显示倾向于显著增加的趋势(p＜0.15)。两种事件并没有带回统计学分析所需的足够数量的穗。pMON92870的四种转基因事件中的三种显示谷粒蛋白质含量显著增加(p＜0.1)，一种事件由于分析所需的穗的数目不足而没有进行检测。这些数据确认了pMON79706和pMON92870产生了除增加叶子的天冬酰胺含量以外还能够提高玉米中的谷粒蛋白质含量的转基因事件。

    表2.用玉米AsnS2基因(pMON79706)或玉米AsnS3基因(pMON92870)转化的近交玉米中的相对叶子天冬酰胺浓度。

    

    

     ^a 在两个分开的实验中确定pMON79706和pMON92870的叶子天冬酰胺。

     ^b 测定的相对游离天冬酰胺表示为叶子组织中总游离氨基酸的百分比。

    表3.用玉米AsnS2基因(pMON79706)或玉米AsnS3基因(pMON92870)转化的近交玉米中的谷粒蛋白质含量。

    

     ^a 在两个分开的实验中确定pMON79706和pMON92870的谷粒蛋白质。

     ^b 测定的谷粒蛋白质表示为基于0％湿度的总谷粒组合物的百分比。

     ^c nd；未测定。

    在第二个实验中，高天冬酰胺和谷粒蛋白质表型pMON79706在多个组织中得到证实。BC₁代之后，pMON79706的五种事件在后续的两个苗圃中自花授粉，以产生转基因纯合的BC₁S₃种子。通过对比纯合BC₁S₃植物和LH59玉米品种对照(表4)，在玉米V8生长阶段的研究中确定了pMON79706构建体表达产生的天冬酰胺的相对浓度。以随机化的完全区组设计种植转基因项和对照，在田间样地中具有5个重复的区域。将两种植物的上部完全展开的叶子和茎部分采样、集中、置于干冰上、碾碎、冻干，并通过HPLC测定其游离氨基酸含量。后面标有″*″的数值表示与LH59对照有显著性差异(Dunnett′s单尾检验；(SAS 9.1，Cary，NC))。在V8生长阶段和R₁代进行的天冬酰胺测定显示五种pMON79706事件产生的植物的游离天冬酰胺显著增加。与LH59品种对照的3.4％相比，V8叶子组织中的相对游离天冬酰胺水平增长至可达13.9％；与对照的9.6相比，茎的天冬酰胺增长至可达39％(表4)。对于谷粒蛋白质分析，每块地采样10个穗、去壳，并分析谷粒蛋白质浓度。在pMON79706的五种事件中，谷粒蛋白质也显著增加(表4)。结果显示：作为总体趋势，导致天冬酰胺显著增加的事件也导致核仁蛋白质的显著增加(表2‑4)。

    表4.用玉米AsnS2基因(pMON79706)转化的BC₁S₃玉米植物中，V8生长阶段的相对天冬酰胺浓度和成熟期的谷粒蛋白质浓度。

    

       ZM_M50984  9.18^*  997^*  28.20^*  8062^*  14.4^*  ZM_M50985  5.86^*  697  15.12^*  3404  14.5^*  ZM_M51011  13.89^*  1740^*  37.05^*  11820^*  15.0<sup>*

     *</sup>p＜0.05时具有显著性

    对于在水稻肌动蛋白启动子下表达天冬酰胺合成酶基因的三种不同的构建体，观察到杂种谷粒蛋白质的显著增加。纯合的近交玉米系是由pMON79706(玉米AsnS2)、pMON79700(大豆AsnS)和pMON79653(酵母AsnS1)的R₀转基因事件如下产生的：首先将R₀事件与回归亲本LH59进行回交，然后在两个后续的近交苗圃中对转基因阳性选择进行自花授粉，使用NPTII选择性标记来对接合性进行打分。然后使用每种构建体的纯合事件作为雄性花粉供体与雌性近交系进行杂交，以产生F₁杂种。在多地点试验中种植F₁杂种种子，分析每种构建体的转基因事件的最终谷粒蛋白质，并在基于在田间以规律的间隔种植的对照杂种中谷粒蛋白质的空间校正分析之后，与回归亲本杂种对照进行对比。从每块地中收获谷粒、去壳，并分析其蛋白质含量。通过进行旁位置和交叉位置分析，使用定制开发的空间方法来分析数据。旁位置分析为一种两步方法。该分析的第一步包括通过使用被系统地置于田间(每第三块样地)的所有的空间对照样地来拟合各向异性球形间半变量图模型，来估计田间的空间自相关。该分析的第二阶段包括使用在分析的第一阶段估计的空间自相关结构，来调节转基因项的空间变异性值。在每个位置分别调节空间自相关之后，进行交叉位置分析，其中，转基因项的平均值与亲本对照进行对比，以检验转基因与对照平均值之间的差异的统计学显著性(P＝0.20)。pMON79706的所有五种事件在杂种试验中都显示谷粒蛋白质显著增加，这与观察到在这种构建体的转基因事件的近交系中谷粒蛋白质显著增加相一致(表5)。另外两种天冬酰胺合成酶构建体pMON79700(大豆AsnS)和pMON79653(酵母AsnS)也显示出分别在五种事件中的两种事件和两种事件中的两种事件中谷粒蛋白质水平显著增加。

    表5.用来自玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)和酵母(酿酒酵母)的天冬酰胺合成酶基因转化的杂种玉米中谷粒蛋白质的含量^a。

    

     ^a 测定的谷粒蛋白质显示为基于0％湿度的总谷粒组合物的百分比。

    实施例6

    由于pMON79706和pMON92870导致的转基因表达和天冬酰胺合成酶活性的田间评估

    证实了pMON79706和pMON92870的转基因事件中的转基因表达。对于pMON79706，用于在对BC₁S₃纯合近交系的田间试验中确定叶子天冬酰胺含量的组织也同样用于基于确定来自开花期的pMON79706的3’终止子序列(St.Pis4)的表达确定转基因表达。从五个重复块地(近交对照为10个)的每一个中收集两种叶子样品，集中，并在干冰上冷冻。然后冷冻研磨叶样品用于表达分析。对于RNA提取，将50mg冷冻组织等分到96孔板中。使用包含ABI核酸裂解溶液(Applied Biosystems，Foster City，CA)与1X PBS pH 7.4(不含MgCl或CaCl)的1∶1溶液的500μl裂解缓冲液提取每种样品。使用滤板从粗裂解物中捕获核酸，以从新鲜冷冻的组织中提取RNA，并使用50μl ABI洗脱缓冲液洗脱结合的RNA。使用5μl RNA模板和5μl ABI一步RT‑PCR试剂来进行定量PCR。反应在ABI Taqman7900 PCR仪器上进行40个PCR循环，循环参数为48℃30分钟，95℃10分钟，95℃ 10秒，60℃ 1分钟。在40个循环中的每个循环中，对每个孔中的来自马铃薯蛋白酶抑制剂II(St.Pis4)的终止子序列和内源对照(泛素)进行荧光测量。在不存在反转录酶的情况下运行一部分样品，来监测DNA的污染。通过从内源对照的循环阈值中减去St.Pis4的循环阈值来对样品的相对表达进行打分。确定循环阈值(Ct)，通过St.Pis4减去内源对照值计算得到δCt。通过计算内源对照信号的平均值和设定St.Pis4信号值为40来产生原位野生型。从原位野生型的δCt减去未知样品的δCt。最终数据报告为相对于野生型的pinII(St.Pis4)表达。定量RT‑PCR分析证实了来自pMON79706的六种事件中的六种事件的转基因的过表达(表6)。

    还在包含pMON92870的近交事件中证实了转基因的表达。确定处于开花期的生长在田间苗圃中的近交植物的叶子组织中的RNA表达，这是通过首先收集每个植物(每种事件4‑8个植物)的上部展开的叶子、并在干冰上冷冻实现的。预先基于NPTII标记基因的存在确定转基因阳性植物。在冷冻的同时碾碎叶子组织，并分析其来自pMON92870的3’终止子序列(St.Pis4)的表达。定量RT‑PCR分析显示：与近交对照相比，包含pMON92870的六种事件中的五种事件显示出增加的转基因表达(图7)。pMON92870事件ZM_M103316中的低RNA表达与该事件中的低的叶子天冬酰胺含量和谷粒蛋白质含量一致。

    在pMON79706和pMON92870的转基因事件中检测天冬酰胺合成酶基因的表达对天冬酰胺合成酶活性的影响。将冷冻、碾碎的叶子组织等分(200‑400mg)到预冷却的96深孔板的孔中。使用缓冲液A(100mM Hepes‑OH，pH 8.0，0.1mM EDTA，10mM MgCl₂，2mM天冬氨酸，0.5mM DTT，67mM巯基乙醇，20％(v/v)甘油，0.1mM ATP，1％(v/v)P9599(Sigma Company)，25mM KCl)提取蛋白质。向每个孔中添加少量沙子。然后以4∶1(缓冲液∶组织)向孔中的叶子组织添加缓冲液A。然后在振动器中震荡板2分钟来混合样品，然后在5000x g下离心10分钟。在由缓冲液A平衡的96孔大旋板(SNS S025L，TheNest Group Inc.，Southboro，MA)中对上清液(100‑200μl)进行脱盐处理。然后或者立即分析上清液，或者在液氮中冷冻上清液并保存在‑80℃下直至使用。为了分析天冬酰胺合成酶的活性，将脱盐的蛋白质提取物(10‑50μl)添加到包含100μl分析溶液(100mM Hepes，pH 8.0，10mM MgCl₂，2mM天冬氨酸，5mM DTT，10mM ATP，1mM氨基(氧)乙酸(天冬氨酸氨基转移酶抑制剂)，1mM天冬氨酸半醛(天冬酰胺酶抑制剂))的孔中。为了开始反应，向溶液中添加谷氨酰胺(标准分析的终浓度为2mM)，然后进行混合。然后温育分析混合液1至2小时。通过添加等体积的20％(w/v)三氯乙酸来终止反应。然后过滤混合液来去除沉淀，并使用HPLC来测定天冬酰胺。用于HPLC的样品的体积从0.5μl增加到2.5μl，激发波长从340nm降低到235nm，荧光计的增益从10增加到13。这导致能够检测0.5至100μM天冬酰胺的灵敏度，并允许以100s的微单位测定活性水平。

    对于pMON79706，用于确定叶子中天冬酰胺合成酶活性的组织来自使用在V7生长阶段收获的BC₁S₃纯合近交系的田间试验。pMON79706的事件显示出叶子中的天冬酰胺合成酶活性增加(表6)。相对于近交品种对照，天冬酰胺合成酶活性提高了最多5倍。还确定了在近交田间苗圃中处于开花期的pMON92870的转基因事件的天冬酰胺合成酶活性。五种pMON92870事件中的四种也显示出增加的酶活性(表6)。在水稻肌动蛋白启动子下表达玉米AshS2(pMON79706)或玉米AshS3(pMON92870)的玉米植物中增加的天冬酰胺合成酶活性与这些构建体中观察到的基因表达的提高和叶子中天冬酰胺的增加是一致的。

    表6.pMON79706和pMON92870的转基因事件的近交系中的天冬酰胺合成酶活性^a。

    

     ^a pMON79706和pMON92870的酶活性通过两种不同的田间实验确定。

    实施例7

    pMON66231、pMON66239和pMON74946对天冬酰胺和谷粒蛋白质含量的影响的田间评估

    玉米组织中游离天冬酰胺的相对含量是从来自用pMON66231转化的R₀玉米植物(LH244背景)的杂种系获得的(图4)，其中，玉米AsnS2由玉米FDA启动子控制。杂种是通过杂交R₀植物与雄性近交系LH59得到的，这产生了分离的(1∶1)F₁种群。将产生的F₁种子种植在中西部的三个位置中，每个位置重复两次。在V3生长阶段使用草甘膦喷洒样地以去除无效的分离体。杂种对照种植在周边，与杂种对照进行比较。在开花期，在日落两小时后，从所有的三个位置，从每块样地内的三种植物上收集和集中上端叶子。叶子立即置于干冰中，然后在‑80℃下储存直至加工。冷冻研磨叶子，冻干一部分用于通过HPLC进行游离氨基酸分析。首先使用Bonferroni调节的p值通过用于删除的学生化(studentized)残差的两通方法(two‑passmethod)对离群值(outlier)筛选数据。在开始方差计算的分析之前，确定离群值，并从数据组中去除。根据交叉位置随机化的完全区组设计来分析数据。构建体‑事件的组合用固定效果建模，位置和位置内的重复(reps)用随机效果建模。通过对构建体‑事件的组合的最小均方进行比较，进行处理对比。在pMON66231的12种事件中的11种中，相对叶子天冬酰胺显著增加，与对照的3％相比，天冬酰胺水平高达16％(表7)。每块样地收获10个穗，然后去壳和集中每块样地的种子，然后在测定谷粒蛋白质的含量，从而测定了成熟的谷粒蛋白质。相对于LH244/LH59杂种对照，发现在成熟的谷粒中12种事件中的九种事件显著增加了蛋白质含量。

    表7.pMON66231转基因事件中的相对叶子天冬酰胺和成熟谷粒蛋白质含量。

    

       ZM_S122291  16.25  ＜.001  9.83  0.004  ZM_S122303  6.44  0.126  8.53  0.71

     ^a 测定的相对游离天冬酰胺表示为叶子组织中总游离氨基酸的百分比。

     ^b 与杂种对照相比

    玉米组织中的相对游离天冬酰胺含量是从来自用pMON66239和pMON74946转化的R₀玉米植物(LH244背景)的杂交系得到的，其中，玉米AsnS2分别在RTBV或e35S启动子的控制下。杂种是通过杂交R₀植物与雄性近交系LH59得到的，这产生了分离的(1∶1)F₁种群。将产生的F₁种子种植在夏威夷的一个位置，每种转基因事件重复三次。在V3生长阶段使用草甘膦喷洒样地以去除无效的分离体。包括缺乏玉米AsnS2基因的杂种对照用于比较。在开花期，在日落两小时后，从每块样地内的三种植物中收集和集中上端叶子。叶子立即置于干冰上，然后在‑80℃下储存直至加工。冷冻研磨叶子，冻干一部分用于通过HPLC进行游离氨基酸分析。首先使用Bonferroni调节的p值通过用于删除的学生化(studentized)残差的两通方法(two‑pass method)对离群值(outlier)筛选数据。在开始方差计算的分析之前，确定离群值，并从数据组中去除。根据交叉位置随机化的完全区组设计来分析数据。构建体‑事件的组合用固定效果建模，重复(reps)用随机效果建模。通过对构建体‑事件的组合的最小均方进行比较，进行处理对比。在pMON74946的13种事件中的10种中，相对叶子天冬酰胺显著增加，与对照的2％相比，天冬酰胺水平高达16％(表8)。每块样地收获所有穗，然后去壳和集中每块样地的种子，然后在测定谷粒蛋白质的含量并对叶子天冬酰胺性状进行统计学分析，从而测定了成熟的谷粒蛋白质。相对于杂种对照，发现13种事件中的10种事件在成熟的谷粒中具有显著增加的蛋白质含量，叶子天冬酰胺增加的这10种事件还显示在杂交试验中蛋白质也增加。对于pMON66239的转基因事件，在0.05α水平时，15种事件中的11种显示叶子天冬酰胺含量增加，15种事件中的3种显示谷粒蛋白质显著增加，尽管另外的五种转基因事件在p＜0.15时显示蛋白质增加，提示在RTBV启动子(pMON66239)下玉米AsnS2的表达能够增加叶子天冬酰胺含量和核仁蛋白质含量，但是增加的程度低于在e35S启动子(pMON74946)下的表达(表8)。

    表8.pMON74946和pMON66239转基因事件中的相对叶子天冬酰胺和成熟谷粒蛋白质含量。

    

    

     ^a 测定的相对游离天冬酰胺表示为叶子组织中总游离氨基酸的百分比

     ^b 与杂种对照相比

    实施例8

    AsnS1、AsnS2、AsnS3和AsnS4同工型的细菌表达载体、纯化以及动力学

    该实施例描述了将AsnS1(SEQ ID NO：1)、AsnS2(SEQ ID NO：3)、AsnS3(SEQ ID NO：5)和AsnS4(SEQ ID NO：50)的核苷酸序列克隆到大肠杆菌表达载体中，以及这四种AsnS同工型的重组形式的表达、纯化和动力学。

    使用公开的玉米基因序列(Chevalier等人，1996；gi984262))进行生物信息学检索，在专有内部cDNA集合中确定了四种全长cDNA序列，确定它们与公开的AsnS基因具有显著的序列相似性。与公开的AsnS序列具有序列同一性的两种全长cDNA命名为Zm‑AsnS1和Zm‑AsnS3。其它两种基因分别命名为Zm‑AsnS2和Zm‑AsnS4(SEQ IDNO：50)。Zm‑AsnS1、Zm‑AsnS2和Zm‑AsnS3序列向植物表达载体中的克隆已在上述实施例2和3中有所描述。如下所述将这三种基因和Zm‑AsnS4克隆到细菌表达载体中：

    Zm‑AsnS1、Zm‑AsnS3和AsnS4的全长编码序列分别从专有内部cDNA集合中的cDNA克隆700151670_FLI、LIB5399‑001‑A2和LibLIB3732‑039‑F9_FLI通过聚合酶链反应(PCR)扩增得到。编码Zm‑AsnS1的PCR扩增片段的正向和反向引物序列为：

    Zm‑AsnS1_for1 5’‑ggaattccatATGTGTGGCATCTTAGC‑3’(SEQID NO：52)和

    Zm‑AsnS1_rev1

    5’‑ataagaatgcggccgcGACCGCGATCGCGACTGCGACA‑3’(SEQ IDNO：53)

    用于Zm‑AsnS3 PCR扩增的正向和反向引物序列为：

    Zm‑AsnS3_for2 5’‑ctagctagctagATGTGCGGCATCCTC‑3’(SEQID NO：54)和

    Zm‑AsnS3_rev2

    5’‑ccgctcgagGACAGCTGTGGCTGAAGCAACG‑3’(SEQ ID NO：55)

    编码全长AsnS4的PCR扩增片段(SEQ ID NO：50)是通过下述引物对得到的：

    Zm‑AsnS4_for3 5’‑gggaattccatATGTGTGGCATCTTAGC‑3’(S EQID NO：56)和

    Zm‑AsnS4_rev3

    5’‑ataagaatgcggccgcCACCGCGATCGCGACAGCGA‑3’(SEQ ID NO：57)

    Zm‑AsnS2的全长编码序列是从pMON79706(图1；SEQ ID NO：3)通过聚合酶链反应(PCR)进行扩增的。用于Zm‑AsnS2 PCR扩增的引物序列为：

    Zm‑AsnS2_for4 5’‑tatgtgcggcatacttgctgtgctcgggt‑3’(SEQ ID NO：58)和

    Zm‑AsnS2_rev4 5’‑gctatccctcgatggcaacgccagat‑3’(SEQ ID NO：59)

    PCR在总体积50μl中进行，使用Expand^TM高保真度PCR试剂盒(Boehringer Mannheim，德国)。使用PTC‑200Peltier热循环仪(MJResearch Inc.，Watertown，Massachusetts)在下述条件下进行反应：

    起始温育：

    95℃5分钟

    27个下述循环：

    95℃1分钟

    56℃退火1分钟

    然后进行：

    72℃延伸2分钟

    72℃温育10分钟。

    将产生的PCR片段亚克隆到pET30a(+)或pET21d(+)(Novagen，San Diego，CA)之一中，得到质粒pET30a‑Zm‑AsnS1、pET30a‑ZmAsnS2、pET30a‑Zm‑AsnS3和pET21d‑Zm‑AsnS4。通过DNA序列分析确定质粒序列。这些载体预期能够产生带有C末端组氨酸标签的重组蛋白质。

    使用上一段中描述的大肠杆菌表达载体转化Rosetta DE5^TM大肠杆菌细胞(Novagen)。从固体LB培养基平板中转移出转化的细胞，并在包含标准浓度的卡那霉素(50μM)和氯霉素(25μM)的液体LB培养基中在37℃下生长。过夜培养液用于接种25mL培养液，其在37℃下生长直到对数中期(OD₆₀₀＝0.4‑0.6)。然后将细胞转移到20℃30分钟，之后添加IPTG至终浓度为0.5mM。然后细胞在20℃下生长12小时，通过离心收集细胞沉淀物。

    蛋白质从不溶性的部分中回收，同时与镍柱结合。用于纯化重组AsnS的缓冲液为：

    缓冲液A：100mM Hepes‑OH，pH＝7.6，0.1mM EDTA，10mMMgCl₂，2mM天冬氨酸，0.5mM DTT，20％(v/v)甘油，0.1mM ATP，1％(v/v)蛋白酶抑制剂混合物(Sigma产品号P9599)，25mM KCl。

    缓冲液B：(缓冲液A+6M盐酸胍)

    缓冲液C：(缓冲液A+6M尿素)

    缓冲液D：(缓冲液A+4M尿素)

    缓冲液E：(缓冲液A+2M尿素)

    缓冲液F：(缓冲液A+1M尿素)

    缓冲液G：(缓冲液A+500mM咪唑)

    除非特别说明，所有的纯化步骤都在4℃下进行。将大肠杆菌沉淀物溶于缓冲液A，以16,000PSI通过弗氏细胞压碎器3次。然后在75,000xg下离心样品至少1小时。在液氮中冷冻沉淀物(包涵体)，然后在‑80℃下储存直到使用。

    对纯化过程中已经在镍柱上重折叠的含有his标签的植物AsnS形式进行植物AsnS酶的所有常规动力学测量。如上所述在200mL LB培养基中表达AsnS形式之一的细菌产生的大肠杆菌沉淀物作为起始物使用。使用Pierce Pro‑Matrix^TM蛋白质重折叠指导(Thermo FisherScientific，Rockford，IL，产品号89867；附录A)中描述的方法分离包涵体，然后使用Pierce Pro‑Matrix^TM蛋白质重折叠指导(产品号89867；附录B)方案进行溶解，唯一不同的是使用缓冲液B代替6‑8M GdnHCl，50mM Tris。然后将溶解的样品以1mL/min的流速加样到使用缓冲液B预平衡的3‑5mL镍NTA琼脂糖(Qiagen)柱上。然后以1mL/min的流速使用至少两倍柱床体积的缓冲液B、C、D和E和F连续洗涤柱子。然后使用缓冲液A洗涤柱子直到柱子洗脱液的OD₂₈₀小于0.05。整个洗涤过程在1‑2小时内完成。然后使用缓冲液G以1mL/min的流速洗脱蛋白质。收集2mL组分，并合并具有最高蛋白质量的三个组分，在液氮中冷冻并储存在‑80℃下直到如实施例6所述进行分析为止。滴定每种底物(ATP、谷氨酰胺、NH₄⁺和天冬氨酸)的水平来确定各自的K_m and V_max值。对于每种底物和一些酶，测量的动力学参数为K_m(Asp)、K_m(Gln)、K_m(NH₄⁺)和V_max。结果报告于表9中。

    所有四种基因都编码能够产生具有AsnS活性的多肽的序列。AsnS1、AsnS2和AsnS3看起来在动力学上是显著不同的，因为AsnS2的K_m(Gln)比其它酶低几倍；AsnS1的V_max比其它酶低几倍。

    表9.玉米天冬酰胺合成酶的动力学对比

       V_max  μu/mg  K_m(Gln)  μM  K_m(Asp)  μM  K_m(ATP)  μM  K_m(NH₄⁺)  μM

       Zm AsnS1  170  543  980  110  9900  Zm AsnS2  850  110  910  125  750  Zm AsnS3  350  423  1200  97  8400  Zm AsnS4  310  233  930  128  9000

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    所有的出版物、专利和专利申请在此引入作为参考，就好像每个出版物或专利申请都被特定地和单独地引入作为参考。

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