一种多功能微生物肥料及其制备方法 【技术领域】
本技术方案涉及一种多功能微生物肥料及其制备方法，特别是涉及一种含有多种有益微生物作为有效成分，并添加一定量营养元素的多功能微生物肥料及其制备方法，所述多功能微生物肥料具有促进作物生长、缓解盐胁迫及防治土传立枯病等多种用途，属于微生物技术领域。
背景技术
目前，由于我国农业生产中大量使用化学肥料和化学农药，给农业生产和人类生存环境带来的危害日趋严重。我国目前单位面积化肥用量处于世界前列，并仍有增长的趋势。微生物肥料是将某些有益微生物经人工大量培养而制成的肥料，又称生物菌肥。微生物肥料无毒无害、不污染环境，可通过微生物的生命代谢活动，增加土壤中的氮素或有效磷、钾的含量，或调节作物激素物质水平，或抑制植物病原菌的活动，从而提高土壤肥力，改善作物营养条件和生长环境，提高作物产量。通过微生物肥料的使用可以部分替代或减少化学肥料和化学农药的使用量，从而有效缓解土壤生态环境的恶化。
因此，寻求使用高效微生物肥料，提高化肥利用率，降低化肥与化学农药的使用量，改善生态环境、实现无公害农产品生产与农业的可持续发展，是当今我国农业迫切而艰巨的任务。
目前，我国西北干旱半干旱地区，水资源匮乏，蒸发强烈，盐容易积累在耕作层，尤其是新疆大面积推广膜下滴灌栽培模式，土壤“次生盐渍化”日趋严重，此外，有些地区的土传病害非常严重，如立枯病、根腐病及青枯病等，尤其是幼苗，抗病性较差，在苗期最容易发生烂根病，导致缺苗断垄，严重影响作物的产量。因此，开发具有缓解盐胁迫、防病、促生等功能的微生物肥料具有重要的意义。近年来研究发现，土壤中存在一些植物根围促生菌(PGPR)具有增加盐胁迫条件下作物生长、增加光合速率和生物量、减少盐胁迫对作物造成的严重伤害，以及具有生防、促进作物生长发育的功能。
尽管目前已有一些微生物肥料，但大多是单一性的微生物肥料，如：固氮菌肥、磷细菌肥、钾细菌肥等。这些肥料单独使用时只能解决作物所需营养的单一方面，这样造成产品的用量大、成本高等问题，而且还存在一些有效活菌数不达标及产品应用效果不稳定等质量问题。此外，现有的微生物肥料大都是从营养配伍或添加防病因子的角度开发，很少有从缓解作物盐胁迫，提高作物抗盐性、抗病性等方面综合开发的微生物肥料。
为了解决土壤次生盐渍化、化肥使用超量、低效、耕地质量逐年下降及苗期病害严重等突出问题，并以减少化肥及农药使用量、改善耕地质量、降低苗期病害及促进作物生长为主要目标，利用植物根围的多种有益菌株开发具有促生、防病、提高肥料利用率及帮助作物提高抗盐碱性等功效的多功能微生物肥料，已日益受到关注。
【发明内容】
本技术方案的目的是为了解决上述问题而提供一种多功能微生物肥料及其制备方法。以本技术方案筛选的有效微生物发酵液为主要成份，复合一定营养元素，制备得到一种新型多功能微生物肥料，使其具有对作物在次生盐渍化条件下解盐、促生和防病的功能，并可以很好地解决同类产品中菌株性能单一、产品性能单一及活菌数低等问题。
本技术方案的目的是通过下述技术方案实现的。
一种多功能微生物肥料，包括：以肥料总体质量为100％计：
微生物发酵液： 90～97％；
营养元素： 3～10％；
其中，所述的微生物发酵液的菌株选自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、克雷伯氏菌(Klebsiella Oxytoca)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、植生拉乌尔菌(Raoultella planticola)、假单胞菌(Pseudomonas putida)中的两种或者两种以上的复配，所述的微生物发酵液的体积比为：枯草芽孢杆菌：克雷伯氏菌：阴沟肠杆菌：植生拉乌尔菌：假单胞菌为2～6∶1～2∶0～2∶0～2∶0～2；所述微生物发酵液的有效活菌数＞1012cfu/ml为合格，根据土壤肥力及植物对营养的需求，所述的多功能微生物肥料中的营养元素包括但不限于硼(B)、锌(Zn)、铁(Fe)、钼(Mo)、锰(Mn)中的一种或一种以上的复配，加入质量占肥料总体质量为：硼1～3％，锌1～3％，铁0～1％，钼0～1％，锰1～2％，各营养元素的加入量为50～200mg/L，可以以硼酸、硫酸锌、硫酸亚铁、钼酸铵、硫酸锰的形式加入，在土壤总盐质量占土壤质量的0.3～0.8％条件下，以田间滴灌方式使用，使用量为200～1000g/亩。
一种多功能微生物肥料的制备方法包括如下步骤：
步骤一、采用高密度培养的方法制备所述微生物菌株，通过菌种——斜面活化——一级种子培养——二级种子培养——种子罐培养——发酵罐培养，得到微生物发酵液；
1.将低温、甘油保存的枯草芽孢杆菌、克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、植生拉乌尔菌、假单胞菌菌株，分别划线于NA营养琼脂培养基试管斜面上，在28～30℃培养箱中培养24h，得到供生产用的斜面菌种；
2.将1得到不同种斜面菌种分开培养，用接种环分别挑取所述斜面菌种单菌落，接种于装有SDAY培养基(萨氏葡萄糖培养基)的三角瓶中，进行摇瓶培养，一级种子培养基的装液量为三角瓶体积的20％，在28～30℃下180～200r/min振荡培养16～24h，得到所述发酵菌株的一级种子液；
3.将所述一级种子液分开培养，分别按照二级培养基3～5％(v/v)的接种量，接入装有二级种子培养基的三角瓶，二级种子培养基的装液量为三角瓶体积的20％，于30℃、180～200r/min振荡培养24h，得到所述发酵菌株的二级种子液；
4.将所述二级种子液分开培养，在25L搅拌式发酵罐内加入20L发酵培养基，0.10％(w/v)消泡剂，按5％接入二级种子液，在30℃下通气量5L/min，罐压80kPa，搅拌转速250r/min条件下培养，培养时间控制为24h，得到三级种子液；
5.将所述三级种子液分开培养，在250L搅拌式发酵罐内加入200L发酵培养基，0.10％(w/v)消泡剂，按10％接入三级种子液，在30℃下通气量10L/min，罐压80kPa，搅拌转速200r/min条件下，发酵30h，即可得到发酵物。
所述供生产用地斜面菌种在冰箱内保存最多不超过一周；二级种子液经显微镜观察菌形正常，无杂菌污染，培养液含活菌数≥109cfu/ml，方可作为合格的二级种子应用；其中所述的NA营养琼脂培养基为：牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，琼脂15g/L，pH 7.0；其中所述的SDAY培养基为：葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸膏10g/L，pH 7.0；其中所述的二级培养基为：葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸膏10g/L，pH 7.0；其中所述的发酵培养基为：豆饼粉10g/L，玉米粉10g/L，酵母粉5g/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，葡萄糖10g/L，氯化钠5g/L，碳酸钠2g/L，磷酸氢二钾2g/L；各培养基灭菌前调节pH为7.0～7.5，灭菌后pH为7.0，各培养基的灭菌条件为：0.10～0.15MPa，121℃蒸汽灭菌30min；三级种子发酵得到的发酵物用显微镜检查有10～30％的芽胞囊破裂后，便可放罐。
步骤二、取发酵好并且检验合格的微生物发酵液，按一定的体积比打入储液罐，混合均匀，再复配营养元素。称取适量的营养元素添加到混合好的发酵液中，搅拌使之溶解，将储液罐的菌液混合均匀后即制备得到本技术方案所述的一种多功能微生物肥料。
其中，所述微生物发酵液的有效活菌数＞1012cfu/ml为合格，所述的微生物发酵液的体积比为：枯草芽孢杆菌∶克雷伯氏菌∶阴沟肠杆菌∶植生拉乌尔菌∶假单胞菌为2～6∶1～2∶0～2∶0～2∶0～2，所述的营养元素包括但不限于硼(B)、锌(Zn)、铁(Fe)、钼(Mo)、锰(Mn)中的一种或一种以上的复配，加入质量占总体质量为：硼1～3％，锌1～3％，铁0～1％，钼0～1％，锰1～2％，各营养元素的加入量为50～200mg/L，可以以硼酸、硫酸锌、硫酸亚铁、钼酸铵、硫酸锰的形式加入。
有益效果
枯草芽孢杆菌、克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、植生拉乌尔菌、假单胞菌能够产生植物生长激素IAA(吲哚乙酸)、有机酸、嗜铁素等物质，并具有固氮、溶磷、解钾等功能，另外对立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、枯萎病菌(Fusariumoxysporum lycopersici)、腐霉病菌(Pythium aphanidermatum)等致病菌有良好的抑制作用，同时具有缓解作物对于盐胁迫的危害、提高作物对营养的吸收、促进作物生长等功效。本技术方案所述的多功能微生物肥料在次生盐渍化即土壤总盐质量占土壤质量的0.3～0.8％条件下，对作物的应用试验证明，膜下滴灌的施用量为200～1000g/亩，能够促进种子发芽、提高出苗率；对作物的致病菌，包括但不限于立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、枯萎病菌(Fusarium oxysporumlycopersici)、腐霉病菌(Pythium aphanidermatum)等有良好的抑制作用，可有效防治作物苗期由致病菌引起的病害，显著提高作物的产量。
【具体实施方式】
为了充分说明本技术方案的特性以及实施本技术方案的方式，下面给出实施例。
实施例1
采用如下培养的方法制备所述微生物菌株
通过菌种——斜面活化——一级种子培养——二级种子培养——种子罐培养——发酵罐培养，得到微生物发酵液；
1.将低温、甘油保存的枯草芽孢杆菌、克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、植生拉乌尔菌、假单胞菌菌株，分别划线于NA营养琼脂培养基试管斜面上，在28℃培养箱中培养24h，得到供生产用的斜面菌种；
其中所述的NA营养琼脂培养基为：牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，琼脂15g/L，pH 7.0，灭菌条件：0.15MPa，121℃蒸汽灭菌30min；
2.将所述各发酵菌株的斜面菌种分开单独培养，用接种环分别挑取所述斜面菌种单菌落，接种于装有50ml SDAY培养基的250ml三角瓶中，在28℃下180～200r/min分别振荡培养16h，得到所述各发酵菌株的一级种子液；
步骤2中所述的SDAY培养基为：葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，琼脂15g/L，酵母浸膏10g/L，pH 7.0，灭菌条件：0.15MPa，121℃蒸汽灭菌30min；
3.将所述各发酵菌株的一级种子液分开单独培养，分别按照接种量为5％接入200ml二级种子培养基的1000ml三角瓶，于30℃下200r/min振荡培养24h，得到所述各发酵菌株的二级种子液；
步骤3中所述的二级种子培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸膏10g/L，pH 7.0，灭菌条件：0.15MPa，121℃蒸汽灭菌30min；
4.将所述各发酵菌株的二级种子液分开单独培养，在25L搅拌式发酵罐内加入20L发酵培养基，0.10％(w/v)消泡剂，分别以1L的接种量接入二级种子液，在30℃下通气量5L/min，罐压80kPa，搅拌转速250r/min条件下培养，培养时间控制为24h，得到三级种子液；
5.将所述各发酵菌株的三级种子液分开单独培养，在250L搅拌式发酵罐内加入200L发酵培养基，0.10％(w/v)消泡剂，分别以20L的接种量接入三级种子液，在30℃下通气量10L/min、罐压80kPa、搅拌转速200r/min条件下，发酵30h，即可得到发酵物。
用显微镜检查有10～30％的芽胞囊破裂后，便可放罐，得到枯草芽孢杆菌发酵液的有效活菌数为1.5×1012cfu/ml、克雷伯氏菌发酵液的有效活菌数为4.3×1013cfu/ml、阴沟肠杆菌发酵液的有效活菌数为8.3×1013cfu/ml、植生拉乌尔菌发酵液的有效活菌数为9.5×1015cfu/ml、假单胞菌发酵液的有效活菌数为7.3×1012cfu/ml，均大于1012cfu/ml，达到合格。
步骤4、5中所述的发酵培养基为：豆饼粉10g/L，玉米粉10g/L，酵母粉5g/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，葡萄糖10g/L，氯化钠5g/L，碳酸钠2g/L，磷酸氢二钾2g/L；灭菌前调节pH为7.0～7.5，灭菌后pH为7.0；灭菌条件：0.15MPa，121℃蒸汽灭菌30min。
实施例2
取实施例1得到的枯草芽孢杆菌发酵液750L，克雷伯氏菌发酵液250L打入储液罐，混合均匀，再复配营养元素硼和锌，硼以硼酸的形式加入，锌以硫酸锌的形式加入，分别称取硼酸1kg和硫酸锌1kg添加到混合好的发酵液中，搅拌使之溶解，将储液罐的菌液混合均匀后即制备出本技术方案所述的多功能微生物肥料。
实施例3
取实施例1得到的枯草芽孢杆菌发酵液600L，克雷伯氏菌发酵液200L，阴沟肠杆菌发酵液200L打入储液罐，混合均匀，再复配营养元素硼、锌和钼，硼以硼酸的形式加入，锌以硫酸锌的形式加入，钼以钼酸铵的形式加入，分别称取硼酸1kg，硫酸锌1kg和钼酸铵1kg，添加到混合好的发酵液中，搅拌使之溶解，将储液罐的菌液混合均匀后即制备出本技术方案所述的多功能微生物肥料。
实施例4
取实施例1得到的枯草芽孢杆菌发酵液500L，克雷伯氏菌发酵液166L，阴沟肠杆菌发酵液167L和植生拉乌尔菌发酵液167L打入储液罐，混合均匀，再复配营养元素硼、锌、钼和锰，硼以硼酸的形式加入，锌以硫酸锌的形式加入，钼以钼酸铵的形式加入，锰以硫酸锰的形式加入，分别称取硼酸1kg，硫酸锌1kg，钼酸铵1kg和硫酸锰1kg添加到混合好的发酵液中，搅拌使之溶解，将储液罐的菌液混合均匀后即制备出本技术方案所述的多功能微生物肥料。
实施例5
取实施例1得到的枯草芽孢杆菌发酵液429L，克雷伯氏菌发酵液143L，阴沟肠杆菌发酵液143L，植生拉乌尔菌发酵液142.5L，假单胞菌发酵液142.5L打入储液罐，混合均匀，再复配营养元素硼、锌、钼、锰和铁，硼以硼酸的形式加入，锌以硫酸锌的形式加入，钼以钼酸铵的形式加入，锰以硫酸锰的形式加入，铁以硫酸亚铁的形式及加入，分别称取硼酸1kg，硫酸锌1kg，钼酸铵1kg，硫酸锰1kg和硫酸亚铁1kg添加到混合好的发酵液中，搅拌使之溶解，将储液罐的菌液混合均匀后即制备出本技术方案所述的多功能微生物肥料。
实施例6
取实施例1得到的枯草芽孢杆菌发酵液666.5L，克雷伯氏菌发酵液333.5L打入储液罐，混合均匀，再复配营养元素硼和锌，硼以硼酸的形式加入，锌以硫酸锌的形式加入，分别称取硼酸1kg和硫酸锌1kg添加到混合好的发酵液中，搅拌使之溶解，将储液罐的菌液混合均匀后即制备出本技术方案所述的多功能微生物肥料。
实施例7
取实施例1得到的枯草芽孢杆菌发酵液500L，克雷伯氏菌发酵液125L，阴沟肠杆菌发酵液125L，植生拉乌尔菌发酵液125L，假单胞菌发酵液125L打入储液罐，混合均匀，再复配营养元素硼和锌，硼以硼酸的形式加入，锌以硫酸锌的形式加入，分别称取硼酸1kg和硫酸锌1kg添加到混合好的发酵液中，搅拌使之溶解，将储液罐的菌液混合均匀后即制备出本技术方案所述的多功能微生物肥料。
实施例8
取实施例1得到的枯草芽孢杆菌发酵液500L，克雷伯氏菌发酵液125L，阴沟肠杆菌发酵液125L，植生拉乌尔菌发酵液125L，假单胞菌发酵液125L打入储液罐，混合均匀，再复配营养元素硼、锌、钼、锰和铁，硼以硼酸的形式加入，锌以硫酸锌的形式加入，钼以钼酸铵的形式加入，锰以硫酸锰的形式加入，铁以硫酸亚铁的形式及加入，分别称取硼酸1kg，硫酸锌1kg，钼酸铵1kg，硫酸锰1kg和硫酸亚铁1kg添加到混合好的发酵液中，搅拌使之溶解，将储液罐的菌液混合均匀后即制备出本技术方案所述的多功能微生物肥料。
实施例9
将本技术方案实施例2～实施例8制备的多功能微生物肥料产品，对棉花进行田间进行应用试验研究，棉花按常规方式播种5天后，将该产品经水稀释后，进行膜下滴灌到棉苗根部，对照是采用等量的水进行滴灌处理。出苗25天后，调查出苗率、发病率，并计算病情指数和防病效果。由表1结果可知，用本技术方案所述的多功能微生物肥料滴灌处理后，棉花出苗率和防病效果均有显著提高，且发病率明显降低。
表1 多功能微生物肥料对棉花出苗及苗期病害的作用
注：病害的分级标准：
0级根茎健全，须根无病斑。
1级根茎部有零星病斑，但不连片，须根上无病斑。
2级根茎部病斑连片，但小于根部周长的1/4，须根略有发病。
3级根茎部病斑大于根部周长的1/4，但小于1/2，须根病斑较多，但不成片。
4级根茎部病斑大于周长的1/2，但小于3/4，须根病斑成片，部分须根脱落。
5级根茎部均有病斑包围，根部腐烂，须根近无。
防效计算公式：
出苗率(％)＝(出苗数/播种数)×100
病情指数(％)＝(∑(各级发病数×发病级数)/调查总数×最高发病级数)×100
相对防效(％)＝(对照发病率-处理发病率)/对照发病率×100
为了考察多功能微生物肥料对棉花植物生物量的影响，出苗后调查了棉花叶干重、茎干重、根干重、株高、蕾数、单株叶面积及叶面积指数等指标，结果见表2。利用本技术方案所述的多功能微生物肥料滴灌处理后，棉花在根、茎、叶的干重，叶面积指数和蕾数等指标上都较常规对照有显著的提高。可见，多功能微生物肥料对棉花苗期生长具有显著的促进作用。
表2 多功能微生物肥料对棉花生物量的影响作用
为了考察多功能微生物肥料对棉花的增产的影响，对施用肥料的棉花采收后进行测产，结果表明，棉花植物的单株结铃数、单铃重、平均亩产都明显的增加。常规对照处理平均单株结铃5.6个，单铃重4.76克，平均亩产335公斤。多功能微生物肥料处理平均单株结铃5.8～6.7个，单铃重5.23～5.71克，平均亩产378～407公斤，增产率可达11.38～18.18％。
实施例10
将本技术方案实施例2～实施例8制备的多功能微生物肥料产品，对加工番茄进行田间应用试验研究，番茄种子按常规方式播种5天后，将该产品经水稀释后，进行膜下滴灌施用，对照组采用等量的水进行滴灌处理。种子出苗30天后，调查出苗率和发病情况；考察加工番茄种子的出苗率、平均株高、平均鲜重、平均干重、发病率等指标，计算病情指数和防病效果，由表3结果可知，多功能微生物肥料能提高番茄种子的出苗率，促进加工番茄苗期的生长，降低番茄苗期立枯丝核菌的发病率，具有促生和防病双重功能。另外，微生物肥料产品处理的棉花植株的平均株高，鲜重和干重均比对照有显著提高，防病性能也均表现良好，发病率和病情指数都显著降低。
表3 多功能微生物肥料对加工番茄出苗及苗期病害的作用
注：病害的分级标准和防效计算公式同表1注
为了考察多功能微生物肥料对番茄植物生物量的影响，70天后测鲜重、干重、株高、开花数及结果数，调查出苗率、发病率，结果见表4。番茄植株的鲜重，干重和株高均比对照显著提高，开花数和座果率也明显提高。可见，多功能微生物肥料对番茄生长具有显著的促进作用。
表4多功能微生物肥料对加工番茄苗期生物量的作用
多功能微生物肥料对加工番茄产量影响统计结果显示，常规对照组平均亩产5.34吨，多功能微生物肥料处理组平均亩产6.05～6.87吨，增产率为13.01～22.27％。
以上结果表明，多功能微生物肥料对加工番茄既有一定的防病效果，又有促生和增产效应。
本技术方案包括但不限于以上实施例，凡是在本技术方案的精神和原则之下进行的任何等同替换或局部改进，都将视为在本技术方案的保护范围之内。