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有机化合物
    本发明涉及作为新的 α 选择性的磷脂酰肌醇 (PI)3- 激酶抑制剂化合物的特定的 2- 氨甲酰环氨基脲衍生物、 它们的可药用盐、 其前药以及它们的制备方法。 本发明还涉及单 独或者与至少一种另外的治疗剂组合的这些化合物以及任选的可药用载体的组合物。 本发 明还涉及使用单独或者与至少一种另外的治疗剂组合的这些化合物来治疗多种疾病、 特别 是通过一种或多种生长因子、 受体酪氨酸激酶、 蛋白丝氨酸 / 苏氨酸激酶、 G 蛋白偶联受体 以及磷脂激酶和磷酸酶的异常活性所介导的那些疾病的方法。
     磷脂酰肌醇 3- 激酶 (PI3K) 包括脂激酶 (lipid kinases) 家族， 这些脂激酶可催 化磷酸基团转移到肌醇脂类的 D-3′位置上， 产生磷酸肌醇 -3- 磷酸 (PIP)、 磷酸肌醇 -3， 4- 二磷酸 (PIP2) 和磷酸肌醇 -3， 4， 5- 三磷酸 (PIP3)， 它们接着作为第二信使在信号级联 放大中通过使含有普列克底物蛋白 - 同源区、 FYVE、 Phox 和其它磷脂结合结构域的蛋白质 停靠在通常位于质膜的多种信号传导复合物中而发挥作用 ((Vanhaesebroeck 等人， Annu. Rev.Biochem70 ： 535(2001) ； Katso 等 人， Annu.Rev.Cell Dev.Biol.17 ： 615(2001))。 在 两种 1 类 PI3K 中， 1A 类 PI3K 是由与调节亚基 ( 它可以是 p85α、 p55α、 p50α、 p85β 或 p55γ 组成性结合的催化 p110 亚基 (α、 β、 δ 同工型 ) 所组成的异二聚体。1B 类亚类具 有一个家族成员 ： 由与两个调节亚基 p101 或 p84 其中之一结合的催化 p110γ 亚基所组成 的异二聚体 (Fruman 等人， Annu Rev.Biochem.67 ： 481(1998) ； Suire 等人， Curr.Biol.15 ： 566(2005))。 p85/55/50 亚基的模块结构域包括 Src 同源性 (SH2) 结构域， 它们可使特定的
     序列背景的磷酸酪氨酸残基结合在激活的受体和胞质酪氨酸激酶上， 引起 1A 类 PI3K 的激 活和定位。 1B 类 PI3K 直接被结合各种肽和非肽类配体的 G 蛋白偶联受体所激活 (Stephens 等人， Cell 89 ： 105(1997)) ； Katso 等人， Annu.Rev.Cell Dev.Biol.17 ： 615-675(2001))。 因此， I 类 PI3K 产生的磷脂产物使上游受体与下游的细胞活动联系起来， 所述的细胞活动 包括增殖、 存活、 趋化性、 细胞运输、 运动性、 代谢、 炎症和过敏反应、 转录和翻译 (Cantley 等 人， Cell 64 ： 281(1991) ； Escobedo 和 Williams， Nature 335 ： 85(1988) ； Fantl 等 人， Cell 69 ： 413(1992))。
     在许多情况中， PIP2 和 PIP3 将 Akt( 病毒癌基因 v-Akt 的人类同源物的产物 ) 募 集到质膜， 在那里它充当许多对生长和存活很重要的细胞内信号传导途径的节点 (Fantl 等人， Cell 69 ： 413-423(1992) ； Bader 等人， Nature Rev.Cancer 5 ： 921(2005) ； Vivanco 和 Sawyer， Nature Rev.Cancer 2 ： 489(2002))。PI3K 的异常调节通常通过 Akt 的激活来 增加存活， 这是人类癌症中最普遍的事件之一， 并且已经显示出可在多种水平上发生。肿 瘤抑制基因 PTEN 使磷酸肌醇在肌醇环的 3′位上脱磷酸， 从而拮抗 PI3K 活性， 而在多种肿 瘤中该基因 PTEN 在功能上缺失。在其它肿瘤中， p110α 同工型 PIK3CA 和 Akt 的基因被 扩增， 并且其基因产物的蛋白表达增加， 这已经在一些人类癌症中得到证实。而且， 用于向 上调节 p85-p110 复合物的 p85α 的突变和易位也已经在人类癌症中有描述。最后， 激活 下游信号传导途径的 PIK3CA 中的体细胞错义突变已经在各种人类癌症中非常频繁地被描 述过 (Kang 等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102 ： 802(2005) ； Samuels 等人， Science 304 ： 554(2004) ； Samuels 等人， Cancer Cell 7 ： 561-573(2005))。 这些观察表明， 磷酸肌醇 -3 激酶以及该信号传导途径的上游和下游组分的失控是与人类癌症和增殖性疾病有关的最常 见的失控之一 (Parsons 等人， Nature 436 ： 792(2005) ； Hennessey 等人， Nature Rev.Drug Disc.4 ： 988-1004(2005))。
     根据上文， PI3Kα 抑制剂将在治疗增殖性疾病和其它病症中具有特殊价值。
     WO2004/096797 公开了作为 PI3Kγ 抑制剂的某些噻唑类衍生物及其药物用途， 特 别是用于治疗炎症和过敏病症。
     WO 2005/021519 也公开了作为 PI3Kγ 抑制剂的某些噻唑类衍生物及其药物用 途， 特别是用于治疗炎症和过敏病症。
     WO 2006/051270 也公开了作为 PI3Kα 抑制剂的某些噻唑类衍生物及其药物用 途， 特别是由于其抗肿瘤活性。
     WO 2007/129044 也公开了作为 PI3Kα 抑制剂的某些噻唑类衍生物及其药物用 途， 特别是由于其抗肿瘤活性。
     根据现有技术， 需要提供更多适合于治疗增殖性疾病的化合物， 特别是提供具有 增强的选择性和 / 或较高的 / 增强的活性的化合物。
     目前已经发现， 下文给出的式 (I) 的 2- 氨甲酰环氨基脲衍生物具有有利的药理性 质且抑制例如 PI3K( 磷脂酰肌醇 3- 激酶 )。具体而言， 这些化合物优选地相对于 β 和 / 或 δ 和 / 或 γ 亚型而言对于 PI3Kα 显示出增强的选择性。因此， 式 I 化合物适合例如用于 治疗依赖 PI3 激酶 ( 尤其是 PI3Kα， 例如那些显示 PI3Kα 的过表达或扩增、 PIK3CA 的体细 胞突变或 PTEN 的种系突变或体细胞突变或导致上调 p85-p110 复合物的 p85α 的突变和易 位的激酶 ) 的疾病， 特别是增殖性疾病， 例如肿瘤疾病和白血病。 此外， 这些化合物优选地显示增强的代谢稳定性， 并因此降低了清除率， 得到改善 的药代动力学特性。
     在第一方面， 本发明提供了式 (I) 化合物
     或其盐， 其中
     A 代表杂芳基 ；
     R1 代表 (1) 任选被取代的烷基 ； (2) 任选被取代的环烷基 ； (3) 任选被取代的芳基 ； (4) 任选被取代的胺 ； (5) 任选被取代的磺酰基 ； (6) 卤素 ； 2 1
     R 代表氢、 氘或如 R 所定义的取代基 ； 3
     R 代表氢、 卤素、 任选被取代的烷基 ；
     (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-( 叔丁基 )- 嘧啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻 唑 -2- 基 }- 酰胺 ) 除外。
     本发明可以通过参考以下描述、 包括以下术语汇编和总结性实例而被更完全地理 解。为了简短， 本说明书中引用的出版物的公开内容引入本文作为参考。如本文所用的术 语 “包括” 、 “含有” 和 “包含” 以其开放的非限制性的意义而在本文中使用。
     本文所给的任意式意欲代表具有结构式所描述的结构的化合物以及某些变体或 形式。 特别是本文所给的任意式的化合物可以具有不对称中心并因此以不同的对映异构形 式存在。如果式 (I) 化合物中存在至少一个不对称碳原子， 则这类化合物可以以旋光活性 形式或以旋光异构体混合物的形式、 例如以外消旋混合物的形式存在。所有旋光异构体及 其混合物、 包括外消旋混合物是本发明的一部分。 因此， 本文所给的任意所给式意欲代表外 消旋物、 一种或多种对映异构形式、 一种或多种非对映异构形式、 一种或多种阻转异构体形 式及其混合物。而且， 某些结构还可以作为几何异构体 ( 即顺式和反式异构体 )、 互变异构 体或阻转异构体而存在。
     本文所给的任意式意欲代表这类化合物的水合物、 溶剂合物和多晶型物及其混合 物。
     本文所给的任意式还意欲代表化合物的未标记的形式以及同位素标记的形式。 除 了一个或多个原子被具有所选原子质量或质量数的原子所代替外， 同位素标记的化合物具 有本文所给的式所描述的结构。可以掺入本发明的化合物中的同位素的实例包括氢、 碳、 2 3 11 13 14 15 18 31 32 35 36 125 氮、 氧、 磷、 氟和氯的同位素， 例如分别有 H、 H、 C、 C、 C、 N、 F、 P、 P、 S、 Cl、 I。本发13 明包含多种如本文所定义的同位素标记的化合物， 例如有放射性同位素如 3H、 C 和 14C 存在 的那些。这类同位素标记的化合物可用于代谢研究 ( 优选用 14C)、 反应动力学研究 ( 例如 2 3 用 H 或 H)、 检测或显像技术、 例如正电子发射断层摄影术 (PET) 或单光子发射计算体层摄 影术 (SPECT)、 包括药物或底物组织分布测定， 或者可用于放射治疗患者。特别是 18F 或标 记的化合物可以特别优选用于 PET 或 SPECT 研究。通常可以通过进行在下文描述的流程图 或者实施例和制备中所公开的方法， 通过用容易得到的同位素标记的试剂取代非同位素标 记的试剂来制备同位素标记的本发明的化合物及其前药。
     此外， 被更重的同位素、 特别是氘 ( 即 2H 或 D) 所取代还可以获得由更高的代谢稳 定性引起的某些治疗益处， 例如延长体内半衰期或降低剂量要求或改善治疗指数。可以理 解， 上下文中的氘可被看作式 (I) 化合物的取代基。这类更重同位素、 特别是氘的浓度可以 由同位素富集因子来定义。如本文所用的术语 “同位素富集因子” 表示特定同位素的同位 素丰度和天然丰度之间的比值。如果本发明的化合物中的取代基标有氘， 则这类化合物具 有的对每个指定氘原子的同位素富集因子为至少 3500( 在每个指定氘原子处具有 52.5％ 氘掺入率 )、 至少 4000(60％氘掺入率 )、 至少 4500(67.5％氘掺入率 )、 至少 5000(75％氘掺 入率 )、 至少 5500(82.5％氘掺入率 )、 至少 6000(90％氘掺入率 )、 至少 6333.3(95％氘掺入 率 )、 至少 6466.7(97％氘掺入率 )、 至少 6600(99％氘掺入率 ) 或至少 6633.3(99.5％氘掺 入率 )。 在本发明的化合物中， 没有具体指定为特定同位素的任意原子意欲代表该原子的任 意稳定同位素。除非另有说明， 当位置被具体指定为 “H” 或 “氢” 时， 该位置可以理解为在 其天然丰度同位素组成上具有氢。因此， 在本发明的化合物中， 被具体指定为氘 (D) 的任意 原子意欲代表例如在以上所给范围内的氘。
     当参考本文所给的任意式时， 从可能种类的名单中为规定变量选择特定部分并不 表示用来定义在别处出现的变量的部分。 换言之， 当变量出现一次以上时， 从规定名单中选择种类不依赖于为该式中别处的相同变量选择的种类 ( 当实施方案中一个或多个直至所 有更一般的表述 ( 其特征为上文或下文所优选的 ) 可以被更具体的定义代替时， 由此分别 产生本发明的更优选的实施方案 )。
     当使用复数形式 ( 例如多种化合物、 盐 ) 时， 其包括单数 ( 例如一种化合物、 一种 盐 )。 “化合物” 不排除 ( 例如在药物制剂中 ) 存在一种以上的式 (I) 化合物 ( 或其盐 )。
     以下一般定义将适用于本说明书， 除非另有说明 ：
     卤素表示氟、 溴、 氯或碘， 特别是氟、 氯。卤素取代的基团和部分， 例如被卤素取代 的烷基 ( 卤代烷基 ) 可以被单、 多或全卤代。
     杂原子是除碳和氢外的原子， 优选氮 (N)、 氧 (O) 或硫 (S)， 特别是氮。
     含碳的基团、 部分或分子含有 1 至 7 个、 优选 1 至 6 个、 更优选 1 至 4 个、 最优选 1 或 2 个碳原子。具有 1 个以上碳原子的任意非环状含碳的基团或部分是直链或支链的。
     前缀 “低级” 或 “C1-C7” 表示具有最多且包括 7 个、 尤其是最多且包括 4 个碳原子 的基团， 所述基团是直链或者具有一个或多个分支的支链。
     “烷基” 指直链或支链烷基， 优选代表直链或支链 C1-12 烷基， 特别优选代表直链或 支链 C1-7 烷基 ； 例如甲基、 乙基、 正或异丙基、 正、 异、 仲或叔丁基、 正戊基、 正己基、 正庚基、 正辛基、 正壬基、 正癸基、 正十一烷基、 正十二烷基， 特别优选甲基、 乙基、 正丙基、 异丙基以 及正丁基和异丁基。烷基可以是未取代的或取代的。示例性取代基包括但不限于氘、 羟基、 烷氧基、 卤素和氨基。取代的烷基的实例有三氟甲基。环烷基也可以是烷基的取代基。这 类情况的实例有部分 ( 烷基 )- 环丙基或亚烷基 - 环丙基， 如 -CH2- 环丙基。C1-C7- 烷基优 选是具有从 1 且包括 1 至 7 且包括 7、 优选从 1 且包括 1 至 4 且包括 4 的烷基， 并且是直链 或支链 ； 优选低级烷基是丁基如正丁基、 仲丁基、 异丁基、 叔丁基、 丙基如正丙基或异丙基、 乙基或者优选甲基。
     其它基团如 “烷氧基” 、 “烷氧基烷基” 、 “烷氧基羰基” 、 “烷氧基 - 羰基烷基” 、 “烷基 磺酰基” 、 “烷基磺酰基 (alkylsulfoxyl)” 、 “烷基氨基” 、 “卤代烷基” 中的每个烷基部分将具 有以上提到的 “烷基” 定义中描述的相同含义。
     “亚烷基” 指通过两个不同碳原子与部分结合的直链或支链亚烷基， 它优选代表直 链或支链 C1-12 亚烷基， 特别优选代表直链或支链 C1-6 亚烷基 ； 例如亚甲基 (-CH2-)、 1， 2- 亚 乙基 (-CH2-CH2-)、 1， 1- 亚乙基 ((-CH(CH3)-)、 1， 1-， 1， 2-， 1， 3- 亚丙基和 1， 1-， 1， 2-， 1， 3-， 1， 4- 亚丁基， 特别优选亚甲基、 1， 1- 亚乙基、 1， 2- 亚乙基、 1， 3- 亚丙基、 1， 4- 亚丁基。
     “亚链烯基” 指通过两个不同碳原子与分子结合的直链或支链亚链烯基， 它优选 代表直链或支链 C2-6 亚烷基 ； 例如 -CH ＝ CH-、 -CH ＝ C(CH3)-、 -CH ＝ CH-CH2-、 -C(CH3) ＝ CH-CH2-、 -CH ＝ C(CH3)-CH2-、 -CH ＝ CH-C(CH3)H-、 -CH ＝ CH-CH ＝ CH-、 -C(CH3) ＝ CH-CH ＝ CH-、 -CH ＝ C(CH3)-CH ＝ CH-， 特别优选 -CH ＝ CH-CH2-、 -CH ＝ CH-CH ＝ CH-。亚链烯基可 以是取代的或未取代的。
     “环烷基” 指饱和或部分饱和的单环、 稠合多环或螺多环碳环， 每个碳环具有 3 至 12 个环原子。环烷基的说明性实例包括以下部分 ： 环丙基、 环丁基、 环戊基和环己基。环 烷基可以是未取代的或取代的 ； 示例性取代基在对烷基的定义中提供， 且还包括烷基自身 ( 如甲基 )。例如 -(CH3) 环丙基的基团被认为是被取代的环烷基。
     “芳基” 指具有 6 个或更多个碳原子的芳香族同素环系统 ( 即仅有碳作为成环原子 )， 芳基优选是具有 6 至 14 个环碳原子、 更优选具有 6 至 10 个环碳原子的芳香族部分， 例如苯基或萘基， 优选苯基。芳基可以是未取代的或者被一个或多个、 优选最多三个、 更 优选最多两个取代基所取代， 所述的取代基独立地选自 ： 如下描述的未取代的或取代的杂 环基， 尤其是吡咯烷基如吡咯烷子基、 氧代吡咯烷基如氧代 - 吡咯烷子基、 C 1-C7- 烷基 - 吡 咯烷基、 2， 5- 二 -(C1-C7 烷基 ) 吡咯烷基如 2， 5- 二 -(C1-C7 烷基 )- 吡咯烷子基、 四氢呋 喃基、 噻吩基、 C1-C7- 烷基吡唑烷基、 吡啶基、 C1-C7- 烷基哌啶基、 哌啶子基、 被氨基或者 N- 单 - 或 N， N- 二 -[ 低级烷基、 苯基、 C1-C7- 烷酰基和 / 或苯基 - 低级烷基 )- 氨基所取代 的哌啶子基、 未取代的或 N- 低级烷基取代的通过环碳原子结合的哌啶基、 哌嗪子基、 低级 烷基哌嗪子基、 吗啉代基、 硫代吗啉代基、 S- 氧代 - 硫代吗啉代基或 S， S- 二氧代硫代吗啉 代基 ； C1-C7- 烷基、 氨基 -C1-C7- 烷基、 N-C1-C7- 烷酰基氨基 -C1-C7- 烷基、 N-C1-C7- 烷基磺 酰基 - 氨基 -C1-C7- 烷基、 氨甲酰基 -C1-C7- 烷基、 [N- 单 - 或 N， N- 二 -(C1-C7- 烷基 )- 氨 甲酰基 ]-C1-C7- 烷基、 C1-C7- 烷基亚磺酰基 -C1-C7- 烷基、 C1-C7- 烷基磺酰基 -C1-C7- 烷基、 苯基、 萘基、 单至三 -[C1-C7- 烷基、 卤素和 / 或氰基 ]- 苯基或单至三 -[C1-C7- 烷基、 卤素 和 / 或氰基 ]- 萘基 ； C3-C8- 环烷基、 单至三 -[C1-C7- 烷基和 / 或羟基 ]-C3-C8- 环烷基 ； 卤 素、 羟基、 低级烷氧基、 低级烷氧基 - 低级烷氧基、 ( 低级 - 烷氧基 )- 低级烷氧基 - 低级烷 氧基、 卤代 -C1-C7- 烷氧基、 苯氧基、 萘氧基、 苯基 - 或萘基 - 低级烷氧基 ； 氨基 -C1-C7- 烷 氧基、 低级烷酰基氧基、 苯甲酰基氧基、 萘甲酰基氧基、 甲酰基 (CHO)、 氨基、 N- 单 - 或 N， N- 二 -(C1-C7- 烷基 )- 氨基、 C1-C7- 烷酰基氨基、 C1-C7- 烷基磺酰基氨基、 羧基、 低级烷氧基羰 基， 例如 ； 苯基 - 或萘基 - 低级烷氧基羰基， 例如苄基氧基羰基 ； C1-C7- 烷酰基如乙酰基、 苯 甲酰基、 萘甲酰基、 氨甲酰基、 N- 单 - 或 N， N- 二取代的氨甲酰基如 N- 单 - 或 N， N- 二 - 取代 的氨甲酰基， 其中取代基选自低级烷基、 ( 低级 - 烷氧基 )- 低级烷基和羟基 - 低级烷基 ； 脒 基、 胍基、 脲基、 巯基、 低级烷硫基、 苯基 - 或萘基硫基、 苯基 - 或萘基 - 低级烷硫基、 低级烷 基 - 苯硫基、 低级烷基 - 萘基硫基、 卤素 - 低级烷基巯基、 磺基 (-SO3H)、 低级烷基磺酰基、 苯 基 - 或萘基 - 磺酰基、 苯基 - 或萘基 - 低级烷基磺酰基、 烷基苯基磺酰基、 卤素 - 低级烷基磺 酰基如三氟甲磺酰基 ； 磺酰氨基 (sulfonamido)、 苯磺酰氨基、 叠氮基、 叠氮基 -C1-C7- 烷基、 尤其是叠氮基甲基、 C1-C7- 烷基磺酰基、 氨磺酰基、 N- 单 - 或 N， N- 二 -(C1-C7- 烷基 )- 氨磺 酰基、 吗啉代基磺酰基、 硫代吗啉代基磺酰基、 氰基和硝基 ； 其中作为取代基或作为取代的 烷基 ( 或者还有本文提到的取代的芳基、 杂环基等 ) 的取代基的一部分的以上提到的苯基 或萘基 ( 和在苯氧基或萘氧基中的 ) 各自本身是未取代的或者被一个或多个、 例如最多三 个、 优选 1 或 2 个取代基所取代， 所述取代基独立地选自卤素、 卤代 - 低级烷基如三氟甲基、 羟基、 低级烷氧基、 叠氮基、 氨基、 N- 单 - 或 N， N- 二 -( 低级烷基和 / 或 C1-C7- 烷酰基 )- 氨 基、 硝基、 羧基、 低级烷氧基羰基、 氨甲酰基、 氰基和 / 或氨磺酰基。
     “杂环基” 指如下定义的杂环基团 ： 其为不饱和的 ( ＝环中带有最高可能数目的共 轭双键 )、 饱和或部分饱和的并且优选是单环或者在本发明的更广泛方面是二环、 三环或螺 环； 并且具有 3 至 24 个、 更优选 4 至 16 个、 最优选 5 至 10 个且最优选 5 或 6 个环原子 ； 其中 一个或多个、 优选 1 至 4 个、 尤其是 1 或 2 个环原子是杂原子 ( 因此剩余环原子是碳 )。 键合 环 ( 即与分子连接的环 ) 优选具有 4 至 12 个、 尤其是 5 至 7 个环原子。术语杂环基还包括 杂芳基。 杂环基团 ( 杂环基 ) 可以是未取代的或者被一个或多个、 尤其是 1 至 3 个取代基所 取代， 所述的取代基独立地选自以上对取代的烷基所定义的取代基和 / 或选自一个或多个以下取代基 ： 氧代 ( ＝ O)、 硫代羰基 ( ＝ S)、 亚氨基 ( ＝ NH)、 亚氨基 - 低级烷基。 此外， 杂环 基尤其是选自如下的杂环基 ： 氧杂环丙烷基、 氮杂环丙烯基、 吖丙啶基、 1， 2- 氧杂硫杂环戊 烷基、 噻吩基、 呋喃基、 四氢呋喃基、 吡喃基、 噻喃基、 噻蒽基、 异苯并呋喃基、 苯并呋喃基、 色 烯基、 2H- 吡咯基、 吡咯基、 吡咯啉基、 吡咯烷基、 咪唑基、 咪唑烷基、 苯并咪唑基、 吡唑基、 吡 嗪基、 吡唑烷基、 噻唑基、 异噻唑基、 二噻唑基、 唑基、 异 唑基、 吡啶基、 吡嗪基、 嘧啶基、 哌啶基、 哌嗪基、 哒嗪基、 吗啉基、 硫代吗啉基、 (S- 氧代或 S， S- 二氧代 )- 硫代吗啉基、 吲嗪 基、 氮杂环庚基、 二氮杂环庚基、 尤其是 1， 4- 二氮杂环庚基、 异吲哚基、 3H- 吲哚基、 吲哚基、 苯并咪唑基、 香豆基 (cumaryl)、 吲唑基、 三唑基、 四唑基、 嘌呤基、 4H- 喹嗪基、 异喹啉基、 喹 啉基、 四氢喹啉基、 四氢异喹啉基、 十氢喹啉基、 八氢异喹啉基、 苯并呋喃基、 二苯并呋喃基、 苯并噻吩基、 二苯并噻吩基、 酞嗪基、 萘啶基、 喹喔啉基、 喹唑啉基、 喹唑啉基、 噌啉基、 蝶啶 菲咯啉基、 呋咱基、 吩嗪基、 吩噻嗪基、 吩 基、 咔唑基、 β- 咔啉基、 菲啶基、 吖啶基、 啶基、 嗪基、 色烯基、 异苯并二氢吡喃基、 苯并二氢吡喃基、 苯并 [1， 3] 二氧杂环戊烯 -5- 基和 2， 3- 二氢 - 苯并 [1， 4] 二 烯 -6- 基， 这些基团各自是未取代的或者被一个或多个、 优选 最多三个取代基所取代， 所述的取代基选自以上对取代的芳基提到的那些和 / 或选自一个 或多个以下取代基 ： 氧代 ( ＝ O)、 硫代羰基 ( ＝ S)、 亚氨基 ( ＝ NH)、 亚氨基 - 低级烷基。 “芳基烷基” 指通过烷基如甲基或乙基与分子结合的芳基， 优选苯乙基或苄基， 特 别是苄基。类似地， 环烷基烷基和杂环基烷基代表通过烷基与分子结合的环烷基或者通过 烷基与分子结合的杂环基。在每种情况中， 芳基、 杂环基、 环烷基和烷基可以如上定义的那 样被取代。
     “治疗” 包括预防性 ( 防护性 ) 和治疗性治疗以及延缓疾病或紊乱的进展。
     “PI3 激酶介导的疾病” ( 尤其是 PI3Kα 介导的疾病或者由 PI3Kα 的过表达或扩 增、 PIK3CA 的体细胞突变或 PTEN 的种系突变或体细胞突变或用于正调节 p85-p110 复合物 的 p85α 的突变和易位的激酶所介导的疾病 ) 尤其是以有益的方式 ( 例如改善一种或多种 症状、 延缓疾病发作、 直至暂时或完全治愈疾病 ) 对抑制 PI3 激酶、 尤其是抑制 PI3Kα 或其 突变形式有响应的这类病症 ( 其中在所治疗的疾病中， 增殖性疾病例如肿瘤疾病和白血病 是尤其被提到的 )。
     “盐” ( 其以 “或其盐” 表示 ) 可以单独或与游离式 (I) 化合物混合存在， 并且优选 是可药用盐。这类盐例如作为酸加成盐、 优选与有机或无机酸从含有碱性氮原子的式 (I) 化合物而形成， 尤其是可药用盐。适宜的无机酸例如有氢卤酸如盐酸、 硫酸或磷酸。适宜的 有机酸例如有羧酸或磺酸， 如富马酸或甲磺酸。 为了分离或纯化的目的， 还可能使用不可药 用的盐， 例如苦味酸盐或高氯酸盐。对于治疗用途， 仅采用可药用盐或游离化合物 ( 其中可 以以药物制剂的形式应用 )， 因此优选这些盐。 由于游离形式的新化合物以及其盐形式 ( 包 括例如在新化合物的纯化或鉴定中可以用作中间体的那些盐 ) 之间的密切关系， 因此上下 文中涉及游离化合物的地方可以适当和有利地理解为还指相应的盐。式 (I) 化合物的盐优 选是可药用的盐 ； 形成可药用盐的合适的抗衡离子是本领域已知的。
     “组合” 是指一种剂量单位形式的固定组合， 或者用于组合施用的成套药盒， 其中 式 (I) 化合物和组合伙伴 ( 例如如下解释的其它药物， 还称为 “治疗剂” 或 “共用物质” )可 以同时独立施用或在时间间隔内分别施用， 尤其是当这些时间间隔使组合伙伴显示出协作
     作用、 例如协同作用时。如本文所用的术语 “共同施用” 或 “组合施用” 等意欲囊括将所选 的组合伙伴施用于需要其的单个个体 ( 例如患者 )， 并且意欲包括其中物质不必通过相同 施用途径或同时施用的治疗方案。如本文所用的术语 “药物组合产品” 表示将一种以上活 性成分混合或组合所得到的产品， 并且既包括活性成分的固定组合也包括非固定组合。术 语 “固定组合” 表示活性成分如式 I 化合物和组合伙伴以单一实体或剂量的形式同时施用 于患者。术语 “非固定组合” 表示活性成分如式 I 化合物和组合伙伴均作为单独实体同时、 共同或无特定时间限制地先后施用于患者， 其中该施用在患者体内提供了两种化合物的治 疗有效水平。后者还适用于鸡尾酒疗法， 例如施用 3 种或更多种活性成分。
     在优选的实施方案 ( 其独立地、 共同地或以任意组合或亚组合进行优选 ) 中， 本发 明涉及游离碱形式或酸加成盐形式的式 I 化合物， 其中取代基如本文所定义。
     在一项有利的实施方案中， 本发明涉及式 IA 化合物
     其中， 取代基如式 (I) 化合物所定义。 在另一项有利的实施方案中， 本发明涉及式 IB 化合物其中， 取代基如式 (I) 化合物所定义。
     因此， 式 (I) 化合物还包括式 (IA) 和 (IB) 化合物。在本发明的全文中， 以下定义 也都适用。
     A 优选地代表具有一个或两个氮原子和 5-10 个成环原子的杂芳基。
     A 特别优选地代表选自以下基团的杂芳基 ：
     A 非常特别优选地代表选自以下基团的杂芳基 ：
     A 最优选代表选自以下基团的杂芳基 ：R1 优选地代表以下取代基之一 ：
     (1) 未取代或取代的， 优选取代的 C1-C7- 烷基， 其中所述取代基独立地选自一个或 多个， 优选一至九个以下基团 ： 氘、 卤素、 氰基、 C3-C12- 环烷基、 C1-C7- 烷基氨基、 二 (C1-C7- 烷 基 ) 氨基、 C1-C7- 烷基氨基羰基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基羰基、 C1-C7- 烷氧基、 苯基 ( 其是 未取代的或者被一个或多个， 优选一个 C1-C7- 烷基、 C1-C7- 烷氧基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨 苯氧基 ( 其是未取代的或者被一个或多个， 优选一个 C1-C7- 烷基、 基 -C1-C7- 烷氧基取代 )、 C1-C7- 烷氧基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基 -C1-C7- 烷氧基 ) ；
     (2) 未取代或取代的 C3-C12- 环烷基， 其中所述取代基独立地选自一个或多个， 优 选一至四个以下基团 ： 氘、 卤素、 氰基、 C1-C7- 烷基、 C1-C7- 烷基氨基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨 基、 氨基羰基、 C1-C7- 烷基氨基羰基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基羰基、 C1-C7- 烷氧基、 苯基 ( 其 是未取代的或者被一个或多个， 优选一个 C1-C7- 烷基、 C1-C7- 烷氧基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨 基 -C1-C7- 烷氧基 )、 苯氧基 ( 其是未取代的或者被一个或多个， 优选一个 C1-C7- 烷基、 C1-C7- 烷氧基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基 -C1-C7- 烷氧基 ) ；
     (3) 未取代或取代的苯基， 其中所述取代基独立地选自一个或多个， 优选一至两个 以下基团 ： 氘、 卤素、 氰基、 C1-C7- 烷基、 C1-C7- 烷基氨基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基、 C1-C7- 烷基 氨基羰基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基羰基、 C1-C7- 烷氧基 ；
     (4) 未取代的、 单 - 或二取代的胺 ； 其中所述取代基独立地选自以下基团 ： 氘、 C1-C7- 烷基 ( 其是未取代的或被一个或多个选自氘、 氟、 氯、 羟基的基团取代 )、 C1-C7- 烷 基羰基、 苯基 ( 其是未取代的或被一个或多个， 优选一个 C1-C7- 烷基、 C1-C7- 烷氧基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基 -C1-C7- 烷氧基取代 )、 苯基磺酰基 ( 其是未取代的或被一个或多个， 优 选一个 C1-C7- 烷基、 C1-C7- 烷氧基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基 -C1-C7- 烷氧基取代 )，
     (5) 取代的磺酰基 ； 其中所述取代基选自以下基团 ： C1-C7- 烷基 ( 其是未取代的或 被一个或多个选自氘、 氟、 氯、 羟基的基团取代 )、 C1-C7- 烷基氨基 ( 其中烷基部分是未取代 的或被一个或多个选自氘、 氟、 氯、 羟基的基团取代 )、 二 -C1-C7- 烷基氨基 ( 其中烷基部分 是未取代的或被一个或多个选自氘、 氟、 氯、 羟基的基团取代 ) ；
     (6) 氟、 氯。 1
     R 特别优选地代表以下取代基之一 ：
     (1) 未取代或取代的， 优选取代的 C1-C7- 烷基， 其中所述取代基独立地选自一个或 多个， 优选一至九个以下基团 ： 氘、 氟， 或者一个或两个以下基团 ： C3-C5- 环烷基 ；
     (2) 任选被取代的 C3-C5- 环烷基， 其中所述取代基独立地选自一个或多个， 优选一 至四个以下基团 ： 氘、 C1-C4- 烷基 ( 优选甲基 )、 氟、 氰基、 氨基羰基 ；
     (3) 任选被取代的苯基， 其中所述取代基独立地选自一个或多个， 优选一至两个以 下基团 ： 氘、 卤素、 氰基、 C1-C7- 烷基、 C1-C7- 烷基氨基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基、 C1-C7- 烷基氨 基羰基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基羰基、 C1-C7- 烷氧基 ；
     (4) 任 选 的 单 - 或 二 取 代 的 胺 ； 其中所述取代基独立地选自以下基团 ： 氘、 C1-C7- 烷基 ( 其是未取代的或被一个或多个选自氘、 氟、 氯、 羟基的基团取代 )、 苯基磺酰基 ( 其是未取代的或被一个或多个， 优选一个 C1-C7- 烷基、 C1-C7- 烷氧基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨 基 -C1-C7- 烷氧基取代 )，
     (5) 取代的磺酰基 ； 其中所述取代基选自以下基团 ： C1-C7- 烷基 ( 其是未取代的 或被一个或多个选自氘、 氟的基团取代 )、 吡咯烷子基 ( 其是未取代的或被一个或多个选自 氘、 羟基、 氧代的基团取代 ； 特别是被一个氧代取代 )，
     (6) 氟、 氯。 1
     R 非常特别优选地代表 ：
     (1) 环丙基甲基， 或任选被取代的、 支链的 C3-C7- 烷基， 其中所述取代基独立地选 自一个或多个， 优选一至九个以下基团 ： 氘、 氟；
     (2) 任选被取代的环丙基或环丁基， 其中所述取代基独立地选自一个或多个， 优选 一至四个以下基团 ： 甲基、 氘、 氟、 氰基、 氨基羰基 ；
     (3) 任选被取代的苯基， 其中所述取代基独立地选自一个或多个， 优选一至两个以 下基团 ： 氘、 卤素、 氰基、 C1-C7- 烷基、 C1-C7- 烷基氨基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基、 C1-C7- 烷基氨 基羰基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基羰基、 C1-C7- 烷氧基 ；
     (4) 任 选 的 单 - 或 二 取 代 的 胺 ； 其中所述取代基独立地选自以下基团 ： 氘、 C1-C7- 烷基 ( 其是未取代的或被一个或多个选自氘、 氟、 氯、 羟基的基团取代 )、 苯基磺酰基 ( 其是未取代的或被一个或多个， 优选一个 C1-C7- 烷基、 C1-C7- 烷氧基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨 基 -C1-C7- 烷氧基取代 )，
     (5) 取代的磺酰基 ； 其中所述取代基选自以下基团 ： C1-C7- 烷基 ( 其是未取代的 或被一个或多个选自氘、 氟的基团取代 )、 吡咯烷子基 ( 其是未取代的或被一个或多个选自 氘、 羟基、 氧代的基团取代 ； 特别是被一个氧代取代 )，
     (6) 氟、 氯。 1
     R 非常特别优选地代表以下取代基之一 ： -C(CH3)2CF3、 C(CD3)3、 1- 甲基环丙基 ； 优 选在 (I-A) 和 (I-B) 的背景中。
     R2 优选地代表如 R1 所定义的取代基。
     R2 进一步优选地代表氢或氘。
     R2 特别优选地代表氢。
     R2 在一项可选择的实施方案中代表甲基。
     R3 优选地代表 (1) 氢， (2) 卤素， (3) 任选被取代的 C1-C7- 烷基， 其中所述取代基独 立地选自一个或多个， 优选一至三个以下基团 ： 氘、 卤素、 C1-C7- 烷基氨基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基。
     R3 特别优选地代表 (1) 氢， (2) 氟、 氯， (3) 任选被取代的甲基， 其中所述取代基独立地选自一个或多个， 优选一至三个以下基团 ： 氘、 氟、 氯、 二甲基氨基。 3
     R 非常特别优选地代表氢、 甲基、 CD3、 CH2Cl、 CH2F、 CH2N(CH3)3 ； 优选甲基。 1 2
     本发明还涉及如本文所定义的式 (I) 化合物， 其中 R 和 / 或 R 代表叔丁基的化合 物除外。
     本发明还涉及式 (I) 化合物的可药用前药。
     本发明还涉及式 (I) 化合物的可药用代谢物。
     本发明尤其涉及实施例中以及本文所述制备方法中给出的式 (I) 化合物。
     本发明还涉及式 (I) 化合物的制备方法。基本上所有已知的将两种不同的胺转化 为相应的脲衍生物的方法都是适合的， 且可以通过使用各自的起始原料进行应用。
     因此， 本发明特别涉及式 (I) 化合物的制备方法， 其包括将式 (II) 化合物
     与式 (IIIA) 化合物
     其中取代基如本文所定义， 且 R3 可以另外代表氯， 在活化试剂的存在下反应 ( “方 法 A” )， 或者与式 (IIIB) 化合物反应其中 R1 和 R2 如本文所定义， R3 如本文所定义且可以另外代表氯， 且 RG 代表反应 基团， 例如咪唑基羰基， 其可以直接反应或者通过形成 (IIIE) 的异氰酸酯中间体进行反应 (“方法 B” )，
     其中所述取代基如 (IIIB) 中所定义，
     在每种情况中任选在稀释剂的存在下并且任选在反应助剂的存在下反应， 和回收 所得的游离形式或盐形式的式 (I) 化合物， 以及
     任选将根据方法 A 或方法 B 可得到的式 (I) 化合物转化为不同的式 (I) 化合物， 和 / 或将可得到的式 (I) 化合物的盐转化为其不同的盐， 和 / 或将可得到的游离式 (I) 化 合物转化为其盐， 和 / 或从一种或多种不同的可得到的式 (I) 的异构体中分离可得到的式 (I) 化合物的异构体。
     反应条件
     可以根据本领域已知的方法或者按照以下实施例中公开的方法进行该方法。例 如， 可以使式 II 化合物与式 III 化合物在溶剂如二甲基甲酰胺中、 在碱、 例如有机胺如三乙 胺的存在下反应。
     当温度在上文或下文中被给出时， 应当加入 “约” ， 因为所给数值的小偏差、 例如 ±10％的变化是容许的。
     所有反应可以在一种或多种稀释剂和 / 或溶剂的存在下进行。原料可以以等摩尔 量使用 ； 或者， 化合物可以过量使用， 例如作为溶剂而发挥作用或使平衡移动或通常加快反 应速率。
     可以如本领域已知的、 反应所需要的那样并且按照通常已知的操作加入适宜量的 反应助剂， 例如酸、 碱或催化剂。
     保护基团
     如果一个或多个其它官能团， 例如羧基、 羟基、 氨基、 巯基等在如本文描述的原料 或任意其它前体中被保护或需要被保护， 因为它们不应参与反应或干扰反应， 则这些基团 是如通常在肽化合物、 头孢菌素类和青霉素类以及核酸衍生物和糖类的合成中使用的这类 基团。保护基团是一旦它们被除去就不再在最终化合物中存在的这类基团， 而在此处所用 的意义上作为取代基保留的基团不是保护基团， 保护基团是在原料或中间体阶段被加入， 并且被除去以得到最终化合物的基团。此外， 对于式 (I) 化合物转化为不同的式 (I) 化合 物而言， 如果有用或需要的话， 可以加入和除去保护基团。
     保护基团可以已经在前体中存在， 并且应该保护有关的官能团以防止不需要的二 次反应如酰化、 醚化、 酯化、 氧化、 溶剂解以及类似的反应。 保护基团的特征是它们自身易于 ( 即没有不需要的二次反应 ) 除去， 通常通过乙酰解、 质子解、 溶剂解、 还原、 光解或通过酶 活性、 例如在类似于生理条件的条件下除去， 并且它们在终产物中不存在。 专业人员知道或
     可以容易确定哪些保护基团适于上下文提到的反应。
     这类保护基团对这些官能团的保护、 保护基团本身及其去除反应例如在如下 标准参考著作中有描述 ： 例如 J.F.W.McOmie， 《有机化学中的保护基团》 (“Protective Groups in Organic Chemistry” )， 普 莱 姆 出 版 社 (Plenum Press)， 伦 敦 和 纽 约 1973， T.W.Greene， 《有机合成中的保护基团》 (“Protective Groups in Organic Synthesis” )， 第 三 版，威 利 (Wiley) 公 司，纽 约 1999， 《肽》 (“The Peptides” )； 第 3 卷 ( 编 者： E.Gross 和 J.Meienhofer)， 学术出版社 (Academic Press)， 伦敦和纽约 1981， “Methoden derorganischen Chemie” ( 有 机 化 学 方 法 )， Houben Weyl， 第 4 版， 第 15 卷 /I， Georg Thieme Verlag， 斯 图 加 特 1974， H.-D.Jakubke 和 H.Jescheit， Peptide， Proteine” ( 氨基酸、 肽、 蛋白质 )， Verlag Chemie， Weinheim， Deerfield Beach 和 Basel 1982，和 Jochen Lehmann， “Chemieder Kohlenhydrate ： Monosaccharide und Derivate” ( 碳水化合物化学 ： 单糖和衍生物 )， Georg Thieme Verlag， 斯图加特 1974。
     任选的反应和转化
     一种式 (I) 化合物可以被转化为不同的式 (I) 化合物。
     在其中 R3 代表氟的式 (I) 化合物中， 可以通过将相应的氯衍生物转化为氟化合物 而得到这类化合物。这类反应是已知的并且被称为取代反应。该转化可以在式 (IIIA 或 B) 的原料的步骤进行或者通过将相应的式 (I) 化合物转化而进行。
     在其中取代基带有氨基或氨基 -C1-C7- 烷基取代基的式 (I) 化合物中， 可以通过与 相应的 C1-C7- 烷酰基卤化物或 C1-C7- 烷基磺酰基卤化物、 例如相应的氯化物在如下条件下 反应将氨基转化为酰基氨基、 例如 C1-C7- 烷酰基氨基或 C1-C7- 烷基磺酰基氨基 ： 在叔氮碱 如三乙胺或吡啶的存在下， 在有或没有适当溶剂如二氯甲烷的存在下， 例如在 -20 至 50℃ 范围内的温度下如在约室温下进行。
     在其中取代基带有氰基取代基的式 (I) 化合物中， 可以例如通过在如下条件下氢 化将氰基转化为氨基甲基 ： 在适当的金属催化剂如阮内镍或阮内钴的存在下， 在适当溶剂、 例如低级链烷醇如甲醇和 / 或乙醇中， 例如在 -20 至 50℃范围内的温度下如在约室温下进 行。
     具有成盐基团的式 (I) 化合物的盐可以按照本身已知的方式来制备。 因此， 式 (I) 化合物的酸加成盐可以通过用酸或用适宜的阴离子交换试剂处理而得到。 具有两个酸分子 的盐 ( 例如式 (I) 化合物的二卤化物 ) 还可以被转化为每个化合物具有一个酸分子的盐 ( 例如单卤化物 ) ； 这可以通过如下方法做到 ： 加热至熔化物， 或者例如作为固体在高真空 下、 在高温如从 130 至 170℃下加热， 此时每分子的式 (I) 化合物排出一分子酸。通常可以 例如通过用适宜的碱性化合物、 例如用碱金属碳酸盐、 碱金属碳酸氢盐或碱金属氢氧化物、 通常为碳酸钾或氢氧化钠处理而将盐转化为游离化合物。
     可以按照本身已知的方式、 通过适宜的分离方法将立体异构混合物、 例如非对映 异构体的混合物分离为其相应的异构体。 例如可以通过分步结晶、 色谱法、 溶剂分配和类似 方法将非对映异构混合物分离为其单独的非对映异构体。 该分离可以在起始化合物的水平 或者在式 (I) 化合物本身中进行。可以通过形成非对映异构盐、 例如通过与对映异构体纯 的手性酸形成盐或者通过色谱法、 例如通过 HPLC、 使用具有手性配体的色谱基质来分离对 映异构体。应该强调， 与本章中所提到的转化类似的反应也可以在适当中间体的水平进行 ( 并且因此可用于制备相应的原料 )。
     原料 ：
     式 II 和 III 的原料以及本文如下文提到的其它原料可以按照或类似于本领域已 知的方法来制备， 它们是本领域已知的和 / 或可市售获得。在对于原料的制备没有特别描 述的情况下， 化合物是已知的或者可以按照类似于本领域已知的方法、 例如 WO 05/021519 或 WO04/096797 中的方法或者按照下文公开的方法来制备。新原料及其制备方法同样是本 发明的实施方案。在优选的实施方案中， 使用这类原料并选择所选反应以便能够得到优选 的化合物。
     在也可以适当和有利地作为盐形式使用和 / 或得到的原料 ( 包括中间体 ) 中， 取 代基优选如对式 (I) 化合物所定义。
     本发明还涉及式 (IIIA) 化合物或其盐
     其中所述取代基如式 (I) 化合物所定义。
     本发明还涉及式 (IIIA) 化合物的制备方法。基本上， 全部已知的将两种或芳基 / 杂芳基组分偶联 ( 例如 Heck 型反应 ) 成对应的脲衍生物的方法都是适合的， 且可以通过使 用各自的起始原料进行应用。因此本发明还涉及式 (IIIA) 的制备方法， 其包括
     ( 步骤 1) 将式 (IV) 化合物
     其中 R3 如本文所定义且可以另外代表卤素， PG 代表保护基团， 例如酰基基团， 与式 (V) 化合物其中 R1、 R2、 A 如本文所定义， 且 Hal 代表卤素， 例如溴， 在 Heck 条件下反应 ； 任选 地在稀释剂的存在下且任选地在反应助剂的存在下反应 ；
     ( 步骤 2) 然后除去保护基团， 例如在酸性条件下 ； 任选地在稀释剂的存在下且任
     选地在反应助剂的存在下反应 ； 并
     回 收 所 得 到 的 游 离 形 式 或 盐 形 式 的 式 (IIIA) 化 合 物， 并任选地将所得的式 (IIIA) 化合物转化为不同的式 (IIIA) 化合物， 和 / 或将所得的式 (IIIA) 化合物的盐转化 为其不同的盐， 和 / 或将所得的游离的式 (IIIA) 化合物转化为其盐， 和 / 或从得到的一种 或多种不同的式 (IIIA) 的异构体中分离式 (IIIA) 化合物的一种可得到的异构体。
     本发明还涉及式 (IIIB) 化合物或其盐
     其中 R1、 R2、 A 如式 (I) 化合物所定义， RG 代表反应基团， 特别是咪唑基羰基， 其可 以直接反应或者通过形成 (IIIE) 的异氰酸酯中间体进行反应， 且 R3 如本文所定义并可以 另外代表卤素。
     本发明还涉及式 (IIIB) 化合物的制备方法。基本上， 全部已知的将胺或其盐转化 成对应的活化衍生物的方法都是适合的， 且可以通过使用各自的起始原料进行应用。因此 本发明还涉及式 (IIIB) 化合物的制备方法， 其包括将式 (IIIA) 化合物
     其中取代基如本文所定义， 与活化试剂， 例如 1， 1’ - 羰基二咪唑， 任选地在稀释剂 的存在下且任选地在反应助剂的存在下反应 ； 并且
     回收得到的游离形式或盐形式的式 (IIIB) 化合物， 和任选地将所得的式 (IIIB) 化合物转化为不同的式 (IIIB) 化合物， 和 / 或将所得的式 (IIIB) 化合物的盐转化为其不 同的盐， 和 / 或将所得的游离的式 (IIIB) 化合物转化为其盐， 和 / 或从得到的一种或多种 不同的式 (IIIB) 的异构体中分离式 (IIIB) 化合物的一种可得到的异构体。
     本发明还涉及式 (IIIC) 化合物或其盐
     其中取代基如式 (I) 化合物所定义。
     本发明还涉及式 (IIIC) 化合物的制备方法。基本上， 全部环合反应都是适合的， 且可以通过使用各自的起始原料进行应用。因此本发明还涉及式 (IIIC) 化合物的制备方 法， 其包括将式 (VI) 化合物
     其中 R3 如本文所定义且可以另外代表卤素， 与式 (VII) 化合物其中 R1 如本文所定义 ； 任选地在稀释剂的存在下且任选地在反应助剂的存在下进 行反应 ； 并且
     回收得到的游离形式或盐形式的式 (IIIC) 化合物， 并任选地将所得的式 (IIIC) 化合物转化为不同的式 (IIIC) 化合物， 和 / 或将所得的式 (IIIC) 化合物的盐转化为其不 同的盐， 和 / 或将所得的游离的式 (IIIC) 化合物转化为其盐， 和 / 或从得到的一种或多种 不同的式 (IIIC) 的异构体中分离式 (IIIC) 化合物的一种可得到的异构体。
     本发明还涉及式 (IIID) 化合物或其盐
     其中 R1 如本文所定义， RG 代表反应基团， 特别是咪唑基羰基， R3 如本文所定义， 且 可以另外代表卤素。
     本发明还涉及式 (IIID) 化合物的制备方法。基本上， 全部已知的将胺或其盐转化 成对应的活化衍生物的方法都是适合的， 且可以通过使用各自的起始原料进行应用。因此 本发明还涉及式 (IIID) 化合物的制备方法， 其包括将式 (IIIC) 化合物
     其中取代基如上文所定义， 与活化试剂， 例如 1， 1’ - 羰基二咪唑， 任选地在稀释剂 的存在下且任选地在反应助剂的存在下反应 ； 并且
     回收得到的游离形式或盐形式的式 (IIID) 化合物， 和任选地将所得的式 (IIID) 化合物转化为不同的式 (IIID) 化合物， 和 / 或将所得的式 (IIID) 化合物的盐转化为其不 同的盐， 和 / 或将所得的游离的式 (IIID) 化合物转化为其盐， 和 / 或从得到的一种或多种 不同的式 (IIID) 的异构体中分离式 (IIID) 化合物的一种可得到的异构体。
     本发明还涉及式 (VI) 化合物或其盐
     其中 R3 如本文所定义且可以另外代表卤素。
     本发明还涉及式 (VI) 化合物的制备方法。基本上， 全部已知的适合用于此类转化 的方法都可以通过使用各自的起始原料进行应用。因此本发明还涉及式 (IIID) 化合物的 制备方法， 其包括将式 (IIX) 化合物
     其中 R3 如式 (I) 所定义且可以另外代表卤素， 与二甲基甲酰胺的缩醛， 例如 DMF- 二甲基缩醛反应， 得到式 (VI) 化合物 ；
     回收得到的游离形式或盐形式的式 (IIID) 化合物， 并任选地将所得的式 (IIX) 化 合物转化为不同的式 (IIX) 化合物， 和 / 或将所得的式 (IIX) 化合物的盐转化为其不同的 盐， 和 / 或将所得的游离的式 (IIX) 化合物转化为其盐， 和 / 或从得到的一种或多种不同的 式 (IIX) 的异构体中分离式 (IIX) 化合物的一种可得到的异构体。
     式 (I) 化合物还包括亚式 (IA)、 (IB) 及其可药用盐， 可用作药物， 其中
     A 代表杂芳基 ；
     R1 代表 (1) 任选被取代的烷基 ； (2) 任选被取代的环烷基 ； (3) 任选被取代的芳基 ； (4) 任选被取代的胺 ； (5) 任选被取代的磺酰基 ； (6) 卤素 ； 2 1
     R 代表氢、 氘或如 R 所定义的取代基 ； 3
     R 代表氢、 卤素、 任选被取代的烷基。
     因此， 本发明涉及其中表明 PI3K 抑制的用于人类或兽用的组合物的一项实施 方案。该实施方案还包含 (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-( 叔丁基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺， 但或者不包含所述化合物。
     在一项实施方案中， 本发明涉及治疗由 PI3K 介导的细胞增殖性疾病、 例如肿瘤和 / 或癌性细胞生长。疾病包括那些显示 PI3Kα 的过表达或扩增、 PIK3CA 的体细胞突变或 PTEN 的种系突变或体细胞突变或用于正调节 p85-p110 复合物的 p85α 的突变和易位的 激酶所介导的疾病。具体而言， 化合物可用于治疗人或动物 ( 例如鼠类 ) 癌症， 包括例如 肉瘤 ； 肺癌 ； 支气管癌 ； 前列腺癌 ； 乳腺癌 ( 包括散发的乳腺癌和考登病患者 ) ； 胰腺癌 ； 胃 肠癌 ； 结肠癌 ； 直肠癌 ； 结肠癌 ； 结肠直肠腺瘤 ； 甲状腺癌 ； 肝癌 ； 肝内胆管癌 ； 肝细胞癌 ； 肾 上腺癌 ； 胃癌 ； 胃癌 ； 神经胶质瘤 ； 胶质母细胞瘤 ； 子宫内膜癌 ； 黑素瘤 ； 肾癌 ； 肾盂癌 ； 膀胱 癌； 子宫体癌 ； 子宫颈癌 ； 阴道癌 ； 卵巢癌 ； 多发性骨髓瘤 ； 食管癌 ； 白血病 ； 急性髓性白血 病； 慢性髓性白血病 ； 淋巴细胞白血病 ； 髓性白血病 ； 脑癌 ； 脑癌 ； 口腔和咽癌 ； 喉癌 ； 小肠 癌； 非霍奇金淋巴瘤 ； 黑素瘤和绒毛状结肠腺瘤 ； 瘤形成 ； 上皮特征的瘤形成 ； 淋巴瘤 ； 乳 癌； 基底细胞癌 ； 鳞状细胞癌 ； 光化性角化病 ； 肿瘤疾病， 包括实体瘤 ； 颈或头部肿瘤 ； 真性 红细胞增多症 ； 原发性血小板增多症 ； 骨髓纤维化伴骨髓化生 ； 和瓦尔登斯特伦病。
     在其它实施方案中， 病症或紊乱 ( 如 PI3K 介导的 ) 选自 ： 真性红细胞增多症、 原 发性血小板增多症、 骨髓纤维化伴骨髓化生、 哮喘、 COPD、 ARDS、 勒夫勒综合征、 嗜酸细胞性 肺炎、 寄生虫 ( 特别是后生动物 ) 侵染 ( 包括热带肺嗜酸细胞增多 )、 支气管肺曲霉病、 结 节性多动脉炎 ( 包括丘 - 斯综合征 )、 嗜酸细胞肉芽肿、 由药物反应引起的影响气道的与嗜 酸性细胞有关的紊乱、 银屑病、 接触性皮炎、 特应性皮炎、 斑秃、 多形性红斑、 疱疹样皮炎、 硬 皮病、 白癜风、 变应性血管炎、 荨麻疹、 大疱性类天疱疮、 红斑狼疮、 天疱疮 (pemphisus)、 后 天性大疱性表皮松解、 自身免疫性血液病 ( 例如溶血性贫血、 再生障碍性贫血、 纯红细胞贫 血和特发性血小板减少 )、 系统性红斑狼疮、 多发性软骨炎、 硬皮病、 韦格纳肉芽肿病、 皮肌 炎、 慢性活动性肝炎、 重症肌无力、 斯 - 琼氏综合征、 特发性口炎性腹泻、 自身免疫性炎性肠 病 ( 例如溃疡性结肠炎和克罗恩病 )、 内分泌性眼病、 格雷夫斯病、 结节病、 肺泡炎、 慢性过
     敏性肺炎、 多发性硬化症、 原发性胆汁性肝硬化、 ( 前和后 ) 眼色素层炎、 肺间质纤维化、 银屑病关节炎、 肾小球肾炎、 心血管疾病、 动脉粥样硬化、 高血压、 深部静脉血栓形成、 中风、 心 肌梗塞、 不稳定心绞痛、 血栓栓塞、 肺栓塞、 血栓溶解性疾病、 急性动脉缺血、 外周血栓性阻 塞和冠状动脉疾病、 再灌注损伤、 视网膜病、 例如糖尿病性视网膜病或高压氧引起的视网膜 病， 以及以升高眼内压或眼房水分泌为特征的病症、 例如青光眼。
     对于以上用途， 所需的剂量当然将根据施用方式、 所治疗的具体病症和所期望的 作用而改变。通常， 以约 0.03 至约 100.0mg/kg 体重， 例如约 0.03 至约 10.0mg/kg 体重的 日剂量全身施用表明可获得满意的结果。大型哺乳动物、 例如人的指示日剂量的范围为约 0.5mg 至约 3g， 例如约 5mg 至约 1.5g， 其方便地例如以一天最多四次的分份剂量或以缓释 形式施用。适合于口服施用的单位剂量形式包含约 0.1 至约 500mg， 例如约 1.0 至约 500mg 活性成分。
     式 (I) 化合物可以通过任意常规途径施用， 特别是经肠施用、 例如口服施用， 如以 片剂或胶囊剂的形式施用， 或经胃肠道外施用、 例如以可注射的溶液或混悬液的形式施用， 局部施用、 例如以洗剂、 凝胶剂、 软膏剂或乳膏剂的形式施用， 通过吸入施用， 鼻内施用， 或 以栓剂形式施用。
     式 (I) 化合物可以以游离形式或以可药用盐的形式、 例如如上所示的那样施用。 这类盐可以以常规方式来制备并且显示出与游离化合物相同级别的活性。 因此， 本发明还提供了 ：
     ■在需要这类治疗的个体中预防或治疗通过激活 PI3K( 如 PI3 激酶 α) 酶所介导 的病症、 紊乱或疾病的方法， 例如以上所示的那些疾病， 该方法包括给所述个体施用有效量 的式 (I) 化合物或其可药用盐。
     ■游离形式或可药用盐形式的式 (I) 化合物， 其例如在如本文所示的任意方法中 作为药物。
     ■游离形式或可药用盐形式的式 (I) 化合物， 其例如在如本文所示的任意方法中 用作药物， 特别是用于一种或多种磷脂酰肌醇 3- 激酶介导的疾病。
     ■游离形式或可药用盐形式的式 (I) 化合物在如本文所示的任意方法中的用途， 特别是用于治疗一种或多种磷脂酰肌醇 3- 激酶介导的疾病。
     ■游离形式或可药用盐形式的式 (I) 化合物在如本文所示的任意方法中的用途， 特别是用于制备治疗一种或多种磷脂酰肌醇 3- 激酶介导的疾病的药物。
     PI3K 充当整合平行的信号传导途径的第二信使节点， 有证据正在表明， PI3K 抑制 剂和其它途径的抑制剂的组合将可用于治疗人类癌症和增殖性疾病。
     约 20-30 ％的人乳腺癌过表达 Her-2/neu-ErbB2( 药物曲妥珠单抗的靶标 )。虽 然曲妥珠单抗在表达 Her2/neu-ErbB2 的一些患者中已经证明了持久的响应， 但是只有部 分这些患者有响应。近来的工作已经表明， 该有限的响应速率可以通过曲妥珠单抗和 PI3K 或 PI3K/AKT 途径的抑制剂的组合来显著提高 (Chan 等人， Breast Can.Res.Treat.91 ： 187(2005)， WoodsIgnatoski 等 人， Brit.J.Cancer 82 ： 666(2000)， Nagata 等 人， Cancer Cell6 ： 117(2004))。
     多种人恶性瘤表达激活突变或增加 Her1/EGFR 水平， 已经开发了许多抗体和小分 子抑制剂来对抗该受体酪氨酸激酶， 包括特罗凯、 吉非替尼和爱必要。但是， 虽然 EGFR 抑 制剂证明在某些人肿瘤 ( 例如 NSCLC) 中具有抗肿瘤活性， 可是它们不能在患有表达 EGFR
     的肿瘤的所有患者中增加总的患者存活。这可以由如下事实来合理解释 ： Her1/EGFR 的许 多下游靶点在多种恶性瘤中以高频率发生突变或失调， 包括 PI3K/Akt 途径。例如， 吉非替 尼在体外试验中可抑制腺癌细胞系的生长。但是， 可以挑选出对吉非替尼有抗性的这些细 胞系的亚克隆， 证明 PI3/Akt 途径的激活增加了。向下调节或抑制该途径使有抗性的亚克 隆对吉非替尼敏感 (Kokubo 等人， Brit.J.Cancer 92 ： 1711(2005))。而且， 在具有含 PTEN 突变并且过表达 EGFR 的细胞系的乳腺癌的体外模型中， 既抑制 PI3K/Akt 途径又抑制 EGFR 产生了协同作用 (She 等人， Cancer Cell 8 ： 287-297(2005))。这些结果表明， 吉非替尼和 PI3K/Akt 途径抑制剂的组合将是癌症中有吸引力的治疗策略。
     AEE778(Her-2/neu/ErbB2、 VEGFR 和 EGFR 的抑制剂 ) 和 RAD001(mTOR(Akt 的下游 靶标 ) 的抑制剂 ) 的组合在胶质母细胞瘤异种移植物模型中产生了比单独的任一物质更大 的组合效能 (Goudar 等人， Mol.Cancer.Ther.4 ： 101-112(2005))。
     抗雌激素剂如他莫昔芬可通过诱导细胞周期停滞 ( 其需要细胞周期抑制物 p27Kip 的作用 ) 而抑制乳腺癌生长。近来， 已经表明 Ras-Raf-MAP 激酶途径的激活可改变 p27Kip 的磷酸化状态， 结果其在使细胞周期停滞中的抑制活性被减弱， 由此引起抗雌激素 抗性 (Donovan 等人， J.Biol.Chem.276 ： 40888， (2001))。如 Donovan 等人所报道的那样， 通过用 MEK 抑制剂处理来抑制 MAPK 信号传导在激素抵抗的乳腺癌细胞系中逆转了 p27 的 异常磷酸化状态， 并且由此恢复了激素敏感性。类似地， 通过 Akt 使 p27Kip 磷酸化也可取 消其对使细胞周期停滞的作用 (Viglietto 等人， Nat Med.8 ： 1145(2002))。
     因此， 在另一方面， 式 I 化合物可用于治疗激素依赖性癌症、 例如乳腺和前列腺 癌。该用途的目标是用常规的抗癌剂来逆转这些癌症中常见的激素抗性。
     在血液癌症如慢性髓性白血病 (CML) 中， 染色体易位负责组成性激活的 BCR-Abl 酪氨酸激酶。受影响的患者由于 Abl 激酶活性的抑制而对伊马替尼 ( 一种小分子酪氨酸激 酶抑制剂 ) 作出响应。但是， 患有晚期疾病的许多患者起初对伊马替尼有响应， 可是后来由 于在 Abl 激酶结构域中发生了给予抗性的突变而复发。体外研究已经表明， BCR-Ab1 利用 Ras-Raf 激酶途径来引起其作用。 此外， 抑制相同途径中一种以上的激酶可提供另外的保护 以防止给予抗性的突变。
     因此， 在另一方面， 式 I 化合物与至少一种选自激酶抑制剂如 的另外 的物质组合使用来治疗血液癌症如慢性髓性白血病 (CML)。 通过该用途可知， 目标是逆转或 阻止对所述的至少一种另外的物质的抗性。
     因为激活 PI3K/Akt 途径可驱动细胞存活， 所以与驱动癌细胞中细胞凋亡的疗 法 ( 包括放射治疗和化学治疗 ) 组合来抑制该途径将使响应提高 (Ghobrial 等人， CA Cancer J.Clin 55 ： 178-194(2005))。作为实例， PI3 激酶抑制剂和卡铂的组合表明在体外 增殖和细胞凋亡试验中以及在卵巢癌的异种移植物模型的体内肿瘤效能中具有协同作用 (Westfall 和 Skinner， Mol.Cancer Ther.4 ： 1764-1771(2005))。
     除了癌症和增殖性疾病外， 有越来越多的证据表明 1A 和 1B 类 PI3 激酶的抑制剂 将在治疗上可用于其它疾病领域。抑制 p110β(PIK3CB 基因的 PI3K 同工型产物 ) 已经表 明可参与剪切引起的血小板激活 (Jackson 等人， Nature Medicine 11 ： 507-514(2005))。 因此， 抑制 p110β 的 PI3K 抑制剂将在抗血栓治疗中可用作单独的药物或可组合使用。同 工型 p110δ(PIK3CD 基因的产物 ) 在 B 细胞功能和分化 (Clayton 等人， J.Exp.Med.196 ：753-763(2002))、 T 细 胞 依 赖 性 和 非 依 赖 性 抗 原 响 应 (Jou 等 人， Mol.Cell.Biol.22 ： 8580-8590(2002)) 及肥大细胞分化 (Ali 等人， Nature 431 ： 1007-1011(2004)) 中是重要 的。因此， 期望 p110δ 抑制剂将可用于治疗 B 细胞驱动的自身免疫性疾病和哮喘。最后， 抑制 p110γ(PI3KCG 基因的同工型产物 ) 使 T 细胞而非 B 细胞的响应减少 (Reif 等人， J.Immunol.173 ： 2236-2240(2004))， 这种抑制证明在自身免疫性疾病的动物模型中具有效 能 (Camps 等人， Nature Medicine 11 ： 936-943(2005)， Barber 等人， Nature Medicine11 ： 933-935(2005))。
     本发明还提供了药物组合物， 其包含单独的或者与其它抗癌剂一起的至少一种式 (I) 化合物以及适合施用于人或动物个体的可药用赋形剂。
     本发明还提供了治疗患有细胞增殖性疾病如癌症的人或动物个体的方法。因此， 本发明提供了治疗需要这类治疗的人或动物个体的方法， 包括给该个体单独施用或者与一 种或多种其它抗癌剂组合施用治疗有效量的式 (I) 化合物。特别是组分将被配制在一起作 为组合治疗剂或者分别施用。适于与式 (I) 化合物使用的抗癌剂包括但不限于一种或多 种选自以下所述的激酶抑制剂、 抗雌激素剂、 抗雄激素剂、 其它抑制剂、 癌症化疗药物、 烷化 剂、 螯合剂、 生物效应调节剂、 癌症疫苗、 用于反义治疗的物质的化合物 ：
     A. 激酶抑制剂 ： 作为抗癌剂与式 (I) 化合物联合使用的激酶抑制剂包括 ： 表 皮生长因子受体 (EGFR) 激酶抑制剂， 例如小分子喹唑啉类如吉非替尼 (US 5457105、 US 5616582 和 US 5770599)、 ZD-6474(WO 01/32651)、 厄洛替尼 ( US 5,747,498 和 WO 96/30347) 和 lapatinib(US6,727,256 和 WO 02/02552) ； 血管内皮生长因子 受 体 (VEGFR) 激 酶 抑 制 剂， 包 括 SU-11248(WO 01/60814)、 SU 5416(US 5,883,113 和 WO 99/61422)、 SU 6668(US 5,883,113 和 WO 99/61422)、 CHIR-258(US 6,605,617 和 US6,774,237)、 伐 他 拉 尼 或 PTK-787(US 6,258,812)、 VEGF-Trap(WO02/57423)、 B43- 染 料木黄酮 (WO-09606116)、 芬维 A 胺 ( 维甲酸对 - 羟基苯胺 )(US 4,323,581)、 IM-862(WO 02/62826)、 贝伐单抗或 (WO94/10202)、 KRN-951、 3-[5-( 甲 基 磺 酰 基 哌 啶 甲 基 )- 吲哚基 ]- 喹诺酮、 AG-13736 和 AG-13925、 吡咯并 [2， 1-f][1， 2， 4] 三嗪、 ZK-304709、 VMDA-3601、 EG-004、 CEP-701(US 5,621,100)、 Cand5(WO 04/09769) ； Erb2 酪 氨酸激酶抑制剂， 例如 pertuzumab(WO 01/00245)、 曲妥珠单抗和利妥昔单抗 ； Akt 蛋白激 酶抑制剂， 例如 RX-0201 ； 蛋白激酶 C(PKC) 抑制剂， 例如 LY-317615(WO 95/17182) 和哌 立福辛 (US 2003171303) ； Raf/Map/MEK/Ras 激酶抑制剂， 包括索拉非尼 (BAY 43-9006)、 ARQ-350RP、 LErafAON、 BMS-354825AMG-548， 和在 WO 03/82272 中公开的其它化合物 ； 成纤 维细胞生长因子受体 (FGFR) 激酶抑制剂 ； 细胞依赖性激酶 (CDK) 抑制剂， 包括 CYC-202 或 Roscovitine(WO 97/20842 和 WO 99/02162) ； 血小板衍生生长因子受体 (PDGFR) 激酶抑制 剂， 例如 CHIR-258、 3G3mAb、 AG-13736、 SU-11248 和 SU6668 ； 以及 Bcr-Abl 激酶和融合蛋白 抑制剂如 STI-571 或
     ( 伊马替尼 )。B. 抗雌激素剂 ： _ 在抗癌治疗中与式 (I) 化合物联合使用的雌激素靶向的物质 包括 ： 选择性雌激素受体调节剂 (SERMs)， 包括他莫昔芬、 托瑞米芬、 雷洛昔芬 ； 芳香酶抑制 剂， 包括 司群。29或阿那曲唑 ； 雌激素受体负调节物 (ERDs)， 包括或氟维102149711 A CN 102149713
     说明书21/100 页C. 抗雄激素剂 ： _ 在抗癌治疗中与式 (I) 化合物联合使用的雄激素靶向的物质包 括氟他胺、 比卡鲁胺、 非那雄胺、 氨鲁米特、 酮康唑和皮质类固醇。
     D. 其它抑制剂 ： _ 作为抗癌剂与式 (I) 化合物联合使用的其它抑制剂包括 ： 蛋 白法尼基转移酶抑制剂， 包括替匹法尼或 R-115777(US 2003134846 和 WO 97/21701)、 BMS-214662、 AZD-3409 和 FTI-277 ； 拓 扑 异 构 酶 抑 制 剂， 包 括 merbarone 和 二 氟 替 康 (BN-80915) ； 有丝分裂纺锤体驱动蛋白 (KSP) 抑制剂， 包括 SB-743921 和 MKI-833 ； 蛋白酶 体调节剂， 例如硼替佐米或 (US 5,780,454)、 XL-784 ； 和环加氧酶 2(COX-2) 抑 制剂， 包括非甾体抗炎药 I(NSAIDs)。
     E. 癌症化疗药物 ： 作为抗癌剂与式 (I) 化合物联合使用的具体的癌症化学治疗 剂包括阿那曲唑 白消安 比卡鲁胺 白消安注射液 硫酸博来霉素 卡培他滨 卡莫司汀 克拉屈滨 环磷酰胺 阿糖胞苷脂质体注射液 N4- 戊 氧 基 苯丁酸氮芥 或羰 基 -5- 脱 氧 -5- 氟 胞 苷、 卡铂 顺铂 阿糖胞苷、 阿糖胞苷 达 卡 巴 嗪 (DTIC-)、 放 线 菌 素 D( 放 线 菌 素 D， Cosmegan)、 盐酸柔红霉素 地塞米松、 多西他赛 依托泊苷 氟他胺 伊达比星 L- 门 冬 酰 胺 酶 甲氨蝶呤 亚 米 磷枸橼酸柔红霉素脂质体注射液 盐酸多柔比星 酸氟达拉滨 5- 氟尿嘧啶tezacitibine、 吉西他滨 ( 二氟脱氧胞苷 )、 羟基脲 异环磷酰胺 叶 酸 钙、 美法仑 托蒽醌 伊立替康 6- 巯 基 嘌 呤 麦 罗 塔、 紫杉醇phoenix( 钇 90/MX-DTPA)、 喷司 枸橼酸他莫昔芬 注射用盐酸 和长春瑞滨他 丁、 聚 苯 丙 生 20 和 卡 莫 司 汀 植 入 物 替尼泊苷 托泊替康6- 硫 鸟 嘌 呤、 塞 替 派、 替拉扎明 长春碱 长春新碱F. 烷化剂 ： _ 与式 (I) 化合物联合使用的烷化剂包括 VNP-40101M 或 cloretizine、 奥沙利铂 (US 4,169,846、 WO 03/24978 和 WO 03/04505)、 葡磷酰胺、 马磷酰胺、 凡毕复 (US 5,041,424)、 泼尼莫司汀 ； 曲奥舒凡 ； 白消安 ； irofluven( 酰基富烯 ) ； penclomedine ； 吡唑 并吖啶 (PD-115934) ； O6- 苄基鸟嘌呤 ； 地西他滨 (5- 氮杂 -2- 脱氧胞苷 ) ； brostallicin ；
     丝 裂 霉 素 C(MitoExtra) ； TLK-286替莫唑胺 ； 曲 贝 替 定 (US 5,478,932) ；AP-5280( 顺铂的铂酸盐制剂 ) ； 泊非霉素 ； 和 clearazide(meclorethamine)。
     G. 螯合剂 ： _ 与式 (I) 化合物联合使用的螯合剂包括四硫钼酸盐 (WO01/60814) ；RP-697 ； 嵌合的 T84.66(cT84.66) ； 钆膦维司 (EPT) 组合的博来霉素。
     去铁胺 ； 以及任选与电穿孔法H. 生 物 效 应 调 节 剂 ： _ 与 式 (I) 化 合 物 联 合 使 用 的 生 物 效 应 调 节 剂、 例如免 疫调节剂包括 ： 星型包菌素及其大环类似物， 包括 UCN-01、 CEP-701 和米哚妥林 ( 参见 WO 02/30941、 WO 97/07081、 WO 89/07105、 US5,621,100、 WO 93/07153、 WO 01/04125、 WO 02/30941、 WO 93/08809、 WO 94/06799、 WO 00/27422、 WO 96/13506 和 WO 88/07045) ； 角鲨胺 (WO01/79255) ； DA-9601(WO 98/04541 和 US 6,025,387) ； 阿仑单抗 ； 干扰素 ( 例 如 IFN-a、 IFN-b 等 ) ； 白 细 胞 介 素， 特 别 是 IL-2 或 阿 地 白 介 素 以 及 IL-1、 IL-3、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-7、 IL-8、 IL-9、 IL-10、 IL-11、 IL-12， 及具有多于 70 ％天然人序列的氨 基酸序列的其活性生物变体 ； 六甲蜜胺 SU 101 或来氟米特 (WO 04/06834 和 US 6,331,555) ； 咪唑并喹啉， 例如瑞喹莫德和咪喹莫特 (US 4,689,338、 5,389,640、 5,268,376 、 4,929,624 、 5,266,575 、 5,352,784 、 5,494,916 、 5,482,936 、 5,346,905 、 5,395,937、 5,238,944 和 5,525,612) ； 以及 SMIPs， 包括苯并唑类、 蒽醌类、 缩氨基硫脲类和 色胺酮类 (WO 04/87153、 WO 04/64759 和 WO 04/60308)。
     I. 癌 症 疫 苗 ： _ 与 式 (I) 化 合 物 联 合 使 用 的 抗 癌 疫 苗 包 括(Tetrahedron Lett.26 ： 2269-70(1974)) ； oregovomab (STn-KLH) ； 黑素瘤疫苗 ； 针对 Ras 蛋白中 5 个突变的 GI-4000 系列 (GI-4014、 GI-4015 和 GI-4016) ； GlioVax-1 ； MelaVax ； 或 INGN-201(WO 95/12660) ； Sig/E7/LAMP-1， 编码 HPV-16E7 ； MAGE-3 疫苗或 M3TK(WO 94/05304) ； HER-2VAX ； 刺激对肿瘤特异的 T 细胞的 ACTIVE ； GM-CSF 癌症疫苗 ； 和基于利斯特菌属 (Listeria) 单细胞质基因的疫苗。
     J. 反 义 治 疗 ： _ 与 式 (I) 化 合 物 联 合 使 用 的 抗 癌 剂 还 包 括 反 义 组 分， 例如 AEG-35156(GEM-640) ； AP-12009 和 AP-11014(TGF-β2 特异性反义寡核苷酸 ) ； AVI-4126 ； AVI-4557 ； AVI-4472 ； oblimersen JFS2 ； aprinocarsen(WO 97/29780) ； GTI-2040(R2 核 糖 核 苷 酸 还 原 酶 mRNA 反 义 寡 核 苷 酸 )(WO 98/05769) ； GTI-2501(WO 98/05769) ； 脂 质 体 包 囊 的 c-Raf 反 义 寡 脱 氧 核 苷 酸 (LErafAON)(WO 98/43095) ； 和 Sirna-027( 基于 RNAi 的靶向于 VEGFR-1mRNA 的治疗剂 )。
     式 (I) 化合物还可以在药物组合物中与支气管扩张或抗组胺药物组合。这类支 气管扩张药物包括抗胆碱能或抗毒蕈碱剂， 特别是异丙托溴铵、 氧托溴铵和噻托溴铵， 以及 β-2- 肾上腺素受体激动剂， 例如沙丁胺醇、 特布他林、 沙美特罗、 卡莫特罗、 milveterol 以 及尤其是福莫特罗和茚达特罗。共同治疗的抗组胺药物包括盐酸西替利嗪、 富马酸氯马斯 汀、 异丙嗪、 氯雷他定、 地氯雷他定、 苯海拉明和盐酸非索非那定。
     在另外的方面， 本发明提供了组合， 其包含式 (I) 化合物以及一种或多种可用于 治疗血栓性疾病、 心脏病、 中风等的化合物。 这类化合物包括阿司匹林、 链激酶、 组织纤溶酶 原激活剂、 尿激酶、 抗凝血剂、 抗血小板药 ( 例如 PLAVIX ； 氯吡格雷硫酸氢盐 )、 他汀类化合 物 ( 例如立普妥或阿托伐他汀钙、 舒降之 ( 辛伐他汀 )、 可定 ( 罗苏伐他汀 ) 等 )、 β 阻滞 剂 ( 例如阿替洛尔 )、 络活喜 ( 苯磺酸氨氯地平 ) 和 ACE 抑制剂 ( 例如赖诺普利 )。
     在另外的方面， 本发明提供了组合， 其包含式 (I) 化合物以及一种或多种可用于 治疗高血压的化合物。这类化合物包括 ACE 抑制剂、 降脂药物如他汀类、 立普妥 ( 阿托伐他汀钙 )、 钙通道阻滞剂如络活喜 ( 苯磺酸氨氯地平 )。
     在另外的方面， 本发明提供了组合， 其包含式 (I) 化合物以及一种或多种选自贝 特类 (fibrates)、 β- 阻滞剂、 NEPI 抑制剂、 血管紧张素 -2 受体拮抗剂和血小板聚集抑制 剂的化合物。
     在另外的方面， 本发明提供了组合， 其包含式 (I) 化合物以及适于治疗炎性疾病、 包括类风湿性关节炎的化合物。这类化合物可以选自 TNF-α 抑制剂如抗 -TNF-α 单克隆 抗体 ( 例如类克、 CDP-870) 和 D2E7(HUMIRA) 及 TNF 受体免疫球蛋白融合分子 ( 例如依那 西普 )、 IL-1 抑制剂、 受体拮抗剂或可溶性 IL-1Rα( 例如 KINERET 或 ICE 抑制剂 )、 非甾体 抗炎药 (NSAIDS)、 吡罗昔康、 双氯芬酸、 萘普生、 氟比洛芬、 非诺洛芬、 酮洛芬、 布洛芬、 灭酸 酯类 (fenamates)、 甲芬那酸、 吲哚美辛、 舒林酸、 阿扎丙宗、 吡唑啉酮类、 保泰松、 阿司匹林、 COX-2 抑制剂 ( 例如西乐葆 ( 塞来考昔 )、 PREXIGE( 芦米考昔 ))、 金属蛋白酶抑制剂 ( 优选 MMP-13 选择性抑制剂 )、 p2x7 抑制剂、 α2α 抑制剂、 NEUROTIN、 普瑞巴林、 低剂量甲氨蝶呤、 来氟米特、 羟氯喹、 d- 青霉胺、 金诺芬或者胃肠道外或口服金。
     在另外的方面， 本发明提供了组合， 其包含式 (I) 化合物以及适于治疗骨关节炎 的化合物。这类化合物可以选自标准的非甾体抗炎药 ( 下文为 NSAIDs) 如吡罗昔康、 双氯 芬酸、 丙酸类如萘普生、 氟比洛芬、 非诺洛芬、 酮洛芬和布洛芬、 灭酸酯类如甲芬那酸、 吲哚 美辛、 舒林酸、 阿扎丙宗、 吡唑啉酮类如保泰松、 水杨酸类如阿司匹林、 COX-2 抑制剂如塞来 考昔、 伐地考昔、 芦米考昔和艾托考昔、 镇痛药以及关节内治疗剂如皮质类固醇及透明质酸 如海尔根和欣维可。 在另外的方面， 本发明提供了组合， 其包含式 (I) 化合物以及抗病毒剂和 / 或抗菌 化合物。所述抗病毒剂可以选自泛罗赛、 AZT、 阿昔洛韦和泛昔洛韦。所述抗菌化合物可以 选自 Valant。
     在另外的方面， 本发明提供了组合， 其包含式 (I) 化合物以及一种或多种选自如 下的物质 ： CNS 药物， 例如抗抑郁药 ( 舍曲林 )、 抗帕金森症药 ( 例如地普雷尼尔、 L- 多巴、 Requip、 普拉克索 ； MAOB 抑制剂 ( 例如司来吉兰 (selegine) 和雷沙吉兰 ) ； comP 抑制剂 ( 例 如托卡朋 ) ； A-2 抑制剂 ； 多巴胺重吸收抑制剂 ； NMDA 拮抗剂 ； 烟碱激动剂 ； 多巴胺激动剂 ； 和神经元的一氧化氮合酶抑制剂 )。
     在另外的方面， 本发明提供了组合， 其包含式 (I) 化合物以及一种或多种抗阿 尔茨海默病药物。所述抗阿尔茨海默病药物可以选自多奈哌齐、 他克林、 α2δ 抑制剂、 NEUROTIN、 普瑞巴林、 COX-2 抑制剂、 丙戊茶碱或美曲膦酯。
     在另外的方面， 本发明提供了组合， 其包含式 (I) 化合物以及抗骨质疏松症药物 和 / 或免疫抑制剂。所述骨质疏松症药物可以选自易维特 ( 盐酸雷洛昔芬 )、 屈洛昔芬、 拉 索昔芬或 Fosomax。所述免疫抑制剂可以选自 FK-506 和雷帕霉素。
     在优选实施方案的另一方面， 提供了药盒， 其包括一种或多种式 (I) 化合物和如 本文公开的组合伙伴。代表性药盒包括 PI3K 抑制剂化合物 ( 例如式 (I) 化合物 ) 以及包 装插页或其它标记， 包括通过施用 PI3K 抑制量的化合物来治疗细胞增殖性疾病的说明书。
     通常， 式 (I) 化合物将以治疗有效量、 通过对任何发挥类似功效的物质而言可接 受的施用方式来施用。式 (I) 化合物、 即活性成分的实际量将取决于多种因素， 例如所治疗 疾病的严重性、 个体的年龄和相对健康、 所用化合物的效能、 施用的途径和形式以及其它因
     素。药物可以一天施用一次以上， 优选一天施用一次或两次。所有这些因素都在主治医师 的技能之内。式 (I) 化合物的治疗有效量的范围可以在约 0.05 至约 50mg/ 公斤受者体重 /天； 优选约 0.1-25mg/kg/ 天， 更优选约 0.5 至 10mg/kg/ 天。因此， 对于施用于 70kg 的人 而言， 剂量范围将最优选为约 35-70mg/ 天。
     通常， 式 (I) 化合物将作为药物组合物、 通过任意一种以下途径施用 ： 口服、 全身 ( 例如透皮、 鼻内或通过栓剂 ) 或胃肠道外 ( 例如肌内、 静脉内或皮下 ) 施用。优选的施 用方式是使用方便的日剂量方案进行口服， 所述的日剂量方案可以根据病痛的程度进行调 整。组合物可以采取片剂、 丸剂、 胶囊剂、 半固体、 粉末、 缓释制剂、 溶液、 混悬液、 酏剂、 气雾 剂的形式或任意其它适当的组合物。另一种优选的施用式 I 化合物的方式是吸入。这是将 治疗剂直接传递到呼吸道的有效方法。
     制剂的选择取决于多种因素， 例如药物施用的方式和药物物质的生物利用度。对 于通过吸入传递而言， 化合物可以被配制成液体溶液、 混悬液、 气雾喷射剂或干粉， 并且可 以被装入适于施用的分配器中。有数种类型的药物吸入装置 - 喷雾器吸入器、 定量吸入器 (MDI) 和干粉吸入器 (DPI)。喷雾器装置可产生高速空气流， 使治疗剂 ( 以液体形式配制 ) 喷成薄雾， 其被带入患者的呼吸道。MDI 通常是用压缩气体包装的制剂。启动后， 该装置通 过压缩气体释放出定量的治疗剂， 由此提供施用指定量的物质的可靠方法。 DPI 可分配自由 流动的粉末形式的治疗剂， 这些治疗剂可以在通过该装置进行呼吸的过程中被分散到患者 的吸入气流中。为了获得自由流动的粉末， 治疗剂可与赋形剂如乳糖进行配制。定量的治 疗剂以胶囊形式贮存， 并且用每次启动进行分配。 本发明还涉及其中式 (I) 化合物的粒度在 10-1000nm、 优选 10-400nm 之间的制 剂。尤其对于显示出生物利用度差的药物， 根据可以通过增加表面积、 即减小粒度来提 高生物利用度的原理， 已经开发了这类药物制剂。例如， U.S.4,107,288 描述了具有大小 范围为 10 至 1,000nm 的颗粒的药物制剂， 其中活性物质被支持在交联的大分子基质上。 U.S.5,145,684 描述了药物制剂的制备， 其中在表面修饰剂的存在下药物物质被粉碎成纳 米粒 ( 平均粒度为 400nm)， 然后被分散在液体介质中， 得到显示出非常高的生物利用度的 药物制剂。这两篇文献均被包括在本文内作为参考。
     在另外的方面， 本发明提供了药物组合物， 其包含 ( 治疗有效量 ) 的式 (I) 化合物 以及至少一种可药用赋形剂。可接受的赋形剂是无毒的、 可帮助施用并且不会不利地影响 式 I 化合物的治疗益处。这类赋形剂可以是任意固体、 液体、 半固体， 或者对于气雾剂组合 物而言可以是本领域技术人员通常可得到的气体赋形剂。
     固体药物赋形剂包括淀粉、 纤维素、 滑石粉、 葡萄糖、 乳糖、 蔗糖、 明胶、 麦芽、 米、 面 粉、 白垩、 硅胶、 硬脂酸镁、 硬脂酸钠、 单硬脂酸甘油酯、 氯化钠、 脱脂奶粉等。
     液体和半固体赋形剂可以选自甘油、 丙二醇、 水、 乙醇和多种油类、 包括石油、 动 物、 植物或合成来源的那些、 例如花生油、 大豆油、 矿油、 芝麻油等。特别用于可注射溶液的 优选的液体载体包括水、 盐水、 葡萄糖水和二醇类。
     压缩气体可以用于分散气雾剂形式的式 (I) 化合物。适于该目的的惰性气体有氮 气、 二氧化碳等。其它适宜的药物赋形剂及其制剂在 E.W.Martin 编写的 《雷明顿药物科学》 (Remington′ s Pharmaceutical Sciences)( 马克 (Mack) 出版公司， 第 18 版， 1990) 中有 描述。
     制剂中化合物的量可以在本领域技术人员所采用的全部范围内改变。通常， 基于 重量百分数 ( 重量％ ) 计算， 制剂将含有约 0.01-99.99 重量％的式 (I) 化合物 ( 基于总制 剂计算 )， 而剩余物质为一种或多种适宜的药物赋形剂。优选化合物以约 1-80 重量％的水 平存在。
     本发明还涉及药物组合物， 其包含 ( 即含有或包括 ) 至少一种式 (I) 化合物以及 至少一种可药用赋形剂。
     包含游离形式或可药用盐形式的式 (I) 化合物以及至少一种可药用赋形剂 ( 例如 载体和 / 或稀释剂 ) 的药物组合物可以按照常规方式、 通过将组分混合来制备。
     包含游离形式或可药用盐形式的式 (I) 化合物并且还包含组合伙伴 ( 作为一个剂 量单位形式或作为成套药盒 ) 以及至少一种可药用的载体和 / 或稀释剂的组合的药物组合 物可以按照常规方式、 通过将可药用的载体和 / 或稀释剂与所述的活性成分混合来制备。
     因此， 在另外的方面， 本发明提供了 ：
     ■组合的药物组合物， 例如用于本文描述的任意方法， 其包含游离形式或可药用 盐形式的式 (I) 化合物以及可药用的稀释剂和 / 或载体。
     ■组合的药物组合物， 其包含作为活性成分的游离形式或可药用盐形式的式 (I) 化合物 ； 一种或多种可药用的载体物质和 / 或稀释剂以及任选的一种或多种另外的药物物 质。这类组合的药物组合物可以是一种剂量单位形式或作为成套药盒。
     ■组合的药物组合物， 其包含治疗有效量的游离形式或可药用盐形式的式 (I) 化 合物以及第二种药物物质， 它们可同时或先后施用。
     ■如上定义的方法， 该方法包括共同施用， 例如同时或先后施用治疗有效的无毒 量的式 (I) 化合物或其可药用盐以及至少第二种药物物质、 例如如上所示的第二种药物物 质。
     ■药物组合产品， 例如药盒， 其包含 a) 第一种物质， 它是游离形式或可药用盐形 式的如本文公开的式 (I) 化合物， 和 b) 至少一种共用药物、 例如如上所示的共用药物 ； 其中 这类药盒可以包含其施用说明书。
     以下的式 (I) 化合物的实施例说明了本发明而非限制其范围。制备这类化合物的 方法在下文有描述。
     实 施 例 1： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 叔 丁 基 - 吡 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
     在氩气中将 Et3N(1.54mL， 11.1mmol， 3 当量 ) 加入咪唑 -1- 甲酸 [5-(2- 叔丁基 - 吡 啶 -4- 基 )-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 ]- 酰 胺 ( 步 骤 1.1)(1.26g， 3.7mmol) 和 L- 脯 氨 酰 胺 (0.548g， 4.8mmol， 1.3 当量 ) 在 DMF(25mL) 的溶液中。 将反应混合物在室温下搅拌 14 小时， 通过加入饱和 NaHCO3 溶液猝灭， 并用 EtOAc 萃取。将有机相用饱和 NaHCO3 溶液洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱 (DCM/MeOH， 1 ∶ 0 → 94 ∶ 6) 纯化， 然后用 + Et2O 研磨， 得到 1.22g 标题化合物， 为灰白色固体 ： ESI-MS ： 388.1[M+H] ； tR ＝ 2.35min( 系 1 统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.36(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。 H NMR(400MHz， DMSO-d6)δ(ppm) ： 1.32(s， 9H)1.75-1.95(m ， 3H)1.97-2.13(m ， 1H)2.39(s ， 3H)3.38-3.50(m ， 1H)3.52-3.65(m. ， 1H)4.10-4.40(m， 1H)6.94(b r.s.， 1H)7.22(d， 1H)7.30-7.48(m， 2H)8.49(d， 1H)10.87(b r.s.， 1H)
     步骤 1.1 ： 咪唑 -1- 甲酸 [5-(2- 叔丁基 - 吡啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰 胺
     将 5-(2- 叔丁基 - 吡啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基胺 ( 步骤 1.2)(1g， 4.05mmol) 和 1， 1’ - 羰 基 二 咪 唑 (0.984g， 6.07mmol， 1.5 当 量 ) 在 DCM(50mL) 中 的 混 合 物 回 流 搅 拌 4 小时， 并冷却。经过滤收集所得沉淀， 得到 1.26g 标题化合物， 为白色固体 ： ESI-MS ： 340.2[M-H] ； tR ＝ 2.85min( 系统 1)。
     步骤 1.2 ： 5-(2- 叔丁基 - 吡啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基胺将 N-[5-(2- 叔丁基 - 吡啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 乙酰胺 ( 步骤 1.3)(2g， 7mmol)、 6N 的 HCl 水溶液 (10mL) 和 EtOH(50mL) 的混合物在 85℃下搅拌 2 小时， 冷却， 通过 加入饱和 NaHCO3 溶液猝灭并用 DCM/MeOH(9 ∶ 1， v/v) 萃取。将有机相用饱和 NaHCO3 溶液 洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。 将残余物经硅胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH， 1 ∶ 0 → 96 ∶ 4) + 得 到 1.21g 标 题 化 合 物， 为黄色固体 ： ESI-MS ： 248.1[M+H] ； TLC ： Rf ＝ 0.36(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 1.3 ： N-[5-(2- 叔丁基 - 吡啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 乙酰胺
     在 氩 气 中 将 2- 乙 酰 氨 基 -4- 甲 基 噻 唑 (1.2g， 7.7mmol， 1.1 当 量 )、 碳酸铯 四氟硼酸盐 (0.406g， 1.4mmol， 0.2 当量 )、 乙酸钯(4.55g， 14mmol， 2 当量 )、 三叔丁基(II)(0.15g， 0.7mmol， 0.1 当量 ) 和 4- 溴 -2- 叔丁基 - 吡啶 ( 步骤 1.4)(1.5g， 7mmol) 在 DMF(50mL) 中的混合物在 90℃下搅拌 1.5 小时， 冷却， 通过加入饱和 NaHCO3 溶液猝灭， 并经 硅藻土垫过滤。将滤液用 EtOAc 萃取。将有机相用饱和 NaHCO3 溶液洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过 滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH， 1 ∶ 0 → 97 ∶ 3) 得到 2.02g 标题化合 + 物， 为黄色固体 ： ESI-MS ： 290.1[M+H] ； TLC ： Rf ＝ 0.35(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 1.4 ： 4- 溴 -2- 叔丁基 - 吡啶
     将 2- 叔丁基 -1H- 吡啶 -4- 酮 ( 步骤 1.5)(4.25g， 28mmol) 和 POBr3(8.88g， 31mmol， 1.1 当量 ) 的混合物加热至 120℃， 搅拌 15 分钟， 冷却， 通过加入饱和 NaHCO3 溶液猝灭， 并用 DCM/MeOH(9 ∶ 1， v/v) 萃取。 将有机相用饱和 NaHCO3 溶液洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。 将残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 95 ∶ 5) 得到 5.18g 标题化合物， 为黄色油状物 ： + ESI-MS ： 214.0/216.0[M+H] ； tR ＝ 2.49min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.35(Hex/EtOAc， 1 ∶ 1)。
     步骤 1.5 ： 2- 叔丁基 -1H- 吡啶 -4- 酮
     将 2- 叔丁基 - 吡喃 -4- 酮 ( 步骤 1.6)(5.74g， 37.7mmol) 和 30％的氢氧化铵水溶 液 (100mL) 回流下搅拌 1 小时， 冷却并浓缩。 将残余物用 MeOH(200mL) 研磨并过滤。 浓缩滤 aq 液并将残余物经硅胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH/NH3 ， 94 ∶ 5 ∶ 1 → 92 ∶ 7 ∶ 1) 得到 4.46g 标 + 题化合物， 为黄色固体 ： ESI-MS ： 152.0[M+H] ； tR ＝ 1.45min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.11(DCM/ MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 1.6 ： 2- 叔丁基 - 吡喃 -4- 酮
     将 5- 羟基 -1- 甲氧基 -6， 6- 二甲基 - 庚 -1， 4- 二烯 -3- 酮 ( 步骤 1.7)(6.8g， 36.9mmol) 和 TFA(5.65mL， 74mmol， 2 当量 ) 在苯 (250mL) 中的混合物在室温下搅拌 14 小时 并浓缩。 残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 1 ∶ 0 → 75 ∶ 25)， 得到 5.74g 标题化合物， + 为黄色油状物 ： ESI-MS ： 153.1[M+H] ； tR ＝ 3.21min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.22(Hex/EtOAc，
     1 ∶ 1)。
     步骤 1.7 ： 5- 羟基 -1- 甲氧基 -6， 6- 二甲基 - 庚 -1， 4- 二烯 -3- 酮
     将 LiHMDS(1M 的 THF 溶 液， 100mL， 2 当 量 ) 逐 滴 加 入 冷 却 的 (-78 ℃ )4- 甲 氧 基 -3- 丁烯 -2- 酮 (10mL， 100mmol， 2 当量 ) 在 THF(400mL) 的溶液中。在 -78℃搅拌 30 分 钟后， 加入特戊酰氯 (6.12mL， 50mmol) 在 THF(100mL) 中的溶液。将所得混合物历经 2 小时 加温至室温， 并通过加入饱和 NH4Cl 溶液猝灭。真空除去 THF。将该浓缩的混合物用 Et2O 萃取。有机相用盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/ EtOAc， 1 ∶ 0 → 85 ∶ 15) 得到 6.83g 标题化合物， 为黄色油状物 ： ESI-MS ： 185.1[M+H]+ ； TLC ： Rf ＝ 0.87(Hex/EtOAc， 1 ∶ 1)。
     实 施 例 2： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 环 丙 基 - 吡 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
     按照与实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。 在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 4 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 85℃搅拌 2 小时。 在步骤 1.3 中， 使用 4- 氯 -2-(1- 甲基 - 环丙基 )- 吡啶 ( 步骤 2.1)， 并将反应混合物在 + 150℃下搅拌 2 小时。 标题化合物 ： ESI-MS ： 372.1[M+H] ； TLC ： Rf ＝ 0.35(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 2.1 ： 4- 氯 -2- 环丙基 - 吡啶
     按照文献 [Comins， D.L. ； Mantlo， N.B.， Journal of Organic Chemistry， (1985)， 50， 4410-4411] 中所述方法的修改方法制备标题化合物。
     将环丙基溴化镁 (0.5M 的 THF 溶液， 100mL， 50mmol， 2.2 当量 ) 一次加入冷却的 (-78℃ )4- 氯吡啶盐酸化物 (3.4g， 22mmol) 在 THF(68mL) 的溶液中。在 -78 ℃搅拌 10 分 钟后， 逐滴加入氯甲酸苯基酯 (2.76mL， 22mmol)。将反应混合物在 -78℃搅拌 15 分钟， 加温 至室温， 通过加入 20％的 NH4Cl 水溶液猝灭， 并用 Et2O 萃取 (2x100mL)。将有机相用饱和
     NaHCO3 溶液 (50mL) 洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。 向溶于甲苯 (100mL) 的残余物中加入 邻 - 氯醌 (6g， 24.2mmol， 1.1 当量 ) 在冰醋酸 (50mL) 中的溶液。将反应混合物在室温下搅 拌 14 小时， 冷却至 0℃， 通过加入 10％ NaOH 水溶液碱化， 并经硅胶垫过滤。 将滤液中的有机 层用 H2O(20mL) 洗涤， 并用 10％的 HCl 水溶液萃取 (3x25mL)。通过加入 20％的 NaOH 水溶 液将合并的酸层碱化， 并用 DCM 萃取 (3x25mL)。 将有机相用 H2O(50mL) 洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。残余物经硅胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH， 1 ∶ 0 → 99 ∶ 1) 得到 0.951g 标题化 + 合物， 为无色油状物 ： ESI-MS ： 154.1[M+H] ； tR ＝ 1.41min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.85(DCM/ MeOH， 9 ∶ 1)。
     实施例3： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-({5-[2-(2- 氟 - 苯 基 )- 吡 啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     按 照 实 施 例 1 中 所 述 类 似 的 方 法 制 备 标 题 化 合 物， 但 在 步 骤 1.3 中 使 用 4- 氯 -2-(2- 氟 - 苯基 )- 吡啶 ( 步骤 3.1)， 并在 150℃下搅拌对应的混合物 2 小时 ： ESI-MS ： + 426.1[M+H] ； tR ＝ 2.60min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.40(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 3.1 ： 4- 氯 -2-(2- 氟 - 苯基 )- 吡啶
     在 105℃下在氩气中将 2- 氟苯基硼酸 (141mg， 1mmol， 1.2 当量 ) 在 EtOH(1mL) 中 的混合物加入 4- 氯 -2- 碘 - 吡啶 [Choppin， S. ； Gros， P. ； Fort， Y.， European Journal of Organic Chemistry(2001)， (3)， 603-606](200mg， 0.84mmol)， PdCl2(dPPf)(18mg， 0.025mmol， 0.03 当量 ) 和 Na2CO3(2M 的 H2O 溶液， 1.68mL， 3.36mmol， 4 当量 ) 在甲苯 (2mL) 的混合物中。将反应混合物在 105℃下搅拌 1 小时， 冷却至室温， 通过加入饱和 NaHCO3 溶液 猝灭， 并用 EtOAc 萃取。将有机相用饱和 NaHCO3 溶液洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将 残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 1 ∶ 0 → 97 ∶ 3) 得到 127mg 标题化合物， 为白色固 + 体： ESI-MS ： 208.1[M+H] ； tR ＝ 4.66min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.27(Hex/EtOAc， 9 ∶ 1)。
     实 施 例 4： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 环 丁 基 - 吡 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
     按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 4 小时， 用 EtOAc 和 H2O 稀释， 并用 EtOAc 萃取。干燥并浓 缩有机相后， 将残余物在 DCM 中研磨进行纯化。在步骤 1.3 中， 将反应混合物在 120℃下搅 拌 2 小时， 冷却， 用 EtOAc 和 H2O 稀释， 经硅藻土垫过滤， 并用 EtOAc 萃取。干燥并浓缩有机 相后， 将残余物在 Et2O 中研磨进行纯化。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 80℃下搅拌 1 小 时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.7 中， 将 4- 甲氧基 -3- 丁烯 -2- 酮在 THF 中的溶液 加入冷却的 (-78℃ )LiHMDS 在 THF 中的溶液。30 分钟后， 加入环丁基甲酰氯的 THF 溶液， 并将反应混合物历经 18 小时达到室温。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 386.1[M+H]+ ； TLC ： Rf ＝ 0.11(DCM/MeOH， 95 ∶ 5)。
     实施例 5 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环丙 基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在步骤 1.1中， 将反应混合物在回流下搅拌 14 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 85℃下搅拌 1 小 时。在步骤 1.3 中， 将反应混合物在 120 ℃下搅拌 3 小时。在步骤 1.5 中， 将反应混合物 65-70℃下搅拌 1 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.7 中， 使用 1- 甲基 - 环丙烷甲 酰氯 ( 步骤 5.1)。
     标 题 化 合 物： ESI-MS ： 386.1[M+H]+ ； TLC ： Rf ＝ 0.40(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。 1 H NMR(400MHz ，DMSO-d6) δ (ppm) ： 0.71-0.87(m ， 2H)1.11-1.26(m ， 2H)1.47(s ， 3H)1.74-1.96(m ， 3H)2.00-2.15(m ， 1H)2.39(s ， 3H)3.35-3.52(m ， 1H)3.52-3.73(m ， 1H)4.10-4.40(m ， 1H)6.93(br.s. ， 1H)7.15(dd ， 1H)7.27(s ， 1H)7.35(s ， 1H)8.40(d ， 1H)10.99(b r.s.， 1H)
     步骤 5.1 ： 1- 甲基 - 环丙烷甲酰氯
     将 1- 甲基 - 环丙烷甲酸 (10g， 100mmol) 和草酰氯 (10.49ml， 120mmol， 1.2 当量 ) 在 CHCl3(80ml) 中的混合物在 70℃下搅拌 4 小时。 浓缩反应混合物得到 11.8g 标题化合物， 为黄色油状物， 其不经进一步纯化直接使用。
     实施例 6 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环丁 基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物通过加入 EtOAc 和 H2O 稀释进行猝灭， 并用 EtOAc 萃取。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 100℃下搅拌 2 小时。在步骤 1.3 中， 将反应混合物在 100℃下搅拌 3 小 时， 用 EtOAc/H2O 稀释， 并用 EtOAc 萃取。干燥并浓缩有机相后， 将残余物经硅胶柱色谱纯 化 (Hex/EtOAc， 1 ∶ 4)。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 80℃下搅拌 2 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.7 中， 将 4- 甲氧基 -3- 丁烯 -2- 酮 (50mmol) 在 THF(100mL) 中的溶液 加入冷却的 (-78℃ )LiHMDS(1M 的 THF 溶液， 100mL) 在 THF(200mL) 的溶液中。30 分钟后， 加入 1- 甲基 - 环丁烷氯化物 ( 步骤 6.1)， 并将反应混合物历经 18 小时达到室温。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 400.1[M+H]+ ； TLC ： Rf ＝ 0.06(DCM/MeOH/NH3aq， 94 ∶ 5 ∶ 1)。
     步骤 6.1 ： 1- 甲基 - 环丁烷甲酰氯
     按照如步骤 5.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 1- 甲基 - 环丁烷甲酸 [Cowling， S.J. ； Goodby， J.W.， Chemical Communications， (2006)， (39)， 4107-4109]。实施例 7 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[5-(2- 叔丁基 - 吡啶 -4- 基 )- 噻 唑 -2- 基 ]- 酰胺 }按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 16 小时， 通过加入 EtOAc 和 H2O 稀释进行猝灭， 并用 EtOAc 萃 取。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 2 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 100℃下搅拌 1 小时。在步骤 1.3 下， 使用 N- 噻唑 -2- 基 - 乙酰胺。将反应混合物在 120℃ 搅拌 2 小时， 用 EtOAc/H2O 稀释， 并用 EtOAc 萃取。干燥并浓缩有机相后， 将残余物经硅胶 柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 1 ∶ 1)， 然后在 Et2O 中研磨。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 374.1[M+H]+ ； tR ＝ 2.16min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.10(DCM/ aq MeOH/NH3 ， 94 ∶ 5 ∶ 1)。
     实 施 例 8： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 异 丙 基 - 吡 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
     按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 16 小时， 通过加入 EtOAc 和 H2O 稀释进行猝灭， 并用 EtOAc 萃取。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 100℃搅拌 2 小时。在步骤 1.3 中， 使用 4- 氯 -2- 异 丙基 - 吡啶 ( 步骤 8.1)。 将反应混合物在 150℃搅拌 3 小时， 用 EtOAc/H2O 稀释， 并用 EtOAc 萃取。干燥并浓缩有机相后， 将残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 25 ∶ 75)。 +
     标题化合物 ： ESI-MS ： 374.1[M+H] ； tR ＝ 1.99min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.10(DCM/ aq MeOH/NH3 ， 94 ∶ 5 ∶ 1)。
     步骤 8.1 ： 4- 氯 -2- 异丙基 - 吡啶
     按照步骤 2.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用异丙基氯化镁 (2M 在 THF + 中的溶液 ) ： ESI-MS ： 156.0[M+H] ； TLC ： Rf ＝ 0.32(DCM)。
     实施例 9 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[5-(2- 环丁基 - 吡啶 -4- 基 )- 噻 唑 -2- 基 ]- 酰胺 }按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 16 小时， 用 DCM/H2O 稀释， 并用 DCM 萃取。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 100 ℃下搅拌 2 小时， 且粗产物不再纯化。在步骤 1.3 中， 使用 N- 噻 唑 -2- 基 - 乙酰胺。将反应混合物在 120 ℃下搅拌 3 小时， 通过加入 EtOAc 和 H2O 稀释进 行猝灭， 并用 EtOAc 萃取。干燥并浓缩有机相后， 将残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 2 ∶ 3)。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 80℃下搅拌 1 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在 步骤 1.7 中， 将 4- 甲氧基 -3- 丁烯 -2- 酮 (50mmol) 在 THF(100mL) 中的溶液加入冷却的 (-78℃ )LiHMDS(1M 的 THF 溶液， 100mL) 在 THF(200mL) 的溶液中。30 分钟后， 加入环丁基 甲酰氯， 并将反应混合物历经 18 小时达到室温。
     标 题 化 合 物： ESI-MS ： 372.1[M+H] + ； TLC ： Rf ＝ 0.13(DCM/MeOH/NH3aq， 91.5 ∶ 7.5 ∶ 1)。
     实施例 10 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(1- 甲基 - 环丙基 )- 吡 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 14 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 85℃下搅拌 1 小 时。在步骤 1.3 中， 使用 N- 噻唑 -2- 基 - 乙酰胺， 并将反应混合物在 120℃下搅拌 4 小时。 在步骤 1.5 中， 不再进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.7 中， 使用 1- 甲基 - 环丙烷甲酰氯 ( 步骤 5.1)。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 372.1[M+H]+ ； TLC ： Rf ＝ 0.43(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。
     实 施 例 11 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-({5-[2-(1- 三 氟 甲 基 - 环 丙 基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 14 小时。在步骤 1.3 中， 使用 N- 噻唑 -2- 基 - 乙酰胺。 将反应混合物在 120℃下搅拌 2 小时。在步骤 1.4 中， 使用 1， 2- 二氯乙烷 ( 每 mmol 的吡 啶 -4- 酮用 2.55mL) 作为溶剂。将反应混合物在 83℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 65℃下搅拌 1 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步 骤 1.7 中， 使用 1- 三氟甲基 - 环丙烷甲酰氯 ( 步骤 11.1)。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 426.0[M+H]+ ； tR ＝ 2.35min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.25(DCM/ MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 11.1 ： 1- 三氟甲基 - 环丙烷甲酰氯
     按照步骤 5.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 1- 三氟甲基 - 环丙烷甲酸。
     实施例 12 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲 基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 5 小时。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 14 小 时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 85℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步 骤 1.3 中， 使用 N- 噻唑 -2- 基 - 乙酰胺。将反应混合物在 120℃下搅拌 2.5 小时。在步骤 1.4 中， 将反应混合物在 83℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.5 中， 将 反应混合物在 65℃下搅拌 1 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 粗产物不再纯 化。在步骤 1.7 中， 使用 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酰氯 ( 步骤 12.1)。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 428.0[M+H]+ ； tR ＝ 2.75min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.21(DCM/ MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 12.1 ： 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酰氯
     按照步骤 5.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲 基 - 丙酸。
     实 施 例 13 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-({5-[2-(1- 三 氟 甲 基 - 环 丁 基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 18 小时， 通过用 DCM/H2O 稀释猝灭， 并用 DCM 萃取。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 1 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 100℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。在步骤 1.3 中， 使用 N- 噻唑 -2- 基 - 乙酰胺。将反应混合 物在 120℃下搅拌 5 小时， 通过用 EtOAc/H2O 稀释猝灭， 并用 EtOAc 萃取。在步骤 1.4 中， 使 用 1， 2- 二氯乙烷 ( 每 mmol 的吡啶 -4- 酮用 2.26mL) 作为溶剂。将反应混合物在回流下搅 拌 1 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在室温下搅拌 1 小时， 不 进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 将反应混合物在室温下搅拌 18 小时。在步骤 1.7 中， 将 4- 甲氧基 -3- 丁烯 -2- 酮在 THF 中的溶液加入冷却的 (-78℃ )LiHMDS 在 THF 的溶液 中。30 分钟后， 加入 1- 三氟甲基 - 环丁烷甲酰氯 ( 步骤 13.1) 在 THF 中的溶液。将反应混 合物历经 18 小时达到室温， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 440.0[M+H]+ ； tR ＝ 2.68min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.08(DCM/ aq MeOH/NH3 ， 91.5 ∶ 7.5 ∶ 1)。
     步骤 13.1 ： 1- 三氟甲基 - 环丁烷甲酰氯
     按照步骤 5.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 1- 三氟甲基 - 环丁烷甲 酸， 并将反应混合物在回流下搅拌 2 小时。
     实施例 14 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2-(1- 三氟甲基 - 环 丙基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 14 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 85℃下搅拌 1 小 时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.3 中， 将反应混合物在 120℃下搅拌 2 小时。在步 骤 1.4 中， 使用 1， 2- 二氯乙烷 ( 每 mmol 的吡啶 -4- 酮用 2.55mL) 作为溶剂。将反应混合 物在 83℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 65℃ 下搅拌 1 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.7 中， 使用 1- 三氟甲基 - 环丙烷甲酰氯 ( 步骤 11.1)。
     标 题 化 合 物： ESI-MS ： 440.0[M+H]+ ； tR ＝ 2.65min( 系 统 1) ； TLC ： Rf ＝ 1 0.36(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。 H NMR(400MHz， DMSO-d6)δ(ppm) ： 1.41(s， 4H)1.70-1.90(m， 3H)2.00-2.10(m ， 1H)2.40(s ， 3H)3.36-3.52(m ， 1H)3.52-3.65(m ， 1H)4.10-4.40(m ， 1H)6.95(b r.s.， 1H)7.37(d， 2H)7.47(s， 1H)8.52(d， 1H)10.94(b r.s.， 1H)
     实施例 15 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 14 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 85℃下搅拌 1 小 时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。 在步骤 1.3 中， 将反应混合物在 120℃下搅拌 2.5 小时。 在步 骤 1.4 中， 将反应混合物在 83℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 65℃下搅拌 1 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 粗产物不再 纯化。在步骤 1.7 中， 使用 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酰氯 ( 步骤 12.1)。
     标 题 化 合 物： ESI-MS ： 442.0[M+H]+ ； tR ＝ 3.02min( 系 统 1) ； TLC ： Rf ＝ 1 0.35(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。 H NMR(400MHz， DMSO-d6)δ(ppm) ： 1.60(s， 6H)1.70-1.95(m， 3H)1.99-2.16(m ， 1H)2.40(s ， 3H)3.38-3.51(m ， 1H)3.51-3.69(m ， 1H)4.10-4.40(m ， 1H)6.95(b r.s.， 1H)7.39(d， 2H)7.53(s， 1H)8.58(d， 1H)10.93(br.s.， 1H)
     在一项可选择的方法中， 按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进 行以下修改 ： 使用 N， N- 二甲基乙酰胺代替 DMF， 并将该混合物在 65℃下搅拌 2 小时。在步 骤 1.1 中， 使用氯甲酸苯基酯 ( 缓慢加入 ) 代替 1， 1’ - 羰基二咪唑， 并将该反应在 THF 中在 N， N- 二乙基 - 异丙基胺的存在下于室温下进行 (1.5h)。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在搅 拌下加热 5 小时 ( 回流 )， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。 在步骤 1.3 中， 将反应混合物在 100℃ 下搅拌 2 小时。在步骤 1.4 中， 该反应在甲苯中进行， 使用 1.1 当量的 POBr3 和 1.1 当量的 三丙基胺， 并将该混合物在 80℃下搅拌 2 小时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 65℃下搅拌 1 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 使用甲苯代 替苯， 且粗产物不再纯化。在步骤 1.7 中， 使用 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酰氯 ( 步骤 12.1)。
     实施例 16 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2-(1- 三氟甲基 - 环 丁基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 72 小时， 通过用 DCM/H2O 稀释猝灭， 并用 DCM 萃取。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 1 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 100℃下搅拌 2 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。在步骤 1.3 中， 将反应混合物在 120℃下搅拌 6 小时， 通过 加入 EtOAc 和 H2O 稀释进行猝灭， 经硅藻土垫过滤并用 EtOAc 萃取。在步骤 1.4 中， 使用 1， 2- 二氯乙烷 ( 每 mmol 的吡啶 -4- 酮用 2.26mL) 作为溶剂。将反应混合物在回流下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在室温下搅拌 1 小时， 不进行 在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 将反应混合物在室温下搅拌 18 小时。在步骤 1.7 中， 将 4- 甲氧基 -3- 丁烯 -2- 酮在 THF 中的溶液加入冷却的 (-78℃ )LiHMDS 在 THF 的溶液中。30 分钟后， 加入 1- 三氟甲基 - 环丁烷甲酰氯 ( 步骤 13.1) 的 THF 溶液。将反应混合物历经 18 小时达到室温， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 454.1[M+H]+ ； tR ＝ 2.90min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.22(DCM/ aq MeOH/NH3 ， 91.5 ∶ 7.5 ∶ 1)。
     实施例 17 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(1- 甲基 - 环丁基 )- 吡 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 24 小时， 通过加入 EtOAc 和 H2O 稀释进行猝灭， 并用 EtOAc 萃取。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 100℃下搅拌 2 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。在步 骤 1.3 中， 使用 N- 噻唑 -2- 基 - 乙酰胺。将反应混合物在 100℃下搅拌 3 小时， 用 EtOAc/ H2O 稀释， 并用 EtOAc 萃取。 干燥并浓缩有机相后， 将残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 25 ∶ 75)。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 80℃下搅拌 2 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。 在步骤 1.7 中， 将 4- 甲氧基 -3- 丁烯 -2- 酮在 THF 中的溶液加入冷却的 (-78℃ )LiHMDS 在 THF 的溶液中。30 分钟后， 加入 1- 甲基 - 环丁烷氯化物 ( 步骤 6.1) 在 THF 中的溶液， 并将 反应混合物历经 18 小时达到室温。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 386.1[M+H]+ ； tR ＝ 2.32min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.05(DCM/ aq MeOH/NH3 ， 94 ∶ 5 ∶ 1)。
     实施例 18 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(1- 氰基 - 环丙基 )- 吡 啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 16 小时， 通过加入 EtOAc 和 H2O 稀释进行猝灭， 并用 EtOAc 萃取。在步骤 1.1 中， 使用 1-[4-(2- 氨基 -4- 甲基 - 噻唑 -5- 基 )- 吡啶 -2- 基 ]- 环丙烷 甲腈 ( 步骤 18.1)， 并将反应混合物在回流下搅拌 2 小时。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 397.0[M+H]+ ； tR ＝ 2.90min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.08(DCM/ 1 aq 94 ∶ 5 ∶ 1)。 H NMR(400MHz， DMSO-d6)δ(ppm) ： 1.69-1.93(m， 7H)2.00-2.20(m， MeOH/NH3 ， 1H)2.42(s ， 3H)3.38-3.50(m ， 1H)3.50-3.65(m ， 1H)4.10-4.40(m ， 1H)6.94(b r.s. ， 1H)7.34(dd， 1H)7.37(b r.s.， 1H)7.47(s， 1H)8.47(d， 1H)
     步骤 18.1 ： 1-[4-(2- 氨基 -4- 甲基 - 噻唑 -5- 基 )- 吡啶 -2- 基 ]- 环丙烷甲腈
     将 {5-[2-(1- 氰 基 - 环 丙 基 )- 吡 啶 -4- 基 ]-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 }- 氨 基 甲 酸叔丁基酯 ( 步骤 18.2)(295mg)、 DCM(4mL) 和 TFA(1mL) 的混合物在室温下搅拌 2 小时， 并随后浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH/NH3aq， 94 ∶ 5 ∶ 1) 得到 182mg 标题 + 化合物 ： ESI-MS ： 257.1[M+H] ； tR ＝ 2.54min( 系 统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.30((DCM/MeOH/NH3aq， 94 ∶ 5 ∶ 1)。
     步骤 18.2 ： {5-[2-(1- 氰基 - 环丙基 )- 吡啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 氨 基甲酸叔丁基酯按 照 步 骤 1.3 中 所 述 类 似 的 方 法 制 备 标 题 化 合 物， 但 使 用 1-(4- 溴 - 吡 啶 -2- 基 )- 环丙烷甲腈 ( 步骤 18.3) 和 (4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 )- 氨基甲酸叔丁基酯 ( 步 骤 18.4)。将反应混合物在 100℃下搅拌 2 小时， 通过加入 EtOAc 和 H2O 稀释进行猝灭， 并用
     EtOAc 萃取。粗产物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 1 ∶ 1)， 得到 122mg 标题化合物， 为白 + 色固体 ： ESI-MS ： 357.1[M+H] ； tR ＝ 4.86min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.29(Hex/EtOAc， 1 ∶ 1)。
     步骤 18.3 ： 1-(4- 溴 - 吡啶 -2- 基 )- 环丙烷甲腈
     将 LiHMDS(1M 甲 苯 溶 液， 17.6mL， 17.6mmol， 3.1 当 量 ) 逐 滴 加 入 冷 却 的 (-5℃ )4- 溴 -2- 氟 - 吡啶 [Marsais， F. 等人， Journal of Organic Chemistry， (1992)， 57， 565-573](1g， 5.7mmol)、 环丙烷甲腈 (1.25mL， 17mmol， 3 当量 )、 4 分子筛和甲苯 (20mL)的混合物中。 将反应混合物加温至室温， 搅拌 16 小时， 倒入 H2O 中并过滤。 将滤液用 EtOAc/ H2O 稀释并用 EtOAc 萃取。有机相用 H2O 和盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将残余 物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 9 ∶ 1)， 得到 620mg 标题化合物， 为白色固体 ： ESI-MS ： + 223.1/225.1[M+H] ； tR ＝ 4.22min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.25(Hex/EtOAc， 9 ∶ 1)。
     步骤 18.4 ： (4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 )- 氨基甲酸叔丁基酯
     将二碳酸二叔丁基酯 (21g， 96.5mmol， 1.1 当量 ) 在 t-BuOH(50mL) 中的溶液加入 4- 甲基 -2- 氨基噻唑 (10g， 87.7mmol) 和 DMAP(1.1g， 8.8mmol， 0.1 当量 ) 在 t-BuOH(50mL) 的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌 72 小时并浓缩。将残余物用 EtOAc/H2O 稀释并用 EtOAc 萃取。有机相用 H2O 和盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色 谱纯化 (DCM/MeOH， 98 ∶ 2)， 得到 15.2g 标题化合物， 为白色固体 ： ESI-MS ： 215.1[M+H]+ ； tR ＝ 3.43min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.30(DCM/MeOH， 98 ∶ 2)。
     实施例 19 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(1- 氰基 - 环丁基 )- 吡 啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 6 小时。在步骤 1.1 中， 使用 1-[4-(2- 氨基 -4- 甲基 - 噻 唑 -5- 基 )- 吡啶 -2- 基 ]- 环丁烷甲腈 ( 步骤 19.1)， 并将反应混合物在回流下搅拌 3 小 时。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 411.1[M+H]+ ； TLC ： Rf ＝ 0.36(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。 步骤 19.1 ： 1-[4-(2- 氨基 -4- 甲基 - 噻唑 -5- 基 )- 吡啶 -2- 基 ]- 环丁烷甲腈将 {5-[2-(1- 氰 基 - 环 丁 基 )- 吡 啶 -4- 基 ]-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 }- 氨 基 甲 酸叔丁基酯 ( 步骤 19.2)(300mg)、 DCM(5mL) 和 TFA(1mL) 的混合物在室温下搅拌 4 小时， 通过加入饱和 NaHCO3 溶液猝灭 (50mL)， 并用 DCM 萃取 (3x75mL)。有机相用饱和 NaHCO3 溶 液 洗 涤 (2x50mL)， 干 燥 (Na2SO4)， 过 滤 并 浓 缩。 将 残 余 物 经 硅 胶 柱 色 谱 纯 化 (DCM/ MeOH， 1 ∶ 0 → 96 ∶ 4) 得到 181mg 标题化合物， 为黄色固体 ： ESI-MS ： 271.1[M+H]+ ； tR ＝ 2.48min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.45(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 19.2 ： {5-[2-(1- 氰基 - 环丁基 )- 吡啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 氨 基甲酸叔丁基酯
     按 照 步 骤 1.3 中 所 述 类 似 的 方 法 制 备 标 题 化 合 物， 但 使 用 1-(4- 溴 - 吡 啶 -2- 基 )- 环丁烷甲腈 ( 步骤 19.3) 和 (4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 )- 氨基甲酸叔丁基酯 ( 步 骤 18.4)。将反应混合物在 100℃下搅拌 3 小时。标题化合物 ： ESI-MS ： 371.1[M+H]+ ； tR ＝ 4.86min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.66(Hex/EtOAc， 1 ∶ 1)。
     步骤 19.3 ： 1-(4- 溴 - 吡啶 -2- 基 )- 环丁烷甲腈
     将 LiHMDS(1M 甲 苯 溶 液， 17.7mL， 17.7mmol， 3.1 当 量 ) 逐 滴 加 入 冷 却 的 (-5℃ )4- 溴 -2- 氟 - 吡啶 [Marsais， F. 等人， Journal of Organic Chemistry， (1992)， 57， 565-573](1g， 5.7mmol) 和环丁烷甲腈 (1.39g， 17.1mmol， 3 当量 ) 在甲苯中的溶液 (20mL)。 将反应混合物加温至室温， 搅拌 5 小时， 通过加入饱和 NaHCO3 溶液猝灭 (50mL)， 并经硅藻 土垫过滤。将滤液用 EtOAc 萃取 (3x75mL)。有机相用饱和 NaHCO3 溶液洗涤 (2x50mL)， 干 燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 1 ∶ 0 → 95 ∶ 5) 得 + 到 933mg 标题化合物， 为黄色油状物 ： ESI-MS ： 237.0/239.0[M+H] ； tR ＝ 4.27min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.30(Hex/EtOAc， 9 ∶ 1)。
     实施例 20 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(1- 氨基甲酰基 - 环丁 基 )- 吡啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 3 小时。在步骤 1.1 中， 使用 1-[4-(2- 氨基 -4- 甲基 - 噻 唑 -5- 基 )- 吡啶 -2- 基 ]- 环丁烷甲酰胺 ( 步骤 20.1)， 并将反应混合物在回流下搅拌 12 小时。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 429.1[M+H]+ ； tR ＝ 2.90min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.11(DCM/ MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 20.1 ： 1-[4-(2- 氨基 -4- 甲基 - 噻唑 -5- 基 )- 吡啶 -2- 基 ]- 环丁烷甲酰胺
     将 {5-[2-(1- 氰基 - 环丁基 )- 吡啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 氨基甲酸 叔丁基酯 ( 步骤 19.2)(640mg， 1.73mmol) 和浓硫酸的混合物在 0℃下搅拌 40 分钟， 加温至 室温， 搅拌 1 小时， 通过加入饱和 NaHCO3 溶液猝灭 (50mL)， 并用 DCM 萃取 (3x75mL)。有机相 用饱和 NaHCO3 溶液洗涤 (2x50mL)， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。残余物经硅胶柱色谱纯化 aq (DCM/MeOH/NH3 ， 99 ∶ 0 ∶ 1 → 93 ∶ 6 ∶ 1) 得到 35mg 标题化合物， 为黄色固体 ： ESI-MS ： + 289.1[M+H] ； TLC ： Rf ＝ 0.32(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。
     实施例 21 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(2- 二甲基氨基 -1， 1- 二 甲基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在步骤 1.1 中， 使用 5-[2-(2- 二甲基氨基 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 胺 ( 步骤 21.1)， 并将反应混合物在回流下搅拌 14 小时。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 431.1[M+H]+ ； TLC ： Rf ＝ 0.12(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 21.1 ： 5-[2-(2- 二甲基氨基 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻 唑 -2- 基胺
     按照步骤 19.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 {5-[2-(2- 二甲基氨 基 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 氨基甲酸叔丁基酯 ( 步 骤 21.2)， 并将反应混合物在室温下搅拌 2 小时。标题化合物 ： ESI-MS ： 291.1[M+H]+ ； tR ＝ 2.48min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.11(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 21.2 ： {5-[2-(2- 二甲基氨基 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]-4- 甲 基 - 噻唑 -2- 基 }- 氨基甲酸叔丁基酯
     将甲醛 (36 ％的 H2O 溶液， 0.144mL， 1.87mmol， 2 当量 ) 加入 {5-[2-(2- 氨基 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 氨基甲酸叔丁基酯 ( 步骤 21.3) (0.34g， 0.94mmol) 和乙酰氧基硼氢化钠 (0.6g， 2.82mmol， 3 当量 ) 在 1， 2- 二氯乙烷 (10mL) 中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌 1 小时并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (DCM/ MeOH/NH3aq， 99 ∶ 0 ∶ 1 → 97 ∶ 2 ∶ 1) 得 到 0.222g 标 题 化 合 物， 为白色固体 ： ESI-MS ： + 391.2[M+H] ； tR ＝ 4.27min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.15(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。
     步 骤 21.3 ： {5-[2-(2- 氨 基 -1， 1- 二 甲 基 - 乙 基 )- 吡 啶 -4- 基 ]-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 }- 氨基甲酸叔丁基酯
     在氩气中将 LiAlH4(1M 的 THF 溶液， 3.06mL， 3.06mmol， 1.5 当量 ) 加入 {5-[2-( 氰 基 - 二 甲 基 - 甲 基 )- 吡 啶 -4- 基 ]-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 }- 氨 基 甲 酸 叔 丁 基 酯 ( 步 骤 21.4)(0.73g， 2.04mmol) 在 THF(10mL) 的 溶 液 中。 将 反 应 混 合 物 在 室 温 下 搅 拌 2 小 时， 通 过 加 入 H2O(20mL) 猝 灭 并 用 EtOAc 萃 取 (2x75mL)。 有 机 相 用 饱 和 NaHCO3 溶 液 洗 涤 (2x50mL)， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH/NH3aq， 99 ∶ 0 ∶ 1 → 94 ∶ 5 ∶ 1) 得到 318mg 标题化合物， 为褐色固体 ： ESI-MS ： 363.1[M+H]+ ； TLC ： Rf ＝ 0.11(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。
     步 骤 21.4 ： {5-[2-( 氰 基 - 二 甲 基 - 甲 基 )- 吡 啶 -4- 基 ]-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 }- 氨基甲酸叔丁基酯
     按 照 步 骤 1.3 中 所 述 类 似 的 方 法 制 备 标 题 化 合 物， 但 使 用 2-(4- 碘 - 吡 啶 -2- 基 )-2- 甲基 - 丙腈 ( 步骤 21.5) 和 (4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 )- 氨基甲酸叔丁基酯 ( 步骤 18.4)。将反应混合物在 100℃下搅拌 3 小时。标题化合物 ： ESI-MS ： 359.1[M+H]+ ； TLC ： Rf ＝ 0.47(Hex/EtOAc， 1 ∶ 1)。
     步骤 21.5 ： 2-(4- 碘 - 吡啶 -2- 基 )-2- 甲基 - 丙腈
     按照步骤 19.3 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 2- 氟 -4- 碘吡啶。 标题 + 化合物 ： ESI-MS ： 273.0[M+H] ； tR ＝ 4.22min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.36(Hex/EtOAc， 9 ∶ 1)。
     实 施 例 22 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 二 乙 基 氨 基 - 吡 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 18 小时， 通过用 DCM/H2O 稀释猝灭， 并用 DCM 萃取。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 1 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 100℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。在步骤 1.3 中， 使用二乙基 -(4- 碘 - 吡啶 -2- 基 )- 胺 ( 步 骤 22.1)。将反应混合物在 120℃下搅拌 16 小时， 通过加入 EtOAc 和 H2O 稀释进行猝灭， 经 硅藻土垫过滤， 并用 EtOAc 萃取。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 403.2[M+H]+ ； tR ＝ 2.38min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.10(DCM/ MeOH/NH3aq， 91.5 ∶ 7.5 ∶ 1)。
     步骤 22.1 ： 二乙基 -(4- 碘 - 吡啶 -2- 基 )- 胺
     将 2- 氟 -4- 碘 吡 啶 (2g， 8.97mmol)、二 乙 胺 (2.77ml， 26.9mmol， 3当量)和K2CO3(2.48g， 17.94mmol， 2 当量 ) 在 DMF(20mL) 中的混合物在 100℃下搅拌 18 小时， 冷却至 室温， 用 EtOAc/H2O 稀释并用 EtOAc 萃取。有机相用 H2O 和盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并 浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/Et2O， 98 ∶ 2) 得到 2.3g 标题化合物， 为黄色油状 + 物： ESI-MS ： 277.1[M+H] ； TLC ： Rf ＝ 0.52(Hex/Et2O， 98 ∶ 2)。
     实 施 例 23 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 二 乙 基 氨 基 - 吡 啶 -4- 基 )- 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
     按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 18 小时， 通过用 DCM/H2O 稀释猝灭， 并用 DCM 萃取。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 1 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 100℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。在步骤 1.3 中， 使用二乙基 -(4- 碘 - 吡啶 -2- 基 )- 胺 ( 步 骤 22.1) 和 N- 噻唑 -2- 基 - 乙酰胺。将反应混合物在 120℃下搅拌 5 小时， 通过加入 EtOAc 经硅藻土垫过滤， 并用 EtOAc 萃取。 和 H2O 稀释进行猝灭，
     标题化合物 ： ESI-MS ： 389.2[M+H]+ ； tR ＝ 2.28min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.34(DCM/ aq MeOH/NH3 ， 91.5 ∶ 7.5 ∶ 1)。
     实 施 例 24 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(3- 叔 丁 基 -3H- 苯 并 咪 唑 -5- 基 )- 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
     按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 5 小时。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 14 小 时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 85℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.3 中， 使用 6- 溴 -1- 叔丁基 -1H- 苯并咪唑 ( 步骤 24.1) 和 N- 噻唑 -2- 基 - 乙酰胺。将 反应混合物在 120℃下搅拌 7 小时。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 413.2[M+H]+ ； tR ＝ 2.29min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.45(DCM/ MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 241.6- 溴 -1- 叔丁基 -1H- 苯并咪唑
     将 4- 溴 -N ＊ 2 ＊ - 叔丁基 - 苯 -1， 2- 二胺 ( 步骤 24.2)(2.14g， 8.80mmol) 和原甲 酸三乙酯 (14.7mL， 88mmol) 的混合物在 148℃下搅拌 1 小时， 冷却并浓缩。将残余物经硅 胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH， 1 ∶ 0 → 99 ∶ 1) 得到 1.74g 标题化合物， 为白色固体 ： ESI-MS ： + 253.0/255.0[M+H] ； tR ＝ 2.88min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.54(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。 ＊ ＊
     步骤 24.2 ： 4- 溴 -N 2 - 叔丁基 - 苯 -1， 2- 二胺
     室温下将 (5- 溴 -2- 硝基 - 苯基 )- 叔丁基 - 胺 ( 步骤 24.3)(6g， 21.97mmol) 和 兰尼镍 (2g) 在 MeOH/THF(1 ∶ 1v/v， 600mL) 中的混悬液在氢气中搅拌 9 小时。将反应混合 物经硅藻土垫过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 97 ∶ 3 → 3 ∶ 1) 得 + tR ＝ 2.75min( 系统 1) ； 到 4.4g 标题化合物， 为黑色油状物 ： ESI-MS ： 243.0/245.0[M+H] ； TLC ： Rf ＝ 0.89(Hex/EtOAc， 1 ∶ 1)。
     步骤 24.3 ： (5- 溴 -2- 硝基 - 苯基 )- 叔丁基 - 胺
     将 4- 溴 -2- 氟 - 硝基苯 (4g， 18.2mmol) 和叔丁基胺 (4.78mL， 45.5mmol， 2.5 当 量 ) 在 EtOH(80mL) 中的溶液在 85 ℃下搅拌 15 小时， 冷却并浓缩。将残余物经硅胶柱 色 谱 纯 化 (Hex/EtOAc， 1 ∶ 0 → 99 ∶ 1) 得 到 4.8g 标 题 化 合 物， 为橙色固体 ： ESI-MS ： + 273.0/275.0[M+H] ； tR ＝ 5.68min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.49(Hex/EtOAc， 9 ∶ 1)。
     实施例 25 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[5-(3- 叔丁基 -2- 甲基 -3H- 苯 并咪唑 -5- 基 )- 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
     按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 14 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 85℃下搅拌 1 小
     时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.3 中， 使用 6- 溴 -1- 叔丁基 -2- 甲基 -1H- 苯并咪 唑 ( 步骤 25.1) 和 N- 噻唑 -2- 基 - 乙酰胺。将反应混合物在 120℃下搅拌 5 小时。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 427.2[M+H]+ ； tR ＝ 2.37min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.38(DCM/ MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 25.1 ： 6- 溴 -1- 叔丁基 -2- 甲基 -1H- 苯并咪唑
     将 6- 溴 -1- 叔丁基 -2- 乙氧基甲基 -2- 甲基 -2， 3- 二氢 -1H- 苯并咪唑 ( 步骤 25.2)(2.04g， 6.51mmol) 和 TFA(10ml) 的混合物在室温下搅拌过夜， 通过加入饱和 NaHCO3 溶液猝灭 (100mL)， 并用 EtOAc 萃取 (2x150mL)。有机相用饱和 NaHCO3 溶液洗涤 (2x50mL)， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH， 1 ∶ 0 → 98 ∶ 2) 得到 + 1.05g 标题化合物， 为白色固体 ： ESI-MS ： 267.0/269.0[M+H] ； tR ＝ 2.99min( 系统 1) ； TLC ： 9 ∶ 1)。 Rf ＝ 0.58(DCM/MeOH，
     步骤 25.2 ： 6- 溴 -1- 叔丁基 -2- 乙氧基甲基 -2- 甲基 -2， 3- 二氢 -1H- 苯并咪唑
     将 4- 溴 -N ＊ 2 ＊ - 叔丁基 - 苯 -1， 2- 二胺 ( 步骤 24.2)(2.14g， 8.80mmol) 和原乙 酸三乙酯 (16.2mL， 88mmol， 10 当量 ) 的混合物在 142℃下搅拌 1 小时， 冷却并浓缩。将残 余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 1 ∶ 0 → 95 ∶ 5) 得到 2.04g 标题化合物， 为紫色油状 + 物： ESI-MS ： 313.0/315.0[M+H] ； TLC ： Rf ＝ 0.67(Hex/EtOAc， 9 ∶ 1)。
     实 施 例 26 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(3- 乙 基 -3H- 苯 并 咪 唑 -5- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
     按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 15 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 85℃下搅拌 3 小 时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.3 中， 使用 6- 溴 -1- 乙基 -1H- 苯并咪唑 ( 步骤 26.1) 和 N- 噻唑 -2- 基 - 乙酰胺。将反应混合物在 120℃下搅拌 14 小时。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 399.1[M+H]+ ； tR ＝ 1.73min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.25(DCM/ MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 26.1 ： 6- 溴 -1- 乙基 -1H- 苯并咪唑
     将 4- 溴 -N ＊ 2 ＊ - 乙基 - 苯 -1， 2- 二胺 ( 步骤 26.2)(2g， 9.3mmol) 和原甲酸三乙 酯 (15.5mL， 93mmol， 10 当量 ) 的混合物在 148℃下搅拌 1 小时， 冷却并浓缩。将残余物经硅 胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH， 1 ∶ 0 → 98 ∶ 2) 得到 2.05g 标题化合物， 为白色固体 ： ESI-MS ： + 225.1/227.1[M+H] ； tR ＝ 2.31min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.58(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。 ＊ ＊
     步骤 26.2 ： 4- 溴 -N 2 - 乙基 - 苯 -1， 2- 二胺
     在室温下将 (5- 溴 -2- 硝基 - 苯基 )- 乙基 - 胺 ( 步骤 26.3)(6g， 24.48mmol) 和兰 尼镍 (2g) 在 MeOH/THF(1 ∶ 1v/v， 600mL) 中的混悬液在氢气中搅拌 9 小时。将反应混合物 经硅藻土垫过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 95 ∶ 5 → 85 ∶ 15) 得 到 4.51g 标题化合物， 为黑色油状物 ： ESI-MS ： 213.1/215.1[M-H] ； tR ＝ 2.53min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.57(Hex/EtOAc， 1 ∶ 1)。
     步骤 26.3 ： (5- 溴 -2- 硝基 - 苯基 )- 乙基 - 胺
     将 4- 溴 -2- 氟 - 硝 基 苯 (6g， 27.3mmol)、 甲 基 胺 (2M 的 MeOH 溶 液， 34.1mL， 68.2mmol， 2.5 当量 ) 和 EtOH(80mL) 的混合物在 85℃下搅拌 15 小时， 冷却并浓缩。将残余 物经研磨纯化， 得到 6g 标题化合物， 为黄色固体 ： tR ＝ 5.13min( 系统 1)。
     实 施 例 27 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-[(5-{2-[1-(4- 甲 氧 基 - 苯 基 )-1- 甲基 - 乙基 ]- 吡啶 -4- 基 }-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 24 小时， 用 EtOAc/H2O 稀释猝灭。在步骤 1.2 中， 将反应混 合物在 100℃下搅拌 2 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。 在步骤 1.3 中， 将反应混合物在 100℃ 下搅拌 3 小时， 通过用 EtOAc/H2O 稀释猝灭， 并用 EtOAc 萃取。在步骤 1.4 中， 使用 1， 2- 二 氯乙烷 ( 每 mmol 的吡啶 -4- 酮用 4.3mL) 作为溶剂。将反应混合物在回流下搅拌 1 小时， 倒入饱和 NaHCO3 溶液中， 并用 DCM 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 80℃下搅拌 23 小 时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 将反应混合物在室温下搅拌 21 小时。在步骤 1.7 中， 将 4- 甲氧基 -3- 丁烯 -2- 酮在 THF 中的溶液加入冷却的 (-78℃ )LiHMDS 在 THF 的 溶液中。30 分钟后， 加入 2-(4- 甲氧基 - 苯基 )-2- 甲基 - 丙酰氯 ( 步骤 27.1) 在 THF 中的 溶液， 并将反应混合物历经 16 小时达到室温。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 480.0[M+H]+ ； tR ＝ 3.05min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.13(DCM/ aq MeOH/NH3 ， 94 ∶ 5 ∶ 1)。
     步骤 27.1 ： 2-(4- 甲氧基 - 苯基 )-2- 甲基 - 丙酰氯
     按照步骤 5.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 2-(4- 甲氧基 - 苯 基 )-2- 甲基 - 丙酸， 并将反应混合物在回流下搅拌 3 小时。
     实 施 例 28 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-[(5-{2-[1-(4- 甲 氧 基 - 苯 基 )-1- 甲基 - 乙基 ]- 吡啶 -4- 基 }- 噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
     按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 16 小时， 用 EtOAc/H2O 稀释猝灭。 在步骤 1.2 中， 将反应混合 物在 100℃下搅拌 2 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。在步骤 1.3 中， 使用 N- 噻唑 -2- 基 - 乙 酰胺。将反应混合物在 100℃下搅拌 5 小时， 通过用 EtOAc/H2O 稀释猝灭， 并用 EtOAc 萃取。 在步骤 1.4 中， 使用 1， 2- 二氯乙烷 ( 每 mmol 的吡啶 -4- 酮用 4.3mL) 作为溶剂。将反应混 合物在回流下搅拌 1 小时， 倒入饱和 NaHCO3 溶液中， 并用 DCM 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应 混合物在 80℃下搅拌 23 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 将反应混合物在室 温下搅拌 21 小时。在步骤 1.7 中， 将 4- 甲氧基 -3- 丁烯 -2- 酮在 THF 中的溶液加入冷却 的 (-78℃ )LiHMDS 在 THF 中的溶液。30 分钟后， 加入 2-(4- 甲氧基 - 苯基 )-2- 甲基 - 丙 酰氯 ( 步骤 27.1) 在 THF 中的溶液， 并将反应混合物历经 16 小时达到室温。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 466.1[M+H]+ ； tR ＝ 2.91min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.23(DCM/ aq MeOH/NH3 ， 94 ∶ 5 ∶ 1)。
     实施例 29 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(5-{2-[1-(4- 甲氧基 - 苯基 )- 环 丙基 ]- 吡啶 -4- 基 }-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 21 小时， 用 EtOAc/H2O 稀释猝灭。在步骤 1.2 中， 将反应混 合物在 100℃下搅拌 3 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。 在步骤 1.3 中， 将反应混合物在 100℃ 下搅拌 6 小时， 通过用 EtOAc/H2O 稀释猝灭， 并用 EtOAc 萃取。在步骤 1.4 中， 使用 1， 2- 二 氯乙烷 ( 每 mmol 的吡啶 -4- 酮用 4.3mL) 作为溶剂。将反应混合物在回流下搅拌 1 小时， 倒入饱和 NaHCO3 溶液中， 并用 DCM 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 80℃下搅拌 18 小 时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 将反应混合物在室温下搅拌 18 小时。在步骤 1.7 中， 将 4- 甲氧基 -3- 丁烯 -2- 酮在 THF 中的溶液加入冷却的 (-78℃ )LiHMDS 在 THF 中 的溶液。30 分钟后， 加入 1-(4- 甲氧基 - 苯基 )- 环丙烷甲酰氯 ( 步骤 29.1) 在 THF 中的溶
     液， 并将反应混合物历经 16 小时达到室温。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 478.1[M+H]+ ； tR ＝ 2.65min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.09(DCM/ aq MeOH/NH3 ， 94 ∶ 5 ∶ 1)。
     步骤 29.1 ： 1-(4- 甲氧基 - 苯基 )- 环丙烷甲酰氯
     按照步骤 5.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 1-(4- 甲氧基 - 苯 基 )- 环丙基甲酸， 并将反应混合物在回流下搅拌 3 小时。
     实施例 30 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(5-{2-[1-(4- 甲氧基 - 苯基 )- 环 丙基 ]- 吡啶 -4- 基 }- 噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
     按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 16 小时， 用 EtOAc/H2O 稀释猝灭。 在步骤 1.2 中， 将反应混合 物在 100℃下搅拌 3 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。在步骤 1.3 中， 使用 N- 噻唑 -2- 基 - 乙 酰胺。 将反应混合物在 100℃下搅拌 28 小时， 通过用 EtOAc/H2O 稀释猝灭， 并用 EtOAc 萃取。
     在步骤 1.4 中， 使用 1， 2- 二氯乙烷 ( 每 mmol 的吡啶 -4- 酮用 4.3mL) 作为溶剂。将反应混 合物在回流下搅拌 1 小时， 倒入饱和 NaHCO3 溶液中， 并用 DCM 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应 混合物在 80℃下搅拌 18 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 将反应混合物在室 温下搅拌 18 小时。在步骤 1.7 中， 将 4- 甲氧基 -3- 丁烯 -2- 酮在 THF 中的溶液加入冷却 的 (-78℃ )LiHMDS 在 THF 中的溶液。30 分钟后， 加入 1-(4- 甲氧基 - 苯基 )- 环丙烷甲酰 氯 ( 步骤 29.1) 在 THF 中的溶液， 并将反应混合物历经 16 小时达到室温。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 464.1[M+H]+ ； tR ＝ 2.90min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.06(DCM/ aq MeOH/NH3 ， 94 ∶ 5 ∶ 1)。
     实 施 例 31 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2-{1-[4-(3- 二 甲 基 氨 基 - 丙氧基 )- 苯基 ]-1- 甲基 - 乙基 }- 吡啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
     按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 18 小时， 用 EtOAc/H2O 稀释猝灭。 在步骤 1.2 中， 将反应混合 物在 100℃下搅拌 7 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。 在步骤 1.3 中， 使用 (3-{4-[1-(4- 溴 - 吡 啶 -2- 基 )-1- 甲基 - 乙基 ]- 苯氧基 }- 丙基 )- 二甲基 - 胺 ( 步骤 31.1)。将反应混合物 在 120℃下搅拌 2 小时， 通过用 EtOAc/H2O 稀释猝灭， 并用 EtOAc 萃取。 +
     标题化合物 ： ESI-MS ： 551.1[M+H] ； tR ＝ 2.38min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.05(DCM/ aq MeOH/NH3 ， 94 ∶ 5 ∶ 1)。
     步骤 31.1 ： (3-{4-[1-(4- 溴 - 吡啶 -2- 基 )-1- 甲基 - 乙基 ]- 苯氧基 }- 丙基 )- 二 甲基 - 胺
     将氢氧化钠 ( 精细研磨的颗粒， 0.488g， 12.2mmol， 5 当量 ) 加入 4-[1-(4- 溴 - 吡 啶 -2- 基 )-1- 甲基 - 乙基 ]- 苯酚 ( 步骤 31.2)(0.714g， 2.44mmol) 在 DMF(5mL) 的溶液中。 将该混合物在室温下搅拌 20 分钟。加入 3- 二甲基氨基 -1- 丙基氯化物盐酸化物 (0.611g， 3.87mmol， 1.6 当量 )。将反应混合物加热至 90℃， 搅拌 10 小时， 冷却， 用 EtOAc/H2O 稀释， 并用 EtOAc 萃取。有机相用 H2O 和盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将残余物经硅胶 aq 柱色谱纯化 (DCM/MeOH/NH3 ， 94 ∶ 5 ∶ 1) 得到 0.398g 标题化合物， 为不纯的褐色油状物， + 其不经进一步纯化直接使用 ： ESI-MS ： 377.1/379.0[M+H] ； TLC ： Rf ＝ 0.22(DCM/MeOH/NH3aq， 94 ∶ 5 ∶ 1)。
     步骤 31.2 ： 4-[1-(4- 溴 - 吡啶 -2- 基 )-1- 甲基 - 乙基 ]- 苯酚
     在 氩 气 中 将 BBr3(1M 的 DCM 溶 液， 23mmol， 8当 量)逐 滴 加 入 冷 却 的 (0 ℃ )4- 溴 -2-[1-(4- 甲 氧 基 - 苯 基 )-1- 甲 基 - 乙 基 ]- 吡 啶 ( 步 骤 31.3)(0.878g， 2.87mmol) 在 DCM(42mL) 的溶液中。将反应混合物在 0℃下搅拌 1 小时， 加温至室温， 搅拌 18 小时， 冷却至 0℃， 并通过加入无水 MeOH 猝灭。浓缩该混合物， 用 6M 的 HCl 水溶液稀释， 搅拌 1 小时， 中和至 pH 7， 并用 DCM 萃取。干燥 (Na2SO4) 有机相， 过滤并浓缩。残余物不经 纯化直接使用。
     步骤 31.3 ： 4- 溴 -2-[1-(4- 甲氧基 - 苯基 )-1- 甲基 - 乙基 ]- 吡啶
     按照步骤 1.4 到 1.7 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。 在步骤 1.4 中， 使用 1， 2- 二氯乙烷 ( 每 mmol 的吡啶 -4- 酮用 4.3mL) 作为溶剂。将反应混合物在 回流下搅拌 1 小时， 倒入饱和 NaHCO3 水溶液， 并用 DCM 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应混合物 在 80℃下搅拌 23 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 将反应混合物在室温下搅 拌 21 小时。在步骤 1.7 中， 4- 甲氧基 -3- 丁烯 -2- 酮在 THF 中的溶液加入冷却的 (-78℃ ) LiHMDS 在 THF 中的溶液。30 分钟后， 加入 2-(4- 甲氧基 - 苯基 )-2- 甲基 - 丙酰氯 ( 步骤 27.1) 在 THF 中的溶液， 并将反应混合物历经 16 小时达到室温。
     标题化合物： ESI-MS ： 306.0/308.0[M+H]+ ； tR ＝ 3.94min( 系 统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.55(Hex/EtOAc， 7 ∶ 3)。
     实施例 32 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2-(1-d3- 甲基 - 环 丁基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 18 小时， 通过用 DCM/H2O 稀释猝灭， 并用 DCM 萃取。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 1 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 100℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。 在步骤 1.3 中， 将钯催化剂加入加热的剩余试剂的混合物中， 并将所得混合物在 120℃下搅拌 1 小时， 用 EtOAc/H2O 稀释并用 EtOAc 萃取。干燥并浓缩有 机相后， 将残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 1 ∶ 4)。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在
     80℃下搅拌 3 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.7 中， 4- 甲氧基 -3- 丁烯 -2- 酮在 THF 中的溶液加入冷却的 (-78℃ )LiHMDS 在 THF 中的溶液。 30 分钟后， 加入 1-d3- 甲基 - 环 丁烷氯化物 ( 步骤 32.1) 在 THF 中的溶液， 并将反应混合物历经 16 小时达到室温。
     标 题 化 合 物： ESI-MS ： 403.2[M+H] + ； TLC ： Rf ＝ 0.22(DCM/MeOH/NH3aq， 91.5 ∶ 7.5 ∶ 1)。
     步骤 32.1 ： 1-d3- 甲基 - 环丁烷甲酰氯
     按照步骤 5.1 中所述类似方法制备标题化合物， 但使用 1-d3- 甲基 - 环丁烷甲 酸，其 按 照 [Cowling， S.J. ； Goodby， J.W.， Chemical Communications， (2006)， (39)， 4107-4109] 中所述的方法制备， 但使用 d3- 甲基 - 碘化物。
     实施例 33 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(1-d3- 甲基 - 环丁基 )- 吡 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 18 小时， 通过用 DCM/H2O 稀释猝灭， 并用 DCM 萃取。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 1 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 100℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。在步骤 1.3 中， 使用 N- 噻唑 -2- 基 - 乙酰胺。将钯催化剂加 入加热的剩余试剂的混合物中。将所得混合物在 120℃下搅拌 7 小时， 用 EtOAc/H2O 稀释， 经硅藻土垫过滤并用 EtOAc 萃取。 干燥并浓缩有机相后， 将残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/ EtOAc， 1 ∶ 4)。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 80℃下搅拌 3 小时， 不进行在 MeOH 中的研 磨。在步骤 1.7 中， 4- 甲氧基 -3- 丁烯 -2- 酮在 THF 中的溶液加入冷却的 (-78℃ )LiHMDS 在 THF 中的溶液。30 分钟后， 加入 1-d3- 甲基 - 环丁烷氯化物 ( 步骤 32.1) 在 THF 中的溶 液， 并将反应混合物历经 16 小时达到室温。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 389.2[M+H]+ ； tR ＝ 2.30min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.11(DCM/ aq MeOH/NH3 ， 91.5 ∶ 7.5 ∶ 1)。
     实施例 34 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4-d3- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环 丙基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 8 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 85℃下搅拌 1 小 时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.3 中， 使用 2- 乙酰氨基 -4-d3- 甲基 - 噻唑 ( 步骤 34.1)。将反应混合物在 120℃下搅拌 2 小时。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 65-70℃下 搅拌 1 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.7 中， 使用 1- 甲基 - 环丙烷甲酰氯 ( 步骤 5.1)。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 389.2[M+H]+ ； tR ＝ 2.12min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.35(DCM/ MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 34.1 ： 2- 乙酰氨基 -4-d3- 甲基 - 噻唑
     将 1- 溴 - 丙 烷 -2- 酮 -d 5[Challacombe ， K. 等 人， Journal of the ChemicalSociety Perkin Trans.I， (1988)， 2213-2218](1.25g， 8.8mmol) 和 1- 乙 酰 基 -2- 硫脲 (1g， 8.8mmol) 在 EtOH(20mL) 中的混合物在 85℃下搅拌 2 小时， 冷却并浓缩。 将残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 85 ∶ 15 → 1 ∶ 1)， 得到 1.08g 标题化合物， 为橙 + 色固体 ： ESI-MS ： 160.0[M+H] ； TLC ： Rf ＝ 0.25(Hex/EtOAc， 1 ∶ 1)。
     实施例 35 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4-d3- 甲基 -5-[2-(2， 2， 2- 三 氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 8 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 85℃下搅拌 1 小 时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.3 中， 使用 2- 乙酰氨基 -4-d3- 甲基 - 噻唑 ( 步骤 34.1)。将反应混合物在 120℃下搅拌 2 小时。在步骤 1.4 中， 将反应混合物在 83℃下搅 拌 1 小时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 65℃下搅拌 1 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 粗产物不再纯化。在步骤 1.7 中， 使用 3， 3， 3- 三 氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酰氯 ( 步骤 12.1)。
     标 题 化 合 物： API-ES-MS ： 445.1[M+H]+ ； tR ＝ 3.00min( 系 统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.51(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。
     实 施 例 36 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-({4- 二 甲 基 氨 基 甲 基 -5-[2-(1-d3- 甲基 - 环丁基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 18 小时， 通过用 DCM/H2O 稀释猝灭， 并用 DCM 萃取。在步 骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 2 小时。在步骤 1.2 中， 使用 N-{4- 二甲基氨基甲 基 -5-[2-(1-d3- 甲基 - 环丁基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 乙酰胺 ( 步骤 36.1)。将 反应混合物在 100℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 446.1[M+H]+ ； TLC ： Rf ＝ 0.40(DCM/MeOH/NH3aq， 89 ∶ 10 ∶ 1)。
     步骤 36.1 ： N-{4- 二甲基氨基甲基 -5-[2-(1-d3- 甲基 - 环丁基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 }- 乙酰胺
     将 N-{4- 溴甲基 -5-[2-(1-d3- 甲基 - 环丁基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 乙 酰胺 ( 步骤 36.2)(150mg， 0.391mmol)、 二甲基胺盐酸化物 (38.3mg， 0.470mmol， 1.2 当量 ) 和碳酸铯 (293mg， 0.900mmol， 2.3 当量 ) 在 DMF(2mL) 中的混合物在室温下搅拌 2 小时， 用 EtOAc/H2O 稀释， 并用 EtOAc 萃取。有机相用 H2O 和盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。 将残余物在 Et2O 中研磨纯化， 得到 89mg 标题化合物， 为白色固体 ： ESI-MS ： 348.2[M+H]+。
     步 骤 36.2 ： N-{4- 溴 甲 基 -5-[2-(1-d3- 甲 基 - 环 丁 基 )- 吡 啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 }- 乙酰胺
     将 NBS(554mg， 3.06mmol， 1.1 当 量 ) 加 入 N-{4- 甲 基 -5-[2-(1-d3- 甲 基 - 环 丁 基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 乙酰胺 ( 步骤 36.3)(846mg， 2.78mmol) 在 CCl4(20mL) 和 CHCl3(16mL) 的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌 1 小时， 用 H2O 和盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 1 ∶ 4) 得到 572mg 标题 + 化 合 物， 为浅黄色固体 ： ESI-MS ： 383.0/385.0[M+H] ； tR ＝ 3.12min( 系 统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.45(Hex/EtOAc， 1 ∶ 4)。
     步 骤 36.3 ： N-{4- 甲 基 -5-[2-(1-d3- 甲 基 - 环 丁 基 )- 吡 啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 }- 乙酰胺
     按照步骤 1.3-1.7 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在步骤 1.3 中， 将反应混合物在 120℃下搅拌 1 小时， 并用 EtOAc/H2O 稀释猝灭。 在步骤 1.5 中， 将反 应混合物在 80℃下搅拌 3 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.7 中， 4- 甲氧基 -3- 丁 烯 -2- 酮在 THF 中的溶液加入冷却的 (-78 ℃ )LiHMDS 在 THF 中的溶液。30 分钟后， 加入 1-d3- 甲基 - 环丁烷氯化物 ( 步骤 32.1) 在 THF 中的溶液， 并将反应混合物历经 16 小时达 到室温。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 305.2[M+H]+ ； TLC ： Rf ＝ 0.24(Hex/EtOAc， 1 ∶ 4)。
     实施例 37 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 氯 -5-[2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     将 4- 氯 -5-[2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 胺 ( 步骤 37.1)(100mg， 0.311mmol) 和光气 (0.164mL， 0.311mmol) 在吡啶 (2mL) 中的混合 物在 105℃下搅拌 1 小时。加入 L- 脯氨酰胺 (106mg， 0.932mmol， 3 当量 )。将所得混合物 在 105 ℃下搅拌 30 分钟， 冷却， 通过加入饱和 NaHCO3 溶液猝灭 (100mL)， 并用 EtOAc 萃取(2x100mL)。有机相用饱和 NaHCO3 溶液洗涤 (100mL)， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将残余 物经硅胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH， 99 ∶ 1 → 94 ∶ 6) 得到 46mg 标题化合物， 为黄色固体 ： + ESI-MS ： 461.9[M+H] ； tR ＝ 3.60min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.28(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 37.1 ： 4- 氯 -5-[2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基胺
     按照步骤 1.2-1.7 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 85℃下搅拌 3 小时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.3 中， 使 用 N-(4- 氯 - 噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺 ( 步骤 37.2)。将反应混合物在 120℃下搅拌 2 小时。 在步骤 1.4 中， 将反应混合物在 83℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 65℃下搅拌 1 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 粗产物不 再纯化。在步骤 1.7 中， 使用 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酰氯 ( 步骤 12.1)。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 322.1[M+H]+ ； tR ＝ 3.58min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.45(DCM/ MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 37.2 ： N-(4- 氯 - 噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺
     将 N-(4- 氧代 -4， 5- 二氢 - 噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺 ( 步骤 37.3)(14.8g， 94mmol) 和 POCl3(175mL， 20 当量 ) 的混合物加热至 105℃， 搅拌 15 分钟， 冷却并浓缩。将残余物倒 在冰 -H2O 上， 并用 EtOAc 萃取 (2x100mL)。有机相用饱和 NaHCO3 溶液洗涤 (2x100mL)， 干 燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH， 99 ∶ 1) 得到 13.9g 标 + 题化合物， 为白色固体 ： ESI-MS ： 177.0[M+H] ； tR ＝ 2.74min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.66(DCM/ MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 37.3 ： N-(4- 氧代 -4， 5- 二氢 - 噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺
     将假乙内酰硫脲 (16g， 138mmol) 和乙酸酐 (16.9mL， 179mmol， 1.3 当量 ) 在吡啶 (150mL) 中的混合物加热至 115℃， 搅拌 1 小时并冷却。经过滤收集所得沉淀， 得到 12.64g + 标题化合物， 为褐色固体 ： ESI-MS ： 159.0[M+H] 。
     实施例 38 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 氟甲基 -5-[2-(2， 2， 2- 三 氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 18 小时， 通过用 DCM/H2O 稀释猝灭， 并用 DCM 萃取。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 1 小时， 浓缩， 且所得粗物质不经纯化直接使用。 在步骤 1.2 中， 使用 N-{4- 氟甲基 -5-[2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 }- 乙酰胺 ( 步骤 38.1)。将反应混合物在 100℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。粗物质不经纯化。
     标 题 化 合 物： ESI-MS ： 460.0[M+H] + ； TLC ： Rf ＝ 0.44(DCM/MeOH/NH3aq， 91.5 ∶ 7.5 ∶ 1]
     步 骤 38.1 ： N-{4- 氟 甲 基 -5-[2-(2， 2， 2- 三 氟 -1， 1- 二 甲 基 - 乙 基 )- 吡 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 乙酰胺
     按照步骤 1.3-1.7 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在步骤 1.3 中， 使用 N-(4- 氟甲基 - 噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺 ( 步骤 38.2)。将反应混合物在 90℃下 搅拌 7 小时， 在 100℃下搅拌 5 小时， 并通过用 EtOAc 和 H2O 稀释猝灭。在步骤 1.5 中， 将 反应混合物在 65℃下搅拌 1 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 粗产物不再纯 化。在步骤 1.7 中， 使用 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酰氯 ( 步骤 12.1)。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 362.1[M+H]+ ； tR ＝ 4.18min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.29(Hex/ EtOAc， 1 ∶ 1)。
     步骤 38.2 ： N-(4- 氟甲基 - 噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺
     将 1- 氯 -3- 氟 - 丙烷 -2- 酮 ( 步骤 38.3)(1.14g， 10.3mmol) 和 N- 乙酰基 -2- 硫脲 (1.22g， 10.3mmol) 在 EtOH(10mL) 中的混合物在回流下搅拌 1.5 小时， 冷却并浓缩。 将残余 物溶于 DCM/H2O， 并用 DCM 萃取。 干燥 (Na2SO4) 有机相， 过滤并浓缩。 将残余物经硅胶柱色谱 纯化 (Hex/EtOAc， 1 ∶ 1) 得到 0.143g 标题化合物 ： ESI-MS ： 173.1[M-H]- ； tR ＝ 1.98min( 系
     统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.21(Hex/EtOAc， 1 ∶ 1)。
     步骤 38.3 ： 1- 氯 -3- 氟 - 丙烷 -2- 酮
     将 1- 氟 -3- 氯异丙醇 (2.7mL， 31.2mmol) 缓慢加入装有 30mL 琼斯试剂 ( 通过将 230mL 浓硫酸加入 267g 三氧化铬在 700mL H2O 的溶液中， 并用 H2O 稀释至 1L 来制备 ) 的冷 却至 5℃的烧瓶中。将反应混合物加温至室温， 搅拌 18 小时， 倒入饱和 NaHCO3 溶液中， 并用 Et2O 萃取。将有机相用盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (DCM)， 得到 1.14g 标题化合物， 为不纯的黄色油状物。
     实施例 39 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[5-(5- 苯磺酰基氨基 -6- 氯 - 吡 啶 -3- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
     按 照 步 骤 1.3 中 所 述 类 似 的 方 法 制 备 标 题 化 合 物， 但 进 行 如 下 修 改。 使 用 (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-[(4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 )- 酰 胺 ]( 步 骤 39.2) 和 N-(5- 溴 -2- 氯 - 吡啶 -3- 基 )- 苯磺酰胺 ( 步骤 39.1)。将钯催化剂加入加热的剩余试剂 的混合物中， 并将所得混合物在 135℃下搅拌 3 小时， 用 EtOAc 和 H2O 稀释， 经硅藻土垫过滤 并用 EtOAc 萃取。干燥并浓缩有机相后， 将残余物经硅胶柱色谱及反相 HPLC 纯化。标题化 合物 ： ESI-MS ： 519.0/521.1[M-H]- ； tR ＝ 3.33min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.09(DCM/MeOH/NH3aq， 84 ∶ 15 ∶ 1)。
     步骤 39.1 ： N-(5- 溴 -2- 氯 - 吡啶 -3- 基 )- 苯磺酰胺
     在氩气中将苯磺酰氯 (1.23mL， 9.62mmol， 2 当量 ) 在 DCM(50mL) 中的溶液历经 15 分钟逐滴加入 3- 氨基 -5- 溴 -2- 氯吡啶 [Jouve， K. ； Bergman， J.， Journal of Heterocyclic Chemistry， (2003)， 40(2)， 261-268](1g， 4.81mmol) 和 吡 啶 (1.94ml， 24mmol， 5 当量 ) 在 DCM(20mL) 的溶液中。将所得混合物在室温下搅拌 20 小时， 浓缩， 用 H2O 稀释， 并用 DCM 萃 取。将有机相用盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (DCM) 得到 163mg 标题化合物， 为白色固体 ： ESI-MS ： 346.9[M-H]- ； tR ＝ 4.33min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.23(DCM)。
     步骤 39.2 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
     按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用咪唑 -1- 甲酸 (4- 甲 基 - 噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ( 步骤 39.3)。将反应混合物在室温下搅拌 18 小时并浓缩。将残 余物经硅胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH/NH3aq， 94 ∶ 5 ∶ 1)， 然后在 Et2O 中研磨。标题化合物 ： ESI-MS ： 253.2[M-H]- ； TLC ： Rf ＝ 0.18(DCM/MeOH/NH3aq， 84 ∶ 15 ∶ 1)。
     步骤 39.3 ： 咪唑 -1- 甲酸 (4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 )- 酰胺
     按照步骤 1.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 2- 乙酰氨基 -4- 甲基噻 唑， 并将反应混合物在回流下搅拌 5.5 小时。
     实施例 40 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[5-(5- 苯磺酰基氨基 -6- 氯 - 吡 啶 -3- 基 )- 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
     按照步骤 1.3 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。使用 (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1- 噻 唑 -2- 基 酰 胺 ( 步 骤 40.1) 和 N-(5- 溴 -2- 氯 - 吡 啶 -3- 基 )- 苯磺酰胺 ( 步骤 39.1)。 将钯催化剂加入加热的剩余试剂的混合物中， 并将所得 混合物在 120℃下搅拌 6 小时， 浓缩， 用 DCM/MeOH 稀释， 经硅藻土垫过滤， 并浓缩滤液。 将残 + 余物经硅胶柱色谱及反相 HPLC 纯化。 标题化合物 ： ESI-MS ： 506.9[M+H] ； tR ＝ 3.21min( 系 统 1)。
     步骤 40.1 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1- 噻唑 -2- 基酰胺
     按 照 实 施 例 1 中 所 述 类 似 的 方 法 制 备 标 题 化 合 物， 但 使 用 咪 唑 -1- 甲 酸 噻 唑 -2- 基酰胺 ( 步骤 40.2)。将反应混合物在室温下搅拌 18 小时并浓缩。残余物经硅 胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH/NH3aq， 94 ∶ 5 ∶ 1)， 然后用 EtOAc 研磨。标题化合物 ： ESI-MS ： aq 239.2[M-H] ； TLC ： Rf ＝ 0.11(DCM/MeOH/NH3 ， 84 ∶ 15 ∶ 1)。
     步骤 40.2 ： 咪唑 -1- 甲酸噻唑 -2- 基酰胺
     按照步骤 1.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 N- 噻唑 -2- 基 - 乙酰胺， 并将反应混合物在回流下搅拌 5 小时。
     实施例 41 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[5-(6- 氨基 -5- 三氟甲基 - 吡 啶 -3- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
     按照步骤 1.3 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。使用 (S)- 吡 咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]( 步骤 39.2) 和 5- 溴 -3- 三 氟甲基 - 吡啶 -2- 基胺 (WO2007095588)。将钯催化剂加入加热的剩余试剂的混合物中， 并 并用 DCM 萃取。干燥并浓缩有机相后， 将所得混合物在 120℃搅拌 3 小时， 用 DCM/H2O 稀释， 将残余物经硅胶柱色谱及反相 HPLC 纯化。标题化合物 ： ESI-MS ： 413.1[M-H]- ； TLC ： Rf ＝ aq 0.27(DCM/MeOH/NH3 ， 89 ∶ 10 ∶ 1)。
     实施例 42 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环丙 基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     在室温下将咪唑 -1- 甲酸 {4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环丙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 }- 酰胺 (4.0g) 加入搅拌过的 L- 脯氨酰胺 (1.48g) 和三乙胺 (4.1ml) 在 DMF(46ml) 的溶液中。将反应混合物在室温下放置 22 小时， 蒸发， 在用甲醇 (60ml) 和水 (20ml) 结晶
     后得到标题化合物， 为白色固体。HPLC/MS ： 保留时间 1.24 分钟， M+H 387.1 和 M-H 385.2。
     步骤 42.1 ： 咪唑 -1- 甲酸 {4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环丙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 }- 酰胺
     在 室 温 下 将 羰 基 二 咪 唑 (4.56g) 加 入 4- 甲 基 -5-[2-(1- 甲 基 - 环 丙 基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺 (10.5g) 和三乙胺 (4.28ml) 在 DMF(26ml) 的溶液中， 并随后在 80℃下加热 2 小时。冷却后， 经过滤分离标题化合物。
     步骤 42.2 ： 4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环丙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺
     将粉末的氢氧化钠 (5.86g) 加入 N ′ -[5-(3- 二甲基氨基 - 丙烯酰基 )-4- 甲 基 - 噻唑 -2- 基 ]-N， N- 二甲基 - 甲脒 (13g， 如 S.Wang 等人 J.Med.Chem.2004， 47， 1662-1675 中所述制备 ) 和 1- 甲基 - 环丙烷甲脒盐酸化物 (7.2g， 如 EP0227415 中所述制备 ) 在 2- 甲 氧基乙醇 (98ml) 的溶液中， 并将该混合物在搅拌中于 125℃下加热 1 小时。将反应混合物 冷却， 加入水， 经过滤分离标题化合物。ESI-MS ： M+H 247 和 M-H 245。
     实 施 例 43 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 异 丙 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
     在室温下将咪唑 -1- 甲酸 [5-(2- 异丙基 - 嘧啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰 胺 (50mg) 加入 L- 脯氨酰胺 (19mg) 和三乙胺 (26μl) 在 DMF(152μl) 的溶液中。 将该混合 物在 40℃下搅拌 2 小时， 并随后用制备型反相色谱纯化。 将包含标题化合物的流份用 300mg 的 BondElut SPE、 SCX 柱捕获， 并随后用 7M 的氨在甲醇 (1ml) 中的溶液释放。经蒸发获得
     标题化合物。ESI-MS ： M+H 275 和 M-H 273。
     步骤 43.1 ： 咪唑 -1- 甲酸 {4- 甲基 -5-[2- 异丙基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰 胺
     按照实施例 42 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2- 异丙 基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环丙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基胺。
     实施例 44 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[5-(2- 苄基 - 嘧啶 -4- 基 )-4- 甲 基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
     按照实施例 43 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2- 苄 基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2- 异丙基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 胺。ESI-MS ： M+H 423 和 M-H 421。
     实施例 45 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[5-(2- 乙基 - 嘧啶 -4- 基 )-4- 甲 基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
     按照实施例 43 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2- 乙 基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2- 异丙基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 胺。ESI-MS ： M+H 361 和 M-H 359。
     实 施 例 46 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 甲 氧 基 甲 基 - 嘧
     啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
     按照实施例 43 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2- 甲氧基 甲基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2- 异丙基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 胺。ESI-MS ： M+H 377 和 M-H 375。
     实施例 47 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(2， 6- 二氯 - 苄基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     按照实施例 43 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2-(2， 6- 二氯 - 苄基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2- 异丙基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基胺。ESI-MS ： M+H 491， 493 和 M-H 489， 491。
     实 施 例 48 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 异 丁 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
     按照实施例 43 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2- 异丁 基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2- 异丙基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 胺。ESI-MS ： M+H 389 和 M-H 387。
     实施例 49 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(4- 甲氧基 - 苯氧基甲 基 )- 嘧啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     按照实施例 43 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2-(4- 甲 氧 基 - 苯 氧 基 甲 基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 胺 代 替 4- 甲 基 -5-[2- 异 丙 基 - 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺。ESI-MS ： M+H 469 和 M-H 467。
     实施例 50 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(3- 甲氧基 - 苯氧基甲 基 )- 嘧啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     按照实施例 43 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2-(3- 甲 氧 基 - 苯 氧 基 甲 基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 胺 代 替 4- 甲 基 -5-[2- 异 丙 基 - 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺。ESI-MS M-H 467。
     实 施 例 51 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-({5-[2-(2- 氟 - 苯 基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     在 室 温 下 将 咪 唑 -1- 甲 酸 {5-[2-(2- 氟 - 苯 基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 }- 酰胺 (415mg) 加入 L- 脯氨酰胺 (137mg) 和三乙胺 (182μl) 在 DMF(1.1ml) 的 溶液中。将该混合物在 40℃下搅拌 18 小时， 蒸发并在甲醇 (8ml) 和水 (2ml) 中结晶， 得到 标题化合物， 为白色固体。ESI-MS ： M+H 427 和 M-H 425。
     步 骤 51.1 ： 咪 唑 -1- 甲 酸 {5-[2-(2- 氟 - 苯 基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 }- 酰胺
     按 照 实 施 例 43 中 所 述 类 似 的 方 法 制 备 标 题 化 合 物，但 使 用 4- 甲 基 -5-[2-(2- 氟 - 苯基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环 丙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺。
     实 施 例 52 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 三 氟 甲 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
     在 室 温 下 将 L- 脯 氨 酰 胺 (9mg) 加 入 咪 唑 -1- 甲 酸 [5-(2- 三 氟 甲 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 (25mg) 和三乙胺 (12μl) 在 DMF(71μl) 的溶液 中。将该混合物在 25℃下搅拌 18 小时， 并经制备型反相色谱纯化。将包含标题化合物的 流份用 300mg 的 BondElut SPE、 SCX 柱捕获， 并随后用 7M 的氨在甲醇 (1ml) 中的溶液释放。 经蒸发获得标题化合物。ESI-MS ： M+H401 和 M-H 399。
     步 骤 52.1 ： 咪 唑 -1- 甲 酸 {4- 甲 基 -5-[2- 三 氟 甲 基 - 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 }- 酰胺
     按照实施例 43 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2- 三氟甲 基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环丙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基胺。
     实施例 53 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 一甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2-(1， 1， 2- 三甲 基 - 丙基 )- 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     按照实施例 51 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2-(1， 1， 2- 三甲基 - 丙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2-(2- 氟 - 苯基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺。ESI-MS ： M+H 417 和 M-H 415。
     实 施 例 54 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-[(5-{2-[1-(4- 甲 氧 基 - 苯 基 )-1- 甲基 - 乙基 ]- 嘧啶 -4- 基 }-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
     按 照 实 施 例 51 中 所 述 类 似 的 方 法 制 备 标 题 化 合 物， 但 使 用 5-{2-[1-(4- 甲 氧 基 - 苯 基 )-1- 甲 基 - 乙 基 ]- 嘧 啶 -4- 基 }-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 胺 代 替 4- 甲 基 -5-[2-(2- 氟 - 苯基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺。E SI-MS ： M+H 495 和 M-H 493。 实施例 55 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(2- 氟 -1- 氟甲基 -1- 甲 基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 6 小时。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 15 小 时。 在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 100℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。 在步骤 1.3 中， 将反应混合物在 120℃下搅拌 2 小时。在步骤 1.4 中， 将反应混合物在 85℃下搅拌 30 分钟， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 65℃下搅拌 1 小时， 不 进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 粗产物不再纯化。在步骤 1.7 中， 使用 3- 氟 -2- 氟 甲基 -2- 甲基 - 丙酰氯 ( 步骤 55.1)。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 424.1[M+H]+ ； tR ＝ 2.40min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.35(DCM/
     MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 55.1 ： 3- 氟 -2- 氟甲基 -2- 甲基 - 丙酰氯
     按照步骤 5.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 3- 氟 -2- 氟甲基 -2- 甲 基 - 丙酸 ( 步骤 55.2)。
     步骤 55.2 ： 3- 氟 -2- 氟甲基 -2- 甲基 - 丙酸
     按照步骤 73.2 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 3- 氟 -2- 氟甲基 -2- 甲 基 - 丙酸甲酯 ( 制备 WO 2007/053394)。ESI-MS ： 137.0[M-H]-。
     实施例 56 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2-(1， 1- 二甲基 - 丙 基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     按照实施例 43 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2-(1， 1- 二 甲 基 - 丙 基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 胺 代 替 4- 甲 基 -5-[2- 异 丙 基 - 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺。ESI-MS ： M+H 403 和 M-H 401。
     实施例 57 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 -1- 对 甲苯基 - 乙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     按照实施例 43 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2-(1- 甲 基 -1- 对甲苯基 - 乙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2- 异丙基 - 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺。E SI-MS ： M+H 479 和 M-H 477。
     实施例 58 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2-(1- 苯基 - 环戊 基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )按照实施例 43 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2-(1- 苯 基 - 环戊基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2- 异丙基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基胺。E SI-MS ： M+H 477 和 M-H 475。
     实施例 59 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2- 环丙基 - 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     按照实施例 43 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2- 环丙 基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2- 异丙基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 胺。ESI-MS ： M+H 373 和 M-H 371。
     实施例 60 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2- 环丁基 - 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     按照实施例 52 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2- 环丁 基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2- 三氟甲基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 胺。ESI-MS ： M+H 387 和 M-H 385。
     实 施 例 61 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2-d9- 叔 丁 基 - 嘧
     啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
     在 室 温 下 将 咪 唑 -1- 甲 酸 [5-(2-d9- 叔 丁 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 ]- 酰 胺 (0.82g) 加 入 搅 拌 过 的 L- 脯 氨 酰 胺 (0.29g) 和 三 乙 胺 (0.81ml) 在 DMF(5ml) 的溶液中。将反应混合物在室温下放置 22 小时， 随后蒸发， 并用 2 ∶ 1 的甲醇 ： 水结晶两次后得到标题化合物， 为白色固体。HPLC/MS ： 保留时间 1.27 分钟， M+H 398.3 和 M-H 396.3。
     步 骤 61.1 ： 咪 唑 -1- 甲 酸 [5-(2-d9- 叔 丁 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 ]- 酰胺
     在 室 温 下 将 羰 基 二 咪 唑 (0.77g) 加 入 搅 拌 过 的 5-(2-d9- 叔 丁 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基胺 (1.11g) 在 DMF(4.3ml) 的溶液中。随后将反应混合物 在 25℃下放置 18 小时， 然后经过滤分离标题化合物。
     步骤 61.2 ： 5-(2-d9- 叔丁基 - 嘧啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基胺
     将粉末氢氧化钠 (3.71g) 加入 N′ -[5-(3- 二甲基氨基 - 丙烯酰基 )-4- 甲基 - 噻 唑 -2- 基 ]-N， N- 二甲基 - 甲脒 (5.51g) 和 d9-2， 2- 二甲基 - 丙脒盐酸化物 (4.50g) 在 2- 甲 氧基乙醇 (41ml) 的溶液中， 并将该混合物在搅拌中于 125℃下加热 1 小时。将反应混合物
     冷却， 加入水， 并经过滤分离粗产物。将粗产物经制备型 HPLC 纯化， 并将包含标题化合物的 流份在二氯甲烷和碳酸氢钠水溶液之间分配。 蒸发干燥过的二氯甲烷层之后得到标题化合 物， 为黄色固体。HPLC/MS ： 保留时间 1.12 分钟， M+H 258.4。
     步骤 61.3 ： d9-2， 2- 二甲基 - 丙脒盐酸化物
     将 2M 的三甲基铝在甲苯 (61ml) 中的溶液逐滴加入用冰浴冷却的氯化铵 (6.53g) 在甲苯 (46ml) 的混悬液中。 将反应混合物在室温下搅拌 4 小时， 并加入 d9-2， 2- 二甲基 - 丙 酸丁酯 (6.3g)。在 80℃加热 4 天后， 将反应混合物冷却至 0℃， 并逐滴加入甲醇 (200ml)。 在室温下搅拌并超声处理 1 小时后， 将反应混合物经 Hyflo 过滤， 用甲醇洗涤， 并蒸发滤液， 得到标题化合物， 为灰白色固体。
     步骤 61.4 ： d9-2， 2- 二甲基 - 丙酸丁酯
     将 d9- 叔丁基氯 (5.0g) 分批加入镁 (1.50g) 在四氢呋喃 (20ml) 的混悬液中， 用 催化量的碘活化， 加热以保持稳定回流持续 1 小时。然后将反应混合物再加热 1 小时， 以保 证格氏试剂形成完全。随后将上述格氏试剂溶液逐滴加入用冰浴冷却的咪唑 -1- 甲酸丁酯 (7.5g， 如 T.Werner 和 A.G.M.Barrett J.Org.Chem.2006， 71， 4302-4304 中所述制备 ) 在四 氢呋喃 (40ml) 的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌 18 小时， 加入水 (200ml)， 将该混合 物经 Hyflo 过滤， 滤液用乙醚萃取， 并将乙醚层用硫酸钠干燥并蒸发， 得到标题化合物。
     实施例 62 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2-(2- 甲基 - 环丙 基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     在室温下将咪唑 -1- 甲酸 {4- 甲基 -5-[2-(2- 甲基 - 环丙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 }- 酰 胺 (50mg) 加 入 搅 拌 过 的 L- 脯 氨 酰 胺 (18mg) 和 三 乙 胺 (25μl) 在
     DMF(147μl) 的溶液中。将反应混合物在 40℃下搅拌 2 小时， 并经制备型反相色谱纯化。 将包含标题化合物的流份用 300mg 的 BondElut SPE、 SCX 柱捕获， 并随后用 7M 的氨在甲醇 (1ml) 中的溶液释放。经蒸发获得标题化合物。ESI-MS ： M+H 387 和 M-H 385。
     步骤 62.1 ： 咪唑 -1- 甲酸 {4- 甲基 -5-[2-(2- 甲基 - 环丙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 }- 酰胺
     在 室 温 下 将 羰 基 二 咪 唑 (487mg) 加 入 4- 甲 基 -5-[2-(2- 甲 基 - 环 丙 基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺 (370mg) 和三乙胺 (251μl) 在 DMF(1.5ml) 的溶液中， 并随后在 40℃下加热 2 小时。将反应混合物蒸发， 并用氯仿研磨。经过滤分离标题化合物。
     步骤 62.2 ： 4- 甲基 -5-[2-(2- 甲基 - 环丙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺将粉末氢氧化钠 (300mg) 加入 N′ -[5-(3- 二甲基氨基 - 丙烯酰基 )-4- 甲基 - 噻 唑 -2- 基 ]-N， N- 二甲基 - 甲脒 (1g， 如 S.Wang 等人 J.Med.Chem.2004， 47， 1662-1675 中所 述制备 ) 和顺式 / 反式 2- 甲基 - 环丙烷甲脒盐酸化物 (0.61g， 如 WO 03/087064 中所述制 备 ) 在 2- 甲氧基乙醇 (3.8ml) 的溶液中， 并将该混合物在搅拌中于 125℃下加热 1 小时。 将反应混合物冷却， 过滤， 用水洗涤， 得到标题化合物。MS ： M+H 247 和 M-H 245。
     实 施 例 63(S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 二 乙 基 氨 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
     在 室 温 下 将 咪 唑 -1- 甲 酸 [5-(2- 二 乙 基 氨 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲 基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰 胺 (40mg) 加 入 搅 拌 过 的 L- 脯 氨 酰 胺 (14mg) 和 三 乙 胺 (19μl) 在 DMF(147μl) 的溶液中。将反应混合物在 40℃下搅拌 2 小时， 并经制备型反相色谱纯化。 将包含标题化合物的流份用 300mg 的 BondElut SPE、 SCX 柱捕获， 并随后用 7M 的氨在甲醇 (1ml) 中的溶液释放。经蒸发获得标题化合物。ESI-MS ： M+H 404 和 M-H 402。
     步 骤 63.1 ： 咪 唑 -1- 甲 酸 [5-(2- 二 乙 基 氨 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 ]- 酰胺
     在室温下将羰基二咪唑 (437mg) 加入 [4-(2- 氨基 -4- 甲基 - 噻唑 -5- 基 )- 嘧 啶 -2- 基 ]- 二乙基 - 胺 (355mg) 和三乙胺 (207μl) 在 DMF(1.4ml) 的溶液中， 并随后在 80℃下加热 18 小时。将反应混合物蒸发并用氯仿研磨。经过滤分离标题化合物。
     步骤 63.2 ： [4-(2- 氨基 -4- 甲基 - 噻唑 -5- 基 )- 嘧啶 -2- 基 ]- 二乙基 - 胺
     将粉末氢氧化钠 (150mg) 加入 N′ -[5-(3- 二甲基氨基 - 丙烯酰基 )-4- 甲基 - 噻 唑 -2- 基 ]-N， N- 二甲基 - 甲脒 (0.5g， 如 S.Wang 等人 J.Med.Chem.2004， 47， 1662-1675 中 所述制备 ) 和 1， 1- 二乙基胍 (259mg) 在 2- 甲氧基乙醇 (1.9ml) 的溶液中， 并将该混合物 在搅拌中于 125℃下加热 1 小时。 将反应混合物真空浓缩， 并经正相色谱纯化， 洗脱剂 ； DCM/ EtOAc， 得到标题化合物。ESI-MS ： M+H 264 和 M-H 262。
     实施例 64 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     在室温下将咪唑 -1- 甲酸 {4- 甲基 -5-[2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 (69mg) 加入搅拌过的 L- 脯氨酰胺 (22mg) 和三乙胺 (53mg)在 DMF(1ml) 的溶液中。将反应混合物在室温下放置 22 小时， 随后蒸发， 并用甲醇 (2ml) 和 水 (1ml) 结晶后得到标题化合物， 为白色固体。HPLC/MS ： 保留时间 1.80 分钟， M+H 443.1 和 M-H 441.2。
     步骤 64.1 ： 咪唑 -1- 甲酸 {4- 甲基 -5-[2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺
     在 室 温 下 将 羰 基 二 咪 唑 (38mg) 加 入 4- 甲 基 -5-[2-(2， 2， 2- 三 氟 -1， 1- 二 甲 基 - 乙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺 (65mg) 在 DCM(1ml) 和 DMF(0.2ml) 的溶液中， 并 随后在 25℃下放置 18 小时。冷却后经过滤分离标题化合物。
     步骤 64.2 ： 4- 甲基 -5-[2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基胺
     将粉末氢氧化钠 (0.42g) 加入 N′ -[5-((E)-3- 二甲基氨基 - 丙烯酰基 )-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 ]-N， N- 二 甲 基 - 甲 脒 (0.93g， 如 S.Wang 等 人 J.Med.Chem.2004， 47， 1662-1675 中所述制备 ) 和 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙脒盐酸化物 (0.54g) 在 2- 甲氧 基乙醇 (7ml) 的溶液中， 并将该混合物在搅拌中于 125℃下加热 1 小时。将反应混合物冷 却， 加入水， 并将水层用 10％甲醇的二氯甲烷溶液萃取 4 次。合并的有机层经反相色谱纯 化， 并将碳酸氢钠加入包含标题化合物的流份中， 得到白色沉淀， 其经过滤收集。HPLC/MS ： 保留时间 1.47 分钟， M+H 303.1。
     步骤 64.3 ： 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙脒盐酸化物
     按照步骤 61.3 中所述方法合成标题化合物， 并进行如下修改。使用 3， 3， 3- 三 氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酸丁酯代替 d9-2， 2- 二甲基 - 丙酸丁酯， 并将该混合物在 80℃下搅拌 3天。将粗产物溶于用少量 HCl 的 EtOH 溶液处理过的 DCM 中并蒸发。将残余物用 DCM 研磨， 过滤并干燥， 得到标题化合物， 为灰白色固体。
     步骤 64.4 ： 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酸丁酯
     将 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酸 (3.0g， 19.2mmol) 和一滴 DMF 溶于 30mL 的 DCM 中， 并在室温下用草酰氯 (1.85mL， 21.1mmol) 逐滴处理。2 小时后， 气体停止产生， 并将 该混合物用三乙胺 (5.36mL， 38.4mmol)、 随后用正丁醇 (2.1mL， 23mmol) 缓慢处理。将该混 合物搅拌过夜， 蒸发溶剂， 并将残余物用己烷搅拌。滤出固体， 并蒸发滤液得到褐 - 红色油 状物。Kuge)rohr 蒸馏 (10 毫巴， 60-80℃炉温 )， 得到标题化合物， 为无色液体。
     实施例 65(S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-( 乙基 - 甲基 - 氨基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     将 (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 甲 烷 亚 磺 酰 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }(60mg) 和 N- 乙基甲基胺 (45mg) 在密封的试管 中于 80℃下加热 18 小时。然后将粗产物用制备型反相色谱纯化。将包含标题化合物的流 份用 300mg 的 BondElut SPE、 SCX 柱捕获， 并随后用 7M 的氨在甲醇 (1ml) 中的溶液释放。 经蒸发获得标题化合物。ESI-MS ： M+H 390。
     步 骤 65.1 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 甲 烷 亚 磺 酰 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
     在 0 ℃下将间 - 氯过氧苯甲酸 (0.50g) 加入 (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺1-{[4- 甲基 -5-(2- 甲基硫基 - 嘧啶 -4- 基 )- 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }(1.7g) 在二氯甲烷 (8.5ml) 的溶液中。1 小时后将反应混合物蒸发， 并经正相色谱纯化， 用二氯甲烷 / 甲醇梯 度洗脱， 得到标题化合物， 为黄色固体。ESI-MS ： M+H 395 和 M-H 393。
     步骤 65.2 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[4- 甲基 -5-(2- 甲基硫基 - 嘧 啶 -4- 基 )- 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
     在 室 温 下 将 咪 唑 -1- 甲 酸 [4- 甲 基 -5-(2- 甲 基 硫 基 - 嘧 啶 -4- 基 )- 噻 唑 -2- 基 ]- 酰胺 (1.0g) 加入搅拌过的 L- 脯氨酰胺 (379mg) 和三乙胺 (0.51ml) 在 DMF(3ml) 的溶液中。 将反应混合物在 40℃下搅拌 2 小时， 然后蒸发， 用二氯甲烷和水沉淀后得到标题 化合物， 为橙色固体。ESI-MS ： M+H 379 和 M-H377。
     步 骤 65.3 ： 咪 唑 -1- 甲 酸 [4- 甲 基 -5-(2- 甲 基 硫 基 - 嘧 啶 -4- 基 )- 噻 唑 -2- 基 ]- 酰胺
     在室温下将羰基二咪唑 (1.77g) 加入 4- 甲基 -5-(2- 甲基硫基 - 嘧啶 -4- 基 )- 噻 唑 -2- 基胺 (1.3g) 在三乙胺 (0.84ml) 和 DMF(5.5ml) 的溶液中， 并在 80℃下搅拌 2 小时。 冷却后经过滤分离标题化合物。
     步骤 65.4 ： 4- 甲基 -5-(2- 甲基硫基 - 嘧啶 -4- 基 )- 噻唑 -2- 基胺
     将粉末氢氧化钠 (1.09g) 加入 N′ -[5-(3- 二甲基氨基 - 丙烯酰基 )-4- 甲基 - 噻 唑 -2- 基 ]-N， N- 二甲基 - 甲脒 (2.0g， 按照 S.Wang 等人 J.Med.Chem.2004， 47， 1662-1675 所述制备 ) 和硫脲 (0.57g) 在乙醇 (25ml) 的溶液中， 并将该混合物在搅拌中于回流下加热 3 小时。将反应混合物冷却至室温， 并随后加入水和碘甲烷 (0.47ml)。室温下 1 小时后， 蒸发除去乙醇， 并加入水， 用 2N 的盐酸水溶液将 pH 调至 7。经过滤得到标题化合物。ESI-MS ： M+H239 和 M-H 237。
     实施例 66(S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[5-(6- 环丙基 - 吡嗪 -2- 基 )-4- 甲 基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
     在室温下将咪唑 -1- 甲酸 [5-(6- 环丙基 - 吡嗪 -2- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰 胺 (78mg) 加入搅拌过的 L- 脯氨酰胺 (30mg) 和三乙胺 (83μl) 在 DMF(1ml) 的溶液中。将 反应混合物在室温下放置 18 小时， 蒸发， 并在用甲醇 (1ml) 和水 (0， 5ml) 结晶后得到标题 化合物， 为黄 / 白色固体。HPLC/MS ： 保留时间 1.40 分钟， M+H 373.1 和 M-H 371.3。
     步骤 66.1 ： 咪唑 -1- 甲酸 [5-(6- 环丙基 - 吡嗪 -2- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰 胺
     在室温下将羰基二咪唑 (74mg) 加入 5-(6- 环丙基 - 吡嗪 -2- 基 )-4- 甲基 - 噻 唑 -2- 基胺 (96mg) 在 DMF(2ml) 的溶液中， 并在室温下放置 18 小时。将反应混合物过滤， 用二氯甲烷洗涤， 得到标题化合物。
     步骤 66.2 ： 5-(6- 环丙基 - 吡嗪 -2- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基胺
     在室温下将浓盐酸 (0.4ml) 加入 N-[5-(6- 环丙基 - 吡嗪 -2- 基 )-4- 甲基 - 噻 唑 -2- 基 ]- 乙酰胺 (120mg) 在乙醇 (9ml) 的溶液中， 并将该混合物在回流下加热 18 小时。 将冷却的反应混合物蒸发， 用碳酸氢钠水溶液中和， 并用 10％甲醇的 DCM 溶液萃取。 将合并 的有机萃取物用硫酸钠干燥并蒸发， 得到标题化合物。HPLC/MS ： 保留时间 0.93 分钟， M+H 233.3。
     步骤 66.3 ： N-[5-(6- 环丙基 - 吡嗪 -2- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 乙酰胺
     在室温下将氩气鼓入 2- 环丙基 -6- 氯吡嗪 (154mg， 按照 A.Fiirstner 等人 J.Am. Chem.Soc.2002， 214， 13856-13863 的方法制备 )、 2- 乙酰氨基 -4- 甲基噻唑 (200mg)、 乙酸 钯 (24mg)、 三叔丁基 四氟硼酸盐 (61mg) 和碳酸铯 (678mg) 在 DMF(3ml) 的混合物中持续5 分钟。将反应混合物在密封小瓶内在氩气中于 150℃下在 Biotage InitiatorTM 微波设备 中加热 45 分钟。将反应混合物过滤， 并经制备型 HPLC 纯化。将包含标题化合物的流份合 并， 并蒸发除去乙腈， 经过滤得到标题化合物， 为浅褐色固体。HPLC/MS ： 保留时间 1.65 分 钟， M+H 275.3。 实施例 67(S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[4- 甲基 -5-(5- 三氟甲基 - 吡 啶 -3- 基 )- 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
     在 室 温 下 将 羰 基 二 咪 唑 (29mg) 加 入 搅 拌 过 的 4- 甲 基 -5-(5- 三 氟 甲 基 - 吡 啶 -3- 基 )- 噻唑 -2- 基胺 (42mg) 和三乙胺 (50μl) 在 DMF(1ml) 的溶液中， 并将该混合物 在室温下放置 18 小时。加入 L- 脯氨酰胺 (20mg)， 并将反应混合物在室温下再放置 8 小时， 蒸发， 并在用甲醇 (3ml) 和水 (1.5ml) 结晶后得到标题化合物， 为白色固体。ESI-MS ： M+H 400。
     步骤 67.1 ： 4- 甲基 -5-(5- 三氟甲基 - 吡啶 -3- 基 )- 噻唑 -2- 基胺
     在室温下将三甲基硅烷基氯化物 (0.3ml) 加入 N-[4- 甲基 -5-(5- 三氟甲基 - 吡 啶 -3- 基 )- 噻唑 -2- 基 ]- 乙酰胺 (44mg) 在乙醇 (2ml) 的溶液中， 并将该混合物在室温下搅拌 4.5 小时。 然后将反应物在 50℃加热 18 小时， 冷却， 蒸发， 并在用乙醚研磨后经过滤得 到标题化合物。
     步骤 67.2 ： N-[4- 甲基 -5-(5- 三氟甲基 - 吡啶 -3- 基 )- 噻唑 -2- 基 ]- 乙酰胺
     在 室 温 下 将 氩 气 鼓 入 5-( 三 氟 甲 基 )-3- 吡 啶 基 硼 酸 盐 酸 化 物 (263mg， 如 WO 2007/134828 中所述制备 )、 2- 乙酰氨基 -5- 碘 -4- 甲基噻唑 (260mg， 如 WO 2006/125807 中 所述制备 )、 1， 1′ - 二 -( 二苯基膦基 )- 二茂铁二氯化钯 (II)(38mg)、 碳酸钠 (488mg) 在 DME(2.3ml) 的溶液和水 (2.3ml) 的混合物中持续 5 分钟。将反应混合物在密封小瓶内在 氩气中于 80℃下在 BiotageInitiatorTM 微波设备中加热 30 分钟， 并随后在 80℃下加热 60 分钟。冷却后将反应混合物用 DCM 萃取， 用硅胶蒸发合并的有机层， 并经正相色谱纯化 ( 洗 脱剂 ； 从 DCM 到 DCM ： 乙酸乙酯 1 ∶ 1 梯度洗脱 )。随后将包含产物的流份用甲醇 (5ml)、 DMF(0.3ml) 和水 (1.3ml) 研磨并过滤， 得到标题化合物， 为浅褐色固体。
     实 施 例 68(S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(6-d10- 二 乙 基 氨 基 - 吡 嗪 -2- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }在室温下将咪唑 -1- 甲酸 [5-(6-d10- 二乙基氨基 - 吡嗪 -2- 基 )-4- 甲基 - 噻 唑 -2- 基 ]- 酰胺 (82mg) 加入搅拌过的 L- 脯氨酰胺 (28mg) 和三乙胺 (78μl) 在 DMF(1ml) 的溶液中。将反应混合物在室温下放置 14 小时， 蒸发， 并在用甲醇 (1ml) 和水 (0.5ml) 结 晶后得到标题化合物， 为黄 / 白色固体。HPLC/MS ： 保留时间 1.41 分钟， M+H 414.2 和 M-H 412.3。
     步骤 68.1 ： 咪唑 -1- 甲酸 [5-(6-d10- 二乙基氨基 - 吡嗪 -2- 基 )-4- 甲基 - 噻 唑 -2- 基 ]- 酰胺
     在室温下将羰基二咪唑 (78mg) 加入 5-(6-d10- 二乙基氨基 - 吡嗪 -2- 基 )-4- 甲 基 - 噻唑 -2- 基胺 (121mg) 在 DMF(2ml) 的溶液中， 并在室温下放置 3.5 小时。将反应混合 物过滤， 用二氯甲烷洗涤， 得到标题化合物。
     步骤 68.2 ： 5-(6-d10- 二乙基氨基 - 吡嗪 -2- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基胺
     在室温下将浓盐酸 (0.4ml) 加入 N-[5-(6-d10- 二乙基氨基 - 吡嗪 -2- 基 )-4- 甲 基 - 噻唑 -2- 基 ]- 乙酰胺 (140mg) 在乙醇 (9ml) 的溶液中， 并将该混合物在回流下加热 40 小时。将该冷却的反应混合物蒸发， 用碳酸氢钠水溶液中和， 并用 10％甲醇的 DCM 溶液萃 取。将合并的有机萃取物用硫酸钠干燥并蒸发， 得到标题化合物。HPLC/MS ： 保留时间 1.17 分钟， M+H 274.4。
     步骤 68.3 ： N-[5-(6-d10- 二乙基氨基 - 吡嗪 -2- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 乙 酰胺
     将氩气鼓入 2-d10- 二乙基氨基 -6- 氯吡嗪 (293mg)、 2- 乙酰氨基 -4- 甲基噻唑 四氟硼酸盐 (61mg) 和碳酸铯 (1.02g) 在 DMF(3ml)(300mg)、 乙酸钯 (24mg)、 三叔丁基的混合物中持续 5 分钟。将反应混合物在密封的小瓶内在氩气中于 150 ℃下在 Biotage InitiatorTM 微波设备中加热 45 分钟， 过滤并经制备型 HPLC 纯化。将包含标题化合物的流 份合并， 并蒸发除去乙腈， 经过滤得到标题化合物， 为浅褐色固体。HPLC/MS ： 保留时间 1.68 分钟， M+H 316.3。步骤 68.4 ： 2-d10- 二乙基氨基 -6- 氯吡嗪在室温下将 d10- 二乙基胺 (0.5g) 加入搅拌过的 2， 6- 二氯吡嗪 (0.93g) 和碳酸 钾 (1.41g) 在乙腈 (4ml) 的溶液中。随后将反应混合物在 55℃下加热 60 小时， 冷却， 加入 水并随后用二氯甲烷萃取。 将合并的有机萃取物用硫酸钠干燥， 蒸发并经正相色谱纯化， 用 DCM 洗脱， 得到标题化合物。HPLC/MS ： 保留时间 2.10 分钟， M+H 196.4 和 198.4。
     实 施 例 69(S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(6- 二 乙 基 氨 基 - 吡 嗪 -2- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
     按照实施例 68 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用二乙基胺代替 d10- 二乙 基胺。HPLC/MS ： 保留时间 1.43 分钟， M+H 404.2 和 402.3。
     实 施 例 70 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 环 丙 基 甲 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
     按 照 实 施 例 42 中 所 述 类 似 的 方 法 制 备 标 题 化 合 物， 但 使 用 咪 唑 -1- 甲 酸 [5-(2- 环丙基甲基 - 嘧啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺代替咪唑 -1- 甲酸 {4- 甲 基 -5-[2-(1- 甲 基 - 环 丙 基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 }- 酰 胺。M.p.220-222 ℃， ESI-MS[M+H]+387.1， TLC ： Rf ＝ 0.2(DCM/EtOH 95 ∶ 5)
     步 骤 70.1 ： 咪 唑 -1- 甲 酸 [5-(2- 环 丙 基 甲 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 ]- 酰胺
     按照步骤 42.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 5-(2- 环丙基甲基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环丙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 胺， 并 将 反 应 物 搅 拌 15 小 时。M.p.240-243 ℃， ESI-MS[M+H]+305.1， TLC ： Rf ＝ 0.35(DCM/EtOH 95 ∶ 5)。
     步骤 70.2 ： 5-(2- 环丙基甲基 - 嘧啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基胺
     按照步骤 42.2 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 2- 环丙基 - 乙脒盐酸 化物代替 1- 甲基 - 环丙烷甲脒盐酸化物。M.p.198-200℃， ESI-MS[M+H]+247.1， TLC ： Rf ＝ 0.25(DCM/EtOH 95 ∶ 5)。
     实施例 71 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(2- 氟 -1， 1- 二甲基 - 乙 基 )- 嘧啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     按 照 实 施 例 42 中 所 述 类 似 的 方 法 制 备 标 题 化 合 物， 但 使 用 咪 唑 -1- 甲 酸 {5-[2-(2- 氟 -1， 1- 二 甲 基 - 乙 基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 }- 酰 胺 代 替 咪唑 -1- 甲酸 {4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环丙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺。 M.p.187-190℃， ESI-MS[M+H]+407.1， TLC ： Rf ＝ 0.3(DCM/EtOH 95 ∶ 5)
     步骤 71.1 ： 咪唑 -1- 甲酸 {5-[2-(2- 氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]-4- 甲 基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺
     按照步骤 42.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 5-[2-(2- 氟 -1， 1- 二 甲基 - 乙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环丙 基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺， 并将反应物在 80℃下搅拌 16 小时。
     步骤 71.2 ： 5-[2-(2- 氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 胺
     按照步骤 42.2 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 3- 氟 -2， 2- 二甲基 - 丙 + 脒盐酸化物代替 1- 甲基 - 环丙烷 - 甲脒盐酸化物。 ESI-MS[M+H] 267.1， TLC ： Rf ＝ 0.4(DCM/ EtOH 95 ∶ 5)。
     实施例 72 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[5-(2- 叔丁基 -6- 甲基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
     按 照 实 施 例 42 中 所 述 类 似 的 方 法 制 备 标 题 化 合 物， 但 使 用 咪 唑 -1- 甲 酸 [5-(2- 叔丁基 -6- 甲基 - 嘧啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺代替咪唑 -1- 甲酸 {4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环丙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺。M.p.197-199℃， ESI-MS[M+H]+403.1， TLC ： Rf ＝ 0.3(DCM/EtOH 95 ∶ 5)
     步骤 72.1 ： 咪唑 -1- 甲酸 [5-(2- 叔丁基 -6- 甲基 - 嘧啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻 唑 -2- 基 ]- 酰胺
     按照步骤 42.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 5-(2- 叔丁基 -6- 甲 基 - 嘧啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环丙基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺， 并将反应物搅拌 16 小时。ESI-MS[M-H]-355.2。
     步骤 72.2 ： 5-(2- 叔丁基 -6- 甲基 - 嘧啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基胺
     按照步骤 1.2 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 N-[5-(2- 叔丁基 -6- 甲 基 - 嘧啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 乙酰胺代替 N-[5-(2- 叔丁基 - 吡啶 -4- 基 )-4- 甲 基 - 噻唑 -2- 基 ]- 乙酰胺， 并使用 2N HCl。将反应混合物在室温下搅拌 16 小时， 并随后在 + 90℃下搅拌 3 小时。ESI-MS[M+H] 263.1。
     步骤 72.3 ： N-[5-(2- 叔丁基 -6- 甲基 - 嘧啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 乙 酰胺
     按照步骤 1.3 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 溴 -2- 叔丁基 -6- 甲 + 基 - 嘧啶代替 4- 溴 -2- 叔丁基 - 吡啶。ESI-MS[M+H] 305.2。
     步骤 72.4 ： 4- 溴 -2- 叔丁基 -6- 甲基 - 嘧啶
     按 照 步 骤 1.4 中 所 述 类 似 的 方 法 制 备 标 题 化 合 物， 但 使 用 2- 叔 丁 基 -6- 甲 基 -3H- 嘧啶 -4- 酮代替 2- 叔丁基 -1H- 吡啶 -4- 酮。ESI-MS[M+H]+229/231.0。TLC ： Rf ＝ 0.58( 己烷 /DCM 7 ∶ 3)
     实施例 73 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(2- 氟 -1， 1- 二甲基 - 乙
     基 )- 吡啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 6 小时。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 15 小 时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 100℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步 骤 1.3 中， 将反应混合物在 120℃下搅拌 4 小时。在步骤 1.4 中， 将反应混合物在 85℃下搅 拌 30 分钟， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 70℃下搅拌 1 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 粗产物不再纯化。在步骤 1.7 中， 使用 3- 氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酰氯 ( 步骤 76.1)。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 406.1[M+H]+ ； tR ＝ 2.20min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.47(DCM/ MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 73.1 ： 3- 氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酰氯
     按照步骤 5.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 3- 氟 -2， 2- 二甲基 - 丙 酸 ( 步骤 73.2)。
     步骤 73.2 ： 3- 氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酸
     将 6.9g(38.6mmol)3- 氟 -2， 2- 二 甲 基 - 丙 酸 甲 酯 在 30mL 甲 醇 中 的 溶 液 用 38.6mL(77mmol) 的 2N NaOH 处理， 并将该混合物加热至回流持续 3 小时。将该混合物冷却 至室温， 并蒸发溶剂。将残余物在水和 DCM 之间分配。将水相通过加入 50mL 的 2N HCl 酸 化， 并用乙酸乙酯萃取。将有机相用盐水洗涤， 用硫酸钠干燥并蒸发。无色残余物用己烷搅 拌， 过滤除去不溶物， 蒸发滤液得到标题化合物， 为无色固体。ESI-MS ： 119.0[M-H]-。
     步骤 73.3 ： 3- 氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酸甲酯
     将 27mL 的 1M 四 丁 基 氟 化 铵 在 THF 中 的 溶 液 在 冰 冷 却 下 缓 慢 加 入 7.25g(27.4mmol) 的 2， 2- 二甲基 -3- 三氟甲磺酰基氧基 - 丙酸甲酯在 150mL 的 THF 中的溶 液。将所得溶液在 0℃下搅拌 6 小时， 并随后在室温下搅拌 10 小时。小心蒸发溶剂， 并将残余物在 DCM 和盐水之间分配。将有机相用盐水洗涤， 用硫酸钠干燥并小心蒸发。将褐色油 状物在 Kugelrohr 炉 ( 炉温 120-150℃ ) 中蒸馏， 得到标题化合物， 为无色液体。
     步骤 73.4 ： 2， 2- 二甲基 -3- 三氟甲磺酰基氧基 - 丙酸甲酯
     在 -70 ℃ 下 在 氩 气 中 向 3.64g(27.5mmol)3- 羟 基 -2， 2- 二 甲 基 - 丙 酸 甲 酯 和 4.82mL(41.3mmol)2， 6- 二甲基吡啶在 50mL 无水 DCM 的溶液中缓慢加入三氟甲磺酸酐 (5.12mL， 30.3mmol)。将该黄色溶液在 -70℃下搅拌 5 分钟， 随后移去冷却浴， 并将该混合 物在室温下搅拌 3 小时。颜色从黄色变为橙色再变为褐色。加入 DCM(50mL)， 并将该溶液 用 2N HCl 洗涤两次， 用硫酸钠干燥并蒸发至干。将该褐色残余物真空干燥， 且该标题化合 物不经进一步纯化直接使用。TLC ： Rf ＝ 0.72(EtOAc/ 己烷 1 ∶ 2)。
     分析型 HPLC 条件 ：
     5 分钟内线性梯度 20-100 ％溶剂 A+1.5 分钟 100 ％溶剂 A ； 在 215nm 检测， 流速 1mL/min， 于 30℃下。柱 ： Nucleosil 100-3C18(70x4.0mm)。溶剂 A ＝ CH3CN+0.1％ TFA ； 溶 剂 B ＝ H2O+0.1％ TFA。
     MS 条件 ：
     仪器 ： Micromass Platform II， 洗脱剂 ： 15％甲醇水溶液， 包含 0.2％的 25％氢氧 化铵溶液。 1
     H-NMR 波谱在 Varian Mercury 400 波谱仪上在指定溶剂中检测。缩写 ： br ： 宽； s： 单峰 ； d： 双峰 ； t： 三重峰 ； q： 四重峰 ； ppm ： 百万分之
     HPLC/MS 条件 ：
     仪器 ： Hewlett Packard Agilent 1100 系 列， 柱： XBridgeTM C182.5 微 米， 3.0X 30mm， 温度 ： 50℃， 洗脱剂 ： 2 通道系统 ： 通道 A 5％乙腈的水溶液， 通道 B 包含 1.0％甲酸的 乙腈
     检测 ： Agilent 1100DAD 210-350nm 和 Waters Micromass ZQ 2000ESI+ 和 ESI-。
     制备型 HPLC ：
     仪器 ： Gilson 制备型 HPLC 系统， 柱： SunfireTM Prep C18OBDTM 5 微米， 30X 100mm， 温度 ： 25 ℃， 洗脱剂 ： 20 分钟内， 在 0.05 ％三氟乙酸水溶液中的 5-100 ％乙腈梯度， 流速 ： 30ml/ 分钟， 检测 ： UV 254nm。
     缩写和首字母缩写 ：
     实施例 A ： 作为 PI3 激酶抑制剂的效能PI3K KinaseGlo 试验 ： 将 50nL 化合物稀释液分配在黑色 384 孔小体积非结合苯 乙烯 (NBS) 板 ( 卡西达 (Costar) 公司， 目录号 NBS#3676) 上。将作为 10mg/ml 溶液 ( 在甲 醇中 ) 提供的 L-a- 磷脂酰肌醇 (PI) 转移到玻璃管中， 在氮气流下干燥。然后通过涡旋将 其重新混悬在 3％辛基葡糖苷 (OG) 中， 于 4℃贮存。KinaseGlo 发光激酶检测试剂盒 ( 普洛 麦格 (Promega) 公司， 麦迪逊 /WI， 美国 ) 是通过对在激酶反应后溶液中剩余的 ATP 的量进 行定量来测定激酶活性的均一的 HTS 方法。
     加入 5μL PI/OG 与 PI3K 亚型的混合物 ( 表 1)。加入 5μl ATP 混合物 ( 在 10μL 终体积中含有 10mM TRIS-HCl pH7.5、 3mM MgCl2、 50mM NaCl、 0.05％ CHAPS、 1mM DTT 和 1μM ATP) 使激酶反应开始， 这些反应于室温进行。用 10μl KinaseGlo 使反应终止， 10 分钟后 在 Synergy2 读数器中使用 0.1 秒 / 孔的积分时间对板进行读数。 将 2.5μM 全种类 1PI3 激 酶抑制剂 ( 标准品 ) 加入到试验板中， 产生对激酶反应的 100％抑制， 溶剂载体 (90％ DMSO， 在水中 ) 给出了 0％抑制。使用标准品作为参考化合物， 并且在所有试验板中以 16 个稀释 点的形式包括标准品， 一式两份。
     表 1 使用 KinaseGlo 的 PI3K ： 试验条件和试剂方案
     PI3K 的克隆
     PI3Kα、 PI3Kβ 和 PI3Kδ 构建体是 p85αiSH2 结构域与各自的 p110 同工型的融 合体。通过 PCR、 由第一链 cDNA( 通过 RT-PCR 由市售的来自胎盘、 睾丸和脑的 RNA 产生 ) 按照下述方法产生了 p85α 片段和 p110 同工型基因。PI3Kγ 构建体获自罗杰· 威廉斯 (Roger Williams) 实验室 ( 分子生物学 MRC 实验室， 剑桥， 英国 )(2003 年 11 月 )， 并且有 描述 (Pacold， MichaelE. ； Suire， Sabine ； Perisic， Olga ； Lara-Gonzalez， Samuel ； Davis， Colin T. ； Walker， Edward H. ； Hawkins， Phillip T. ； Stephens， Len ； Eccleston， JohnF. ； Williams， Roger L.Crystal structure and functional analysis of Rasbinding to its effector phosphoinositide 3-kinase gamma.Cell(2000)， 103(6)， 931-943)。
     PI3Kα 构建体和蛋白质
     PI3Kαwt BV1075 p85iSH2(461-568)-GGGGGGGGGGGG-p110α(21-1068)-HisBV1075 ： 用于杆状病毒 BV-1075 的构建体由三部分连接物产生， 所述的三部分连 接物由克隆到载体 pBlueBac4.5 中的 p85 片段和 p110α 片段组成。p85 片段获自用 Nhe/ Spe 消化的质粒 p1661-2。获得的 p110α 片段是克隆， 其通过测序被证实并且作为 SpeI/ HindIII 片段用在 LR410 中。为了产生杆状病毒表达载体 LR410， 使用 Gateway LR 反应将 插入物转移到 Gateway 接头的 pBlueBac4.5( 英杰 (Invitrogen) 公司 ) 载体中。将克隆载 体 pBlueBac4.5( 英杰公司 ) 用 Nhe/HindIII 消化。这产生了构建体 PED 153.8。通过 PCR、 使用作为模板的 ORF 318( 上文所述 ) 以及一个正向引物 KAC1028(5’ -GCTAGCATGCGAGAATA TGATAGAT-TATATGAAG-AATATACC)(SEQ ID NO ： 1) 和两个反向引物 KAC1029 ： (5’ -GCCTCCACC AC-CTCCGCCTG-GTTTAATGCTGTTCATACGTTTGTC)(SEQ IDNO ： 2) 和 KAC1039(5′ -TACTAGTC-CGC CTCCAC-CACCTCCGCCTCCACCACCTCCGCC)(SEQ ID NO ： 3) 产生了 p85 组分 (iSH2)。两个反向 引物重叠， 将 12×Gly 连接子和 p110α 基因的 N- 末端序列引入 SpeI 位点。12×Gly 连接 子取代了 BV1052 构建体中的一个 Gly 连接子。PCR 片段被克隆到 pCR2.1TOPO( 英杰公司 ) 中。在所得克隆中， 通过测序确定了 p1661-2 是正确的。将该质粒用 Nhe 和 SpeI 消化， 将 所得片段进行凝胶分离和纯化以进行亚克隆。
     通过将克隆 LR410( 见上 ) 用 Spe I 和 HindIII 进行酶消化而产生了 p110α 克隆 片段。SpeI 位点在 p110α 基因的编码区内。将所得片段进行凝胶分离和纯化以进行亚克 隆。通过用 Nhe 和 HindIII 进行酶消化而制得克隆载体 pBlueBac4.5( 英杰公司 )。将切 割的载体用凯杰公司 (Qiagen) 柱进行纯化， 然后用小牛肠碱性磷酸酶 (CIP)( 生物实验室 公司 (BioLabs)) 脱磷酸。CIP 反应完成后， 将切割的载体再次进行柱纯化， 产生最终载体。 使用罗氏公司 (Roche) 快速连接酶和销售商说明书进行了三部分连接。通过测序证实了最 终质粒。
     激酶结构域。
     BV 1075 的蛋白质序列 ：
     1 MREYDRLYEE YTRTSQEIQM KRTAIEAFNE TIKIFEEQCQ TQERYSKEYI EKFKREGNEK
     61 EIQRIMHNYD KLKSRISEII DSRRRLEEDL KKQAAEYREI DKRMNSIKPG GGGGGGGGGG
     121 GLVECLLPNG MIVTLECLRE ATLITIKHEL FKEARKYPLH QLLQDESSYI FVSVTQEAER
     181 EEFFDETRRL CDLRLFQPFL KVIEPVGNRE EKILNREIGF AIGMPVCEFD MVKDPEVQDF
     241 RRNILNVCKE AVDLRDLNSP HSRAMYVYPP NVESSPELPK HIYNKLDKGQ IIVVIWVIVS
     301 PNNDKQKYTL KINHDCVPEQ VIAEAIRKKT RSMLLSSEQL KLCVLEYQGK YILKVCGCDE
     361 YFLEKYPLSQ YKYIRSCIML GRMPNLMLMA KESLYSQLPM DCFTMPSYSR RISTATPYMN
     421 GETSTKSLWV INSALRIKIL CATYVNVNIR DIDKIYVRTG IYHGGEPLCD NVNTQRVPCS
     481 NPRWNEWLNY DIYIPDLPRA ARLCLSICSV KGRKGAKEEH CPLAWGNINL FDYTDTLVSG
     541 KMALNLWPVP HGLEDLLNPI GVTGSNPNKE TPCLELEFDW FSSVVKFPDM SVIEEHANWS
     601 VSREAGFSYS HAGLSNRLAR DNELRENDKE QLKAISTRDP LSEITEQEKD FLWSHRHYCV
     661 TIPEILPKLL LSVKWNSRDE VAQMYCLVKD WPPIKPEQAM ELLDCNYPDP MVRGFAVRCL
     721 EKYLTDDKLS QYLIQLVQVL KYEQYLDNLL VRFLLKKALT NQRIGHFFFW HLKSEMHNKT
     781 VSQRFGLLLE SYCRACGMYL KHLNRQVEAM EKLINLTDIL KQEKKDETQK VQMKFLVEQM
     841 RRPDFMDALQ GFLSPLNPAH QLGNLRLEEC RIMSSAKRPL WLNWENPDIM SELLFQNNEI
     901 IFKNGDDLRQ DMLTLQIIRI MENIWQNQGL DLRMLPYGCL SIGDCVGLIE VVRNSHTIMQ97102149711 A CN 102149713
     PI3Kβ
     BV949说明书YDAAIDLFTR ERVPFVLTQD MPELQSFDDI LGGAHHHHHH89/100 页961 IQCKGGLKGA LQFNSHTLHQ 1021 NIMVKDDGQL FHIDFGHFLD 1081 FQEMCYKAYL AIRQHANLFI 1141 MKQMNDAHHG GWTTKMDWIF PI3Kβ 构建体和蛋白质WLKDKNKGEI HKKKKFGYKR NLFSMMLGSG HTIKQHALNESCAGYCVATF ILGIGDRHNS FLIVISKGAQ ECTKTREFER AYIRKTLALD KTEQEALEYF (SEQID NO ： 4)p85iSH2(461-N58K-568)-GGGGGG-p110β(2-1070)-HisBV949 ： 通过重叠 PCR 产生和融合了用于 p85PI3Kα、 PI3Kβ 和 PI3Kδ 亚基的 inter SH2 结构域 (iSH2) 以及用于全长 p110β 亚基的 PCR 产物。由第一链 cDNA( 通过 RT-PCR 由市售的来自胎盘、 睾丸和脑的人 RNA( 克隆技术公司 (Clontech) 产生 )， 起初使用 引物 gwG130-p01(5’ -CGAGAATATGATAGATTATATGAAGAAT-3’ )(SEQ ID NO ： 5) 和 gwG130-p02 (5’ -TGGTTT-AATGCTGTTCATACGTTTGTCAAT-3’ )(SEQ ID NO ： 6) 获得了 iSH2PCR 产物。随后， 在第二次 PCR 反应中， 分别在 p85iSH2 片段的 5’ 端和 3’ 端、 使用引物 gwG130-p03(5-GGGA CAAGTT-TGTACAAAAAAGCAGGCTACGAAGGAGATATACATATGCGAGAATATGATAGATTATATGAAGAAT-3’ ) (SEQ ID NO ： 7) 和 gwG130-p05(5’ -ACTGAAGCATCCTCCTC-CTCCTCCT-CCTGGTTTAATGCTGTTCA TACGTTTGTC-3’ )(SEQ ID NO ： 8) 加入 Gateway 重组 AttB1 位点和连接子序列。通过 PCR、 使用作为模板的 p110β 克隆 ( 来自未知来源， 其序列已被证实 )， 使用含有连接子序列和 p110β 的 5’ 端的引物 gwG130-p04(5’ -ATTAAACCAGGAGGAGGAGGAGGAGGATGCTT-CAGTTTCATA ATGCCTCCTGCT -3’ )(SEQ ID NO ： 9) 和含有与组氨酸标记融合的 p110-β 的 3’ 端序列的 ) gwG130-p06(5’ -AGCTCCGTGATGGTGATGGTGATGTGCTCCAGATC-TGTAGTCTTTCCGAA-CTGTGTG-3’ (SEQ ID NO ： 10) 得到了 p110β 片段。通过重叠 PCR、 在 iSH2 片段的 3’ 端和 p110β 片段 的 5’ 端进行的连接子反应， 使用上述 gwG130-p03 引物以及含有重叠的组氨酸标记和 AttB2 重组序列的引物 ： (5’ -GGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAAGCTCCGTGATGGTGATGGTGATGTGC TCC-3’ )(SEQ ID NO ： 11) 组建了 p85-iSH2/p110β 融合蛋白。该终产物在 Gateway( 英杰 公司 )OR 反应中被重组到供体载体 pDONR201( 英杰公司 ) 中， 产生 ORF253 输入克隆。通过 测序证实了该克隆， 其用于 Gateway LR 反应 ( 英杰公司 )， 使插入物转移到 Gateway 接头的 pBlueBac4.5( 英杰公司 ) 载体中， 以产生杆状病毒表达载体 LR280。该 LR280 具有 p85 序 列中的氨基酸突变。
     激酶结构域。
     BV949 的蛋白质序列 ：
     1 MREYDRLYEE YTRTSQEIQM KRTAIEAFNE TIKIFEEQCQ TQERYSKEYI EKFKREGKEK
     61 EIQRIMHNYD KLKSRISEII DSRRRLEEDL KKQAAEYREI DKRMNSIKPG GGGGGCFSFI
     121 MPPAMADILD IWAVDSQIAS DGSIPVDFLL PTGIYIQLEV PREATISYIK QMLWKQVHNY
     181 PMFNLLMDID SYMFACVNQT AVYEELEDET RRLCDVRPFL PVLKLVTRSC DPGEKLDSKI
     241 GVLIGKGLHE FDSLKDPEVN EFRRKMRKFS EEKILSLVGL SWMDWLKQTY PPEHEPSIPE
     301 NLEDKLYGGK LIVAVHFENC QDVFSFQVSP NMNPIKVNEL AIQKRLTIHG KEDEVSPYDY 361 VLQVSGRVEY VFGDHPLIQF QYIRNCVMNR ALPHFILVEC CKIKKMYEQE MIAIEAAINR 421 NSSNLPLPLP PKKTRIISHV WENNNPFQIV LVKGNKLNTE ETVKVHVRAG LFHGTELLCK98102149711 A CN 102149713
     PI3Kγ
     BV950说明书MARLCFAVYA IILHSWSSFP EIASSDSANV LLSIKWNKLE QYLLQLVQVL AYCRGSVGHM DLQSPLNPCV LQMLRLMDLL NKDALLNWLK DFGHILGNFK GNLFITLFAL VNWMAHTVRK90/100 页481 TIVSSEVSGK NDHIWNEPLE 541 TIRKAGKVHY PVAWVNTMVF 601 NATALHVKFP ENKKQPYYYP 661 LSQLCENEMD LIWTLRQDCR 721 LELLDFNYPD QYVREYAVGC 781 NRRIGQFLFW HLRSEVHIPA 841 KLNAVKLNRA KGKEAMHTCL 901 WLVYNNKVFG EDSVGVIFKN 961 RSGLIEVVST SETIADIQLN 1021 GYCVASYVLG IGDRHSDNIM 1081 VIQQGKTGNT EKFGRFRQCC 1141 SLALGKSEEE ALKQFKQKFD (SEQ ID NO ： 12) 激酶结构域。 PI3Kγ 构建体和蛋白质FDINICDLPR DFKGQLRTGD PFDKIIEKAA EIFPQSLPKL LRQMSDEELS VSVQFGVILE KQSAYREALS GDDLRQDMLT SSNVAAAAAF VKKTGQLFHI EDAYLILRRH EALRESWTTKVLDKVKTKKS TKTINPSKYQ DELEEMLNPM GTVQTNPYTE SSRGGKKFLP VLKEILDRDP DVAQLQALLQ IWPKLPPREA KYEPFLDCAL SRFLLERALG KVLSKQVEAL NKLKTLNSLI ILSELYVEKC KYMDSKMKPL WKEAGLDLRM LPYGCLATGD EYNSGDDLDR AIEEFTLSCA SKFGIKRERV PFILTYDFIH MLTAGLPELT SVKDIQYLKD DYRSGAHHHH HHGAp110γ(Δ143-[Met144-1102])-His构建体获自罗杰·威廉斯实验室 ( 分子生物学 MRC 实验室， 剑桥， 英国 )(2003 年 11 月 )。构建体在 (Pacold， Michael E. ； Suire， Sabine ； Perisic， Olga ； Lara-Gonzalez， Samuel ； DaVis， Colin T. ； Walker， Edward H. ； Hawkins， Phillip T. ； Stephens， Len ； Eccleston， John F. ； Williams， Roger L.Crystal structure and functional analysis of Ras binding to its effectorphosphoinositide 3-kinase gamma.Cell(2000)， 103(6)， 931-943) 中有描述。构建体缺少 N- 末端 144 氨基酸。
     BV950 的蛋白质序列 ：
     1 MSEESQAFQR QLTALIGYDV TDVSNVHDDE LEFTRRGLVT PRMAEVASRD PKLYAMHPWV
     61 TSKPLPEYLW KKIANNCIFI VIHRSTTSQT IKVSPDDTPG AILQSFFTKM AKKKSLMDIP
     121 ESQSEQDFVL RVCGRDEYLV GETPIKNFQW VRHCLKNGEE IHVVLDTPPD PALDEVRKEE
     181 WPLVDDCTGV TGYHEQLTIH GKDHESVFTV SLWDCDRKFR VKIRGIDIPV LPRNTDLTVF
     241 VEANIQHGQQ VLCQRRTSPK PFTEEVLWNV WLEFSIKIKD LPKGALLNLQ IYCGKAPALS
     301 SKASAESPSS ESKGKVRLLY YVNLLLIDHR FLLRRGEYVL HMWQISGKGE DQGSFNADKL
     361 TSATNPDKEN SMSISILLDN YCHPIALPKH QPTPDPEGDR VRAEMPNQLR KQLEAIIATD
     421 PLNPLTAEDK ELLWHFRYES LKHPKAYPKL FSSVKWGQQE IVAKTYQLLA RREVWDQSAL
     481 DVGLTMQLLD CNFSDENVRA IAVQKLESLE DDDVLHYLLQ LVQAVKFEPY HDSALARFLL
     541 KRGLRNKRIG HFLFWFLRSE IAQSRHYQQR FAVILEAYLR GCGTAMLHDF TQQVQVIEML
     601 QKVTLDIKSL SAEKYDVSSQ VISQLKQKLE NLQNSQLPES FRVPYDPGLK AGALAIEKCK
     661 VMASKKKPLW LEFKCADPTA LSNETIGIIF KHGDDLRQDM LILQILRIME SIWETESLDL 721 CLLPYGCIST GDKIGMIEIV KDATTIAKIQ QSTVGNTGAF KDEVLNHWLK EKSPTEEKFQ 781 AAVERFVYSC AGYCVATFVL GIGDRHNDNI MITETGNLFH IDFGHILGNY KSFLGINKER841 VPFVLTPDFL FVMGTSGKKT SPHFQKFQDI CVKAYLALRH HTNLLIILFS MMLMTGMPQL 901 TSKEDIEYIR DALTVGKNEE DAKKYFLDQI EVCRDKGWTV QFNWFLHLVL GIKQGEKHSA 961 HHHHHH (SEQ ID NO ： 13) PI3Kδ 构建体和蛋白质p55iSH2(461-568)-GGGGGG-p110δ(2-1044)-HisBV1060 ： 通过重叠 PCR 产生和融合了用于 p85 亚基的 inter SH2 结构域 (iSH2) 以及用于全长 p110δ 亚基的 PCR 产物。通过使用作为模板的 ORF318( 见上 ) 以及引物 g wG130-p03(5’ -GGGACAAGTT-TGTACAAAAAAGCAGGCTACGAAGGAGATATACATATGCGAGAATATGATAGAT TATATGAAGAAT-3’ )(SEQ ID NO ： 7) 和 gwG154-p04(5’ -TCCTCCTCCT-CCTCCTCCTGGTTTAATGCT GTTCATACGTTTGTC-3’ )(SEQ ID NO ： 14) 产生 iSH2PCR 产物。由第一链 cDNA( 通过 RT-PCR 由市售的来自胎盘、 睾丸和脑的人 RNA( 克隆技术公司 ) 产生 )、 首先使用引物 gwG154-p0 1(5’ -ATGCCCCCTGGGGTGGACTGCCCCAT-3’ )(SEQ ID NO ： 15) 和 gwG154-p02(5’ -CTACTGCCTG T-TGTCTTTGGACACGT-3’ )(SEQ ID NO ： 16) 获得 p110δ 片段。在随后 PCR 反应中， 分别在 p110δ 片段的 5’端和 3’端、 用引物 gw154-p03(5’ -ATTAAACCAGGAGGAGGAGGAGGAGGACCCC CTGGGGTGGAC-TGCCCCATGGA-3’ )(SEQ ID NO ： 17) 和 gwG154-p06(5’ -AGCTCCGTGATGGTGATGG TGAT-GTGCT-CCCTGCCTGTTGTCTTTGGACACGTTGT-3’ )(SEQ ID NO ： 18) 加入连接子序列和组氨 酸标记。在第三次 PCR 反应中， 通过 iSH2 片段的 3’ 端和 p110δ 片段的 5’ 端的重叠连接 子、 使用以上提到的 gwG130-p03 引物以及含有重叠的组氨酸标记和 Gateway( 英杰公司 ) AttB2 重组序列的引物 (5’ -GGG-ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAA-GCTCCGTGATGGTGATGGT GAGTGCTCC-3’ )(SEQ ID NO ： 19) 组装了 p85-iSH2/p110δ 融合蛋白。该终产物在 Gateway OR 反应中被重组到供体载体 pDONR201( 英杰公司 ) 中， 产生 ORF319 输入克隆。通过测序 证实了该克隆， 其用于 Gateway LR 反应 ( 英杰公司 ) 中， 使插入物转移到 Gateway 接头的 pBlueBac4.5( 英杰公司 ) 载体中， 以产生杆状病毒表达载体 LR415。
     BV1060 的蛋白质序列 ：
     1 MREYDRLYEE YTRTSQEIQM KRTAIEAFNE TIKIFEEQCQ TQERYSKEYI EKFKREGNEK
     61 EIQRIMHNYD KLKSRISEII DSRRRLEEDL KKQAAEYREI DKRMNSIKPG GGGGGPPGVD
     121 CPMEFWTKEE NQSVVVDFLL PTGVYLNFPV SRNANLSTIK QLLWHRAQYE PLFHMLSGPE
     181 AYVFTCINQT AEQQELEDEQ RRLCDVQPFL PVLRLVAREG DRVKKLINSQ ISLLIGKGLH
     241 EFDSLCDPEV NDFRAKMCQF CEEAAARRQQ LGWEAWLQYS FPLQLEPSAQ TWGPGTLRLP
     301 NRALLVNVKF EGSEESFTFQ VSTKDVPLAL MACALRKKAT VFRQPLVEQP EDYTLQVNGR
     361 HEYLYGSYPL CQFQYICSCL HSGLTPHLTM VHSSSILAMR DEQSNPAPQV QKPRAKPPPI
     421 PAKKPSSVSL WSLEQPFRIE LIQGSKVNAD ERMKLVVQAG LFHGNEMLCK TVSSSEVSVC
     481 SEPVWKQRLE FDINICDLPR MARLCFALYA VIEKAKKARS TKKKSKKADC PIAWANLMLF
     541 DYKDQLKTGE RCLYMWPSVP DEKGELLNPT GTVRSNPNTD SAAALLICLP EVAPHPVYYP 601 ALEKILELGR HSECVHVTEE EQLQLREILE RRGSGELYEH EKDLVWKLRH EVQEHFPEAL 661 ARLLLVTKWN KHEDVAQMLY LLCSWPELPV LSALELLDFS FPDCHVGSFA IKSLRKLTDD721 ELFQYLLQLV QVLKYESYLD CELTKFLLDR ALANRKIGHF LFWHLRSEMH VPSVALRFGL
     781 ILEAYCRGST HHMKVLMKQG EALSKLKALN DFVKLSSQKT PKPQTKELMH LCMRQEAYLE
     841 ALSHLQSPLD PSTLLAEVCV EQCTFMDSKM KPLWIMYSNE EAGSGGSVGI IFKNGDDLRQ
     901 DMLTLQMIQL MDVLWKQEGL DLRMTPYGCL PTGDRTGLIE VVLRSDTIAN IQLNKSNMAA
     961 TAAFNKDALL NWLKSKNPGE ALDRAIEEFT LSCAGYCVAT YVLGIGDRHS DNIMIRESGQ
     1021 LFHIDFGHFL GNFKTKFGIN RERVPFILTY DFVHVIQQGK TNNSEKFERF RGYCERAYTI
     1081 LRRHGLLFLH LFALMRAAGL PELSCSKDIQ YLKDSLALGK TEEEALKHFR VKFNEALRES
     1141 WKTKVNWLAH NVSKDNRQEL GGAHHHHHH
     (SEQ ID NO ： 20)
     PI3Kα、 PI3Kβ 和 PI3Kγ 构建体的纯化
     以两个色谱步骤纯化了 PI3Kα、 PI3Kβ 和 PI3Kγ ： 在 Ni 琼脂糖树脂 ( 通用电气 公司医疗保健部 (GE Healthcare)) 上进行固定化金属亲和层析 (IMAC) 以及采用 Superdex 20026/60 柱 ( 通用电气公司医疗保健部 ) 进行凝胶过滤。将所有缓冲液冷却至 4℃， 在冰 上冷却下进行裂解。于室温进行柱分级分离。除了以下描述的那些外， 用于纯化 PI3Kβ 的 所有缓冲液还含有 0.05％ Triton X100。
     通常， 将来自 10L Tn5 细胞培养物的冷冻细胞重新混悬在 “裂解缓冲液” (20mM Tris-Cl， pH7.5， 500mM NaCl， 5％甘油， 5mM 咪唑， 1mM NaF， 0.1ug/mL 冈田酸 (OAA)， 5mM BME， 1× 完全蛋白酶抑制剂混合物 - 不含 EDTA(20 片 /1L 缓冲液， 罗氏应用科学公司 (Roche Applied Sciences))， benzonase(25U/mL 缓冲液， EMD 生物科学公司 (EMD Biosciences)) ( 片状物 (pellet) 与裂解缓冲液的比例为 1 ： 6v/v)) 中， 通过使用紧密契合的研棒冲击 20 次而进行机械裂解。于 45,000g 将裂解物离心 30 分钟， 将上清液装到预平衡的 IMAC 柱上 (3mL 树脂 /100mL 裂解物 )。将柱用 3-5 个柱体积的裂解缓冲液冲洗， 然后用 3-5 个柱体 积的 20mM Tris-Cl， pH7.5， 500mMNaCl， 5％甘油， 45mM 咪唑， 1mM NaF， 0.1μg/mL OAA， 5mM BME， 1× 完全蛋白酶抑制剂混合物 - 不含 EDTA 进行第二次冲洗。 将蛋白质用 20mMTris-Cl， pH7.5， 0.5M NaCl， 5％甘油， 250mM 咪唑， 1mM NaF， 0.1μg/mLOAA， 5mM BME， 1× 完全蛋白酶 抑制剂混合物 - 不含 EDTA 进行洗脱。将有关流分通过 SDS-PAGE 进行分析， 从而将其合并。 通过在 Superdex20026/60 柱 ( 用 20mM Tris-Cl， pH7.5， 0.5M NaCl， 5％甘油， 1mM NaF， 5mM DTT， 1× 完全蛋白酶抑制剂混合物 - 不含 EDTA 进行平衡 ) 上进行凝胶过滤而将蛋白质进 一步纯化。将有关流分通过 SDS-PAGE 进行分析， 从而将其合并。将等体积的透析缓冲液 (20mM Tris-Cl， pH7.5， 500mM NaCl， 50％甘油， 5mM NaF， 5mM DTT) 加入到合并物中， 然后通 过透析缓冲液进行透析， 其间更换两次 ( 一次更换过夜 )。将蛋白质于 -20℃贮存。
     PI3Kδ 的纯化
     以三个色谱步骤纯化了 PI3Kδ ： 在 Ni 琼脂糖树脂 ( 通用电气公司医疗保健部 ) 上 进行固定化金属亲和层析， 采用 Superdex 20026/60 柱 ( 通用电气公司医疗保健部 ) 进行 凝胶过滤， 最后在 Q-HP 柱 ( 通用电气公司医疗保健部 ) 上进行离子交换步骤。将所有缓冲 液冷却至 4℃， 在冰上冷却进行裂解。于室温进行柱分级分离。
     通常， 将来自 10L Tn5 细胞培养物的冷冻细胞重新混悬在 “裂解缓冲液” (20mM Tris-Cl， pH7.5， 500mM NaCl， 5 ％ 甘 油， 5mM 咪 唑， 1mM NaF， 0.1μg/mL 冈 田 酸 (OAA)， 5mM BME， 1× 完全蛋白酶抑制剂混合物 - 不含 EDTA(20 片 /1L 缓冲液， 罗氏应用科学公司 )，benzonase(25U/mL 裂 解 缓 冲 液， EMD 生 物 科 学 公 司 )( 片 状 物 与 裂 解 缓 冲 液 的 比 例 为 1 ∶ 10v/v)) 中， 通过使用紧密契合的研棒冲击 20 次进行机械裂解。于 45,000g 将裂解物 离心 30 分钟， 将上清液装到预平衡的 IMAC 柱上 (5mL 树脂 /100mL 裂解物 )。将柱用 3-5 个 柱体积的裂解缓冲液冲洗， 然后用 3-5 个柱体积的 20mMTris-Cl， pH7.5， 500mM NaCl， 5％甘 油， 40mM 咪唑， 1mM NaF， 0.1ug/mLOAA， 5mM BME， 1× 完全蛋白酶抑制剂混合物 - 不含 EDTA 进行第二次冲洗。将蛋白质用 20mM Tris-Cl， pH7.5， 500mM NaCl， 5％甘油， 250mM 咪唑， 1mM NaF， 0.1μg/mL OAA， 5mM BME， 1× 完全蛋白酶抑制剂混合物 - 不含 EDTA 进行洗脱。将有 关流分通过 SDS-PAGE 进行分析， 从而将其合并。通过在 Superdex 200( 用 20mM Tris-Cl， pH7.5， 500mM NaCl， 5％甘油， 1mM NaF， 0.1ug/mL OAA， 5mM DTT， 1× 完全蛋白酶抑制剂混 合物 - 不含 EDTA 进行平衡 ) 上进行凝胶过滤而将蛋白质进一步纯化。将有关流分通过 SDS-PAGE 进行分析， 从而将其合并。将这些流分用 “缓冲液 A” (20mM Tris-Cl， pH8.2， 5％ 甘油， 1mM NaF， 0.1μg/mL OAA， 5mM DTT) 稀释 ( 合并物体积与缓冲液的比例为 1 ∶ 10v/ v)， 装到制备的 Q-HP 柱上。样品装载完成后， 我们用 3-5 个柱体积的缓冲液 A 和 5％ “缓冲 液 B” (20mMTris-Cl， pH8.2， 1M NaCl， 5％甘油， 1mM NaF， 0.1ug/mL OAA， 5mM DTT) 进行了冲 洗。我们使用缓冲液 B 的 5％ -30％梯度洗脱了蛋白质。通常， 以～ 200mM NaCl 洗脱出蛋 白质。将有关流分通过 SDS-PAGE 进行分析， 从而将其合并。将等体积的透析缓冲液 (20mM Tris-Cl， pH7.5， 500mM NaCl， 50％甘油， 1mM NaF， 0.1μg/mL OAA， 5mM DTT) 加入到合并物 中， 然后通过透析缓冲液进行透析， 其间更换两次 ( 一次更换过夜 )。将蛋白质于 -20℃贮 存。
     使用上述试验得到以下结果。
     本发明化合物， 特别是本发明优选的化合物对 PI3Kα 相对于 β 和 / 或 δ 和 / 或 γ 亚型 ( 例如在生化实验中检测的亚型 ) 而言显示出增强的选择性。 如细胞实验中所检测 的， 这些化合物还优选地对 PI3Kα 相对于 β 和 / 或 δ 和 / 或 γ 亚型而言显示出选择性。
     实施例 B ： 体外代谢清除率检测 缩写
     最终的检品和蛋白浓度以及孵育时间如下所示 ( 表 1)。 选择低检品浓度以符合下 述假设 ： 在低于 ( 或约等于 )Km 的浓度下评价反应动力学。
     已知 DMSO 对 CYP 活性有抑制作用。因此， 在孵育介质中的 DMSO 浓度被限制为 0.01％ (v/v)， 以使其对代谢过程的干扰最小化。
     表 1 在代谢清除孵育液中的最终的反应组分和浓度
     用来重建 UGT( 尿苷 5’ 二磷酸葡糖醛酸基转移酶 ) 活性所需的最佳成分。
     通常的试验在 96 孔板上在 37℃振荡孵育下进行。体外代谢清除速率根据在 4 个 时间点 ( 例如 0、 5、 15 和 30 分钟 ) 在含有辅因子 (NADPH 和 / 或 UDPGA) 的反应中收集的数 据获得。还进行了 30 分钟的阴性对照孵育 ( 不含辅因子 ) 来评价与 CYP 不相关的稳定性 问题 ( 例如化学不稳定性、 不依赖 CYP 的代谢 )。
     一般而言， 在 10mM DMSO 中的检品被 0.6％ ACN(v/v) 的 DiH2O 溶液 1 ∶ 1000 倍稀 释到 10μM。在即将开始试验之前， 将 1.25mg/mL 的微粒体蛋白悬浮在 50mM KPi 中。为了 评价 UGT- 介导的代谢， 悬浮液可以首先在冰上用阿拉霉素 (25μg/mg 微粒体蛋白 ) 孵育 5
     105a102149711 A CN 102149713说明书97/100 页分钟来进行预处理。将检品 (35μL) 加入 140μL 的微粒体混悬液中得到 175μL 酶 - 底物 混合物。该酶 - 底物混合物在 37℃预孵育 15 分钟。通过将 25μL 酶 - 底物混合物与等体 积的含有 4mM MgCl2 的 50mM KPi 合并来进行 30 分钟的阴性对照孵育。在 37℃孵育 30 分 钟后， 向混合物加入 50μL 含有 MS 内标 (2μM 阿普洛尔 ) 的 ACN 来猝灭。T ＝ 0 分钟的时 间点通过将 25μL 酶 - 底物混合物直接与 50μL 含有 MS 内标 (2μM 阿普洛尔 ) 的 ACN 合 并来进行。将 25μL 的辅因子加入 (2mM NADPH， 在 50mM KPi 中， 添加 4mM MgCl2 ； 任选含有 2mM UDPGA 用于 CYP+UGT 测定 )， 以刺激完全猝灭的反应混合物。
     对其余时间点的全部反应， 通过将 125μL 辅因子溶液 (2mM NADPH， 在 50mM KPi 中， 添加 4mM MgCl2) 加入到剩余 125μL 酶 - 底物混合物中。对于 UGT 代谢， 辅因子溶液 中包含 2mM UDPGA。在特定的反应时间点 ( 例如 5、 15、 30 分钟 ) 上， 取出反应的等份试样 (50μL)， 并加入含有质谱内标 (2μM 阿普洛尔 ) 的乙腈 (50μL) 来终止反应。所有样品都 在～ 3400xg、 在 4℃下离心 10 分钟， 上清液用 LC-MS/MS 分析， 对剩余的检品进行定量。剩 余的 TA 相对于 0 分钟的百分比被用来估计体外消除速率常数 (kmic)， 该常数可用于计算体 外代谢清除率。
     在高效液相色谱 - 串联质谱 (LC/MS) 系统上进行样品分析， 该系统包括 Waters Quattro Premiere 质谱仪、 ESI 离子源、 CTC-HTS Pal 自动进样器和安捷伦 LC 泵。样品在 Atlantic C18 柱 (2.1x30mm， 3.5 微米 ) 上分离， 使用表 2 中所概述的快速流动相。 流动相 A 由含有 10mM 甲酸铵的纯水组成。 流动相 B 由含有 0.01％甲酸的乙腈组成。 流速为 1mL/min。 进样体积为 10μL。 最初 30 秒的洗脱液被弃去， 用于样品净化。 化合物使用软件 MassLynx/ QuanLynx 检测， 其收集所有与供试化合物分子量相关的碎片的强度数据。在收集原始数据 后， 如果需要， 该软件可将最多 3 个质量碎片的曲线合并。通常， 对最大强度的碎片峰进行 积分。
     表 2HPLC 的流动相梯度
     每个微粒体消除速率 kmic 是基于单峰形式测试的 4- 个点的消除曲线。反应板的 LC-MS/MS 原始数据以对于检品和内标的积分的分析物峰面积形式返回。 这些数值可以转换 为分析物 ： 内标的峰面积之比， 以使数据的比较达到标准化。
     将反应时间点 ( 例如 0、 5、 20 或 30 分钟 ) 相对于剩余检品相对 0 分钟的百分比 ( 基于相对的峰面积之比 ) 的自然对数作图。清除曲线的斜率 kmic 用来计算体外半衰期 t1/2， 如方程 (1) 所示。为了集中于线性的反应动力学， 如果可能的话， 一般将代表剩余检 品＜ 10％的数据点排除在清除曲线的斜率限定之外。 该反应的 t1/2 是核心的试验数值， 用 于计算 CLint( 方程 2)
     方程 (1) ： t1/2 ＝ 0.693/-kmic 方程 (2) ： Clint ＝ 0.693/-kmic·V/M 使用上述方法获得以下结果 ：实施例 C ： 在荧光素酶发光试验中测定的 PI3Kα 突变体 E545K 和 H1047R 的抑制
     发光值是早已确立的用来测定 ATP 浓度的读数， 因此可以用来在不考虑其底物的 情况下追踪多种激酶的活性。KinaseGlo 发光激酶检测试剂盒 (Promega， Madison/WI， USA) 是在激酶反应后通过对溶液中剩余的 ATP 定量来测定激酶活性的均一的 HTS 方法。
     磷酸肌醇 3- 激酶在室温下在 50-μi 含有 1μM ATP、 5mM MgCl2、 50mM NaCl、 5μg/ ml 大豆磷脂酰肌醇 (Avanti Polar lipids， 目录号 840044C)、 0.015％八葡糖苷 (Sigma， 目 录号 O9882)、 0.01％ CHAPS、 1mM DTT、 2.5％ DMSO 和 10mM Tris-HCl pH 7.5 的介质中孵育。 激酶反应通过加入 ATP( 酶与抑制剂预孵育 15 分钟 ) 启动， 1 小时后用 50μl Kinase (Promega， 目录号 V6714) 终止， 用 Victor II 读数器 (0.1 秒积分 ) 测定发光度。使用逻辑 方程通过非线性回归来拟合曲线 (X 的模式 205， IDBusiness Solutions， Guildford， 英国 )。
     发光试验的测定原理 (KinaseGlo) ：
     使用上述试验系统和使用来自下表显示的构建体的 PI3K 蛋白， 评价了对野生型 和突变型 PI3Kα 的抑制活性。
     结果显示在下表中。 野生型和突变型 PI3Kα 的抑制 ：BV1147 ： 将在许多癌症中发现的激活突变 E545K 使用 QuickChangeXL 诱变试剂 盒 (Stratagene) 通过定点诱变引入 ORF318。使用生产商推荐的方法和突变引物 ： gwG152 -p15(5’ -CTCTCTGAAATCACTAAGCAGGAGAAAGATTTT-3’ )(SEQ ID NO ： 21)， 和 gwG152-p16(5’ AAAATCTTTCT-CCTGCTTAGTGATTTCAGAGAG-3’ )(SEQ ID NO ： 22)， 产生 ORF544。该克隆经测 序验证后， 用于 Gateway LR 反应 (Invitrogen)， 以便将插入片段转移到 Gateway 接头的 pBlueBac4.5(Invitrogen) 载体中， 用于生成杆状病毒表达载体 LR561。
     激酶结构域
     BV 1147 的蛋白序列 ：
     1 MREYDRLYEE YTRTSQEIQM KRTAIEAFNE TIKIFEEQCQ TQERYSKEYI EKFKREGNEK
     61 EIQRIMHNYD KLKSRISEII DSRRRLEEDL KKQAAEYREI DKRMNSIKPG GISGGGGGIM
     121 VLVECLLPNG MIVTLECLRE ATLITIKHEL FKEARKYPLH QLLQDESSYI FVSVTQEAER
     181 EEFFDETRRL CDLRLFQPFL KVIEPVGNRE EKILNREIGF AIGMPVCEFD MVKDPEVQDF
     241 RRNILNVCKE AVDLRDLNSP HSRAMYVYPP NVESSPELPK HIYNKLDKGQ IIVVIWVIVS
     301 PNNDKQKYTL KINHDCVPEQ VIAEAIRKKT RSMLLSSEQL KLCVLEYQGK YILKVCGCDE
     361 YFLEKYPLSQ YKYIRSCIML GRMPNLMLMA KESLYSQLPM DCFTMPSYSR RISTATPYMN
     421 GETSTKSLWV INSALRIKIL CATYVNVNIR DIDKIYVRTG IYHGGEPLCD NVNTQRVPCS
     481 NPRWNEWLNY DIYIPDLPRA ARLCLSICSV KGRKGAKEEH CPLAWGNINL FDYTDTLVSG
     541 KMALNLWPVP HGLEDLLNPI GVTGSNPNKE TPCLELEFDW FSSVVKFPDM SVIEEHANWS
     601 VSREAGFSYS HAGLSNRLAR DNELRENDKE QLKAISTRDP LSEITKQEKD FLWSHRHYCV
     661 TIPEILPKLL LSVKWNSRDE VAQMYCLVKD WPPIKPEQAM ELLDCNYPDP MVRGFAVRCL
     721 EKYLTDDKLS QYLIQLVQVL KYEQYLDNLL VRFLLKKALT NQRIGHFFFW HLKSEMHNKT
     781 VSQRFGLLLE SYCRACGMYL KHLNRQVEAM EKLINLTDIL KQEKKDETQK VQMKFLVEQM
     841 RRPDFMDALQ GFLSPLNPAH QLGNLRLEEC RIMSSAKRPL WLNWENPDIM SELLFQNNEI
     901 IFKNGDDLRQ DMLTLQIIRI MEMIWQNQGL DLRMLPYGCL SIGDCVGLIE VVRNSHTIMQ
     961 IQCKGGLKGA LQFNSHTLHQ WLKDKNKGEI YDAAIDLFTR SCAGYCVATF ILGIGDRHNS
     1021 NIMVKDDGQL FHIDFGHFLD HKKKKFGYKR ERVPFVLTQD FLIVISKGAQ ECTKTREFER
     1081 FQEMCYKAYL AIRQHANLFI NLFSMMLGSG MPELQSFDDI AYIRKTLALD KTEQEALEYF
     1141 MKQMNDAHHG GWTTKMDWIF HTIKQHALNE LGGAHHHHHH (SEQ ID NO ： 23).
     BV1097 ： 将许多癌症中发现的激活突变 H1047R 用 QuickChange XL 诱变试剂盒 (Stratagene) 通过定点诱变引入 ORF318。使用生产商推荐方法和突变引物 ： gwG152-p0 7(5’ -CAAATGAATGATGCACGTCATGGTGGCTGGACA-3’ )(SEQ ID NO ： 24)， 和 gwG152-p11(5’ -TG TCCAGCCA-CCATGACGTGCATCATTCATTTG-3’ )(SE Q ID NO ： 25)， 产生 ORF396。该克隆经测 序验证后， 用于 Gateway LR 反应 (Invitrogen)， 以便将插入片段转移到 Gateway 接头的 pBlueBac4.5(Invitrogen) 载体中， 用于生成杆状病毒表达载体 LR480。
     激酶结构域
     BV 1097 的蛋白序列 ：
     1 MREYDRLYEE YTRTSQEIQM KRTAIEAFNE TIKIFEEQCQ TQERYSKEYI EKFKREGNEK
     61 EIQRIMHNYD KLKSRISEII DSRRRLEEDL KKQAAEYREI DKRMNSIKPG GISGGGGGIM
     121 VLVECLLPNG MIVTLECLRE ATLITIKHEL FKEARKYPLH QLLQDESSYI FVSVTQEAER
     181 EEFFDETRRL CDLRLFQPFL KVIEPVGNRE EKILNREIGF AIGMPVCEFD MVKDPEVQDF
     241 RRNILNVCKE AVDLRDLNSP HSRAMYVYPP NVESSPELPK HIYNKLDKGQ IIVVIWVIVS
     301 PNNDKQKYTL KINHDCVPEQ VIAEAIRKKT RSMLLSSEQL KLCVLEYQGK YILKVCGCDE
     361 YFLEKYPLSQ YKYIRSCIML GRMPNLMLMA KESLYSQLPM DCFTMPSYSR RISTATPYMN
     421 GETSTKSLWV INSALRIKIL CATYVNVNIR DIDKIYVRTG IYHGGEPLCD NVNTQRVPCS
     481 NPRWNEWLNY DIYIPDLPRA ARLCLSICSV KGRKGAKEEH CPLAWGNINL FDYTDTLVSG
     541 KMALNLWPVP HGLEDLLNPI GVTGSNPNKE TPCLELEFDW FSSVVKFPDM SVIEEHANWS

    [1000] 601 VSREAGFSYS HAGLSNRLAR DNELRENDKE QLKAISTRDP LSEITEQEKD FLWSHRHYCV

    [1001] 661 TIPEILPKLL LSVKWNSRDE VAQMYCLVKD WPPIKPEQAM ELLDCNYPDP MVRGFAVRCL

    [1002] 721 EKYLTDDKLS QYLIQLVQVL KYEQYLDNLL VRFLLKKALT NQRIGHFFFW HLKSEMHNKT

    [1003] 781 VSQRFGLLLE SYCRACGMYL KHLNRQVEAM EKLINLTDIL KQEKKDETQK VQMKFIVEQM

    [1004] 841 RRPDFMDALQ GFLSPLNPAH QLGNLRLEEC RIMSSAKRPL WLNWENPDIM SELLFQNNEI

    [1005] 901 IFKNGDDLRQ DMLTLQIIRI MENIWQNQGL DLRMLPYGCL SIGDCVGLIE VVRNSHTIMQ

    [1006] 961 IQCKGGLKGA LQFNSHTLHQ WLKDKNKGEI YDAAIDLFTR SCAGYCVATF ILGIGDRHNS

    [1007] 1021 NIMVKDDGQL FHIDFGHFLD HKKKKFGYKR ERVPFVLTQD FLIVISKGAQ ECTKTREFER

    [1008] 1081 FQEMCYKAYL AIRQHANLFI NLFSMMLGSG MPELQSFDDI AYIRKTLALD KTEQEALEYF

    [1009] 磷脂酰肌醇 3- 激酶 (PI3K) 包括脂激酶 (lipid kinases) 家族， 这些脂激酶可催 化磷酸基团转移到肌醇脂类的 D-3′位置上， 产生磷酸肌醇 -3- 磷酸 (PIP)、 磷酸肌醇 -3， 4- 二磷酸 (PIP2) 和磷酸肌醇 -3， 4， 5- 三磷酸 (PIP3)， 它们接着作为第二信使在信号级联 放大中通过使含有普列克底物蛋白 - 同源区、 FYVE、 Phox 和其它磷脂结合结构域的蛋白质 停靠在通常位于质膜的多种信号传导复合物中而发挥作用 ((Vanhaesebroeck 等人， Annu. Rev.Biochem70 ： 535(2001) ； Katso 等 人， Annu.Rev.Cell Dev.Biol.17 ： 615(2001))。 在 两种 1 类 PI3K 中， 1A 类 PI3K 是由与调节亚基 ( 它可以是 p85α、 p55α、 p50α、 p85β 或 p55γ 组成性结合的催化 p110 亚基 (α、 β、 δ 同工型 ) 所组成的异二聚体。1B 类亚类具 有一个家族成员 ： 由与两个调节亚基 p101 或 p84 其中之一结合的催化 p110γ 亚基所组成 的异二聚体 (Fruman 等人， Annu Rev.Biochem.67 ： 481(1998) ； Suire 等人， Curr.Biol.15 ： 566(2005))。 p85/55/50 亚基的模块结构域包括 Src 同源性 (SH2) 结构域， 它们可使特定的
    序列背景的磷酸酪氨酸残基结合在激活的受体和胞质酪氨酸激酶上， 引起 1A 类 PI3K 的激 活和定位。 1B 类 PI3K 直接被结合各种肽和非肽类配体的 G 蛋白偶联受体所激活 (Stephens 等人， Cell 89 ： 105(1997)) ； Katso 等人， Annu.Rev.Cell Dev.Biol.17 ： 615-675(2001))。 因此， I 类 PI3K 产生的磷脂产物使上游受体与下游的细胞活动联系起来， 所述的细胞活动 包括增殖、 存活、 趋化性、 细胞运输、 运动性、 代谢、 炎症和过敏反应、 转录和翻译 (Cantley 等 人， Cell 64 ： 281(1991) ； Escobedo 和 Williams， Nature 335 ： 85(1988) ； Fantl 等 人， Cell 69 ： 413(1992))。
     在许多情况中， PIP2 和 PIP3 将 Akt( 病毒癌基因 v-Akt 的人类同源物的产物 ) 募 集到质膜， 在那里它充当许多对生长和存活很重要的细胞内信号传导途径的节点 (Fantl 等人， Cell 69 ： 413-423(1992) ； Bader 等人， Nature Rev.Cancer 5 ： 921(2005) ； Vivanco 和 Sawyer， Nature Rev.Cancer 2 ： 489(2002))。PI3K 的异常调节通常通过 Akt 的激活来 增加存活， 这是人类癌症中最普遍的事件之一， 并且已经显示出可在多种水平上发生。肿 瘤抑制基因 PTEN 使磷酸肌醇在肌醇环的 3′位上脱磷酸， 从而拮抗 PI3K 活性， 而在多种肿 瘤中该基因 PTEN 在功能上缺失。在其它肿瘤中， p110α 同工型 PIK3CA 和 Akt 的基因被 扩增， 并且其基因产物的蛋白表达增加， 这已经在一些人类癌症中得到证实。而且， 用于向 上调节 p85-p110 复合物的 p85α 的突变和易位也已经在人类癌症中有描述。最后， 激活 下游信号传导途径的 PIK3CA 中的体细胞错义突变已经在各种人类癌症中非常频繁地被描 述过 (Kang 等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102 ： 802(2005) ； Samuels 等人， Science 304 ： 554(2004) ； Samuels 等人， Cancer Cell 7 ： 561-573(2005))。 这些观察表明， 磷酸肌醇 -3 激酶以及该信号传导途径的上游和下游组分的失控是与人类癌症和增殖性疾病有关的最常 见的失控之一 (Parsons 等人， Nature 436 ： 792(2005) ； Hennessey 等人， Nature Rev.Drug Disc.4 ： 988-1004(2005))。
     根据上文， PI3Kα 抑制剂将在治疗增殖性疾病和其它病症中具有特殊价值。
     WO2004/096797 公开了作为 PI3Kγ 抑制剂的某些噻唑类衍生物及其药物用途， 特 别是用于治疗炎症和过敏病症。
     WO 2005/021519 也公开了作为 PI3Kγ 抑制剂的某些噻唑类衍生物及其药物用 途， 特别是用于治疗炎症和过敏病症。
     WO 2006/051270 也公开了作为 PI3Kα 抑制剂的某些噻唑类衍生物及其药物用 途， 特别是由于其抗肿瘤活性。
     WO 2007/129044 也公开了作为 PI3Kα 抑制剂的某些噻唑类衍生物及其药物用 途， 特别是由于其抗肿瘤活性。
     根据现有技术， 需要提供更多适合于治疗增殖性疾病的化合物， 特别是提供具有 增强的选择性和 / 或较高的 / 增强的活性的化合物。
     目前已经发现， 下文给出的式 (I) 的 2- 氨甲酰环氨基脲衍生物具有有利的药理性 质且抑制例如 PI3K( 磷脂酰肌醇 3- 激酶 )。具体而言， 这些化合物优选地相对于 β 和 / 或 δ 和 / 或 γ 亚型而言对于 PI3Kα 显示出增强的选择性。因此， 式 I 化合物适合例如用于 治疗依赖 PI3 激酶 ( 尤其是 PI3Kα， 例如那些显示 PI3Kα 的过表达或扩增、 PIK3CA 的体细 胞突变或 PTEN 的种系突变或体细胞突变或导致上调 p85-p110 复合物的 p85α 的突变和易 位的激酶 ) 的疾病， 特别是增殖性疾病， 例如肿瘤疾病和白血病。 此外， 这些化合物优选地显示增强的代谢稳定性， 并因此降低了清除率， 得到改善 的药代动力学特性。
     在第一方面， 本发明提供了式 (I) 化合物
     在第一方面， 本发明提供了式 (I) 化合物
    
     或其盐， 其中
     A 代表杂芳基 ；
     R1 代表 (1) 任选被取代的烷基 ； (2) 任选被取代的环烷基 ； (3) 任选被取代的芳基 ； (4) 任选被取代的胺 ； (5) 任选被取代的磺酰基 ； (6) 卤素 ； 2 1
     R 代表氢、 氘或如 R 所定义的取代基 ； 3
     R 代表氢、 卤素、 任选被取代的烷基 ；
     (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-( 叔丁基 )- 嘧啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻 唑 -2- 基 }- 酰胺 ) 除外。
     A 代表杂芳基 ；
     R1 代表 (1) 任选被取代的烷基 ； (2) 任选被取代的环烷基 ； (3) 任选被取代的芳基 ； (4) 任选被取代的胺 ； (5) 任选被取代的磺酰基 ； (6) 卤素 ； 2 1
     R 代表氢、 氘或如 R 所定义的取代基 ； 3
     R 代表氢、 卤素、 任选被取代的烷基 ；
     (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-( 叔丁基 )- 嘧啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻 唑 -2- 基 }- 酰胺 ) 除外。
     本发明可以通过参考以下描述、 包括以下术语汇编和总结性实例而被更完全地理 解。为了简短， 本说明书中引用的出版物的公开内容引入本文作为参考。如本文所用的术 语 “包括” 、 “含有” 和 “包含” 以其开放的非限制性的意义而在本文中使用。
     本文所给的任意式意欲代表具有结构式所描述的结构的化合物以及某些变体或 形式。 特别是本文所给的任意式的化合物可以具有不对称中心并因此以不同的对映异构形 式存在。如果式 (I) 化合物中存在至少一个不对称碳原子， 则这类化合物可以以旋光活性 形式或以旋光异构体混合物的形式、 例如以外消旋混合物的形式存在。所有旋光异构体及 其混合物、 包括外消旋混合物是本发明的一部分。 因此， 本文所给的任意所给式意欲代表外 消旋物、 一种或多种对映异构形式、 一种或多种非对映异构形式、 一种或多种阻转异构体形 式及其混合物。而且， 某些结构还可以作为几何异构体 ( 即顺式和反式异构体 )、 互变异构 体或阻转异构体而存在。
     本文所给的任意式意欲代表这类化合物的水合物、 溶剂合物和多晶型物及其混合 物。
     本文所给的任意式还意欲代表化合物的未标记的形式以及同位素标记的形式。 除 了一个或多个原子被具有所选原子质量或质量数的原子所代替外， 同位素标记的化合物具 有本文所给的式所描述的结构。可以掺入本发明的化合物中的同位素的实例包括氢、 碳、 2 3 11 13 14 15 18 31 32 35 36 125 氮、 氧、 磷、 氟和氯的同位素， 例如分别有 H、 H、 C、 C、 C、 N、 F、 P、 P、 S、 Cl、 I。本发13 明包含多种如本文所定义的同位素标记的化合物， 例如有放射性同位素如 3H、 C 和 14C 存在 的那些。这类同位素标记的化合物可用于代谢研究 ( 优选用 14C)、 反应动力学研究 ( 例如 2 3 用 H 或 H)、 检测或显像技术、 例如正电子发射断层摄影术 (PET) 或单光子发射计算体层摄 影术 (SPECT)、 包括药物或底物组织分布测定， 或者可用于放射治疗患者。特别是 18F 或标 记的化合物可以特别优选用于 PET 或 SPECT 研究。通常可以通过进行在下文描述的流程图 或者实施例和制备中所公开的方法， 通过用容易得到的同位素标记的试剂取代非同位素标 记的试剂来制备同位素标记的本发明的化合物及其前药。
     此外， 被更重的同位素、 特别是氘 ( 即 2H 或 D) 所取代还可以获得由更高的代谢稳 定性引起的某些治疗益处， 例如延长体内半衰期或降低剂量要求或改善治疗指数。可以理 解， 上下文中的氘可被看作式 (I) 化合物的取代基。这类更重同位素、 特别是氘的浓度可以 由同位素富集因子来定义。如本文所用的术语 “同位素富集因子” 表示特定同位素的同位 素丰度和天然丰度之间的比值。如果本发明的化合物中的取代基标有氘， 则这类化合物具 有的对每个指定氘原子的同位素富集因子为至少 3500( 在每个指定氘原子处具有 52.5％ 氘掺入率 )、 至少 4000(60％氘掺入率 )、 至少 4500(67.5％氘掺入率 )、 至少 5000(75％氘掺 入率 )、 至少 5500(82.5％氘掺入率 )、 至少 6000(90％氘掺入率 )、 至少 6333.3(95％氘掺入 率 )、 至少 6466.7(97％氘掺入率 )、 至少 6600(99％氘掺入率 ) 或至少 6633.3(99.5％氘掺 入率 )。 在本发明的化合物中， 没有具体指定为特定同位素的任意原子意欲代表该原子的任 意稳定同位素。除非另有说明， 当位置被具体指定为 “H” 或 “氢” 时， 该位置可以理解为在 其天然丰度同位素组成上具有氢。因此， 在本发明的化合物中， 被具体指定为氘 (D) 的任意 原子意欲代表例如在以上所给范围内的氘。
     当参考本文所给的任意式时， 从可能种类的名单中为规定变量选择特定部分并不 表示用来定义在别处出现的变量的部分。 换言之， 当变量出现一次以上时， 从规定名单中选择种类不依赖于为该式中别处的相同变量选择的种类 ( 当实施方案中一个或多个直至所 有更一般的表述 ( 其特征为上文或下文所优选的 ) 可以被更具体的定义代替时， 由此分别 产生本发明的更优选的实施方案 )。
     当使用复数形式 ( 例如多种化合物、 盐 ) 时， 其包括单数 ( 例如一种化合物、 一种 盐 )。 “化合物” 不排除 ( 例如在药物制剂中 ) 存在一种以上的式 (I) 化合物 ( 或其盐 )。
     以下一般定义将适用于本说明书， 除非另有说明 ：
     卤素表示氟、 溴、 氯或碘， 特别是氟、 氯。卤素取代的基团和部分， 例如被卤素取代 的烷基 ( 卤代烷基 ) 可以被单、 多或全卤代。
     杂原子是除碳和氢外的原子， 优选氮 (N)、 氧 (O) 或硫 (S)， 特别是氮。
     含碳的基团、 部分或分子含有 1 至 7 个、 优选 1 至 6 个、 更优选 1 至 4 个、 最优选 1 或 2 个碳原子。具有 1 个以上碳原子的任意非环状含碳的基团或部分是直链或支链的。
     前缀 “低级” 或 “C1-C7” 表示具有最多且包括 7 个、 尤其是最多且包括 4 个碳原子 的基团， 所述基团是直链或者具有一个或多个分支的支链。
     “烷基” 指直链或支链烷基， 优选代表直链或支链 C1-12 烷基， 特别优选代表直链或 支链 C1-7 烷基 ； 例如甲基、 乙基、 正或异丙基、 正、 异、 仲或叔丁基、 正戊基、 正己基、 正庚基、 正辛基、 正壬基、 正癸基、 正十一烷基、 正十二烷基， 特别优选甲基、 乙基、 正丙基、 异丙基以 及正丁基和异丁基。烷基可以是未取代的或取代的。示例性取代基包括但不限于氘、 羟基、 烷氧基、 卤素和氨基。取代的烷基的实例有三氟甲基。环烷基也可以是烷基的取代基。这 类情况的实例有部分 ( 烷基 )- 环丙基或亚烷基 - 环丙基， 如 -CH2- 环丙基。C1-C7- 烷基优 选是具有从 1 且包括 1 至 7 且包括 7、 优选从 1 且包括 1 至 4 且包括 4 的烷基， 并且是直链 或支链 ； 优选低级烷基是丁基如正丁基、 仲丁基、 异丁基、 叔丁基、 丙基如正丙基或异丙基、 乙基或者优选甲基。
     其它基团如 “烷氧基” 、 “烷氧基烷基” 、 “烷氧基羰基” 、 “烷氧基 - 羰基烷基” 、 “烷基 磺酰基” 、 “烷基磺酰基 (alkylsulfoxyl)” 、 “烷基氨基” 、 “卤代烷基” 中的每个烷基部分将具 有以上提到的 “烷基” 定义中描述的相同含义。
     “亚烷基” 指通过两个不同碳原子与部分结合的直链或支链亚烷基， 它优选代表直 链或支链 C1-12 亚烷基， 特别优选代表直链或支链 C1-6 亚烷基 ； 例如亚甲基 (-CH2-)、 1， 2- 亚 乙基 (-CH2-CH2-)、 1， 1- 亚乙基 ((-CH(CH3)-)、 1， 1-， 1， 2-， 1， 3- 亚丙基和 1， 1-， 1， 2-， 1， 3-， 1， 4- 亚丁基， 特别优选亚甲基、 1， 1- 亚乙基、 1， 2- 亚乙基、 1， 3- 亚丙基、 1， 4- 亚丁基。
     “亚链烯基” 指通过两个不同碳原子与分子结合的直链或支链亚链烯基， 它优选 代表直链或支链 C2-6 亚烷基 ； 例如 -CH ＝ CH-、 -CH ＝ C(CH3)-、 -CH ＝ CH-CH2-、 -C(CH3) ＝ CH-CH2-、 -CH ＝ C(CH3)-CH2-、 -CH ＝ CH-C(CH3)H-、 -CH ＝ CH-CH ＝ CH-、 -C(CH3) ＝ CH-CH ＝ CH-、 -CH ＝ C(CH3)-CH ＝ CH-， 特别优选 -CH ＝ CH-CH2-、 -CH ＝ CH-CH ＝ CH-。亚链烯基可 以是取代的或未取代的。
     “环烷基” 指饱和或部分饱和的单环、 稠合多环或螺多环碳环， 每个碳环具有 3 至 12 个环原子。环烷基的说明性实例包括以下部分 ： 环丙基、 环丁基、 环戊基和环己基。环 烷基可以是未取代的或取代的 ； 示例性取代基在对烷基的定义中提供， 且还包括烷基自身 ( 如甲基 )。例如 -(CH3) 环丙基的基团被认为是被取代的环烷基。
     “芳基” 指具有 6 个或更多个碳原子的芳香族同素环系统 ( 即仅有碳作为成环原子 )， 芳基优选是具有 6 至 14 个环碳原子、 更优选具有 6 至 10 个环碳原子的芳香族部分， 例如苯基或萘基， 优选苯基。芳基可以是未取代的或者被一个或多个、 优选最多三个、 更 优选最多两个取代基所取代， 所述的取代基独立地选自 ： 如下描述的未取代的或取代的杂 环基， 尤其是吡咯烷基如吡咯烷子基、 氧代吡咯烷基如氧代 - 吡咯烷子基、 C 1-C7- 烷基 - 吡 咯烷基、 2， 5- 二 -(C1-C7 烷基 ) 吡咯烷基如 2， 5- 二 -(C1-C7 烷基 )- 吡咯烷子基、 四氢呋 喃基、 噻吩基、 C1-C7- 烷基吡唑烷基、 吡啶基、 C1-C7- 烷基哌啶基、 哌啶子基、 被氨基或者 N- 单 - 或 N， N- 二 -[ 低级烷基、 苯基、 C1-C7- 烷酰基和 / 或苯基 - 低级烷基 )- 氨基所取代 的哌啶子基、 未取代的或 N- 低级烷基取代的通过环碳原子结合的哌啶基、 哌嗪子基、 低级 烷基哌嗪子基、 吗啉代基、 硫代吗啉代基、 S- 氧代 - 硫代吗啉代基或 S， S- 二氧代硫代吗啉 代基 ； C1-C7- 烷基、 氨基 -C1-C7- 烷基、 N-C1-C7- 烷酰基氨基 -C1-C7- 烷基、 N-C1-C7- 烷基磺 酰基 - 氨基 -C1-C7- 烷基、 氨甲酰基 -C1-C7- 烷基、 [N- 单 - 或 N， N- 二 -(C1-C7- 烷基 )- 氨 甲酰基 ]-C1-C7- 烷基、 C1-C7- 烷基亚磺酰基 -C1-C7- 烷基、 C1-C7- 烷基磺酰基 -C1-C7- 烷基、 苯基、 萘基、 单至三 -[C1-C7- 烷基、 卤素和 / 或氰基 ]- 苯基或单至三 -[C1-C7- 烷基、 卤素 和 / 或氰基 ]- 萘基 ； C3-C8- 环烷基、 单至三 -[C1-C7- 烷基和 / 或羟基 ]-C3-C8- 环烷基 ； 卤 素、 羟基、 低级烷氧基、 低级烷氧基 - 低级烷氧基、 ( 低级 - 烷氧基 )- 低级烷氧基 - 低级烷 氧基、 卤代 -C1-C7- 烷氧基、 苯氧基、 萘氧基、 苯基 - 或萘基 - 低级烷氧基 ； 氨基 -C1-C7- 烷 氧基、 低级烷酰基氧基、 苯甲酰基氧基、 萘甲酰基氧基、 甲酰基 (CHO)、 氨基、 N- 单 - 或 N， N- 二 -(C1-C7- 烷基 )- 氨基、 C1-C7- 烷酰基氨基、 C1-C7- 烷基磺酰基氨基、 羧基、 低级烷氧基羰 基， 例如 ； 苯基 - 或萘基 - 低级烷氧基羰基， 例如苄基氧基羰基 ； C1-C7- 烷酰基如乙酰基、 苯 甲酰基、 萘甲酰基、 氨甲酰基、 N- 单 - 或 N， N- 二取代的氨甲酰基如 N- 单 - 或 N， N- 二 - 取代 的氨甲酰基， 其中取代基选自低级烷基、 ( 低级 - 烷氧基 )- 低级烷基和羟基 - 低级烷基 ； 脒 基、 胍基、 脲基、 巯基、 低级烷硫基、 苯基 - 或萘基硫基、 苯基 - 或萘基 - 低级烷硫基、 低级烷 基 - 苯硫基、 低级烷基 - 萘基硫基、 卤素 - 低级烷基巯基、 磺基 (-SO3H)、 低级烷基磺酰基、 苯 基 - 或萘基 - 磺酰基、 苯基 - 或萘基 - 低级烷基磺酰基、 烷基苯基磺酰基、 卤素 - 低级烷基磺 酰基如三氟甲磺酰基 ； 磺酰氨基 (sulfonamido)、 苯磺酰氨基、 叠氮基、 叠氮基 -C1-C7- 烷基、 尤其是叠氮基甲基、 C1-C7- 烷基磺酰基、 氨磺酰基、 N- 单 - 或 N， N- 二 -(C1-C7- 烷基 )- 氨磺 酰基、 吗啉代基磺酰基、 硫代吗啉代基磺酰基、 氰基和硝基 ； 其中作为取代基或作为取代的 烷基 ( 或者还有本文提到的取代的芳基、 杂环基等 ) 的取代基的一部分的以上提到的苯基 或萘基 ( 和在苯氧基或萘氧基中的 ) 各自本身是未取代的或者被一个或多个、 例如最多三 个、 优选 1 或 2 个取代基所取代， 所述取代基独立地选自卤素、 卤代 - 低级烷基如三氟甲基、 羟基、 低级烷氧基、 叠氮基、 氨基、 N- 单 - 或 N， N- 二 -( 低级烷基和 / 或 C1-C7- 烷酰基 )- 氨 基、 硝基、 羧基、 低级烷氧基羰基、 氨甲酰基、 氰基和 / 或氨磺酰基。
     “杂环基” 指如下定义的杂环基团 ： 其为不饱和的 ( ＝环中带有最高可能数目的共 轭双键 )、 饱和或部分饱和的并且优选是单环或者在本发明的更广泛方面是二环、 三环或螺 环； 并且具有 3 至 24 个、 更优选 4 至 16 个、 最优选 5 至 10 个且最优选 5 或 6 个环原子 ； 其中 一个或多个、 优选 1 至 4 个、 尤其是 1 或 2 个环原子是杂原子 ( 因此剩余环原子是碳 )。 键合 环 ( 即与分子连接的环 ) 优选具有 4 至 12 个、 尤其是 5 至 7 个环原子。术语杂环基还包括 杂芳基。 杂环基团 ( 杂环基 ) 可以是未取代的或者被一个或多个、 尤其是 1 至 3 个取代基所 取代， 所述的取代基独立地选自以上对取代的烷基所定义的取代基和 / 或选自一个或多个以下取代基 ： 氧代 ( ＝ O)、 硫代羰基 ( ＝ S)、 亚氨基 ( ＝ NH)、 亚氨基 - 低级烷基。 此外， 杂环 基尤其是选自如下的杂环基 ： 氧杂环丙烷基、 氮杂环丙烯基、 吖丙啶基、 1， 2- 氧杂硫杂环戊 烷基、 噻吩基、 呋喃基、 四氢呋喃基、 吡喃基、 噻喃基、 噻蒽基、 异苯并呋喃基、 苯并呋喃基、 色 烯基、 2H- 吡咯基、 吡咯基、 吡咯啉基、 吡咯烷基、 咪唑基、 咪唑烷基、 苯并咪唑基、 吡唑基、 吡 嗪基、 吡唑烷基、 噻唑基、 异噻唑基、 二噻唑基、 唑基、 异 唑基、 吡啶基、 吡嗪基、 嘧啶基、 哌啶基、 哌嗪基、 哒嗪基、 吗啉基、 硫代吗啉基、 (S- 氧代或 S， S- 二氧代 )- 硫代吗啉基、 吲嗪 基、 氮杂环庚基、 二氮杂环庚基、 尤其是 1， 4- 二氮杂环庚基、 异吲哚基、 3H- 吲哚基、 吲哚基、 苯并咪唑基、 香豆基 (cumaryl)、 吲唑基、 三唑基、 四唑基、 嘌呤基、 4H- 喹嗪基、 异喹啉基、 喹 啉基、 四氢喹啉基、 四氢异喹啉基、 十氢喹啉基、 八氢异喹啉基、 苯并呋喃基、 二苯并呋喃基、 苯并噻吩基、 二苯并噻吩基、 酞嗪基、 萘啶基、 喹喔啉基、 喹唑啉基、 喹唑啉基、 噌啉基、 蝶啶 菲咯啉基、 呋咱基、 吩嗪基、 吩噻嗪基、 吩 基、 咔唑基、 β- 咔啉基、 菲啶基、 吖啶基、 啶基、 嗪基、 色烯基、 异苯并二氢吡喃基、 苯并二氢吡喃基、 苯并 [1， 3] 二氧杂环戊烯 -5- 基和 2， 3- 二氢 - 苯并 [1， 4] 二 烯 -6- 基， 这些基团各自是未取代的或者被一个或多个、 优选 最多三个取代基所取代， 所述的取代基选自以上对取代的芳基提到的那些和 / 或选自一个 或多个以下取代基 ： 氧代 ( ＝ O)、 硫代羰基 ( ＝ S)、 亚氨基 ( ＝ NH)、 亚氨基 - 低级烷基。 “芳基烷基” 指通过烷基如甲基或乙基与分子结合的芳基， 优选苯乙基或苄基， 特 别是苄基。类似地， 环烷基烷基和杂环基烷基代表通过烷基与分子结合的环烷基或者通过 烷基与分子结合的杂环基。在每种情况中， 芳基、 杂环基、 环烷基和烷基可以如上定义的那 样被取代。
     “治疗” 包括预防性 ( 防护性 ) 和治疗性治疗以及延缓疾病或紊乱的进展。
     “PI3 激酶介导的疾病” ( 尤其是 PI3Kα 介导的疾病或者由 PI3Kα 的过表达或扩 增、 PIK3CA 的体细胞突变或 PTEN 的种系突变或体细胞突变或用于正调节 p85-p110 复合物 的 p85α 的突变和易位的激酶所介导的疾病 ) 尤其是以有益的方式 ( 例如改善一种或多种 症状、 延缓疾病发作、 直至暂时或完全治愈疾病 ) 对抑制 PI3 激酶、 尤其是抑制 PI3Kα 或其 突变形式有响应的这类病症 ( 其中在所治疗的疾病中， 增殖性疾病例如肿瘤疾病和白血病 是尤其被提到的 )。
     “盐” ( 其以 “或其盐” 表示 ) 可以单独或与游离式 (I) 化合物混合存在， 并且优选 是可药用盐。这类盐例如作为酸加成盐、 优选与有机或无机酸从含有碱性氮原子的式 (I) 化合物而形成， 尤其是可药用盐。适宜的无机酸例如有氢卤酸如盐酸、 硫酸或磷酸。适宜的 有机酸例如有羧酸或磺酸， 如富马酸或甲磺酸。 为了分离或纯化的目的， 还可能使用不可药 用的盐， 例如苦味酸盐或高氯酸盐。对于治疗用途， 仅采用可药用盐或游离化合物 ( 其中可 以以药物制剂的形式应用 )， 因此优选这些盐。 由于游离形式的新化合物以及其盐形式 ( 包 括例如在新化合物的纯化或鉴定中可以用作中间体的那些盐 ) 之间的密切关系， 因此上下 文中涉及游离化合物的地方可以适当和有利地理解为还指相应的盐。式 (I) 化合物的盐优 选是可药用的盐 ； 形成可药用盐的合适的抗衡离子是本领域已知的。
     “组合” 是指一种剂量单位形式的固定组合， 或者用于组合施用的成套药盒， 其中 式 (I) 化合物和组合伙伴 ( 例如如下解释的其它药物， 还称为 “治疗剂” 或 “共用物质” )可 以同时独立施用或在时间间隔内分别施用， 尤其是当这些时间间隔使组合伙伴显示出协作
     作用、 例如协同作用时。如本文所用的术语 “共同施用” 或 “组合施用” 等意欲囊括将所选 的组合伙伴施用于需要其的单个个体 ( 例如患者 )， 并且意欲包括其中物质不必通过相同 施用途径或同时施用的治疗方案。如本文所用的术语 “药物组合产品” 表示将一种以上活 性成分混合或组合所得到的产品， 并且既包括活性成分的固定组合也包括非固定组合。术 语 “固定组合” 表示活性成分如式 I 化合物和组合伙伴以单一实体或剂量的形式同时施用 于患者。术语 “非固定组合” 表示活性成分如式 I 化合物和组合伙伴均作为单独实体同时、 共同或无特定时间限制地先后施用于患者， 其中该施用在患者体内提供了两种化合物的治 疗有效水平。后者还适用于鸡尾酒疗法， 例如施用 3 种或更多种活性成分。
     在优选的实施方案 ( 其独立地、 共同地或以任意组合或亚组合进行优选 ) 中， 本发 明涉及游离碱形式或酸加成盐形式的式 I 化合物， 其中取代基如本文所定义。
     在一项有利的实施方案中， 本发明涉及式 IA 化合物
    
    
    其中， 取代基如式 (I) 化合物所定义。 在另一项有利的实施方案中， 本发明涉及式 IB 化合物其中， 取代基如式 (I) 化合物所定义。
     因此， 式 (I) 化合物还包括式 (IA) 和 (IB) 化合物。在本发明的全文中， 以下定义 也都适用。
     A 优选地代表具有一个或两个氮原子和 5-10 个成环原子的杂芳基。
     A 特别优选地代表选自以下基团的杂芳基 ：
    
    A 非常特别优选地代表选自以下基团的杂芳基 ：
    
    A 最优选代表选自以下基团的杂芳基 ：R1 优选地代表以下取代基之一 ：
     (1) 未取代或取代的， 优选取代的 C1-C7- 烷基， 其中所述取代基独立地选自一个或 多个， 优选一至九个以下基团 ： 氘、 卤素、 氰基、 C3-C12- 环烷基、 C1-C7- 烷基氨基、 二 (C1-C7- 烷 基 ) 氨基、 C1-C7- 烷基氨基羰基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基羰基、 C1-C7- 烷氧基、 苯基 ( 其是 未取代的或者被一个或多个， 优选一个 C1-C7- 烷基、 C1-C7- 烷氧基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨 苯氧基 ( 其是未取代的或者被一个或多个， 优选一个 C1-C7- 烷基、 基 -C1-C7- 烷氧基取代 )、 C1-C7- 烷氧基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基 -C1-C7- 烷氧基 ) ；
     (2) 未取代或取代的 C3-C12- 环烷基， 其中所述取代基独立地选自一个或多个， 优 选一至四个以下基团 ： 氘、 卤素、 氰基、 C1-C7- 烷基、 C1-C7- 烷基氨基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨 基、 氨基羰基、 C1-C7- 烷基氨基羰基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基羰基、 C1-C7- 烷氧基、 苯基 ( 其 是未取代的或者被一个或多个， 优选一个 C1-C7- 烷基、 C1-C7- 烷氧基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨 基 -C1-C7- 烷氧基 )、 苯氧基 ( 其是未取代的或者被一个或多个， 优选一个 C1-C7- 烷基、 C1-C7- 烷氧基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基 -C1-C7- 烷氧基 ) ；
     (3) 未取代或取代的苯基， 其中所述取代基独立地选自一个或多个， 优选一至两个 以下基团 ： 氘、 卤素、 氰基、 C1-C7- 烷基、 C1-C7- 烷基氨基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基、 C1-C7- 烷基 氨基羰基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基羰基、 C1-C7- 烷氧基 ；
     (4) 未取代的、 单 - 或二取代的胺 ； 其中所述取代基独立地选自以下基团 ： 氘、 C1-C7- 烷基 ( 其是未取代的或被一个或多个选自氘、 氟、 氯、 羟基的基团取代 )、 C1-C7- 烷 基羰基、 苯基 ( 其是未取代的或被一个或多个， 优选一个 C1-C7- 烷基、 C1-C7- 烷氧基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基 -C1-C7- 烷氧基取代 )、 苯基磺酰基 ( 其是未取代的或被一个或多个， 优 选一个 C1-C7- 烷基、 C1-C7- 烷氧基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基 -C1-C7- 烷氧基取代 )，
     (5) 取代的磺酰基 ； 其中所述取代基选自以下基团 ： C1-C7- 烷基 ( 其是未取代的或 被一个或多个选自氘、 氟、 氯、 羟基的基团取代 )、 C1-C7- 烷基氨基 ( 其中烷基部分是未取代 的或被一个或多个选自氘、 氟、 氯、 羟基的基团取代 )、 二 -C1-C7- 烷基氨基 ( 其中烷基部分 是未取代的或被一个或多个选自氘、 氟、 氯、 羟基的基团取代 ) ；
     (6) 氟、 氯。 1
     R 特别优选地代表以下取代基之一 ：
     (1) 未取代或取代的， 优选取代的 C1-C7- 烷基， 其中所述取代基独立地选自一个或 多个， 优选一至九个以下基团 ： 氘、 氟， 或者一个或两个以下基团 ： C3-C5- 环烷基 ；
     (2) 任选被取代的 C3-C5- 环烷基， 其中所述取代基独立地选自一个或多个， 优选一 至四个以下基团 ： 氘、 C1-C4- 烷基 ( 优选甲基 )、 氟、 氰基、 氨基羰基 ；
     (3) 任选被取代的苯基， 其中所述取代基独立地选自一个或多个， 优选一至两个以 下基团 ： 氘、 卤素、 氰基、 C1-C7- 烷基、 C1-C7- 烷基氨基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基、 C1-C7- 烷基氨 基羰基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基羰基、 C1-C7- 烷氧基 ；
     (4) 任 选 的 单 - 或 二 取 代 的 胺 ； 其中所述取代基独立地选自以下基团 ： 氘、 C1-C7- 烷基 ( 其是未取代的或被一个或多个选自氘、 氟、 氯、 羟基的基团取代 )、 苯基磺酰基 ( 其是未取代的或被一个或多个， 优选一个 C1-C7- 烷基、 C1-C7- 烷氧基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨 基 -C1-C7- 烷氧基取代 )，
     (5) 取代的磺酰基 ； 其中所述取代基选自以下基团 ： C1-C7- 烷基 ( 其是未取代的 或被一个或多个选自氘、 氟的基团取代 )、 吡咯烷子基 ( 其是未取代的或被一个或多个选自 氘、 羟基、 氧代的基团取代 ； 特别是被一个氧代取代 )，
     (6) 氟、 氯。 1
     R 非常特别优选地代表 ：
     (1) 环丙基甲基， 或任选被取代的、 支链的 C3-C7- 烷基， 其中所述取代基独立地选 自一个或多个， 优选一至九个以下基团 ： 氘、 氟；
     (2) 任选被取代的环丙基或环丁基， 其中所述取代基独立地选自一个或多个， 优选 一至四个以下基团 ： 甲基、 氘、 氟、 氰基、 氨基羰基 ；
     (3) 任选被取代的苯基， 其中所述取代基独立地选自一个或多个， 优选一至两个以 下基团 ： 氘、 卤素、 氰基、 C1-C7- 烷基、 C1-C7- 烷基氨基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基、 C1-C7- 烷基氨 基羰基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基羰基、 C1-C7- 烷氧基 ；
     (4) 任 选 的 单 - 或 二 取 代 的 胺 ； 其中所述取代基独立地选自以下基团 ： 氘、 C1-C7- 烷基 ( 其是未取代的或被一个或多个选自氘、 氟、 氯、 羟基的基团取代 )、 苯基磺酰基 ( 其是未取代的或被一个或多个， 优选一个 C1-C7- 烷基、 C1-C7- 烷氧基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨 基 -C1-C7- 烷氧基取代 )，
     (5) 取代的磺酰基 ； 其中所述取代基选自以下基团 ： C1-C7- 烷基 ( 其是未取代的 或被一个或多个选自氘、 氟的基团取代 )、 吡咯烷子基 ( 其是未取代的或被一个或多个选自 氘、 羟基、 氧代的基团取代 ； 特别是被一个氧代取代 )，
     (6) 氟、 氯。 1
     R 非常特别优选地代表以下取代基之一 ： -C(CH3)2CF3、 C(CD3)3、 1- 甲基环丙基 ； 优 选在 (I-A) 和 (I-B) 的背景中。
     R2 优选地代表如 R1 所定义的取代基。
     R2 进一步优选地代表氢或氘。
     R2 特别优选地代表氢。
     R2 在一项可选择的实施方案中代表甲基。
     R3 优选地代表 (1) 氢， (2) 卤素， (3) 任选被取代的 C1-C7- 烷基， 其中所述取代基独 立地选自一个或多个， 优选一至三个以下基团 ： 氘、 卤素、 C1-C7- 烷基氨基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基。
     R3 特别优选地代表 (1) 氢， (2) 氟、 氯， (3) 任选被取代的甲基， 其中所述取代基独立地选自一个或多个， 优选一至三个以下基团 ： 氘、 氟、 氯、 二甲基氨基。 3
     R 非常特别优选地代表氢、 甲基、 CD3、 CH2Cl、 CH2F、 CH2N(CH3)3 ； 优选甲基。 1 2
     本发明还涉及如本文所定义的式 (I) 化合物， 其中 R 和 / 或 R 代表叔丁基的化合 物除外。
     本发明还涉及式 (I) 化合物的可药用前药。
     本发明还涉及式 (I) 化合物的可药用代谢物。
     本发明尤其涉及实施例中以及本文所述制备方法中给出的式 (I) 化合物。
     本发明还涉及式 (I) 化合物的制备方法。基本上所有已知的将两种不同的胺转化 为相应的脲衍生物的方法都是适合的， 且可以通过使用各自的起始原料进行应用。
     因此， 本发明特别涉及式 (I) 化合物的制备方法， 其包括将式 (II) 化合物
    
    与式 (IIIA) 化合物
    
    其中取代基如本文所定义， 且 R3 可以另外代表氯， 在活化试剂的存在下反应 ( “方 法 A” )， 或者与式 (IIIB) 化合物反应其中 R1 和 R2 如本文所定义， R3 如本文所定义且可以另外代表氯， 且 RG 代表反应 基团， 例如咪唑基羰基， 其可以直接反应或者通过形成 (IIIE) 的异氰酸酯中间体进行反应 (“方法 B” )，
    
    其中所述取代基如 (IIIB) 中所定义，
     在每种情况中任选在稀释剂的存在下并且任选在反应助剂的存在下反应， 和回收 所得的游离形式或盐形式的式 (I) 化合物， 以及
     任选将根据方法 A 或方法 B 可得到的式 (I) 化合物转化为不同的式 (I) 化合物， 和 / 或将可得到的式 (I) 化合物的盐转化为其不同的盐， 和 / 或将可得到的游离式 (I) 化 合物转化为其盐， 和 / 或从一种或多种不同的可得到的式 (I) 的异构体中分离可得到的式 (I) 化合物的异构体。
     反应条件
     可以根据本领域已知的方法或者按照以下实施例中公开的方法进行该方法。例 如， 可以使式 II 化合物与式 III 化合物在溶剂如二甲基甲酰胺中、 在碱、 例如有机胺如三乙 胺的存在下反应。
     当温度在上文或下文中被给出时， 应当加入 “约” ， 因为所给数值的小偏差、 例如 ±10％的变化是容许的。
     所有反应可以在一种或多种稀释剂和 / 或溶剂的存在下进行。原料可以以等摩尔 量使用 ； 或者， 化合物可以过量使用， 例如作为溶剂而发挥作用或使平衡移动或通常加快反 应速率。
     可以如本领域已知的、 反应所需要的那样并且按照通常已知的操作加入适宜量的 反应助剂， 例如酸、 碱或催化剂。
     保护基团
     如果一个或多个其它官能团， 例如羧基、 羟基、 氨基、 巯基等在如本文描述的原料 或任意其它前体中被保护或需要被保护， 因为它们不应参与反应或干扰反应， 则这些基团 是如通常在肽化合物、 头孢菌素类和青霉素类以及核酸衍生物和糖类的合成中使用的这类 基团。保护基团是一旦它们被除去就不再在最终化合物中存在的这类基团， 而在此处所用 的意义上作为取代基保留的基团不是保护基团， 保护基团是在原料或中间体阶段被加入， 并且被除去以得到最终化合物的基团。此外， 对于式 (I) 化合物转化为不同的式 (I) 化合 物而言， 如果有用或需要的话， 可以加入和除去保护基团。
     保护基团可以已经在前体中存在， 并且应该保护有关的官能团以防止不需要的二 次反应如酰化、 醚化、 酯化、 氧化、 溶剂解以及类似的反应。 保护基团的特征是它们自身易于 ( 即没有不需要的二次反应 ) 除去， 通常通过乙酰解、 质子解、 溶剂解、 还原、 光解或通过酶 活性、 例如在类似于生理条件的条件下除去， 并且它们在终产物中不存在。 专业人员知道或
     可以容易确定哪些保护基团适于上下文提到的反应。
     这类保护基团对这些官能团的保护、 保护基团本身及其去除反应例如在如下 标准参考著作中有描述 ： 例如 J.F.W.McOmie， 《有机化学中的保护基团》 (“Protective Groups in Organic Chemistry” )， 普 莱 姆 出 版 社 (Plenum Press)， 伦 敦 和 纽 约 1973， T.W.Greene， 《有机合成中的保护基团》 (“Protective Groups in Organic Synthesis” )， 第 三 版，威 利 (Wiley) 公 司，纽 约 1999， 《肽》 (“The Peptides” )； 第 3 卷 ( 编 者： E.Gross 和 J.Meienhofer)， 学术出版社 (Academic Press)， 伦敦和纽约 1981， “Methoden derorganischen Chemie” ( 有 机 化 学 方 法 )， Houben Weyl， 第 4 版， 第 15 卷 /I， Georg Thieme Verlag， 斯 图 加 特 1974， H.-D.Jakubke 和 H.Jescheit， Peptide， Proteine” ( 氨基酸、 肽、 蛋白质 )， Verlag Chemie， Weinheim， Deerfield Beach 和 Basel 1982，和 Jochen Lehmann， “Chemieder Kohlenhydrate ： Monosaccharide und Derivate” ( 碳水化合物化学 ： 单糖和衍生物 )， Georg Thieme Verlag， 斯图加特 1974。
     任选的反应和转化
     一种式 (I) 化合物可以被转化为不同的式 (I) 化合物。
     在其中 R3 代表氟的式 (I) 化合物中， 可以通过将相应的氯衍生物转化为氟化合物 而得到这类化合物。这类反应是已知的并且被称为取代反应。该转化可以在式 (IIIA 或 B) 的原料的步骤进行或者通过将相应的式 (I) 化合物转化而进行。
     在其中取代基带有氨基或氨基 -C1-C7- 烷基取代基的式 (I) 化合物中， 可以通过与 相应的 C1-C7- 烷酰基卤化物或 C1-C7- 烷基磺酰基卤化物、 例如相应的氯化物在如下条件下 反应将氨基转化为酰基氨基、 例如 C1-C7- 烷酰基氨基或 C1-C7- 烷基磺酰基氨基 ： 在叔氮碱 如三乙胺或吡啶的存在下， 在有或没有适当溶剂如二氯甲烷的存在下， 例如在 -20 至 50℃ 范围内的温度下如在约室温下进行。
     在其中取代基带有氰基取代基的式 (I) 化合物中， 可以例如通过在如下条件下氢 化将氰基转化为氨基甲基 ： 在适当的金属催化剂如阮内镍或阮内钴的存在下， 在适当溶剂、 例如低级链烷醇如甲醇和 / 或乙醇中， 例如在 -20 至 50℃范围内的温度下如在约室温下进 行。
     具有成盐基团的式 (I) 化合物的盐可以按照本身已知的方式来制备。 因此， 式 (I) 化合物的酸加成盐可以通过用酸或用适宜的阴离子交换试剂处理而得到。 具有两个酸分子 的盐 ( 例如式 (I) 化合物的二卤化物 ) 还可以被转化为每个化合物具有一个酸分子的盐 ( 例如单卤化物 ) ； 这可以通过如下方法做到 ： 加热至熔化物， 或者例如作为固体在高真空 下、 在高温如从 130 至 170℃下加热， 此时每分子的式 (I) 化合物排出一分子酸。通常可以 例如通过用适宜的碱性化合物、 例如用碱金属碳酸盐、 碱金属碳酸氢盐或碱金属氢氧化物、 通常为碳酸钾或氢氧化钠处理而将盐转化为游离化合物。
     可以按照本身已知的方式、 通过适宜的分离方法将立体异构混合物、 例如非对映 异构体的混合物分离为其相应的异构体。 例如可以通过分步结晶、 色谱法、 溶剂分配和类似 方法将非对映异构混合物分离为其单独的非对映异构体。 该分离可以在起始化合物的水平 或者在式 (I) 化合物本身中进行。可以通过形成非对映异构盐、 例如通过与对映异构体纯 的手性酸形成盐或者通过色谱法、 例如通过 HPLC、 使用具有手性配体的色谱基质来分离对 映异构体。应该强调， 与本章中所提到的转化类似的反应也可以在适当中间体的水平进行 ( 并且因此可用于制备相应的原料 )。
     原料 ：
     式 II 和 III 的原料以及本文如下文提到的其它原料可以按照或类似于本领域已 知的方法来制备， 它们是本领域已知的和 / 或可市售获得。在对于原料的制备没有特别描 述的情况下， 化合物是已知的或者可以按照类似于本领域已知的方法、 例如 WO 05/021519 或 WO04/096797 中的方法或者按照下文公开的方法来制备。新原料及其制备方法同样是本 发明的实施方案。在优选的实施方案中， 使用这类原料并选择所选反应以便能够得到优选 的化合物。
     在也可以适当和有利地作为盐形式使用和 / 或得到的原料 ( 包括中间体 ) 中， 取 代基优选如对式 (I) 化合物所定义。
     本发明还涉及式 (IIIA) 化合物或其盐
    其中所述取代基如式 (I) 化合物所定义。
     本发明还涉及式 (IIIA) 化合物的制备方法。基本上， 全部已知的将两种或芳基 / 杂芳基组分偶联 ( 例如 Heck 型反应 ) 成对应的脲衍生物的方法都是适合的， 且可以通过使 用各自的起始原料进行应用。因此本发明还涉及式 (IIIA) 的制备方法， 其包括
     ( 步骤 1) 将式 (IV) 化合物
    
    
    其中 R3 如本文所定义且可以另外代表卤素， PG 代表保护基团， 例如酰基基团， 与式 (V) 化合物其中 R1、 R2、 A 如本文所定义， 且 Hal 代表卤素， 例如溴， 在 Heck 条件下反应 ； 任选 地在稀释剂的存在下且任选地在反应助剂的存在下反应 ；
     ( 步骤 2) 然后除去保护基团， 例如在酸性条件下 ； 任选地在稀释剂的存在下且任
     选地在反应助剂的存在下反应 ； 并
     回 收 所 得 到 的 游 离 形 式 或 盐 形 式 的 式 (IIIA) 化 合 物， 并任选地将所得的式 (IIIA) 化合物转化为不同的式 (IIIA) 化合物， 和 / 或将所得的式 (IIIA) 化合物的盐转化 为其不同的盐， 和 / 或将所得的游离的式 (IIIA) 化合物转化为其盐， 和 / 或从得到的一种 或多种不同的式 (IIIA) 的异构体中分离式 (IIIA) 化合物的一种可得到的异构体。
     本发明还涉及式 (IIIB) 化合物或其盐
    其中 R1、 R2、 A 如式 (I) 化合物所定义， RG 代表反应基团， 特别是咪唑基羰基， 其可 以直接反应或者通过形成 (IIIE) 的异氰酸酯中间体进行反应， 且 R3 如本文所定义并可以 另外代表卤素。
     本发明还涉及式 (IIIB) 化合物的制备方法。基本上， 全部已知的将胺或其盐转化 成对应的活化衍生物的方法都是适合的， 且可以通过使用各自的起始原料进行应用。因此 本发明还涉及式 (IIIB) 化合物的制备方法， 其包括将式 (IIIA) 化合物
    
    其中取代基如本文所定义， 与活化试剂， 例如 1， 1’ - 羰基二咪唑， 任选地在稀释剂 的存在下且任选地在反应助剂的存在下反应 ； 并且
     回收得到的游离形式或盐形式的式 (IIIB) 化合物， 和任选地将所得的式 (IIIB) 化合物转化为不同的式 (IIIB) 化合物， 和 / 或将所得的式 (IIIB) 化合物的盐转化为其不 同的盐， 和 / 或将所得的游离的式 (IIIB) 化合物转化为其盐， 和 / 或从得到的一种或多种 不同的式 (IIIB) 的异构体中分离式 (IIIB) 化合物的一种可得到的异构体。
     本发明还涉及式 (IIIC) 化合物或其盐
    
    其中取代基如式 (I) 化合物所定义。
     本发明还涉及式 (IIIC) 化合物的制备方法。基本上， 全部环合反应都是适合的， 且可以通过使用各自的起始原料进行应用。因此本发明还涉及式 (IIIC) 化合物的制备方 法， 其包括将式 (VI) 化合物
    
    
    其中 R3 如本文所定义且可以另外代表卤素， 与式 (VII) 化合物其中 R1 如本文所定义 ； 任选地在稀释剂的存在下且任选地在反应助剂的存在下进 行反应 ； 并且
     回收得到的游离形式或盐形式的式 (IIIC) 化合物， 并任选地将所得的式 (IIIC) 化合物转化为不同的式 (IIIC) 化合物， 和 / 或将所得的式 (IIIC) 化合物的盐转化为其不 同的盐， 和 / 或将所得的游离的式 (IIIC) 化合物转化为其盐， 和 / 或从得到的一种或多种 不同的式 (IIIC) 的异构体中分离式 (IIIC) 化合物的一种可得到的异构体。
     本发明还涉及式 (IIID) 化合物或其盐
    
    其中 R1 如本文所定义， RG 代表反应基团， 特别是咪唑基羰基， R3 如本文所定义， 且 可以另外代表卤素。
     本发明还涉及式 (IIID) 化合物的制备方法。基本上， 全部已知的将胺或其盐转化 成对应的活化衍生物的方法都是适合的， 且可以通过使用各自的起始原料进行应用。因此 本发明还涉及式 (IIID) 化合物的制备方法， 其包括将式 (IIIC) 化合物
    
     其中取代基如上文所定义， 与活化试剂， 例如 1， 1’ - 羰基二咪唑， 任选地在稀释剂 的存在下且任选地在反应助剂的存在下反应 ； 并且
     回收得到的游离形式或盐形式的式 (IIID) 化合物， 和任选地将所得的式 (IIID) 化合物转化为不同的式 (IIID) 化合物， 和 / 或将所得的式 (IIID) 化合物的盐转化为其不 同的盐， 和 / 或将所得的游离的式 (IIID) 化合物转化为其盐， 和 / 或从得到的一种或多种 不同的式 (IIID) 的异构体中分离式 (IIID) 化合物的一种可得到的异构体。
     本发明还涉及式 (VI) 化合物或其盐
    
    其中 R3 如本文所定义且可以另外代表卤素。
     本发明还涉及式 (VI) 化合物的制备方法。基本上， 全部已知的适合用于此类转化 的方法都可以通过使用各自的起始原料进行应用。因此本发明还涉及式 (IIID) 化合物的 制备方法， 其包括将式 (IIX) 化合物
    
    其中 R3 如式 (I) 所定义且可以另外代表卤素， 与二甲基甲酰胺的缩醛， 例如 DMF- 二甲基缩醛反应， 得到式 (VI) 化合物 ；
     回收得到的游离形式或盐形式的式 (IIID) 化合物， 并任选地将所得的式 (IIX) 化 合物转化为不同的式 (IIX) 化合物， 和 / 或将所得的式 (IIX) 化合物的盐转化为其不同的 盐， 和 / 或将所得的游离的式 (IIX) 化合物转化为其盐， 和 / 或从得到的一种或多种不同的 式 (IIX) 的异构体中分离式 (IIX) 化合物的一种可得到的异构体。
    
    
    式 (I) 化合物还包括亚式 (IA)、 (IB) 及其可药用盐， 可用作药物， 其中
     A 代表杂芳基 ；
     R1 代表 (1) 任选被取代的烷基 ； (2) 任选被取代的环烷基 ； (3) 任选被取代的芳基 ； (4) 任选被取代的胺 ； (5) 任选被取代的磺酰基 ； (6) 卤素 ； 2 1
     R 代表氢、 氘或如 R 所定义的取代基 ； 3
     R 代表氢、 卤素、 任选被取代的烷基。
     因此， 本发明涉及其中表明 PI3K 抑制的用于人类或兽用的组合物的一项实施 方案。该实施方案还包含 (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-( 叔丁基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺， 但或者不包含所述化合物。
     在一项实施方案中， 本发明涉及治疗由 PI3K 介导的细胞增殖性疾病、 例如肿瘤和 / 或癌性细胞生长。疾病包括那些显示 PI3Kα 的过表达或扩增、 PIK3CA 的体细胞突变或 PTEN 的种系突变或体细胞突变或用于正调节 p85-p110 复合物的 p85α 的突变和易位的 激酶所介导的疾病。具体而言， 化合物可用于治疗人或动物 ( 例如鼠类 ) 癌症， 包括例如 肉瘤 ； 肺癌 ； 支气管癌 ； 前列腺癌 ； 乳腺癌 ( 包括散发的乳腺癌和考登病患者 ) ； 胰腺癌 ； 胃 肠癌 ； 结肠癌 ； 直肠癌 ； 结肠癌 ； 结肠直肠腺瘤 ； 甲状腺癌 ； 肝癌 ； 肝内胆管癌 ； 肝细胞癌 ； 肾 上腺癌 ； 胃癌 ； 胃癌 ； 神经胶质瘤 ； 胶质母细胞瘤 ； 子宫内膜癌 ； 黑素瘤 ； 肾癌 ； 肾盂癌 ； 膀胱 癌； 子宫体癌 ； 子宫颈癌 ； 阴道癌 ； 卵巢癌 ； 多发性骨髓瘤 ； 食管癌 ； 白血病 ； 急性髓性白血 病； 慢性髓性白血病 ； 淋巴细胞白血病 ； 髓性白血病 ； 脑癌 ； 脑癌 ； 口腔和咽癌 ； 喉癌 ； 小肠 癌； 非霍奇金淋巴瘤 ； 黑素瘤和绒毛状结肠腺瘤 ； 瘤形成 ； 上皮特征的瘤形成 ； 淋巴瘤 ； 乳 癌； 基底细胞癌 ； 鳞状细胞癌 ； 光化性角化病 ； 肿瘤疾病， 包括实体瘤 ； 颈或头部肿瘤 ； 真性 红细胞增多症 ； 原发性血小板增多症 ； 骨髓纤维化伴骨髓化生 ； 和瓦尔登斯特伦病。
     在其它实施方案中， 病症或紊乱 ( 如 PI3K 介导的 ) 选自 ： 真性红细胞增多症、 原 发性血小板增多症、 骨髓纤维化伴骨髓化生、 哮喘、 COPD、 ARDS、 勒夫勒综合征、 嗜酸细胞性 肺炎、 寄生虫 ( 特别是后生动物 ) 侵染 ( 包括热带肺嗜酸细胞增多 )、 支气管肺曲霉病、 结 节性多动脉炎 ( 包括丘 - 斯综合征 )、 嗜酸细胞肉芽肿、 由药物反应引起的影响气道的与嗜 酸性细胞有关的紊乱、 银屑病、 接触性皮炎、 特应性皮炎、 斑秃、 多形性红斑、 疱疹样皮炎、 硬 皮病、 白癜风、 变应性血管炎、 荨麻疹、 大疱性类天疱疮、 红斑狼疮、 天疱疮 (pemphisus)、 后 天性大疱性表皮松解、 自身免疫性血液病 ( 例如溶血性贫血、 再生障碍性贫血、 纯红细胞贫 血和特发性血小板减少 )、 系统性红斑狼疮、 多发性软骨炎、 硬皮病、 韦格纳肉芽肿病、 皮肌 炎、 慢性活动性肝炎、 重症肌无力、 斯 - 琼氏综合征、 特发性口炎性腹泻、 自身免疫性炎性肠 病 ( 例如溃疡性结肠炎和克罗恩病 )、 内分泌性眼病、 格雷夫斯病、 结节病、 肺泡炎、 慢性过
    敏性肺炎、 多发性硬化症、 原发性胆汁性肝硬化、 ( 前和后 ) 眼色素层炎、 肺间质纤维化、 银屑病关节炎、 肾小球肾炎、 心血管疾病、 动脉粥样硬化、 高血压、 深部静脉血栓形成、 中风、 心 肌梗塞、 不稳定心绞痛、 血栓栓塞、 肺栓塞、 血栓溶解性疾病、 急性动脉缺血、 外周血栓性阻 塞和冠状动脉疾病、 再灌注损伤、 视网膜病、 例如糖尿病性视网膜病或高压氧引起的视网膜 病， 以及以升高眼内压或眼房水分泌为特征的病症、 例如青光眼。
     对于以上用途， 所需的剂量当然将根据施用方式、 所治疗的具体病症和所期望的 作用而改变。通常， 以约 0.03 至约 100.0mg/kg 体重， 例如约 0.03 至约 10.0mg/kg 体重的 日剂量全身施用表明可获得满意的结果。大型哺乳动物、 例如人的指示日剂量的范围为约 0.5mg 至约 3g， 例如约 5mg 至约 1.5g， 其方便地例如以一天最多四次的分份剂量或以缓释 形式施用。适合于口服施用的单位剂量形式包含约 0.1 至约 500mg， 例如约 1.0 至约 500mg 活性成分。
     式 (I) 化合物可以通过任意常规途径施用， 特别是经肠施用、 例如口服施用， 如以 片剂或胶囊剂的形式施用， 或经胃肠道外施用、 例如以可注射的溶液或混悬液的形式施用， 局部施用、 例如以洗剂、 凝胶剂、 软膏剂或乳膏剂的形式施用， 通过吸入施用， 鼻内施用， 或 以栓剂形式施用。
     式 (I) 化合物可以以游离形式或以可药用盐的形式、 例如如上所示的那样施用。 这类盐可以以常规方式来制备并且显示出与游离化合物相同级别的活性。 因此， 本发明还提供了 ：
     ■在需要这类治疗的个体中预防或治疗通过激活 PI3K( 如 PI3 激酶 α) 酶所介导 的病症、 紊乱或疾病的方法， 例如以上所示的那些疾病， 该方法包括给所述个体施用有效量 的式 (I) 化合物或其可药用盐。
     ■游离形式或可药用盐形式的式 (I) 化合物， 其例如在如本文所示的任意方法中 作为药物。
     ■游离形式或可药用盐形式的式 (I) 化合物， 其例如在如本文所示的任意方法中 用作药物， 特别是用于一种或多种磷脂酰肌醇 3- 激酶介导的疾病。
     ■游离形式或可药用盐形式的式 (I) 化合物在如本文所示的任意方法中的用途， 特别是用于治疗一种或多种磷脂酰肌醇 3- 激酶介导的疾病。
     ■游离形式或可药用盐形式的式 (I) 化合物在如本文所示的任意方法中的用途， 特别是用于制备治疗一种或多种磷脂酰肌醇 3- 激酶介导的疾病的药物。
     PI3K 充当整合平行的信号传导途径的第二信使节点， 有证据正在表明， PI3K 抑制 剂和其它途径的抑制剂的组合将可用于治疗人类癌症和增殖性疾病。
     约 20-30 ％的人乳腺癌过表达 Her-2/neu-ErbB2( 药物曲妥珠单抗的靶标 )。虽 然曲妥珠单抗在表达 Her2/neu-ErbB2 的一些患者中已经证明了持久的响应， 但是只有部 分这些患者有响应。近来的工作已经表明， 该有限的响应速率可以通过曲妥珠单抗和 PI3K 或 PI3K/AKT 途径的抑制剂的组合来显著提高 (Chan 等人， Breast Can.Res.Treat.91 ： 187(2005)， WoodsIgnatoski 等 人， Brit.J.Cancer 82 ： 666(2000)， Nagata 等 人， Cancer Cell6 ： 117(2004))。
     多种人恶性瘤表达激活突变或增加 Her1/EGFR 水平， 已经开发了许多抗体和小分 子抑制剂来对抗该受体酪氨酸激酶， 包括特罗凯、 吉非替尼和爱必要。但是， 虽然 EGFR 抑 制剂证明在某些人肿瘤 ( 例如 NSCLC) 中具有抗肿瘤活性， 可是它们不能在患有表达 EGFR
     的肿瘤的所有患者中增加总的患者存活。这可以由如下事实来合理解释 ： Her1/EGFR 的许 多下游靶点在多种恶性瘤中以高频率发生突变或失调， 包括 PI3K/Akt 途径。例如， 吉非替 尼在体外试验中可抑制腺癌细胞系的生长。但是， 可以挑选出对吉非替尼有抗性的这些细 胞系的亚克隆， 证明 PI3/Akt 途径的激活增加了。向下调节或抑制该途径使有抗性的亚克 隆对吉非替尼敏感 (Kokubo 等人， Brit.J.Cancer 92 ： 1711(2005))。而且， 在具有含 PTEN 突变并且过表达 EGFR 的细胞系的乳腺癌的体外模型中， 既抑制 PI3K/Akt 途径又抑制 EGFR 产生了协同作用 (She 等人， Cancer Cell 8 ： 287-297(2005))。这些结果表明， 吉非替尼和 PI3K/Akt 途径抑制剂的组合将是癌症中有吸引力的治疗策略。
     AEE778(Her-2/neu/ErbB2、 VEGFR 和 EGFR 的抑制剂 ) 和 RAD001(mTOR(Akt 的下游 靶标 ) 的抑制剂 ) 的组合在胶质母细胞瘤异种移植物模型中产生了比单独的任一物质更大 的组合效能 (Goudar 等人， Mol.Cancer.Ther.4 ： 101-112(2005))。
     抗雌激素剂如他莫昔芬可通过诱导细胞周期停滞 ( 其需要细胞周期抑制物 p27Kip 的作用 ) 而抑制乳腺癌生长。近来， 已经表明 Ras-Raf-MAP 激酶途径的激活可改变 p27Kip 的磷酸化状态， 结果其在使细胞周期停滞中的抑制活性被减弱， 由此引起抗雌激素 抗性 (Donovan 等人， J.Biol.Chem.276 ： 40888， (2001))。如 Donovan 等人所报道的那样， 通过用 MEK 抑制剂处理来抑制 MAPK 信号传导在激素抵抗的乳腺癌细胞系中逆转了 p27 的 异常磷酸化状态， 并且由此恢复了激素敏感性。类似地， 通过 Akt 使 p27Kip 磷酸化也可取 消其对使细胞周期停滞的作用 (Viglietto 等人， Nat Med.8 ： 1145(2002))。
     因此， 在另一方面， 式 I 化合物可用于治疗激素依赖性癌症、 例如乳腺和前列腺 癌。该用途的目标是用常规的抗癌剂来逆转这些癌症中常见的激素抗性。
     在血液癌症如慢性髓性白血病 (CML) 中， 染色体易位负责组成性激活的 BCR-Abl 酪氨酸激酶。受影响的患者由于 Abl 激酶活性的抑制而对伊马替尼 ( 一种小分子酪氨酸激 酶抑制剂 ) 作出响应。但是， 患有晚期疾病的许多患者起初对伊马替尼有响应， 可是后来由 于在 Abl 激酶结构域中发生了给予抗性的突变而复发。体外研究已经表明， BCR-Ab1 利用 Ras-Raf 激酶途径来引起其作用。 此外， 抑制相同途径中一种以上的激酶可提供另外的保护 以防止给予抗性的突变。
     因此， 在另一方面， 式 I 化合物与至少一种选自激酶抑制剂如 的另外 的物质组合使用来治疗血液癌症如慢性髓性白血病 (CML)。 通过该用途可知， 目标是逆转或 阻止对所述的至少一种另外的物质的抗性。
     因为激活 PI3K/Akt 途径可驱动细胞存活， 所以与驱动癌细胞中细胞凋亡的疗 法 ( 包括放射治疗和化学治疗 ) 组合来抑制该途径将使响应提高 (Ghobrial 等人， CA Cancer J.Clin 55 ： 178-194(2005))。作为实例， PI3 激酶抑制剂和卡铂的组合表明在体外 增殖和细胞凋亡试验中以及在卵巢癌的异种移植物模型的体内肿瘤效能中具有协同作用 (Westfall 和 Skinner， Mol.Cancer Ther.4 ： 1764-1771(2005))。
     除了癌症和增殖性疾病外， 有越来越多的证据表明 1A 和 1B 类 PI3 激酶的抑制剂 将在治疗上可用于其它疾病领域。抑制 p110β(PIK3CB 基因的 PI3K 同工型产物 ) 已经表 明可参与剪切引起的血小板激活 (Jackson 等人， Nature Medicine 11 ： 507-514(2005))。 因此， 抑制 p110β 的 PI3K 抑制剂将在抗血栓治疗中可用作单独的药物或可组合使用。同 工型 p110δ(PIK3CD 基因的产物 ) 在 B 细胞功能和分化 (Clayton 等人， J.Exp.Med.196 ：753-763(2002))、 T 细 胞 依 赖 性 和 非 依 赖 性 抗 原 响 应 (Jou 等 人， Mol.Cell.Biol.22 ： 8580-8590(2002)) 及肥大细胞分化 (Ali 等人， Nature 431 ： 1007-1011(2004)) 中是重要 的。因此， 期望 p110δ 抑制剂将可用于治疗 B 细胞驱动的自身免疫性疾病和哮喘。最后， 抑制 p110γ(PI3KCG 基因的同工型产物 ) 使 T 细胞而非 B 细胞的响应减少 (Reif 等人， J.Immunol.173 ： 2236-2240(2004))， 这种抑制证明在自身免疫性疾病的动物模型中具有效 能 (Camps 等人， Nature Medicine 11 ： 936-943(2005)， Barber 等人， Nature Medicine11 ： 933-935(2005))。
     本发明还提供了药物组合物， 其包含单独的或者与其它抗癌剂一起的至少一种式 (I) 化合物以及适合施用于人或动物个体的可药用赋形剂。
     本发明还提供了治疗患有细胞增殖性疾病如癌症的人或动物个体的方法。因此， 本发明提供了治疗需要这类治疗的人或动物个体的方法， 包括给该个体单独施用或者与一 种或多种其它抗癌剂组合施用治疗有效量的式 (I) 化合物。特别是组分将被配制在一起作 为组合治疗剂或者分别施用。适于与式 (I) 化合物使用的抗癌剂包括但不限于一种或多 种选自以下所述的激酶抑制剂、 抗雌激素剂、 抗雄激素剂、 其它抑制剂、 癌症化疗药物、 烷化 剂、 螯合剂、 生物效应调节剂、 癌症疫苗、 用于反义治疗的物质的化合物 ：
     A. 激酶抑制剂 ： 作为抗癌剂与式 (I) 化合物联合使用的激酶抑制剂包括 ： 表 皮生长因子受体 (EGFR) 激酶抑制剂， 例如小分子喹唑啉类如吉非替尼 (US 5457105、 US 5616582 和 US 5770599)、 ZD-6474(WO 01/32651)、 厄洛替尼 ( US 5,747,498 和 WO 96/30347) 和 lapatinib(US6,727,256 和 WO 02/02552) ； 血管内皮生长因子 受 体 (VEGFR) 激 酶 抑 制 剂， 包 括 SU-11248(WO 01/60814)、 SU 5416(US 5,883,113 和 WO 99/61422)、 SU 6668(US 5,883,113 和 WO 99/61422)、 CHIR-258(US 6,605,617 和 US6,774,237)、 伐 他 拉 尼 或 PTK-787(US 6,258,812)、 VEGF-Trap(WO02/57423)、 B43- 染 料木黄酮 (WO-09606116)、 芬维 A 胺 ( 维甲酸对 - 羟基苯胺 )(US 4,323,581)、 IM-862(WO 02/62826)、 贝伐单抗或 (WO94/10202)、 KRN-951、 3-[5-( 甲 基 磺 酰 基 哌 啶 甲 基 )- 吲哚基 ]- 喹诺酮、 AG-13736 和 AG-13925、 吡咯并 [2， 1-f][1， 2， 4] 三嗪、 ZK-304709、 VMDA-3601、 EG-004、 CEP-701(US 5,621,100)、 Cand5(WO 04/09769) ； Erb2 酪 氨酸激酶抑制剂， 例如 pertuzumab(WO 01/00245)、 曲妥珠单抗和利妥昔单抗 ； Akt 蛋白激 酶抑制剂， 例如 RX-0201 ； 蛋白激酶 C(PKC) 抑制剂， 例如 LY-317615(WO 95/17182) 和哌 立福辛 (US 2003171303) ； Raf/Map/MEK/Ras 激酶抑制剂， 包括索拉非尼 (BAY 43-9006)、 ARQ-350RP、 LErafAON、 BMS-354825AMG-548， 和在 WO 03/82272 中公开的其它化合物 ； 成纤 维细胞生长因子受体 (FGFR) 激酶抑制剂 ； 细胞依赖性激酶 (CDK) 抑制剂， 包括 CYC-202 或 Roscovitine(WO 97/20842 和 WO 99/02162) ； 血小板衍生生长因子受体 (PDGFR) 激酶抑制 剂， 例如 CHIR-258、 3G3mAb、 AG-13736、 SU-11248 和 SU6668 ； 以及 Bcr-Abl 激酶和融合蛋白 抑制剂如 STI-571 或
    ( 伊马替尼 )。B. 抗雌激素剂 ： _ 在抗癌治疗中与式 (I) 化合物联合使用的雌激素靶向的物质 包括 ： 选择性雌激素受体调节剂 (SERMs)， 包括他莫昔芬、 托瑞米芬、 雷洛昔芬 ； 芳香酶抑制 剂， 包括 司群。29或阿那曲唑 ； 雌激素受体负调节物 (ERDs)， 包括或氟维102149711 A CN 102149713
    说明书21/100 页C. 抗雄激素剂 ： _ 在抗癌治疗中与式 (I) 化合物联合使用的雄激素靶向的物质包 括氟他胺、 比卡鲁胺、 非那雄胺、 氨鲁米特、 酮康唑和皮质类固醇。
     D. 其它抑制剂 ： _ 作为抗癌剂与式 (I) 化合物联合使用的其它抑制剂包括 ： 蛋 白法尼基转移酶抑制剂， 包括替匹法尼或 R-115777(US 2003134846 和 WO 97/21701)、 BMS-214662、 AZD-3409 和 FTI-277 ； 拓 扑 异 构 酶 抑 制 剂， 包 括 merbarone 和 二 氟 替 康 (BN-80915) ； 有丝分裂纺锤体驱动蛋白 (KSP) 抑制剂， 包括 SB-743921 和 MKI-833 ； 蛋白酶 体调节剂， 例如硼替佐米或 (US 5,780,454)、 XL-784 ； 和环加氧酶 2(COX-2) 抑 制剂， 包括非甾体抗炎药 I(NSAIDs)。
     E. 癌症化疗药物 ： 作为抗癌剂与式 (I) 化合物联合使用的具体的癌症化学治疗 剂包括阿那曲唑 白消安 比卡鲁胺 白消安注射液 硫酸博来霉素 卡培他滨 卡莫司汀 克拉屈滨 环磷酰胺 阿糖胞苷脂质体注射液 N4- 戊 氧 基 苯丁酸氮芥 或羰 基 -5- 脱 氧 -5- 氟 胞 苷、 卡铂 顺铂 阿糖胞苷、 阿糖胞苷 达 卡 巴 嗪 (DTIC-)、 放 线 菌 素 D( 放 线 菌 素 D， Cosmegan)、 盐酸柔红霉素 地塞米松、 多西他赛 依托泊苷 氟他胺 伊达比星 L- 门 冬 酰 胺 酶 甲氨蝶呤 亚 米 磷枸橼酸柔红霉素脂质体注射液 盐酸多柔比星 酸氟达拉滨 5- 氟尿嘧啶tezacitibine、 吉西他滨 ( 二氟脱氧胞苷 )、 羟基脲 异环磷酰胺 叶 酸 钙、 美法仑 托蒽醌 伊立替康 6- 巯 基 嘌 呤 麦 罗 塔、 紫杉醇phoenix( 钇 90/MX-DTPA)、 喷司 枸橼酸他莫昔芬 注射用盐酸 和长春瑞滨他 丁、 聚 苯 丙 生 20 和 卡 莫 司 汀 植 入 物 替尼泊苷 托泊替康6- 硫 鸟 嘌 呤、 塞 替 派、 替拉扎明 长春碱 长春新碱F. 烷化剂 ： _ 与式 (I) 化合物联合使用的烷化剂包括 VNP-40101M 或 cloretizine、 奥沙利铂 (US 4,169,846、 WO 03/24978 和 WO 03/04505)、 葡磷酰胺、 马磷酰胺、 凡毕复 (US 5,041,424)、 泼尼莫司汀 ； 曲奥舒凡 ； 白消安 ； irofluven( 酰基富烯 ) ； penclomedine ； 吡唑 并吖啶 (PD-115934) ； O6- 苄基鸟嘌呤 ； 地西他滨 (5- 氮杂 -2- 脱氧胞苷 ) ； brostallicin ；
    丝 裂 霉 素 C(MitoExtra) ； TLK-286替莫唑胺 ； 曲 贝 替 定 (US 5,478,932) ；AP-5280( 顺铂的铂酸盐制剂 ) ； 泊非霉素 ； 和 clearazide(meclorethamine)。
     G. 螯合剂 ： _ 与式 (I) 化合物联合使用的螯合剂包括四硫钼酸盐 (WO01/60814) ；RP-697 ； 嵌合的 T84.66(cT84.66) ； 钆膦维司 (EPT) 组合的博来霉素。
    去铁胺 ； 以及任选与电穿孔法H. 生 物 效 应 调 节 剂 ： _ 与 式 (I) 化 合 物 联 合 使 用 的 生 物 效 应 调 节 剂、 例如免 疫调节剂包括 ： 星型包菌素及其大环类似物， 包括 UCN-01、 CEP-701 和米哚妥林 ( 参见 WO 02/30941、 WO 97/07081、 WO 89/07105、 US5,621,100、 WO 93/07153、 WO 01/04125、 WO 02/30941、 WO 93/08809、 WO 94/06799、 WO 00/27422、 WO 96/13506 和 WO 88/07045) ； 角鲨胺 (WO01/79255) ； DA-9601(WO 98/04541 和 US 6,025,387) ； 阿仑单抗 ； 干扰素 ( 例 如 IFN-a、 IFN-b 等 ) ； 白 细 胞 介 素， 特 别 是 IL-2 或 阿 地 白 介 素 以 及 IL-1、 IL-3、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-7、 IL-8、 IL-9、 IL-10、 IL-11、 IL-12， 及具有多于 70 ％天然人序列的氨 基酸序列的其活性生物变体 ； 六甲蜜胺 SU 101 或来氟米特 (WO 04/06834 和 US 6,331,555) ； 咪唑并喹啉， 例如瑞喹莫德和咪喹莫特 (US 4,689,338、 5,389,640、 5,268,376 、 4,929,624 、 5,266,575 、 5,352,784 、 5,494,916 、 5,482,936 、 5,346,905 、 5,395,937、 5,238,944 和 5,525,612) ； 以及 SMIPs， 包括苯并唑类、 蒽醌类、 缩氨基硫脲类和 色胺酮类 (WO 04/87153、 WO 04/64759 和 WO 04/60308)。
    I. 癌 症 疫 苗 ： _ 与 式 (I) 化 合 物 联 合 使 用 的 抗 癌 疫 苗 包 括(Tetrahedron Lett.26 ： 2269-70(1974)) ； oregovomab (STn-KLH) ； 黑素瘤疫苗 ； 针对 Ras 蛋白中 5 个突变的 GI-4000 系列 (GI-4014、 GI-4015 和 GI-4016) ； GlioVax-1 ； MelaVax ； 或 INGN-201(WO 95/12660) ； Sig/E7/LAMP-1， 编码 HPV-16E7 ； MAGE-3 疫苗或 M3TK(WO 94/05304) ； HER-2VAX ； 刺激对肿瘤特异的 T 细胞的 ACTIVE ； GM-CSF 癌症疫苗 ； 和基于利斯特菌属 (Listeria) 单细胞质基因的疫苗。
     J. 反 义 治 疗 ： _ 与 式 (I) 化 合 物 联 合 使 用 的 抗 癌 剂 还 包 括 反 义 组 分， 例如 AEG-35156(GEM-640) ； AP-12009 和 AP-11014(TGF-β2 特异性反义寡核苷酸 ) ； AVI-4126 ； AVI-4557 ； AVI-4472 ； oblimersen JFS2 ； aprinocarsen(WO 97/29780) ； GTI-2040(R2 核 糖 核 苷 酸 还 原 酶 mRNA 反 义 寡 核 苷 酸 )(WO 98/05769) ； GTI-2501(WO 98/05769) ； 脂 质 体 包 囊 的 c-Raf 反 义 寡 脱 氧 核 苷 酸 (LErafAON)(WO 98/43095) ； 和 Sirna-027( 基于 RNAi 的靶向于 VEGFR-1mRNA 的治疗剂 )。
     式 (I) 化合物还可以在药物组合物中与支气管扩张或抗组胺药物组合。这类支 气管扩张药物包括抗胆碱能或抗毒蕈碱剂， 特别是异丙托溴铵、 氧托溴铵和噻托溴铵， 以及 β-2- 肾上腺素受体激动剂， 例如沙丁胺醇、 特布他林、 沙美特罗、 卡莫特罗、 milveterol 以 及尤其是福莫特罗和茚达特罗。共同治疗的抗组胺药物包括盐酸西替利嗪、 富马酸氯马斯 汀、 异丙嗪、 氯雷他定、 地氯雷他定、 苯海拉明和盐酸非索非那定。
     在另外的方面， 本发明提供了组合， 其包含式 (I) 化合物以及一种或多种可用于 治疗血栓性疾病、 心脏病、 中风等的化合物。 这类化合物包括阿司匹林、 链激酶、 组织纤溶酶 原激活剂、 尿激酶、 抗凝血剂、 抗血小板药 ( 例如 PLAVIX ； 氯吡格雷硫酸氢盐 )、 他汀类化合 物 ( 例如立普妥或阿托伐他汀钙、 舒降之 ( 辛伐他汀 )、 可定 ( 罗苏伐他汀 ) 等 )、 β 阻滞 剂 ( 例如阿替洛尔 )、 络活喜 ( 苯磺酸氨氯地平 ) 和 ACE 抑制剂 ( 例如赖诺普利 )。
     在另外的方面， 本发明提供了组合， 其包含式 (I) 化合物以及一种或多种可用于 治疗高血压的化合物。这类化合物包括 ACE 抑制剂、 降脂药物如他汀类、 立普妥 ( 阿托伐他汀钙 )、 钙通道阻滞剂如络活喜 ( 苯磺酸氨氯地平 )。
     在另外的方面， 本发明提供了组合， 其包含式 (I) 化合物以及一种或多种选自贝 特类 (fibrates)、 β- 阻滞剂、 NEPI 抑制剂、 血管紧张素 -2 受体拮抗剂和血小板聚集抑制 剂的化合物。
     在另外的方面， 本发明提供了组合， 其包含式 (I) 化合物以及适于治疗炎性疾病、 包括类风湿性关节炎的化合物。这类化合物可以选自 TNF-α 抑制剂如抗 -TNF-α 单克隆 抗体 ( 例如类克、 CDP-870) 和 D2E7(HUMIRA) 及 TNF 受体免疫球蛋白融合分子 ( 例如依那 西普 )、 IL-1 抑制剂、 受体拮抗剂或可溶性 IL-1Rα( 例如 KINERET 或 ICE 抑制剂 )、 非甾体 抗炎药 (NSAIDS)、 吡罗昔康、 双氯芬酸、 萘普生、 氟比洛芬、 非诺洛芬、 酮洛芬、 布洛芬、 灭酸 酯类 (fenamates)、 甲芬那酸、 吲哚美辛、 舒林酸、 阿扎丙宗、 吡唑啉酮类、 保泰松、 阿司匹林、 COX-2 抑制剂 ( 例如西乐葆 ( 塞来考昔 )、 PREXIGE( 芦米考昔 ))、 金属蛋白酶抑制剂 ( 优选 MMP-13 选择性抑制剂 )、 p2x7 抑制剂、 α2α 抑制剂、 NEUROTIN、 普瑞巴林、 低剂量甲氨蝶呤、 来氟米特、 羟氯喹、 d- 青霉胺、 金诺芬或者胃肠道外或口服金。
     在另外的方面， 本发明提供了组合， 其包含式 (I) 化合物以及适于治疗骨关节炎 的化合物。这类化合物可以选自标准的非甾体抗炎药 ( 下文为 NSAIDs) 如吡罗昔康、 双氯 芬酸、 丙酸类如萘普生、 氟比洛芬、 非诺洛芬、 酮洛芬和布洛芬、 灭酸酯类如甲芬那酸、 吲哚 美辛、 舒林酸、 阿扎丙宗、 吡唑啉酮类如保泰松、 水杨酸类如阿司匹林、 COX-2 抑制剂如塞来 考昔、 伐地考昔、 芦米考昔和艾托考昔、 镇痛药以及关节内治疗剂如皮质类固醇及透明质酸 如海尔根和欣维可。 在另外的方面， 本发明提供了组合， 其包含式 (I) 化合物以及抗病毒剂和 / 或抗菌 化合物。所述抗病毒剂可以选自泛罗赛、 AZT、 阿昔洛韦和泛昔洛韦。所述抗菌化合物可以 选自 Valant。
     在另外的方面， 本发明提供了组合， 其包含式 (I) 化合物以及一种或多种选自如 下的物质 ： CNS 药物， 例如抗抑郁药 ( 舍曲林 )、 抗帕金森症药 ( 例如地普雷尼尔、 L- 多巴、 Requip、 普拉克索 ； MAOB 抑制剂 ( 例如司来吉兰 (selegine) 和雷沙吉兰 ) ； comP 抑制剂 ( 例 如托卡朋 ) ； A-2 抑制剂 ； 多巴胺重吸收抑制剂 ； NMDA 拮抗剂 ； 烟碱激动剂 ； 多巴胺激动剂 ； 和神经元的一氧化氮合酶抑制剂 )。
     在另外的方面， 本发明提供了组合， 其包含式 (I) 化合物以及一种或多种抗阿 尔茨海默病药物。所述抗阿尔茨海默病药物可以选自多奈哌齐、 他克林、 α2δ 抑制剂、 NEUROTIN、 普瑞巴林、 COX-2 抑制剂、 丙戊茶碱或美曲膦酯。
     在另外的方面， 本发明提供了组合， 其包含式 (I) 化合物以及抗骨质疏松症药物 和 / 或免疫抑制剂。所述骨质疏松症药物可以选自易维特 ( 盐酸雷洛昔芬 )、 屈洛昔芬、 拉 索昔芬或 Fosomax。所述免疫抑制剂可以选自 FK-506 和雷帕霉素。
     在优选实施方案的另一方面， 提供了药盒， 其包括一种或多种式 (I) 化合物和如 本文公开的组合伙伴。代表性药盒包括 PI3K 抑制剂化合物 ( 例如式 (I) 化合物 ) 以及包 装插页或其它标记， 包括通过施用 PI3K 抑制量的化合物来治疗细胞增殖性疾病的说明书。
     通常， 式 (I) 化合物将以治疗有效量、 通过对任何发挥类似功效的物质而言可接 受的施用方式来施用。式 (I) 化合物、 即活性成分的实际量将取决于多种因素， 例如所治疗 疾病的严重性、 个体的年龄和相对健康、 所用化合物的效能、 施用的途径和形式以及其它因
     素。药物可以一天施用一次以上， 优选一天施用一次或两次。所有这些因素都在主治医师 的技能之内。式 (I) 化合物的治疗有效量的范围可以在约 0.05 至约 50mg/ 公斤受者体重 /天； 优选约 0.1-25mg/kg/ 天， 更优选约 0.5 至 10mg/kg/ 天。因此， 对于施用于 70kg 的人 而言， 剂量范围将最优选为约 35-70mg/ 天。
     通常， 式 (I) 化合物将作为药物组合物、 通过任意一种以下途径施用 ： 口服、 全身 ( 例如透皮、 鼻内或通过栓剂 ) 或胃肠道外 ( 例如肌内、 静脉内或皮下 ) 施用。优选的施 用方式是使用方便的日剂量方案进行口服， 所述的日剂量方案可以根据病痛的程度进行调 整。组合物可以采取片剂、 丸剂、 胶囊剂、 半固体、 粉末、 缓释制剂、 溶液、 混悬液、 酏剂、 气雾 剂的形式或任意其它适当的组合物。另一种优选的施用式 I 化合物的方式是吸入。这是将 治疗剂直接传递到呼吸道的有效方法。
     制剂的选择取决于多种因素， 例如药物施用的方式和药物物质的生物利用度。对 于通过吸入传递而言， 化合物可以被配制成液体溶液、 混悬液、 气雾喷射剂或干粉， 并且可 以被装入适于施用的分配器中。有数种类型的药物吸入装置 - 喷雾器吸入器、 定量吸入器 (MDI) 和干粉吸入器 (DPI)。喷雾器装置可产生高速空气流， 使治疗剂 ( 以液体形式配制 ) 喷成薄雾， 其被带入患者的呼吸道。MDI 通常是用压缩气体包装的制剂。启动后， 该装置通 过压缩气体释放出定量的治疗剂， 由此提供施用指定量的物质的可靠方法。 DPI 可分配自由 流动的粉末形式的治疗剂， 这些治疗剂可以在通过该装置进行呼吸的过程中被分散到患者 的吸入气流中。为了获得自由流动的粉末， 治疗剂可与赋形剂如乳糖进行配制。定量的治 疗剂以胶囊形式贮存， 并且用每次启动进行分配。 本发明还涉及其中式 (I) 化合物的粒度在 10-1000nm、 优选 10-400nm 之间的制 剂。尤其对于显示出生物利用度差的药物， 根据可以通过增加表面积、 即减小粒度来提 高生物利用度的原理， 已经开发了这类药物制剂。例如， U.S.4,107,288 描述了具有大小 范围为 10 至 1,000nm 的颗粒的药物制剂， 其中活性物质被支持在交联的大分子基质上。 U.S.5,145,684 描述了药物制剂的制备， 其中在表面修饰剂的存在下药物物质被粉碎成纳 米粒 ( 平均粒度为 400nm)， 然后被分散在液体介质中， 得到显示出非常高的生物利用度的 药物制剂。这两篇文献均被包括在本文内作为参考。
     在另外的方面， 本发明提供了药物组合物， 其包含 ( 治疗有效量 ) 的式 (I) 化合物 以及至少一种可药用赋形剂。可接受的赋形剂是无毒的、 可帮助施用并且不会不利地影响 式 I 化合物的治疗益处。这类赋形剂可以是任意固体、 液体、 半固体， 或者对于气雾剂组合 物而言可以是本领域技术人员通常可得到的气体赋形剂。
     固体药物赋形剂包括淀粉、 纤维素、 滑石粉、 葡萄糖、 乳糖、 蔗糖、 明胶、 麦芽、 米、 面 粉、 白垩、 硅胶、 硬脂酸镁、 硬脂酸钠、 单硬脂酸甘油酯、 氯化钠、 脱脂奶粉等。
     液体和半固体赋形剂可以选自甘油、 丙二醇、 水、 乙醇和多种油类、 包括石油、 动 物、 植物或合成来源的那些、 例如花生油、 大豆油、 矿油、 芝麻油等。特别用于可注射溶液的 优选的液体载体包括水、 盐水、 葡萄糖水和二醇类。
     压缩气体可以用于分散气雾剂形式的式 (I) 化合物。适于该目的的惰性气体有氮 气、 二氧化碳等。其它适宜的药物赋形剂及其制剂在 E.W.Martin 编写的 《雷明顿药物科学》 (Remington′ s Pharmaceutical Sciences)( 马克 (Mack) 出版公司， 第 18 版， 1990) 中有 描述。
     制剂中化合物的量可以在本领域技术人员所采用的全部范围内改变。通常， 基于 重量百分数 ( 重量％ ) 计算， 制剂将含有约 0.01-99.99 重量％的式 (I) 化合物 ( 基于总制 剂计算 )， 而剩余物质为一种或多种适宜的药物赋形剂。优选化合物以约 1-80 重量％的水 平存在。
     本发明还涉及药物组合物， 其包含 ( 即含有或包括 ) 至少一种式 (I) 化合物以及 至少一种可药用赋形剂。
     包含游离形式或可药用盐形式的式 (I) 化合物以及至少一种可药用赋形剂 ( 例如 载体和 / 或稀释剂 ) 的药物组合物可以按照常规方式、 通过将组分混合来制备。
     包含游离形式或可药用盐形式的式 (I) 化合物并且还包含组合伙伴 ( 作为一个剂 量单位形式或作为成套药盒 ) 以及至少一种可药用的载体和 / 或稀释剂的组合的药物组合 物可以按照常规方式、 通过将可药用的载体和 / 或稀释剂与所述的活性成分混合来制备。
     因此， 在另外的方面， 本发明提供了 ：
     ■组合的药物组合物， 例如用于本文描述的任意方法， 其包含游离形式或可药用 盐形式的式 (I) 化合物以及可药用的稀释剂和 / 或载体。
     ■组合的药物组合物， 其包含作为活性成分的游离形式或可药用盐形式的式 (I) 化合物 ； 一种或多种可药用的载体物质和 / 或稀释剂以及任选的一种或多种另外的药物物 质。这类组合的药物组合物可以是一种剂量单位形式或作为成套药盒。
     ■组合的药物组合物， 其包含治疗有效量的游离形式或可药用盐形式的式 (I) 化 合物以及第二种药物物质， 它们可同时或先后施用。
     ■如上定义的方法， 该方法包括共同施用， 例如同时或先后施用治疗有效的无毒 量的式 (I) 化合物或其可药用盐以及至少第二种药物物质、 例如如上所示的第二种药物物 质。
     ■药物组合产品， 例如药盒， 其包含 a) 第一种物质， 它是游离形式或可药用盐形 式的如本文公开的式 (I) 化合物， 和 b) 至少一种共用药物、 例如如上所示的共用药物 ； 其中 这类药盒可以包含其施用说明书。
     以下的式 (I) 化合物的实施例说明了本发明而非限制其范围。制备这类化合物的 方法在下文有描述。
     实 施 例 1： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 叔 丁 基 - 吡 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    在氩气中将 Et3N(1.54mL， 11.1mmol， 3 当量 ) 加入咪唑 -1- 甲酸 [5-(2- 叔丁基 - 吡 啶 -4- 基 )-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 ]- 酰 胺 ( 步 骤 1.1)(1.26g， 3.7mmol) 和 L- 脯 氨 酰 胺 (0.548g， 4.8mmol， 1.3 当量 ) 在 DMF(25mL) 的溶液中。 将反应混合物在室温下搅拌 14 小时， 通过加入饱和 NaHCO3 溶液猝灭， 并用 EtOAc 萃取。将有机相用饱和 NaHCO3 溶液洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱 (DCM/MeOH， 1 ∶ 0 → 94 ∶ 6) 纯化， 然后用 + Et2O 研磨， 得到 1.22g 标题化合物， 为灰白色固体 ： ESI-MS ： 388.1[M+H] ； tR ＝ 2.35min( 系 1 统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.36(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。 H NMR(400MHz， DMSO-d6)δ(ppm) ： 1.32(s， 9H)1.75-1.95(m ， 3H)1.97-2.13(m ， 1H)2.39(s ， 3H)3.38-3.50(m ， 1H)3.52-3.65(m. ， 1H)4.10-4.40(m， 1H)6.94(b r.s.， 1H)7.22(d， 1H)7.30-7.48(m， 2H)8.49(d， 1H)10.87(b r.s.， 1H)
     步骤 1.1 ： 咪唑 -1- 甲酸 [5-(2- 叔丁基 - 吡啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰 胺
    
    将 5-(2- 叔丁基 - 吡啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基胺 ( 步骤 1.2)(1g， 4.05mmol) 和 1， 1’ - 羰 基 二 咪 唑 (0.984g， 6.07mmol， 1.5 当 量 ) 在 DCM(50mL) 中 的 混 合 物 回 流 搅 拌 4 小时， 并冷却。经过滤收集所得沉淀， 得到 1.26g 标题化合物， 为白色固体 ： ESI-MS ： 340.2[M-H] ； tR ＝ 2.85min( 系统 1)。
     步骤 1.2 ： 5-(2- 叔丁基 - 吡啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基胺将 N-[5-(2- 叔丁基 - 吡啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 乙酰胺 ( 步骤 1.3)(2g， 7mmol)、 6N 的 HCl 水溶液 (10mL) 和 EtOH(50mL) 的混合物在 85℃下搅拌 2 小时， 冷却， 通过 加入饱和 NaHCO3 溶液猝灭并用 DCM/MeOH(9 ∶ 1， v/v) 萃取。将有机相用饱和 NaHCO3 溶液 洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。 将残余物经硅胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH， 1 ∶ 0 → 96 ∶ 4) + 得 到 1.21g 标 题 化 合 物， 为黄色固体 ： ESI-MS ： 248.1[M+H] ； TLC ： Rf ＝ 0.36(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 1.3 ： N-[5-(2- 叔丁基 - 吡啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 乙酰胺
    
    在 氩 气 中 将 2- 乙 酰 氨 基 -4- 甲 基 噻 唑 (1.2g， 7.7mmol， 1.1 当 量 )、 碳酸铯 四氟硼酸盐 (0.406g， 1.4mmol， 0.2 当量 )、 乙酸钯(4.55g， 14mmol， 2 当量 )、 三叔丁基(II)(0.15g， 0.7mmol， 0.1 当量 ) 和 4- 溴 -2- 叔丁基 - 吡啶 ( 步骤 1.4)(1.5g， 7mmol) 在 DMF(50mL) 中的混合物在 90℃下搅拌 1.5 小时， 冷却， 通过加入饱和 NaHCO3 溶液猝灭， 并经 硅藻土垫过滤。将滤液用 EtOAc 萃取。将有机相用饱和 NaHCO3 溶液洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过 滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH， 1 ∶ 0 → 97 ∶ 3) 得到 2.02g 标题化合 + 物， 为黄色固体 ： ESI-MS ： 290.1[M+H] ； TLC ： Rf ＝ 0.35(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 1.4 ： 4- 溴 -2- 叔丁基 - 吡啶
    将 2- 叔丁基 -1H- 吡啶 -4- 酮 ( 步骤 1.5)(4.25g， 28mmol) 和 POBr3(8.88g， 31mmol， 1.1 当量 ) 的混合物加热至 120℃， 搅拌 15 分钟， 冷却， 通过加入饱和 NaHCO3 溶液猝灭， 并用 DCM/MeOH(9 ∶ 1， v/v) 萃取。 将有机相用饱和 NaHCO3 溶液洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。 将残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 95 ∶ 5) 得到 5.18g 标题化合物， 为黄色油状物 ： + ESI-MS ： 214.0/216.0[M+H] ； tR ＝ 2.49min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.35(Hex/EtOAc， 1 ∶ 1)。
     步骤 1.5 ： 2- 叔丁基 -1H- 吡啶 -4- 酮
    
    将 2- 叔丁基 - 吡喃 -4- 酮 ( 步骤 1.6)(5.74g， 37.7mmol) 和 30％的氢氧化铵水溶 液 (100mL) 回流下搅拌 1 小时， 冷却并浓缩。 将残余物用 MeOH(200mL) 研磨并过滤。 浓缩滤 aq 液并将残余物经硅胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH/NH3 ， 94 ∶ 5 ∶ 1 → 92 ∶ 7 ∶ 1) 得到 4.46g 标 + 题化合物， 为黄色固体 ： ESI-MS ： 152.0[M+H] ； tR ＝ 1.45min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.11(DCM/ MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 1.6 ： 2- 叔丁基 - 吡喃 -4- 酮
    
    将 5- 羟基 -1- 甲氧基 -6， 6- 二甲基 - 庚 -1， 4- 二烯 -3- 酮 ( 步骤 1.7)(6.8g， 36.9mmol) 和 TFA(5.65mL， 74mmol， 2 当量 ) 在苯 (250mL) 中的混合物在室温下搅拌 14 小时 并浓缩。 残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 1 ∶ 0 → 75 ∶ 25)， 得到 5.74g 标题化合物， + 为黄色油状物 ： ESI-MS ： 153.1[M+H] ； tR ＝ 3.21min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.22(Hex/EtOAc，
    1 ∶ 1)。
     步骤 1.7 ： 5- 羟基 -1- 甲氧基 -6， 6- 二甲基 - 庚 -1， 4- 二烯 -3- 酮
    将 LiHMDS(1M 的 THF 溶 液， 100mL， 2 当 量 ) 逐 滴 加 入 冷 却 的 (-78 ℃ )4- 甲 氧 基 -3- 丁烯 -2- 酮 (10mL， 100mmol， 2 当量 ) 在 THF(400mL) 的溶液中。在 -78℃搅拌 30 分 钟后， 加入特戊酰氯 (6.12mL， 50mmol) 在 THF(100mL) 中的溶液。将所得混合物历经 2 小时 加温至室温， 并通过加入饱和 NH4Cl 溶液猝灭。真空除去 THF。将该浓缩的混合物用 Et2O 萃取。有机相用盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/ EtOAc， 1 ∶ 0 → 85 ∶ 15) 得到 6.83g 标题化合物， 为黄色油状物 ： ESI-MS ： 185.1[M+H]+ ； TLC ： Rf ＝ 0.87(Hex/EtOAc， 1 ∶ 1)。
     实 施 例 2： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 环 丙 基 - 吡 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    按照与实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。 在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 4 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 85℃搅拌 2 小时。 在步骤 1.3 中， 使用 4- 氯 -2-(1- 甲基 - 环丙基 )- 吡啶 ( 步骤 2.1)， 并将反应混合物在 + 150℃下搅拌 2 小时。 标题化合物 ： ESI-MS ： 372.1[M+H] ； TLC ： Rf ＝ 0.35(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 2.1 ： 4- 氯 -2- 环丙基 - 吡啶
    按照文献 [Comins， D.L. ； Mantlo， N.B.， Journal of Organic Chemistry， (1985)， 50， 4410-4411] 中所述方法的修改方法制备标题化合物。
     将环丙基溴化镁 (0.5M 的 THF 溶液， 100mL， 50mmol， 2.2 当量 ) 一次加入冷却的 (-78℃ )4- 氯吡啶盐酸化物 (3.4g， 22mmol) 在 THF(68mL) 的溶液中。在 -78 ℃搅拌 10 分 钟后， 逐滴加入氯甲酸苯基酯 (2.76mL， 22mmol)。将反应混合物在 -78℃搅拌 15 分钟， 加温 至室温， 通过加入 20％的 NH4Cl 水溶液猝灭， 并用 Et2O 萃取 (2x100mL)。将有机相用饱和
    NaHCO3 溶液 (50mL) 洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。 向溶于甲苯 (100mL) 的残余物中加入 邻 - 氯醌 (6g， 24.2mmol， 1.1 当量 ) 在冰醋酸 (50mL) 中的溶液。将反应混合物在室温下搅 拌 14 小时， 冷却至 0℃， 通过加入 10％ NaOH 水溶液碱化， 并经硅胶垫过滤。 将滤液中的有机 层用 H2O(20mL) 洗涤， 并用 10％的 HCl 水溶液萃取 (3x25mL)。通过加入 20％的 NaOH 水溶 液将合并的酸层碱化， 并用 DCM 萃取 (3x25mL)。 将有机相用 H2O(50mL) 洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。残余物经硅胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH， 1 ∶ 0 → 99 ∶ 1) 得到 0.951g 标题化 + 合物， 为无色油状物 ： ESI-MS ： 154.1[M+H] ； tR ＝ 1.41min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.85(DCM/ MeOH， 9 ∶ 1)。
     实施例3： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-({5-[2-(2- 氟 - 苯 基 )- 吡 啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    按 照 实 施 例 1 中 所 述 类 似 的 方 法 制 备 标 题 化 合 物， 但 在 步 骤 1.3 中 使 用 4- 氯 -2-(2- 氟 - 苯基 )- 吡啶 ( 步骤 3.1)， 并在 150℃下搅拌对应的混合物 2 小时 ： ESI-MS ： + 426.1[M+H] ； tR ＝ 2.60min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.40(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 3.1 ： 4- 氯 -2-(2- 氟 - 苯基 )- 吡啶
    在 105℃下在氩气中将 2- 氟苯基硼酸 (141mg， 1mmol， 1.2 当量 ) 在 EtOH(1mL) 中 的混合物加入 4- 氯 -2- 碘 - 吡啶 [Choppin， S. ； Gros， P. ； Fort， Y.， European Journal of Organic Chemistry(2001)， (3)， 603-606](200mg， 0.84mmol)， PdCl2(dPPf)(18mg， 0.025mmol， 0.03 当量 ) 和 Na2CO3(2M 的 H2O 溶液， 1.68mL， 3.36mmol， 4 当量 ) 在甲苯 (2mL) 的混合物中。将反应混合物在 105℃下搅拌 1 小时， 冷却至室温， 通过加入饱和 NaHCO3 溶液 猝灭， 并用 EtOAc 萃取。将有机相用饱和 NaHCO3 溶液洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将 残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 1 ∶ 0 → 97 ∶ 3) 得到 127mg 标题化合物， 为白色固 + 体： ESI-MS ： 208.1[M+H] ； tR ＝ 4.66min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.27(Hex/EtOAc， 9 ∶ 1)。
     实 施 例 4： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 环 丁 基 - 吡 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 4 小时， 用 EtOAc 和 H2O 稀释， 并用 EtOAc 萃取。干燥并浓 缩有机相后， 将残余物在 DCM 中研磨进行纯化。在步骤 1.3 中， 将反应混合物在 120℃下搅 拌 2 小时， 冷却， 用 EtOAc 和 H2O 稀释， 经硅藻土垫过滤， 并用 EtOAc 萃取。干燥并浓缩有机 相后， 将残余物在 Et2O 中研磨进行纯化。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 80℃下搅拌 1 小 时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.7 中， 将 4- 甲氧基 -3- 丁烯 -2- 酮在 THF 中的溶液 加入冷却的 (-78℃ )LiHMDS 在 THF 中的溶液。30 分钟后， 加入环丁基甲酰氯的 THF 溶液， 并将反应混合物历经 18 小时达到室温。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 386.1[M+H]+ ； TLC ： Rf ＝ 0.11(DCM/MeOH， 95 ∶ 5)。
     实施例 5 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环丙 基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在步骤 1.1中， 将反应混合物在回流下搅拌 14 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 85℃下搅拌 1 小 时。在步骤 1.3 中， 将反应混合物在 120 ℃下搅拌 3 小时。在步骤 1.5 中， 将反应混合物 65-70℃下搅拌 1 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.7 中， 使用 1- 甲基 - 环丙烷甲 酰氯 ( 步骤 5.1)。
     标 题 化 合 物： ESI-MS ： 386.1[M+H]+ ； TLC ： Rf ＝ 0.40(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。 1 H NMR(400MHz ，DMSO-d6) δ (ppm) ： 0.71-0.87(m ， 2H)1.11-1.26(m ， 2H)1.47(s ， 3H)1.74-1.96(m ， 3H)2.00-2.15(m ， 1H)2.39(s ， 3H)3.35-3.52(m ， 1H)3.52-3.73(m ， 1H)4.10-4.40(m ， 1H)6.93(br.s. ， 1H)7.15(dd ， 1H)7.27(s ， 1H)7.35(s ， 1H)8.40(d ， 1H)10.99(b r.s.， 1H)
     步骤 5.1 ： 1- 甲基 - 环丙烷甲酰氯
    将 1- 甲基 - 环丙烷甲酸 (10g， 100mmol) 和草酰氯 (10.49ml， 120mmol， 1.2 当量 ) 在 CHCl3(80ml) 中的混合物在 70℃下搅拌 4 小时。 浓缩反应混合物得到 11.8g 标题化合物， 为黄色油状物， 其不经进一步纯化直接使用。
     实施例 6 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环丁 基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物通过加入 EtOAc 和 H2O 稀释进行猝灭， 并用 EtOAc 萃取。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 100℃下搅拌 2 小时。在步骤 1.3 中， 将反应混合物在 100℃下搅拌 3 小 时， 用 EtOAc/H2O 稀释， 并用 EtOAc 萃取。干燥并浓缩有机相后， 将残余物经硅胶柱色谱纯 化 (Hex/EtOAc， 1 ∶ 4)。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 80℃下搅拌 2 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.7 中， 将 4- 甲氧基 -3- 丁烯 -2- 酮 (50mmol) 在 THF(100mL) 中的溶液 加入冷却的 (-78℃ )LiHMDS(1M 的 THF 溶液， 100mL) 在 THF(200mL) 的溶液中。30 分钟后， 加入 1- 甲基 - 环丁烷氯化物 ( 步骤 6.1)， 并将反应混合物历经 18 小时达到室温。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 400.1[M+H]+ ； TLC ： Rf ＝ 0.06(DCM/MeOH/NH3aq， 94 ∶ 5 ∶ 1)。
     步骤 6.1 ： 1- 甲基 - 环丁烷甲酰氯
    
    按照如步骤 5.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 1- 甲基 - 环丁烷甲酸 [Cowling， S.J. ； Goodby， J.W.， Chemical Communications， (2006)， (39)， 4107-4109]。实施例 7 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[5-(2- 叔丁基 - 吡啶 -4- 基 )- 噻 唑 -2- 基 ]- 酰胺 }按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 16 小时， 通过加入 EtOAc 和 H2O 稀释进行猝灭， 并用 EtOAc 萃 取。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 2 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 100℃下搅拌 1 小时。在步骤 1.3 下， 使用 N- 噻唑 -2- 基 - 乙酰胺。将反应混合物在 120℃ 搅拌 2 小时， 用 EtOAc/H2O 稀释， 并用 EtOAc 萃取。干燥并浓缩有机相后， 将残余物经硅胶 柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 1 ∶ 1)， 然后在 Et2O 中研磨。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 374.1[M+H]+ ； tR ＝ 2.16min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.10(DCM/ aq MeOH/NH3 ， 94 ∶ 5 ∶ 1)。
     实 施 例 8： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 异 丙 基 - 吡 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 16 小时， 通过加入 EtOAc 和 H2O 稀释进行猝灭， 并用 EtOAc 萃取。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 100℃搅拌 2 小时。在步骤 1.3 中， 使用 4- 氯 -2- 异 丙基 - 吡啶 ( 步骤 8.1)。 将反应混合物在 150℃搅拌 3 小时， 用 EtOAc/H2O 稀释， 并用 EtOAc 萃取。干燥并浓缩有机相后， 将残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 25 ∶ 75)。 +
     标题化合物 ： ESI-MS ： 374.1[M+H] ； tR ＝ 1.99min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.10(DCM/ aq MeOH/NH3 ， 94 ∶ 5 ∶ 1)。
     步骤 8.1 ： 4- 氯 -2- 异丙基 - 吡啶
    
    按照步骤 2.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用异丙基氯化镁 (2M 在 THF + 中的溶液 ) ： ESI-MS ： 156.0[M+H] ； TLC ： Rf ＝ 0.32(DCM)。
     实施例 9 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[5-(2- 环丁基 - 吡啶 -4- 基 )- 噻 唑 -2- 基 ]- 酰胺 }按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 16 小时， 用 DCM/H2O 稀释， 并用 DCM 萃取。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 100 ℃下搅拌 2 小时， 且粗产物不再纯化。在步骤 1.3 中， 使用 N- 噻 唑 -2- 基 - 乙酰胺。将反应混合物在 120 ℃下搅拌 3 小时， 通过加入 EtOAc 和 H2O 稀释进 行猝灭， 并用 EtOAc 萃取。干燥并浓缩有机相后， 将残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 2 ∶ 3)。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 80℃下搅拌 1 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在 步骤 1.7 中， 将 4- 甲氧基 -3- 丁烯 -2- 酮 (50mmol) 在 THF(100mL) 中的溶液加入冷却的 (-78℃ )LiHMDS(1M 的 THF 溶液， 100mL) 在 THF(200mL) 的溶液中。30 分钟后， 加入环丁基 甲酰氯， 并将反应混合物历经 18 小时达到室温。
    标 题 化 合 物： ESI-MS ： 372.1[M+H] + ； TLC ： Rf ＝ 0.13(DCM/MeOH/NH3aq， 91.5 ∶ 7.5 ∶ 1)。
     实施例 10 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(1- 甲基 - 环丙基 )- 吡 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 14 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 85℃下搅拌 1 小 时。在步骤 1.3 中， 使用 N- 噻唑 -2- 基 - 乙酰胺， 并将反应混合物在 120℃下搅拌 4 小时。 在步骤 1.5 中， 不再进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.7 中， 使用 1- 甲基 - 环丙烷甲酰氯 ( 步骤 5.1)。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 372.1[M+H]+ ； TLC ： Rf ＝ 0.43(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。
     实 施 例 11 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-({5-[2-(1- 三 氟 甲 基 - 环 丙 基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 14 小时。在步骤 1.3 中， 使用 N- 噻唑 -2- 基 - 乙酰胺。 将反应混合物在 120℃下搅拌 2 小时。在步骤 1.4 中， 使用 1， 2- 二氯乙烷 ( 每 mmol 的吡 啶 -4- 酮用 2.55mL) 作为溶剂。将反应混合物在 83℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 65℃下搅拌 1 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步 骤 1.7 中， 使用 1- 三氟甲基 - 环丙烷甲酰氯 ( 步骤 11.1)。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 426.0[M+H]+ ； tR ＝ 2.35min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.25(DCM/ MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 11.1 ： 1- 三氟甲基 - 环丙烷甲酰氯
    
    按照步骤 5.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 1- 三氟甲基 - 环丙烷甲酸。
    
    实施例 12 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲 基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 5 小时。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 14 小 时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 85℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步 骤 1.3 中， 使用 N- 噻唑 -2- 基 - 乙酰胺。将反应混合物在 120℃下搅拌 2.5 小时。在步骤 1.4 中， 将反应混合物在 83℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.5 中， 将 反应混合物在 65℃下搅拌 1 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 粗产物不再纯 化。在步骤 1.7 中， 使用 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酰氯 ( 步骤 12.1)。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 428.0[M+H]+ ； tR ＝ 2.75min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.21(DCM/ MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 12.1 ： 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酰氯
    
    按照步骤 5.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲 基 - 丙酸。
     实 施 例 13 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-({5-[2-(1- 三 氟 甲 基 - 环 丁 基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 18 小时， 通过用 DCM/H2O 稀释猝灭， 并用 DCM 萃取。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 1 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 100℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。在步骤 1.3 中， 使用 N- 噻唑 -2- 基 - 乙酰胺。将反应混合 物在 120℃下搅拌 5 小时， 通过用 EtOAc/H2O 稀释猝灭， 并用 EtOAc 萃取。在步骤 1.4 中， 使 用 1， 2- 二氯乙烷 ( 每 mmol 的吡啶 -4- 酮用 2.26mL) 作为溶剂。将反应混合物在回流下搅 拌 1 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在室温下搅拌 1 小时， 不 进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 将反应混合物在室温下搅拌 18 小时。在步骤 1.7 中， 将 4- 甲氧基 -3- 丁烯 -2- 酮在 THF 中的溶液加入冷却的 (-78℃ )LiHMDS 在 THF 的溶液 中。30 分钟后， 加入 1- 三氟甲基 - 环丁烷甲酰氯 ( 步骤 13.1) 在 THF 中的溶液。将反应混 合物历经 18 小时达到室温， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 440.0[M+H]+ ； tR ＝ 2.68min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.08(DCM/ aq MeOH/NH3 ， 91.5 ∶ 7.5 ∶ 1)。
     步骤 13.1 ： 1- 三氟甲基 - 环丁烷甲酰氯
    
    按照步骤 5.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 1- 三氟甲基 - 环丁烷甲 酸， 并将反应混合物在回流下搅拌 2 小时。
     实施例 14 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2-(1- 三氟甲基 - 环 丙基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 14 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 85℃下搅拌 1 小 时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.3 中， 将反应混合物在 120℃下搅拌 2 小时。在步 骤 1.4 中， 使用 1， 2- 二氯乙烷 ( 每 mmol 的吡啶 -4- 酮用 2.55mL) 作为溶剂。将反应混合 物在 83℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 65℃ 下搅拌 1 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.7 中， 使用 1- 三氟甲基 - 环丙烷甲酰氯 ( 步骤 11.1)。
     标 题 化 合 物： ESI-MS ： 440.0[M+H]+ ； tR ＝ 2.65min( 系 统 1) ； TLC ： Rf ＝ 1 0.36(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。 H NMR(400MHz， DMSO-d6)δ(ppm) ： 1.41(s， 4H)1.70-1.90(m， 3H)2.00-2.10(m ， 1H)2.40(s ， 3H)3.36-3.52(m ， 1H)3.52-3.65(m ， 1H)4.10-4.40(m ， 1H)6.95(b r.s.， 1H)7.37(d， 2H)7.47(s， 1H)8.52(d， 1H)10.94(b r.s.， 1H)
     实施例 15 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 14 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 85℃下搅拌 1 小 时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。 在步骤 1.3 中， 将反应混合物在 120℃下搅拌 2.5 小时。 在步 骤 1.4 中， 将反应混合物在 83℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 65℃下搅拌 1 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 粗产物不再 纯化。在步骤 1.7 中， 使用 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酰氯 ( 步骤 12.1)。
     标 题 化 合 物： ESI-MS ： 442.0[M+H]+ ； tR ＝ 3.02min( 系 统 1) ； TLC ： Rf ＝ 1 0.35(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。 H NMR(400MHz， DMSO-d6)δ(ppm) ： 1.60(s， 6H)1.70-1.95(m， 3H)1.99-2.16(m ， 1H)2.40(s ， 3H)3.38-3.51(m ， 1H)3.51-3.69(m ， 1H)4.10-4.40(m ， 1H)6.95(b r.s.， 1H)7.39(d， 2H)7.53(s， 1H)8.58(d， 1H)10.93(br.s.， 1H)
     在一项可选择的方法中， 按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进 行以下修改 ： 使用 N， N- 二甲基乙酰胺代替 DMF， 并将该混合物在 65℃下搅拌 2 小时。在步 骤 1.1 中， 使用氯甲酸苯基酯 ( 缓慢加入 ) 代替 1， 1’ - 羰基二咪唑， 并将该反应在 THF 中在 N， N- 二乙基 - 异丙基胺的存在下于室温下进行 (1.5h)。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在搅 拌下加热 5 小时 ( 回流 )， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。 在步骤 1.3 中， 将反应混合物在 100℃ 下搅拌 2 小时。在步骤 1.4 中， 该反应在甲苯中进行， 使用 1.1 当量的 POBr3 和 1.1 当量的 三丙基胺， 并将该混合物在 80℃下搅拌 2 小时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 65℃下搅拌 1 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 使用甲苯代 替苯， 且粗产物不再纯化。在步骤 1.7 中， 使用 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酰氯 ( 步骤 12.1)。
     实施例 16 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2-(1- 三氟甲基 - 环 丁基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 72 小时， 通过用 DCM/H2O 稀释猝灭， 并用 DCM 萃取。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 1 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 100℃下搅拌 2 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。在步骤 1.3 中， 将反应混合物在 120℃下搅拌 6 小时， 通过 加入 EtOAc 和 H2O 稀释进行猝灭， 经硅藻土垫过滤并用 EtOAc 萃取。在步骤 1.4 中， 使用 1， 2- 二氯乙烷 ( 每 mmol 的吡啶 -4- 酮用 2.26mL) 作为溶剂。将反应混合物在回流下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在室温下搅拌 1 小时， 不进行 在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 将反应混合物在室温下搅拌 18 小时。在步骤 1.7 中， 将 4- 甲氧基 -3- 丁烯 -2- 酮在 THF 中的溶液加入冷却的 (-78℃ )LiHMDS 在 THF 的溶液中。30 分钟后， 加入 1- 三氟甲基 - 环丁烷甲酰氯 ( 步骤 13.1) 的 THF 溶液。将反应混合物历经 18 小时达到室温， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 454.1[M+H]+ ； tR ＝ 2.90min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.22(DCM/ aq MeOH/NH3 ， 91.5 ∶ 7.5 ∶ 1)。
     实施例 17 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(1- 甲基 - 环丁基 )- 吡 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 24 小时， 通过加入 EtOAc 和 H2O 稀释进行猝灭， 并用 EtOAc 萃取。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 100℃下搅拌 2 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。在步 骤 1.3 中， 使用 N- 噻唑 -2- 基 - 乙酰胺。将反应混合物在 100℃下搅拌 3 小时， 用 EtOAc/ H2O 稀释， 并用 EtOAc 萃取。 干燥并浓缩有机相后， 将残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 25 ∶ 75)。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 80℃下搅拌 2 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。 在步骤 1.7 中， 将 4- 甲氧基 -3- 丁烯 -2- 酮在 THF 中的溶液加入冷却的 (-78℃ )LiHMDS 在 THF 的溶液中。30 分钟后， 加入 1- 甲基 - 环丁烷氯化物 ( 步骤 6.1) 在 THF 中的溶液， 并将 反应混合物历经 18 小时达到室温。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 386.1[M+H]+ ； tR ＝ 2.32min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.05(DCM/ aq MeOH/NH3 ， 94 ∶ 5 ∶ 1)。
     实施例 18 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(1- 氰基 - 环丙基 )- 吡 啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 16 小时， 通过加入 EtOAc 和 H2O 稀释进行猝灭， 并用 EtOAc 萃取。在步骤 1.1 中， 使用 1-[4-(2- 氨基 -4- 甲基 - 噻唑 -5- 基 )- 吡啶 -2- 基 ]- 环丙烷 甲腈 ( 步骤 18.1)， 并将反应混合物在回流下搅拌 2 小时。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 397.0[M+H]+ ； tR ＝ 2.90min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.08(DCM/ 1 aq 94 ∶ 5 ∶ 1)。 H NMR(400MHz， DMSO-d6)δ(ppm) ： 1.69-1.93(m， 7H)2.00-2.20(m， MeOH/NH3 ， 1H)2.42(s ， 3H)3.38-3.50(m ， 1H)3.50-3.65(m ， 1H)4.10-4.40(m ， 1H)6.94(b r.s. ， 1H)7.34(dd， 1H)7.37(b r.s.， 1H)7.47(s， 1H)8.47(d， 1H)
     步骤 18.1 ： 1-[4-(2- 氨基 -4- 甲基 - 噻唑 -5- 基 )- 吡啶 -2- 基 ]- 环丙烷甲腈
    
    将 {5-[2-(1- 氰 基 - 环 丙 基 )- 吡 啶 -4- 基 ]-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 }- 氨 基 甲 酸叔丁基酯 ( 步骤 18.2)(295mg)、 DCM(4mL) 和 TFA(1mL) 的混合物在室温下搅拌 2 小时， 并随后浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH/NH3aq， 94 ∶ 5 ∶ 1) 得到 182mg 标题 + 化合物 ： ESI-MS ： 257.1[M+H] ； tR ＝ 2.54min( 系 统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.30((DCM/MeOH/NH3aq， 94 ∶ 5 ∶ 1)。
    
    
    步骤 18.2 ： {5-[2-(1- 氰基 - 环丙基 )- 吡啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 氨 基甲酸叔丁基酯按 照 步 骤 1.3 中 所 述 类 似 的 方 法 制 备 标 题 化 合 物， 但 使 用 1-(4- 溴 - 吡 啶 -2- 基 )- 环丙烷甲腈 ( 步骤 18.3) 和 (4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 )- 氨基甲酸叔丁基酯 ( 步 骤 18.4)。将反应混合物在 100℃下搅拌 2 小时， 通过加入 EtOAc 和 H2O 稀释进行猝灭， 并用
     EtOAc 萃取。粗产物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 1 ∶ 1)， 得到 122mg 标题化合物， 为白 + 色固体 ： ESI-MS ： 357.1[M+H] ； tR ＝ 4.86min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.29(Hex/EtOAc， 1 ∶ 1)。
     步骤 18.3 ： 1-(4- 溴 - 吡啶 -2- 基 )- 环丙烷甲腈
    将 LiHMDS(1M 甲 苯 溶 液， 17.6mL， 17.6mmol， 3.1 当 量 ) 逐 滴 加 入 冷 却 的 (-5℃ )4- 溴 -2- 氟 - 吡啶 [Marsais， F. 等人， Journal of Organic Chemistry， (1992)， 57， 565-573](1g， 5.7mmol)、 环丙烷甲腈 (1.25mL， 17mmol， 3 当量 )、 4 分子筛和甲苯 (20mL)的混合物中。 将反应混合物加温至室温， 搅拌 16 小时， 倒入 H2O 中并过滤。 将滤液用 EtOAc/ H2O 稀释并用 EtOAc 萃取。有机相用 H2O 和盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将残余 物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 9 ∶ 1)， 得到 620mg 标题化合物， 为白色固体 ： ESI-MS ： + 223.1/225.1[M+H] ； tR ＝ 4.22min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.25(Hex/EtOAc， 9 ∶ 1)。
     步骤 18.4 ： (4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 )- 氨基甲酸叔丁基酯
    将二碳酸二叔丁基酯 (21g， 96.5mmol， 1.1 当量 ) 在 t-BuOH(50mL) 中的溶液加入 4- 甲基 -2- 氨基噻唑 (10g， 87.7mmol) 和 DMAP(1.1g， 8.8mmol， 0.1 当量 ) 在 t-BuOH(50mL) 的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌 72 小时并浓缩。将残余物用 EtOAc/H2O 稀释并用 EtOAc 萃取。有机相用 H2O 和盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色 谱纯化 (DCM/MeOH， 98 ∶ 2)， 得到 15.2g 标题化合物， 为白色固体 ： ESI-MS ： 215.1[M+H]+ ； tR ＝ 3.43min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.30(DCM/MeOH， 98 ∶ 2)。
     实施例 19 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(1- 氰基 - 环丁基 )- 吡 啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 6 小时。在步骤 1.1 中， 使用 1-[4-(2- 氨基 -4- 甲基 - 噻 唑 -5- 基 )- 吡啶 -2- 基 ]- 环丁烷甲腈 ( 步骤 19.1)， 并将反应混合物在回流下搅拌 3 小 时。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 411.1[M+H]+ ； TLC ： Rf ＝ 0.36(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。 步骤 19.1 ： 1-[4-(2- 氨基 -4- 甲基 - 噻唑 -5- 基 )- 吡啶 -2- 基 ]- 环丁烷甲腈将 {5-[2-(1- 氰 基 - 环 丁 基 )- 吡 啶 -4- 基 ]-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 }- 氨 基 甲 酸叔丁基酯 ( 步骤 19.2)(300mg)、 DCM(5mL) 和 TFA(1mL) 的混合物在室温下搅拌 4 小时， 通过加入饱和 NaHCO3 溶液猝灭 (50mL)， 并用 DCM 萃取 (3x75mL)。有机相用饱和 NaHCO3 溶 液 洗 涤 (2x50mL)， 干 燥 (Na2SO4)， 过 滤 并 浓 缩。 将 残 余 物 经 硅 胶 柱 色 谱 纯 化 (DCM/ MeOH， 1 ∶ 0 → 96 ∶ 4) 得到 181mg 标题化合物， 为黄色固体 ： ESI-MS ： 271.1[M+H]+ ； tR ＝ 2.48min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.45(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 19.2 ： {5-[2-(1- 氰基 - 环丁基 )- 吡啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 氨 基甲酸叔丁基酯
    
    按 照 步 骤 1.3 中 所 述 类 似 的 方 法 制 备 标 题 化 合 物， 但 使 用 1-(4- 溴 - 吡 啶 -2- 基 )- 环丁烷甲腈 ( 步骤 19.3) 和 (4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 )- 氨基甲酸叔丁基酯 ( 步 骤 18.4)。将反应混合物在 100℃下搅拌 3 小时。标题化合物 ： ESI-MS ： 371.1[M+H]+ ； tR ＝ 4.86min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.66(Hex/EtOAc， 1 ∶ 1)。
     步骤 19.3 ： 1-(4- 溴 - 吡啶 -2- 基 )- 环丁烷甲腈
    
    将 LiHMDS(1M 甲 苯 溶 液， 17.7mL， 17.7mmol， 3.1 当 量 ) 逐 滴 加 入 冷 却 的 (-5℃ )4- 溴 -2- 氟 - 吡啶 [Marsais， F. 等人， Journal of Organic Chemistry， (1992)， 57， 565-573](1g， 5.7mmol) 和环丁烷甲腈 (1.39g， 17.1mmol， 3 当量 ) 在甲苯中的溶液 (20mL)。 将反应混合物加温至室温， 搅拌 5 小时， 通过加入饱和 NaHCO3 溶液猝灭 (50mL)， 并经硅藻 土垫过滤。将滤液用 EtOAc 萃取 (3x75mL)。有机相用饱和 NaHCO3 溶液洗涤 (2x50mL)， 干 燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 1 ∶ 0 → 95 ∶ 5) 得 + 到 933mg 标题化合物， 为黄色油状物 ： ESI-MS ： 237.0/239.0[M+H] ； tR ＝ 4.27min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.30(Hex/EtOAc， 9 ∶ 1)。
     实施例 20 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(1- 氨基甲酰基 - 环丁 基 )- 吡啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 3 小时。在步骤 1.1 中， 使用 1-[4-(2- 氨基 -4- 甲基 - 噻 唑 -5- 基 )- 吡啶 -2- 基 ]- 环丁烷甲酰胺 ( 步骤 20.1)， 并将反应混合物在回流下搅拌 12 小时。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 429.1[M+H]+ ； tR ＝ 2.90min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.11(DCM/ MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 20.1 ： 1-[4-(2- 氨基 -4- 甲基 - 噻唑 -5- 基 )- 吡啶 -2- 基 ]- 环丁烷甲酰胺
    
    将 {5-[2-(1- 氰基 - 环丁基 )- 吡啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 氨基甲酸 叔丁基酯 ( 步骤 19.2)(640mg， 1.73mmol) 和浓硫酸的混合物在 0℃下搅拌 40 分钟， 加温至 室温， 搅拌 1 小时， 通过加入饱和 NaHCO3 溶液猝灭 (50mL)， 并用 DCM 萃取 (3x75mL)。有机相 用饱和 NaHCO3 溶液洗涤 (2x50mL)， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。残余物经硅胶柱色谱纯化 aq (DCM/MeOH/NH3 ， 99 ∶ 0 ∶ 1 → 93 ∶ 6 ∶ 1) 得到 35mg 标题化合物， 为黄色固体 ： ESI-MS ： + 289.1[M+H] ； TLC ： Rf ＝ 0.32(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。
     实施例 21 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(2- 二甲基氨基 -1， 1- 二 甲基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在步骤 1.1 中， 使用 5-[2-(2- 二甲基氨基 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 胺 ( 步骤 21.1)， 并将反应混合物在回流下搅拌 14 小时。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 431.1[M+H]+ ； TLC ： Rf ＝ 0.12(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 21.1 ： 5-[2-(2- 二甲基氨基 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻 唑 -2- 基胺
    
     按照步骤 19.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 {5-[2-(2- 二甲基氨 基 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 氨基甲酸叔丁基酯 ( 步 骤 21.2)， 并将反应混合物在室温下搅拌 2 小时。标题化合物 ： ESI-MS ： 291.1[M+H]+ ； tR ＝ 2.48min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.11(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 21.2 ： {5-[2-(2- 二甲基氨基 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]-4- 甲 基 - 噻唑 -2- 基 }- 氨基甲酸叔丁基酯
    
    将甲醛 (36 ％的 H2O 溶液， 0.144mL， 1.87mmol， 2 当量 ) 加入 {5-[2-(2- 氨基 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 氨基甲酸叔丁基酯 ( 步骤 21.3) (0.34g， 0.94mmol) 和乙酰氧基硼氢化钠 (0.6g， 2.82mmol， 3 当量 ) 在 1， 2- 二氯乙烷 (10mL) 中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌 1 小时并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (DCM/ MeOH/NH3aq， 99 ∶ 0 ∶ 1 → 97 ∶ 2 ∶ 1) 得 到 0.222g 标 题 化 合 物， 为白色固体 ： ESI-MS ： + 391.2[M+H] ； tR ＝ 4.27min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.15(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。
     步 骤 21.3 ： {5-[2-(2- 氨 基 -1， 1- 二 甲 基 - 乙 基 )- 吡 啶 -4- 基 ]-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 }- 氨基甲酸叔丁基酯
    
    在氩气中将 LiAlH4(1M 的 THF 溶液， 3.06mL， 3.06mmol， 1.5 当量 ) 加入 {5-[2-( 氰 基 - 二 甲 基 - 甲 基 )- 吡 啶 -4- 基 ]-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 }- 氨 基 甲 酸 叔 丁 基 酯 ( 步 骤 21.4)(0.73g， 2.04mmol) 在 THF(10mL) 的 溶 液 中。 将 反 应 混 合 物 在 室 温 下 搅 拌 2 小 时， 通 过 加 入 H2O(20mL) 猝 灭 并 用 EtOAc 萃 取 (2x75mL)。 有 机 相 用 饱 和 NaHCO3 溶 液 洗 涤 (2x50mL)， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH/NH3aq， 99 ∶ 0 ∶ 1 → 94 ∶ 5 ∶ 1) 得到 318mg 标题化合物， 为褐色固体 ： ESI-MS ： 363.1[M+H]+ ； TLC ： Rf ＝ 0.11(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。
     步 骤 21.4 ： {5-[2-( 氰 基 - 二 甲 基 - 甲 基 )- 吡 啶 -4- 基 ]-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 }- 氨基甲酸叔丁基酯
    
    按 照 步 骤 1.3 中 所 述 类 似 的 方 法 制 备 标 题 化 合 物， 但 使 用 2-(4- 碘 - 吡 啶 -2- 基 )-2- 甲基 - 丙腈 ( 步骤 21.5) 和 (4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 )- 氨基甲酸叔丁基酯 ( 步骤 18.4)。将反应混合物在 100℃下搅拌 3 小时。标题化合物 ： ESI-MS ： 359.1[M+H]+ ； TLC ： Rf ＝ 0.47(Hex/EtOAc， 1 ∶ 1)。
     步骤 21.5 ： 2-(4- 碘 - 吡啶 -2- 基 )-2- 甲基 - 丙腈
    
    按照步骤 19.3 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 2- 氟 -4- 碘吡啶。 标题 + 化合物 ： ESI-MS ： 273.0[M+H] ； tR ＝ 4.22min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.36(Hex/EtOAc， 9 ∶ 1)。
    
    
    实 施 例 22 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 二 乙 基 氨 基 - 吡 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 18 小时， 通过用 DCM/H2O 稀释猝灭， 并用 DCM 萃取。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 1 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 100℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。在步骤 1.3 中， 使用二乙基 -(4- 碘 - 吡啶 -2- 基 )- 胺 ( 步 骤 22.1)。将反应混合物在 120℃下搅拌 16 小时， 通过加入 EtOAc 和 H2O 稀释进行猝灭， 经 硅藻土垫过滤， 并用 EtOAc 萃取。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 403.2[M+H]+ ； tR ＝ 2.38min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.10(DCM/ MeOH/NH3aq， 91.5 ∶ 7.5 ∶ 1)。
     步骤 22.1 ： 二乙基 -(4- 碘 - 吡啶 -2- 基 )- 胺
    
    将 2- 氟 -4- 碘 吡 啶 (2g， 8.97mmol)、二 乙 胺 (2.77ml， 26.9mmol， 3当量)和K2CO3(2.48g， 17.94mmol， 2 当量 ) 在 DMF(20mL) 中的混合物在 100℃下搅拌 18 小时， 冷却至 室温， 用 EtOAc/H2O 稀释并用 EtOAc 萃取。有机相用 H2O 和盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并 浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/Et2O， 98 ∶ 2) 得到 2.3g 标题化合物， 为黄色油状 + 物： ESI-MS ： 277.1[M+H] ； TLC ： Rf ＝ 0.52(Hex/Et2O， 98 ∶ 2)。
     实 施 例 23 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 二 乙 基 氨 基 - 吡 啶 -4- 基 )- 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 18 小时， 通过用 DCM/H2O 稀释猝灭， 并用 DCM 萃取。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 1 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 100℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。在步骤 1.3 中， 使用二乙基 -(4- 碘 - 吡啶 -2- 基 )- 胺 ( 步 骤 22.1) 和 N- 噻唑 -2- 基 - 乙酰胺。将反应混合物在 120℃下搅拌 5 小时， 通过加入 EtOAc 经硅藻土垫过滤， 并用 EtOAc 萃取。 和 H2O 稀释进行猝灭，
     标题化合物 ： ESI-MS ： 389.2[M+H]+ ； tR ＝ 2.28min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.34(DCM/ aq MeOH/NH3 ， 91.5 ∶ 7.5 ∶ 1)。
     实 施 例 24 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(3- 叔 丁 基 -3H- 苯 并 咪 唑 -5- 基 )- 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 5 小时。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 14 小 时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 85℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.3 中， 使用 6- 溴 -1- 叔丁基 -1H- 苯并咪唑 ( 步骤 24.1) 和 N- 噻唑 -2- 基 - 乙酰胺。将 反应混合物在 120℃下搅拌 7 小时。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 413.2[M+H]+ ； tR ＝ 2.29min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.45(DCM/ MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 241.6- 溴 -1- 叔丁基 -1H- 苯并咪唑
    
    将 4- 溴 -N ＊ 2 ＊ - 叔丁基 - 苯 -1， 2- 二胺 ( 步骤 24.2)(2.14g， 8.80mmol) 和原甲 酸三乙酯 (14.7mL， 88mmol) 的混合物在 148℃下搅拌 1 小时， 冷却并浓缩。将残余物经硅 胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH， 1 ∶ 0 → 99 ∶ 1) 得到 1.74g 标题化合物， 为白色固体 ： ESI-MS ： + 253.0/255.0[M+H] ； tR ＝ 2.88min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.54(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。 ＊ ＊
     步骤 24.2 ： 4- 溴 -N 2 - 叔丁基 - 苯 -1， 2- 二胺
    
    室温下将 (5- 溴 -2- 硝基 - 苯基 )- 叔丁基 - 胺 ( 步骤 24.3)(6g， 21.97mmol) 和 兰尼镍 (2g) 在 MeOH/THF(1 ∶ 1v/v， 600mL) 中的混悬液在氢气中搅拌 9 小时。将反应混合 物经硅藻土垫过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 97 ∶ 3 → 3 ∶ 1) 得 + tR ＝ 2.75min( 系统 1) ； 到 4.4g 标题化合物， 为黑色油状物 ： ESI-MS ： 243.0/245.0[M+H] ； TLC ： Rf ＝ 0.89(Hex/EtOAc， 1 ∶ 1)。
     步骤 24.3 ： (5- 溴 -2- 硝基 - 苯基 )- 叔丁基 - 胺
    
    将 4- 溴 -2- 氟 - 硝基苯 (4g， 18.2mmol) 和叔丁基胺 (4.78mL， 45.5mmol， 2.5 当 量 ) 在 EtOH(80mL) 中的溶液在 85 ℃下搅拌 15 小时， 冷却并浓缩。将残余物经硅胶柱 色 谱 纯 化 (Hex/EtOAc， 1 ∶ 0 → 99 ∶ 1) 得 到 4.8g 标 题 化 合 物， 为橙色固体 ： ESI-MS ： + 273.0/275.0[M+H] ； tR ＝ 5.68min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.49(Hex/EtOAc， 9 ∶ 1)。
     实施例 25 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[5-(3- 叔丁基 -2- 甲基 -3H- 苯 并咪唑 -5- 基 )- 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 14 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 85℃下搅拌 1 小
     时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.3 中， 使用 6- 溴 -1- 叔丁基 -2- 甲基 -1H- 苯并咪 唑 ( 步骤 25.1) 和 N- 噻唑 -2- 基 - 乙酰胺。将反应混合物在 120℃下搅拌 5 小时。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 427.2[M+H]+ ； tR ＝ 2.37min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.38(DCM/ MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 25.1 ： 6- 溴 -1- 叔丁基 -2- 甲基 -1H- 苯并咪唑
    将 6- 溴 -1- 叔丁基 -2- 乙氧基甲基 -2- 甲基 -2， 3- 二氢 -1H- 苯并咪唑 ( 步骤 25.2)(2.04g， 6.51mmol) 和 TFA(10ml) 的混合物在室温下搅拌过夜， 通过加入饱和 NaHCO3 溶液猝灭 (100mL)， 并用 EtOAc 萃取 (2x150mL)。有机相用饱和 NaHCO3 溶液洗涤 (2x50mL)， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH， 1 ∶ 0 → 98 ∶ 2) 得到 + 1.05g 标题化合物， 为白色固体 ： ESI-MS ： 267.0/269.0[M+H] ； tR ＝ 2.99min( 系统 1) ； TLC ： 9 ∶ 1)。 Rf ＝ 0.58(DCM/MeOH，
     步骤 25.2 ： 6- 溴 -1- 叔丁基 -2- 乙氧基甲基 -2- 甲基 -2， 3- 二氢 -1H- 苯并咪唑
    
    将 4- 溴 -N ＊ 2 ＊ - 叔丁基 - 苯 -1， 2- 二胺 ( 步骤 24.2)(2.14g， 8.80mmol) 和原乙 酸三乙酯 (16.2mL， 88mmol， 10 当量 ) 的混合物在 142℃下搅拌 1 小时， 冷却并浓缩。将残 余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 1 ∶ 0 → 95 ∶ 5) 得到 2.04g 标题化合物， 为紫色油状 + 物： ESI-MS ： 313.0/315.0[M+H] ； TLC ： Rf ＝ 0.67(Hex/EtOAc， 9 ∶ 1)。
     实 施 例 26 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(3- 乙 基 -3H- 苯 并 咪 唑 -5- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 15 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 85℃下搅拌 3 小 时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.3 中， 使用 6- 溴 -1- 乙基 -1H- 苯并咪唑 ( 步骤 26.1) 和 N- 噻唑 -2- 基 - 乙酰胺。将反应混合物在 120℃下搅拌 14 小时。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 399.1[M+H]+ ； tR ＝ 1.73min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.25(DCM/ MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 26.1 ： 6- 溴 -1- 乙基 -1H- 苯并咪唑
    将 4- 溴 -N ＊ 2 ＊ - 乙基 - 苯 -1， 2- 二胺 ( 步骤 26.2)(2g， 9.3mmol) 和原甲酸三乙 酯 (15.5mL， 93mmol， 10 当量 ) 的混合物在 148℃下搅拌 1 小时， 冷却并浓缩。将残余物经硅 胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH， 1 ∶ 0 → 98 ∶ 2) 得到 2.05g 标题化合物， 为白色固体 ： ESI-MS ： + 225.1/227.1[M+H] ； tR ＝ 2.31min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.58(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。 ＊ ＊
     步骤 26.2 ： 4- 溴 -N 2 - 乙基 - 苯 -1， 2- 二胺
    
    在室温下将 (5- 溴 -2- 硝基 - 苯基 )- 乙基 - 胺 ( 步骤 26.3)(6g， 24.48mmol) 和兰 尼镍 (2g) 在 MeOH/THF(1 ∶ 1v/v， 600mL) 中的混悬液在氢气中搅拌 9 小时。将反应混合物 经硅藻土垫过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 95 ∶ 5 → 85 ∶ 15) 得 到 4.51g 标题化合物， 为黑色油状物 ： ESI-MS ： 213.1/215.1[M-H] ； tR ＝ 2.53min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.57(Hex/EtOAc， 1 ∶ 1)。
     步骤 26.3 ： (5- 溴 -2- 硝基 - 苯基 )- 乙基 - 胺
    
    将 4- 溴 -2- 氟 - 硝 基 苯 (6g， 27.3mmol)、 甲 基 胺 (2M 的 MeOH 溶 液， 34.1mL， 68.2mmol， 2.5 当量 ) 和 EtOH(80mL) 的混合物在 85℃下搅拌 15 小时， 冷却并浓缩。将残余 物经研磨纯化， 得到 6g 标题化合物， 为黄色固体 ： tR ＝ 5.13min( 系统 1)。
    
    
    实 施 例 27 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-[(5-{2-[1-(4- 甲 氧 基 - 苯 基 )-1- 甲基 - 乙基 ]- 吡啶 -4- 基 }-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 24 小时， 用 EtOAc/H2O 稀释猝灭。在步骤 1.2 中， 将反应混 合物在 100℃下搅拌 2 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。 在步骤 1.3 中， 将反应混合物在 100℃ 下搅拌 3 小时， 通过用 EtOAc/H2O 稀释猝灭， 并用 EtOAc 萃取。在步骤 1.4 中， 使用 1， 2- 二 氯乙烷 ( 每 mmol 的吡啶 -4- 酮用 4.3mL) 作为溶剂。将反应混合物在回流下搅拌 1 小时， 倒入饱和 NaHCO3 溶液中， 并用 DCM 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 80℃下搅拌 23 小 时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 将反应混合物在室温下搅拌 21 小时。在步骤 1.7 中， 将 4- 甲氧基 -3- 丁烯 -2- 酮在 THF 中的溶液加入冷却的 (-78℃ )LiHMDS 在 THF 的 溶液中。30 分钟后， 加入 2-(4- 甲氧基 - 苯基 )-2- 甲基 - 丙酰氯 ( 步骤 27.1) 在 THF 中的 溶液， 并将反应混合物历经 16 小时达到室温。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 480.0[M+H]+ ； tR ＝ 3.05min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.13(DCM/ aq MeOH/NH3 ， 94 ∶ 5 ∶ 1)。
     步骤 27.1 ： 2-(4- 甲氧基 - 苯基 )-2- 甲基 - 丙酰氯
    按照步骤 5.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 2-(4- 甲氧基 - 苯 基 )-2- 甲基 - 丙酸， 并将反应混合物在回流下搅拌 3 小时。
     实 施 例 28 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-[(5-{2-[1-(4- 甲 氧 基 - 苯 基 )-1- 甲基 - 乙基 ]- 吡啶 -4- 基 }- 噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 16 小时， 用 EtOAc/H2O 稀释猝灭。 在步骤 1.2 中， 将反应混合 物在 100℃下搅拌 2 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。在步骤 1.3 中， 使用 N- 噻唑 -2- 基 - 乙 酰胺。将反应混合物在 100℃下搅拌 5 小时， 通过用 EtOAc/H2O 稀释猝灭， 并用 EtOAc 萃取。 在步骤 1.4 中， 使用 1， 2- 二氯乙烷 ( 每 mmol 的吡啶 -4- 酮用 4.3mL) 作为溶剂。将反应混 合物在回流下搅拌 1 小时， 倒入饱和 NaHCO3 溶液中， 并用 DCM 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应 混合物在 80℃下搅拌 23 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 将反应混合物在室 温下搅拌 21 小时。在步骤 1.7 中， 将 4- 甲氧基 -3- 丁烯 -2- 酮在 THF 中的溶液加入冷却 的 (-78℃ )LiHMDS 在 THF 中的溶液。30 分钟后， 加入 2-(4- 甲氧基 - 苯基 )-2- 甲基 - 丙 酰氯 ( 步骤 27.1) 在 THF 中的溶液， 并将反应混合物历经 16 小时达到室温。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 466.1[M+H]+ ； tR ＝ 2.91min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.23(DCM/ aq MeOH/NH3 ， 94 ∶ 5 ∶ 1)。
     实施例 29 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(5-{2-[1-(4- 甲氧基 - 苯基 )- 环 丙基 ]- 吡啶 -4- 基 }-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 21 小时， 用 EtOAc/H2O 稀释猝灭。在步骤 1.2 中， 将反应混 合物在 100℃下搅拌 3 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。 在步骤 1.3 中， 将反应混合物在 100℃ 下搅拌 6 小时， 通过用 EtOAc/H2O 稀释猝灭， 并用 EtOAc 萃取。在步骤 1.4 中， 使用 1， 2- 二 氯乙烷 ( 每 mmol 的吡啶 -4- 酮用 4.3mL) 作为溶剂。将反应混合物在回流下搅拌 1 小时， 倒入饱和 NaHCO3 溶液中， 并用 DCM 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 80℃下搅拌 18 小 时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 将反应混合物在室温下搅拌 18 小时。在步骤 1.7 中， 将 4- 甲氧基 -3- 丁烯 -2- 酮在 THF 中的溶液加入冷却的 (-78℃ )LiHMDS 在 THF 中 的溶液。30 分钟后， 加入 1-(4- 甲氧基 - 苯基 )- 环丙烷甲酰氯 ( 步骤 29.1) 在 THF 中的溶
    液， 并将反应混合物历经 16 小时达到室温。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 478.1[M+H]+ ； tR ＝ 2.65min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.09(DCM/ aq MeOH/NH3 ， 94 ∶ 5 ∶ 1)。
     步骤 29.1 ： 1-(4- 甲氧基 - 苯基 )- 环丙烷甲酰氯
    按照步骤 5.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 1-(4- 甲氧基 - 苯 基 )- 环丙基甲酸， 并将反应混合物在回流下搅拌 3 小时。
     实施例 30 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(5-{2-[1-(4- 甲氧基 - 苯基 )- 环 丙基 ]- 吡啶 -4- 基 }- 噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 16 小时， 用 EtOAc/H2O 稀释猝灭。 在步骤 1.2 中， 将反应混合 物在 100℃下搅拌 3 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。在步骤 1.3 中， 使用 N- 噻唑 -2- 基 - 乙 酰胺。 将反应混合物在 100℃下搅拌 28 小时， 通过用 EtOAc/H2O 稀释猝灭， 并用 EtOAc 萃取。
     在步骤 1.4 中， 使用 1， 2- 二氯乙烷 ( 每 mmol 的吡啶 -4- 酮用 4.3mL) 作为溶剂。将反应混 合物在回流下搅拌 1 小时， 倒入饱和 NaHCO3 溶液中， 并用 DCM 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应 混合物在 80℃下搅拌 18 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 将反应混合物在室 温下搅拌 18 小时。在步骤 1.7 中， 将 4- 甲氧基 -3- 丁烯 -2- 酮在 THF 中的溶液加入冷却 的 (-78℃ )LiHMDS 在 THF 中的溶液。30 分钟后， 加入 1-(4- 甲氧基 - 苯基 )- 环丙烷甲酰 氯 ( 步骤 29.1) 在 THF 中的溶液， 并将反应混合物历经 16 小时达到室温。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 464.1[M+H]+ ； tR ＝ 2.90min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.06(DCM/ aq MeOH/NH3 ， 94 ∶ 5 ∶ 1)。
     实 施 例 31 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2-{1-[4-(3- 二 甲 基 氨 基 - 丙氧基 )- 苯基 ]-1- 甲基 - 乙基 }- 吡啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 18 小时， 用 EtOAc/H2O 稀释猝灭。 在步骤 1.2 中， 将反应混合 物在 100℃下搅拌 7 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。 在步骤 1.3 中， 使用 (3-{4-[1-(4- 溴 - 吡 啶 -2- 基 )-1- 甲基 - 乙基 ]- 苯氧基 }- 丙基 )- 二甲基 - 胺 ( 步骤 31.1)。将反应混合物 在 120℃下搅拌 2 小时， 通过用 EtOAc/H2O 稀释猝灭， 并用 EtOAc 萃取。 +
     标题化合物 ： ESI-MS ： 551.1[M+H] ； tR ＝ 2.38min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.05(DCM/ aq MeOH/NH3 ， 94 ∶ 5 ∶ 1)。
     步骤 31.1 ： (3-{4-[1-(4- 溴 - 吡啶 -2- 基 )-1- 甲基 - 乙基 ]- 苯氧基 }- 丙基 )- 二 甲基 - 胺
    
    将氢氧化钠 ( 精细研磨的颗粒， 0.488g， 12.2mmol， 5 当量 ) 加入 4-[1-(4- 溴 - 吡 啶 -2- 基 )-1- 甲基 - 乙基 ]- 苯酚 ( 步骤 31.2)(0.714g， 2.44mmol) 在 DMF(5mL) 的溶液中。 将该混合物在室温下搅拌 20 分钟。加入 3- 二甲基氨基 -1- 丙基氯化物盐酸化物 (0.611g， 3.87mmol， 1.6 当量 )。将反应混合物加热至 90℃， 搅拌 10 小时， 冷却， 用 EtOAc/H2O 稀释， 并用 EtOAc 萃取。有机相用 H2O 和盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将残余物经硅胶 aq 柱色谱纯化 (DCM/MeOH/NH3 ， 94 ∶ 5 ∶ 1) 得到 0.398g 标题化合物， 为不纯的褐色油状物， + 其不经进一步纯化直接使用 ： ESI-MS ： 377.1/379.0[M+H] ； TLC ： Rf ＝ 0.22(DCM/MeOH/NH3aq， 94 ∶ 5 ∶ 1)。
     步骤 31.2 ： 4-[1-(4- 溴 - 吡啶 -2- 基 )-1- 甲基 - 乙基 ]- 苯酚
     在 氩 气 中 将 BBr3(1M 的 DCM 溶 液， 23mmol， 8当 量)逐 滴 加 入 冷 却 的 (0 ℃ )4- 溴 -2-[1-(4- 甲 氧 基 - 苯 基 )-1- 甲 基 - 乙 基 ]- 吡 啶 ( 步 骤 31.3)(0.878g， 2.87mmol) 在 DCM(42mL) 的溶液中。将反应混合物在 0℃下搅拌 1 小时， 加温至室温， 搅拌 18 小时， 冷却至 0℃， 并通过加入无水 MeOH 猝灭。浓缩该混合物， 用 6M 的 HCl 水溶液稀释， 搅拌 1 小时， 中和至 pH 7， 并用 DCM 萃取。干燥 (Na2SO4) 有机相， 过滤并浓缩。残余物不经 纯化直接使用。
     步骤 31.3 ： 4- 溴 -2-[1-(4- 甲氧基 - 苯基 )-1- 甲基 - 乙基 ]- 吡啶
    
    按照步骤 1.4 到 1.7 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。 在步骤 1.4 中， 使用 1， 2- 二氯乙烷 ( 每 mmol 的吡啶 -4- 酮用 4.3mL) 作为溶剂。将反应混合物在 回流下搅拌 1 小时， 倒入饱和 NaHCO3 水溶液， 并用 DCM 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应混合物 在 80℃下搅拌 23 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 将反应混合物在室温下搅 拌 21 小时。在步骤 1.7 中， 4- 甲氧基 -3- 丁烯 -2- 酮在 THF 中的溶液加入冷却的 (-78℃ ) LiHMDS 在 THF 中的溶液。30 分钟后， 加入 2-(4- 甲氧基 - 苯基 )-2- 甲基 - 丙酰氯 ( 步骤 27.1) 在 THF 中的溶液， 并将反应混合物历经 16 小时达到室温。
     标题化合物： ESI-MS ： 306.0/308.0[M+H]+ ； tR ＝ 3.94min( 系 统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.55(Hex/EtOAc， 7 ∶ 3)。
     实施例 32 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2-(1-d3- 甲基 - 环 丁基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 18 小时， 通过用 DCM/H2O 稀释猝灭， 并用 DCM 萃取。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 1 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 100℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。 在步骤 1.3 中， 将钯催化剂加入加热的剩余试剂的混合物中， 并将所得混合物在 120℃下搅拌 1 小时， 用 EtOAc/H2O 稀释并用 EtOAc 萃取。干燥并浓缩有 机相后， 将残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 1 ∶ 4)。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在
     80℃下搅拌 3 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.7 中， 4- 甲氧基 -3- 丁烯 -2- 酮在 THF 中的溶液加入冷却的 (-78℃ )LiHMDS 在 THF 中的溶液。 30 分钟后， 加入 1-d3- 甲基 - 环 丁烷氯化物 ( 步骤 32.1) 在 THF 中的溶液， 并将反应混合物历经 16 小时达到室温。
     标 题 化 合 物： ESI-MS ： 403.2[M+H] + ； TLC ： Rf ＝ 0.22(DCM/MeOH/NH3aq， 91.5 ∶ 7.5 ∶ 1)。
     步骤 32.1 ： 1-d3- 甲基 - 环丁烷甲酰氯
    按照步骤 5.1 中所述类似方法制备标题化合物， 但使用 1-d3- 甲基 - 环丁烷甲 酸，其 按 照 [Cowling， S.J. ； Goodby， J.W.， Chemical Communications， (2006)， (39)， 4107-4109] 中所述的方法制备， 但使用 d3- 甲基 - 碘化物。
     实施例 33 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(1-d3- 甲基 - 环丁基 )- 吡 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 18 小时， 通过用 DCM/H2O 稀释猝灭， 并用 DCM 萃取。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 1 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 100℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。在步骤 1.3 中， 使用 N- 噻唑 -2- 基 - 乙酰胺。将钯催化剂加 入加热的剩余试剂的混合物中。将所得混合物在 120℃下搅拌 7 小时， 用 EtOAc/H2O 稀释， 经硅藻土垫过滤并用 EtOAc 萃取。 干燥并浓缩有机相后， 将残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/ EtOAc， 1 ∶ 4)。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 80℃下搅拌 3 小时， 不进行在 MeOH 中的研 磨。在步骤 1.7 中， 4- 甲氧基 -3- 丁烯 -2- 酮在 THF 中的溶液加入冷却的 (-78℃ )LiHMDS 在 THF 中的溶液。30 分钟后， 加入 1-d3- 甲基 - 环丁烷氯化物 ( 步骤 32.1) 在 THF 中的溶 液， 并将反应混合物历经 16 小时达到室温。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 389.2[M+H]+ ； tR ＝ 2.30min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.11(DCM/ aq MeOH/NH3 ， 91.5 ∶ 7.5 ∶ 1)。
     实施例 34 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4-d3- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环 丙基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 8 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 85℃下搅拌 1 小 时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.3 中， 使用 2- 乙酰氨基 -4-d3- 甲基 - 噻唑 ( 步骤 34.1)。将反应混合物在 120℃下搅拌 2 小时。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 65-70℃下 搅拌 1 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.7 中， 使用 1- 甲基 - 环丙烷甲酰氯 ( 步骤 5.1)。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 389.2[M+H]+ ； tR ＝ 2.12min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.35(DCM/ MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 34.1 ： 2- 乙酰氨基 -4-d3- 甲基 - 噻唑
    
    将 1- 溴 - 丙 烷 -2- 酮 -d 5[Challacombe ， K. 等 人， Journal of the ChemicalSociety Perkin Trans.I， (1988)， 2213-2218](1.25g， 8.8mmol) 和 1- 乙 酰 基 -2- 硫脲 (1g， 8.8mmol) 在 EtOH(20mL) 中的混合物在 85℃下搅拌 2 小时， 冷却并浓缩。 将残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 85 ∶ 15 → 1 ∶ 1)， 得到 1.08g 标题化合物， 为橙 + 色固体 ： ESI-MS ： 160.0[M+H] ； TLC ： Rf ＝ 0.25(Hex/EtOAc， 1 ∶ 1)。
     实施例 35 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4-d3- 甲基 -5-[2-(2， 2， 2- 三 氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 8 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 85℃下搅拌 1 小 时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.3 中， 使用 2- 乙酰氨基 -4-d3- 甲基 - 噻唑 ( 步骤 34.1)。将反应混合物在 120℃下搅拌 2 小时。在步骤 1.4 中， 将反应混合物在 83℃下搅 拌 1 小时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 65℃下搅拌 1 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 粗产物不再纯化。在步骤 1.7 中， 使用 3， 3， 3- 三 氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酰氯 ( 步骤 12.1)。
     标 题 化 合 物： API-ES-MS ： 445.1[M+H]+ ； tR ＝ 3.00min( 系 统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.51(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。
     实 施 例 36 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-({4- 二 甲 基 氨 基 甲 基 -5-[2-(1-d3- 甲基 - 环丁基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 18 小时， 通过用 DCM/H2O 稀释猝灭， 并用 DCM 萃取。在步 骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 2 小时。在步骤 1.2 中， 使用 N-{4- 二甲基氨基甲 基 -5-[2-(1-d3- 甲基 - 环丁基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 乙酰胺 ( 步骤 36.1)。将 反应混合物在 100℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 446.1[M+H]+ ； TLC ： Rf ＝ 0.40(DCM/MeOH/NH3aq， 89 ∶ 10 ∶ 1)。
     步骤 36.1 ： N-{4- 二甲基氨基甲基 -5-[2-(1-d3- 甲基 - 环丁基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 }- 乙酰胺
    
    将 N-{4- 溴甲基 -5-[2-(1-d3- 甲基 - 环丁基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 乙 酰胺 ( 步骤 36.2)(150mg， 0.391mmol)、 二甲基胺盐酸化物 (38.3mg， 0.470mmol， 1.2 当量 ) 和碳酸铯 (293mg， 0.900mmol， 2.3 当量 ) 在 DMF(2mL) 中的混合物在室温下搅拌 2 小时， 用 EtOAc/H2O 稀释， 并用 EtOAc 萃取。有机相用 H2O 和盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。 将残余物在 Et2O 中研磨纯化， 得到 89mg 标题化合物， 为白色固体 ： ESI-MS ： 348.2[M+H]+。
     步 骤 36.2 ： N-{4- 溴 甲 基 -5-[2-(1-d3- 甲 基 - 环 丁 基 )- 吡 啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 }- 乙酰胺
    
    将 NBS(554mg， 3.06mmol， 1.1 当 量 ) 加 入 N-{4- 甲 基 -5-[2-(1-d3- 甲 基 - 环 丁 基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 乙酰胺 ( 步骤 36.3)(846mg， 2.78mmol) 在 CCl4(20mL) 和 CHCl3(16mL) 的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌 1 小时， 用 H2O 和盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 1 ∶ 4) 得到 572mg 标题 + 化 合 物， 为浅黄色固体 ： ESI-MS ： 383.0/385.0[M+H] ； tR ＝ 3.12min( 系 统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.45(Hex/EtOAc， 1 ∶ 4)。
     步 骤 36.3 ： N-{4- 甲 基 -5-[2-(1-d3- 甲 基 - 环 丁 基 )- 吡 啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 }- 乙酰胺
    
    按照步骤 1.3-1.7 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在步骤 1.3 中， 将反应混合物在 120℃下搅拌 1 小时， 并用 EtOAc/H2O 稀释猝灭。 在步骤 1.5 中， 将反 应混合物在 80℃下搅拌 3 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.7 中， 4- 甲氧基 -3- 丁 烯 -2- 酮在 THF 中的溶液加入冷却的 (-78 ℃ )LiHMDS 在 THF 中的溶液。30 分钟后， 加入 1-d3- 甲基 - 环丁烷氯化物 ( 步骤 32.1) 在 THF 中的溶液， 并将反应混合物历经 16 小时达 到室温。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 305.2[M+H]+ ； TLC ： Rf ＝ 0.24(Hex/EtOAc， 1 ∶ 4)。
     实施例 37 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 氯 -5-[2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    将 4- 氯 -5-[2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 胺 ( 步骤 37.1)(100mg， 0.311mmol) 和光气 (0.164mL， 0.311mmol) 在吡啶 (2mL) 中的混合 物在 105℃下搅拌 1 小时。加入 L- 脯氨酰胺 (106mg， 0.932mmol， 3 当量 )。将所得混合物 在 105 ℃下搅拌 30 分钟， 冷却， 通过加入饱和 NaHCO3 溶液猝灭 (100mL)， 并用 EtOAc 萃取(2x100mL)。有机相用饱和 NaHCO3 溶液洗涤 (100mL)， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将残余 物经硅胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH， 99 ∶ 1 → 94 ∶ 6) 得到 46mg 标题化合物， 为黄色固体 ： + ESI-MS ： 461.9[M+H] ； tR ＝ 3.60min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.28(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 37.1 ： 4- 氯 -5-[2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基胺
    按照步骤 1.2-1.7 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 85℃下搅拌 3 小时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.3 中， 使 用 N-(4- 氯 - 噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺 ( 步骤 37.2)。将反应混合物在 120℃下搅拌 2 小时。 在步骤 1.4 中， 将反应混合物在 83℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 65℃下搅拌 1 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 粗产物不 再纯化。在步骤 1.7 中， 使用 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酰氯 ( 步骤 12.1)。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 322.1[M+H]+ ； tR ＝ 3.58min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.45(DCM/ MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 37.2 ： N-(4- 氯 - 噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺
    
    将 N-(4- 氧代 -4， 5- 二氢 - 噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺 ( 步骤 37.3)(14.8g， 94mmol) 和 POCl3(175mL， 20 当量 ) 的混合物加热至 105℃， 搅拌 15 分钟， 冷却并浓缩。将残余物倒 在冰 -H2O 上， 并用 EtOAc 萃取 (2x100mL)。有机相用饱和 NaHCO3 溶液洗涤 (2x100mL)， 干 燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH， 99 ∶ 1) 得到 13.9g 标 + 题化合物， 为白色固体 ： ESI-MS ： 177.0[M+H] ； tR ＝ 2.74min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.66(DCM/ MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 37.3 ： N-(4- 氧代 -4， 5- 二氢 - 噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺
    
    将假乙内酰硫脲 (16g， 138mmol) 和乙酸酐 (16.9mL， 179mmol， 1.3 当量 ) 在吡啶 (150mL) 中的混合物加热至 115℃， 搅拌 1 小时并冷却。经过滤收集所得沉淀， 得到 12.64g + 标题化合物， 为褐色固体 ： ESI-MS ： 159.0[M+H] 。
     实施例 38 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 氟甲基 -5-[2-(2， 2， 2- 三 氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 18 小时， 通过用 DCM/H2O 稀释猝灭， 并用 DCM 萃取。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 1 小时， 浓缩， 且所得粗物质不经纯化直接使用。 在步骤 1.2 中， 使用 N-{4- 氟甲基 -5-[2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 }- 乙酰胺 ( 步骤 38.1)。将反应混合物在 100℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。粗物质不经纯化。
     标 题 化 合 物： ESI-MS ： 460.0[M+H] + ； TLC ： Rf ＝ 0.44(DCM/MeOH/NH3aq， 91.5 ∶ 7.5 ∶ 1]
     步 骤 38.1 ： N-{4- 氟 甲 基 -5-[2-(2， 2， 2- 三 氟 -1， 1- 二 甲 基 - 乙 基 )- 吡 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 乙酰胺
    
    按照步骤 1.3-1.7 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在步骤 1.3 中， 使用 N-(4- 氟甲基 - 噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺 ( 步骤 38.2)。将反应混合物在 90℃下 搅拌 7 小时， 在 100℃下搅拌 5 小时， 并通过用 EtOAc 和 H2O 稀释猝灭。在步骤 1.5 中， 将 反应混合物在 65℃下搅拌 1 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 粗产物不再纯 化。在步骤 1.7 中， 使用 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酰氯 ( 步骤 12.1)。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 362.1[M+H]+ ； tR ＝ 4.18min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.29(Hex/ EtOAc， 1 ∶ 1)。
     步骤 38.2 ： N-(4- 氟甲基 - 噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺
    
    将 1- 氯 -3- 氟 - 丙烷 -2- 酮 ( 步骤 38.3)(1.14g， 10.3mmol) 和 N- 乙酰基 -2- 硫脲 (1.22g， 10.3mmol) 在 EtOH(10mL) 中的混合物在回流下搅拌 1.5 小时， 冷却并浓缩。 将残余 物溶于 DCM/H2O， 并用 DCM 萃取。 干燥 (Na2SO4) 有机相， 过滤并浓缩。 将残余物经硅胶柱色谱 纯化 (Hex/EtOAc， 1 ∶ 1) 得到 0.143g 标题化合物 ： ESI-MS ： 173.1[M-H]- ； tR ＝ 1.98min( 系
     统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.21(Hex/EtOAc， 1 ∶ 1)。
     步骤 38.3 ： 1- 氯 -3- 氟 - 丙烷 -2- 酮
    将 1- 氟 -3- 氯异丙醇 (2.7mL， 31.2mmol) 缓慢加入装有 30mL 琼斯试剂 ( 通过将 230mL 浓硫酸加入 267g 三氧化铬在 700mL H2O 的溶液中， 并用 H2O 稀释至 1L 来制备 ) 的冷 却至 5℃的烧瓶中。将反应混合物加温至室温， 搅拌 18 小时， 倒入饱和 NaHCO3 溶液中， 并用 Et2O 萃取。将有机相用盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (DCM)， 得到 1.14g 标题化合物， 为不纯的黄色油状物。
     实施例 39 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[5-(5- 苯磺酰基氨基 -6- 氯 - 吡 啶 -3- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    按 照 步 骤 1.3 中 所 述 类 似 的 方 法 制 备 标 题 化 合 物， 但 进 行 如 下 修 改。 使 用 (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-[(4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 )- 酰 胺 ]( 步 骤 39.2) 和 N-(5- 溴 -2- 氯 - 吡啶 -3- 基 )- 苯磺酰胺 ( 步骤 39.1)。将钯催化剂加入加热的剩余试剂 的混合物中， 并将所得混合物在 135℃下搅拌 3 小时， 用 EtOAc 和 H2O 稀释， 经硅藻土垫过滤 并用 EtOAc 萃取。干燥并浓缩有机相后， 将残余物经硅胶柱色谱及反相 HPLC 纯化。标题化 合物 ： ESI-MS ： 519.0/521.1[M-H]- ； tR ＝ 3.33min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.09(DCM/MeOH/NH3aq， 84 ∶ 15 ∶ 1)。
     步骤 39.1 ： N-(5- 溴 -2- 氯 - 吡啶 -3- 基 )- 苯磺酰胺
    
    在氩气中将苯磺酰氯 (1.23mL， 9.62mmol， 2 当量 ) 在 DCM(50mL) 中的溶液历经 15 分钟逐滴加入 3- 氨基 -5- 溴 -2- 氯吡啶 [Jouve， K. ； Bergman， J.， Journal of Heterocyclic Chemistry， (2003)， 40(2)， 261-268](1g， 4.81mmol) 和 吡 啶 (1.94ml， 24mmol， 5 当量 ) 在 DCM(20mL) 的溶液中。将所得混合物在室温下搅拌 20 小时， 浓缩， 用 H2O 稀释， 并用 DCM 萃 取。将有机相用盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (DCM) 得到 163mg 标题化合物， 为白色固体 ： ESI-MS ： 346.9[M-H]- ； tR ＝ 4.33min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.23(DCM)。
     步骤 39.2 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用咪唑 -1- 甲酸 (4- 甲 基 - 噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ( 步骤 39.3)。将反应混合物在室温下搅拌 18 小时并浓缩。将残 余物经硅胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH/NH3aq， 94 ∶ 5 ∶ 1)， 然后在 Et2O 中研磨。标题化合物 ： ESI-MS ： 253.2[M-H]- ； TLC ： Rf ＝ 0.18(DCM/MeOH/NH3aq， 84 ∶ 15 ∶ 1)。
     步骤 39.3 ： 咪唑 -1- 甲酸 (4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 )- 酰胺
    
    按照步骤 1.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 2- 乙酰氨基 -4- 甲基噻 唑， 并将反应混合物在回流下搅拌 5.5 小时。
     实施例 40 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[5-(5- 苯磺酰基氨基 -6- 氯 - 吡 啶 -3- 基 )- 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    按照步骤 1.3 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。使用 (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1- 噻 唑 -2- 基 酰 胺 ( 步 骤 40.1) 和 N-(5- 溴 -2- 氯 - 吡 啶 -3- 基 )- 苯磺酰胺 ( 步骤 39.1)。 将钯催化剂加入加热的剩余试剂的混合物中， 并将所得 混合物在 120℃下搅拌 6 小时， 浓缩， 用 DCM/MeOH 稀释， 经硅藻土垫过滤， 并浓缩滤液。 将残 + 余物经硅胶柱色谱及反相 HPLC 纯化。 标题化合物 ： ESI-MS ： 506.9[M+H] ； tR ＝ 3.21min( 系 统 1)。
     步骤 40.1 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1- 噻唑 -2- 基酰胺
    
    按 照 实 施 例 1 中 所 述 类 似 的 方 法 制 备 标 题 化 合 物， 但 使 用 咪 唑 -1- 甲 酸 噻 唑 -2- 基酰胺 ( 步骤 40.2)。将反应混合物在室温下搅拌 18 小时并浓缩。残余物经硅 胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH/NH3aq， 94 ∶ 5 ∶ 1)， 然后用 EtOAc 研磨。标题化合物 ： ESI-MS ： aq 239.2[M-H] ； TLC ： Rf ＝ 0.11(DCM/MeOH/NH3 ， 84 ∶ 15 ∶ 1)。
     步骤 40.2 ： 咪唑 -1- 甲酸噻唑 -2- 基酰胺
    按照步骤 1.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 N- 噻唑 -2- 基 - 乙酰胺， 并将反应混合物在回流下搅拌 5 小时。
     实施例 41 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[5-(6- 氨基 -5- 三氟甲基 - 吡 啶 -3- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    按照步骤 1.3 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。使用 (S)- 吡 咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]( 步骤 39.2) 和 5- 溴 -3- 三 氟甲基 - 吡啶 -2- 基胺 (WO2007095588)。将钯催化剂加入加热的剩余试剂的混合物中， 并 并用 DCM 萃取。干燥并浓缩有机相后， 将所得混合物在 120℃搅拌 3 小时， 用 DCM/H2O 稀释， 将残余物经硅胶柱色谱及反相 HPLC 纯化。标题化合物 ： ESI-MS ： 413.1[M-H]- ； TLC ： Rf ＝ aq 0.27(DCM/MeOH/NH3 ， 89 ∶ 10 ∶ 1)。
     实施例 42 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环丙 基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    在室温下将咪唑 -1- 甲酸 {4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环丙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 }- 酰胺 (4.0g) 加入搅拌过的 L- 脯氨酰胺 (1.48g) 和三乙胺 (4.1ml) 在 DMF(46ml) 的溶液中。将反应混合物在室温下放置 22 小时， 蒸发， 在用甲醇 (60ml) 和水 (20ml) 结晶
     后得到标题化合物， 为白色固体。HPLC/MS ： 保留时间 1.24 分钟， M+H 387.1 和 M-H 385.2。
     步骤 42.1 ： 咪唑 -1- 甲酸 {4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环丙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 }- 酰胺
    在 室 温 下 将 羰 基 二 咪 唑 (4.56g) 加 入 4- 甲 基 -5-[2-(1- 甲 基 - 环 丙 基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺 (10.5g) 和三乙胺 (4.28ml) 在 DMF(26ml) 的溶液中， 并随后在 80℃下加热 2 小时。冷却后， 经过滤分离标题化合物。
     步骤 42.2 ： 4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环丙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺
    
    将粉末的氢氧化钠 (5.86g) 加入 N ′ -[5-(3- 二甲基氨基 - 丙烯酰基 )-4- 甲 基 - 噻唑 -2- 基 ]-N， N- 二甲基 - 甲脒 (13g， 如 S.Wang 等人 J.Med.Chem.2004， 47， 1662-1675 中所述制备 ) 和 1- 甲基 - 环丙烷甲脒盐酸化物 (7.2g， 如 EP0227415 中所述制备 ) 在 2- 甲 氧基乙醇 (98ml) 的溶液中， 并将该混合物在搅拌中于 125℃下加热 1 小时。将反应混合物 冷却， 加入水， 经过滤分离标题化合物。ESI-MS ： M+H 247 和 M-H 245。
     实 施 例 43 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 异 丙 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    在室温下将咪唑 -1- 甲酸 [5-(2- 异丙基 - 嘧啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰 胺 (50mg) 加入 L- 脯氨酰胺 (19mg) 和三乙胺 (26μl) 在 DMF(152μl) 的溶液中。 将该混合 物在 40℃下搅拌 2 小时， 并随后用制备型反相色谱纯化。 将包含标题化合物的流份用 300mg 的 BondElut SPE、 SCX 柱捕获， 并随后用 7M 的氨在甲醇 (1ml) 中的溶液释放。经蒸发获得
     标题化合物。ESI-MS ： M+H 275 和 M-H 273。
     步骤 43.1 ： 咪唑 -1- 甲酸 {4- 甲基 -5-[2- 异丙基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰 胺
    按照实施例 42 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2- 异丙 基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环丙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基胺。
     实施例 44 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[5-(2- 苄基 - 嘧啶 -4- 基 )-4- 甲 基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    按照实施例 43 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2- 苄 基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2- 异丙基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 胺。ESI-MS ： M+H 423 和 M-H 421。
     实施例 45 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[5-(2- 乙基 - 嘧啶 -4- 基 )-4- 甲 基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    按照实施例 43 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2- 乙 基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2- 异丙基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 胺。ESI-MS ： M+H 361 和 M-H 359。
     实 施 例 46 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 甲 氧 基 甲 基 - 嘧
     啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    按照实施例 43 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2- 甲氧基 甲基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2- 异丙基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 胺。ESI-MS ： M+H 377 和 M-H 375。
     实施例 47 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(2， 6- 二氯 - 苄基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 43 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2-(2， 6- 二氯 - 苄基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2- 异丙基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基胺。ESI-MS ： M+H 491， 493 和 M-H 489， 491。
     实 施 例 48 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 异 丁 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    按照实施例 43 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2- 异丁 基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2- 异丙基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 胺。ESI-MS ： M+H 389 和 M-H 387。
     实施例 49 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(4- 甲氧基 - 苯氧基甲 基 )- 嘧啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     按照实施例 43 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2-(4- 甲 氧 基 - 苯 氧 基 甲 基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 胺 代 替 4- 甲 基 -5-[2- 异 丙 基 - 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺。ESI-MS ： M+H 469 和 M-H 467。
     实施例 50 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(3- 甲氧基 - 苯氧基甲 基 )- 嘧啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 43 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2-(3- 甲 氧 基 - 苯 氧 基 甲 基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 胺 代 替 4- 甲 基 -5-[2- 异 丙 基 - 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺。ESI-MS M-H 467。
     实 施 例 51 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-({5-[2-(2- 氟 - 苯 基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    在 室 温 下 将 咪 唑 -1- 甲 酸 {5-[2-(2- 氟 - 苯 基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 }- 酰胺 (415mg) 加入 L- 脯氨酰胺 (137mg) 和三乙胺 (182μl) 在 DMF(1.1ml) 的 溶液中。将该混合物在 40℃下搅拌 18 小时， 蒸发并在甲醇 (8ml) 和水 (2ml) 中结晶， 得到 标题化合物， 为白色固体。ESI-MS ： M+H 427 和 M-H 425。
     步 骤 51.1 ： 咪 唑 -1- 甲 酸 {5-[2-(2- 氟 - 苯 基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 }- 酰胺
    
     按 照 实 施 例 43 中 所 述 类 似 的 方 法 制 备 标 题 化 合 物，但 使 用 4- 甲 基 -5-[2-(2- 氟 - 苯基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环 丙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺。
     实 施 例 52 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 三 氟 甲 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    在 室 温 下 将 L- 脯 氨 酰 胺 (9mg) 加 入 咪 唑 -1- 甲 酸 [5-(2- 三 氟 甲 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 (25mg) 和三乙胺 (12μl) 在 DMF(71μl) 的溶液 中。将该混合物在 25℃下搅拌 18 小时， 并经制备型反相色谱纯化。将包含标题化合物的 流份用 300mg 的 BondElut SPE、 SCX 柱捕获， 并随后用 7M 的氨在甲醇 (1ml) 中的溶液释放。 经蒸发获得标题化合物。ESI-MS ： M+H401 和 M-H 399。
     步 骤 52.1 ： 咪 唑 -1- 甲 酸 {4- 甲 基 -5-[2- 三 氟 甲 基 - 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 }- 酰胺
    
    按照实施例 43 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2- 三氟甲 基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环丙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基胺。
     实施例 53 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 一甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2-(1， 1， 2- 三甲 基 - 丙基 )- 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
     按照实施例 51 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2-(1， 1， 2- 三甲基 - 丙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2-(2- 氟 - 苯基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺。ESI-MS ： M+H 417 和 M-H 415。
     实 施 例 54 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-[(5-{2-[1-(4- 甲 氧 基 - 苯 基 )-1- 甲基 - 乙基 ]- 嘧啶 -4- 基 }-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    按 照 实 施 例 51 中 所 述 类 似 的 方 法 制 备 标 题 化 合 物， 但 使 用 5-{2-[1-(4- 甲 氧 基 - 苯 基 )-1- 甲 基 - 乙 基 ]- 嘧 啶 -4- 基 }-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 胺 代 替 4- 甲 基 -5-[2-(2- 氟 - 苯基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺。E SI-MS ： M+H 495 和 M-H 493。 实施例 55 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(2- 氟 -1- 氟甲基 -1- 甲 基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 6 小时。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 15 小 时。 在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 100℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。 在步骤 1.3 中， 将反应混合物在 120℃下搅拌 2 小时。在步骤 1.4 中， 将反应混合物在 85℃下搅拌 30 分钟， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 65℃下搅拌 1 小时， 不 进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 粗产物不再纯化。在步骤 1.7 中， 使用 3- 氟 -2- 氟 甲基 -2- 甲基 - 丙酰氯 ( 步骤 55.1)。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 424.1[M+H]+ ； tR ＝ 2.40min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.35(DCM/
     MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 55.1 ： 3- 氟 -2- 氟甲基 -2- 甲基 - 丙酰氯
    按照步骤 5.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 3- 氟 -2- 氟甲基 -2- 甲 基 - 丙酸 ( 步骤 55.2)。
     步骤 55.2 ： 3- 氟 -2- 氟甲基 -2- 甲基 - 丙酸
    
    按照步骤 73.2 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 3- 氟 -2- 氟甲基 -2- 甲 基 - 丙酸甲酯 ( 制备 WO 2007/053394)。ESI-MS ： 137.0[M-H]-。
     实施例 56 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2-(1， 1- 二甲基 - 丙 基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 43 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2-(1， 1- 二 甲 基 - 丙 基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 胺 代 替 4- 甲 基 -5-[2- 异 丙 基 - 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺。ESI-MS ： M+H 403 和 M-H 401。
     实施例 57 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 -1- 对 甲苯基 - 乙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 43 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2-(1- 甲 基 -1- 对甲苯基 - 乙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2- 异丙基 - 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺。E SI-MS ： M+H 479 和 M-H 477。
     实施例 58 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2-(1- 苯基 - 环戊 基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )按照实施例 43 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2-(1- 苯 基 - 环戊基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2- 异丙基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基胺。E SI-MS ： M+H 477 和 M-H 475。
     实施例 59 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2- 环丙基 - 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 43 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2- 环丙 基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2- 异丙基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 胺。ESI-MS ： M+H 373 和 M-H 371。
     实施例 60 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2- 环丁基 - 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 52 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2- 环丁 基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2- 三氟甲基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 胺。ESI-MS ： M+H 387 和 M-H 385。
     实 施 例 61 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2-d9- 叔 丁 基 - 嘧
     啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    在 室 温 下 将 咪 唑 -1- 甲 酸 [5-(2-d9- 叔 丁 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 ]- 酰 胺 (0.82g) 加 入 搅 拌 过 的 L- 脯 氨 酰 胺 (0.29g) 和 三 乙 胺 (0.81ml) 在 DMF(5ml) 的溶液中。将反应混合物在室温下放置 22 小时， 随后蒸发， 并用 2 ∶ 1 的甲醇 ： 水结晶两次后得到标题化合物， 为白色固体。HPLC/MS ： 保留时间 1.27 分钟， M+H 398.3 和 M-H 396.3。
     步 骤 61.1 ： 咪 唑 -1- 甲 酸 [5-(2-d9- 叔 丁 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 ]- 酰胺
    
    在 室 温 下 将 羰 基 二 咪 唑 (0.77g) 加 入 搅 拌 过 的 5-(2-d9- 叔 丁 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基胺 (1.11g) 在 DMF(4.3ml) 的溶液中。随后将反应混合物 在 25℃下放置 18 小时， 然后经过滤分离标题化合物。
     步骤 61.2 ： 5-(2-d9- 叔丁基 - 嘧啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基胺
    
    将粉末氢氧化钠 (3.71g) 加入 N′ -[5-(3- 二甲基氨基 - 丙烯酰基 )-4- 甲基 - 噻 唑 -2- 基 ]-N， N- 二甲基 - 甲脒 (5.51g) 和 d9-2， 2- 二甲基 - 丙脒盐酸化物 (4.50g) 在 2- 甲 氧基乙醇 (41ml) 的溶液中， 并将该混合物在搅拌中于 125℃下加热 1 小时。将反应混合物
     冷却， 加入水， 并经过滤分离粗产物。将粗产物经制备型 HPLC 纯化， 并将包含标题化合物的 流份在二氯甲烷和碳酸氢钠水溶液之间分配。 蒸发干燥过的二氯甲烷层之后得到标题化合 物， 为黄色固体。HPLC/MS ： 保留时间 1.12 分钟， M+H 258.4。
     步骤 61.3 ： d9-2， 2- 二甲基 - 丙脒盐酸化物
    将 2M 的三甲基铝在甲苯 (61ml) 中的溶液逐滴加入用冰浴冷却的氯化铵 (6.53g) 在甲苯 (46ml) 的混悬液中。 将反应混合物在室温下搅拌 4 小时， 并加入 d9-2， 2- 二甲基 - 丙 酸丁酯 (6.3g)。在 80℃加热 4 天后， 将反应混合物冷却至 0℃， 并逐滴加入甲醇 (200ml)。 在室温下搅拌并超声处理 1 小时后， 将反应混合物经 Hyflo 过滤， 用甲醇洗涤， 并蒸发滤液， 得到标题化合物， 为灰白色固体。
     步骤 61.4 ： d9-2， 2- 二甲基 - 丙酸丁酯
    
    将 d9- 叔丁基氯 (5.0g) 分批加入镁 (1.50g) 在四氢呋喃 (20ml) 的混悬液中， 用 催化量的碘活化， 加热以保持稳定回流持续 1 小时。然后将反应混合物再加热 1 小时， 以保 证格氏试剂形成完全。随后将上述格氏试剂溶液逐滴加入用冰浴冷却的咪唑 -1- 甲酸丁酯 (7.5g， 如 T.Werner 和 A.G.M.Barrett J.Org.Chem.2006， 71， 4302-4304 中所述制备 ) 在四 氢呋喃 (40ml) 的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌 18 小时， 加入水 (200ml)， 将该混合 物经 Hyflo 过滤， 滤液用乙醚萃取， 并将乙醚层用硫酸钠干燥并蒸发， 得到标题化合物。
     实施例 62 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2-(2- 甲基 - 环丙 基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    在室温下将咪唑 -1- 甲酸 {4- 甲基 -5-[2-(2- 甲基 - 环丙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 }- 酰 胺 (50mg) 加 入 搅 拌 过 的 L- 脯 氨 酰 胺 (18mg) 和 三 乙 胺 (25μl) 在
     DMF(147μl) 的溶液中。将反应混合物在 40℃下搅拌 2 小时， 并经制备型反相色谱纯化。 将包含标题化合物的流份用 300mg 的 BondElut SPE、 SCX 柱捕获， 并随后用 7M 的氨在甲醇 (1ml) 中的溶液释放。经蒸发获得标题化合物。ESI-MS ： M+H 387 和 M-H 385。
     步骤 62.1 ： 咪唑 -1- 甲酸 {4- 甲基 -5-[2-(2- 甲基 - 环丙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 }- 酰胺
    在 室 温 下 将 羰 基 二 咪 唑 (487mg) 加 入 4- 甲 基 -5-[2-(2- 甲 基 - 环 丙 基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺 (370mg) 和三乙胺 (251μl) 在 DMF(1.5ml) 的溶液中， 并随后在 40℃下加热 2 小时。将反应混合物蒸发， 并用氯仿研磨。经过滤分离标题化合物。
    
    
    步骤 62.2 ： 4- 甲基 -5-[2-(2- 甲基 - 环丙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺将粉末氢氧化钠 (300mg) 加入 N′ -[5-(3- 二甲基氨基 - 丙烯酰基 )-4- 甲基 - 噻 唑 -2- 基 ]-N， N- 二甲基 - 甲脒 (1g， 如 S.Wang 等人 J.Med.Chem.2004， 47， 1662-1675 中所 述制备 ) 和顺式 / 反式 2- 甲基 - 环丙烷甲脒盐酸化物 (0.61g， 如 WO 03/087064 中所述制 备 ) 在 2- 甲氧基乙醇 (3.8ml) 的溶液中， 并将该混合物在搅拌中于 125℃下加热 1 小时。 将反应混合物冷却， 过滤， 用水洗涤， 得到标题化合物。MS ： M+H 247 和 M-H 245。
    实 施 例 63(S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 二 乙 基 氨 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    在 室 温 下 将 咪 唑 -1- 甲 酸 [5-(2- 二 乙 基 氨 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲 基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰 胺 (40mg) 加 入 搅 拌 过 的 L- 脯 氨 酰 胺 (14mg) 和 三 乙 胺 (19μl) 在 DMF(147μl) 的溶液中。将反应混合物在 40℃下搅拌 2 小时， 并经制备型反相色谱纯化。 将包含标题化合物的流份用 300mg 的 BondElut SPE、 SCX 柱捕获， 并随后用 7M 的氨在甲醇 (1ml) 中的溶液释放。经蒸发获得标题化合物。ESI-MS ： M+H 404 和 M-H 402。
     步 骤 63.1 ： 咪 唑 -1- 甲 酸 [5-(2- 二 乙 基 氨 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 ]- 酰胺
    在室温下将羰基二咪唑 (437mg) 加入 [4-(2- 氨基 -4- 甲基 - 噻唑 -5- 基 )- 嘧 啶 -2- 基 ]- 二乙基 - 胺 (355mg) 和三乙胺 (207μl) 在 DMF(1.4ml) 的溶液中， 并随后在 80℃下加热 18 小时。将反应混合物蒸发并用氯仿研磨。经过滤分离标题化合物。
     步骤 63.2 ： [4-(2- 氨基 -4- 甲基 - 噻唑 -5- 基 )- 嘧啶 -2- 基 ]- 二乙基 - 胺
    
    将粉末氢氧化钠 (150mg) 加入 N′ -[5-(3- 二甲基氨基 - 丙烯酰基 )-4- 甲基 - 噻 唑 -2- 基 ]-N， N- 二甲基 - 甲脒 (0.5g， 如 S.Wang 等人 J.Med.Chem.2004， 47， 1662-1675 中 所述制备 ) 和 1， 1- 二乙基胍 (259mg) 在 2- 甲氧基乙醇 (1.9ml) 的溶液中， 并将该混合物 在搅拌中于 125℃下加热 1 小时。 将反应混合物真空浓缩， 并经正相色谱纯化， 洗脱剂 ； DCM/ EtOAc， 得到标题化合物。ESI-MS ： M+H 264 和 M-H 262。
     实施例 64 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    在室温下将咪唑 -1- 甲酸 {4- 甲基 -5-[2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 (69mg) 加入搅拌过的 L- 脯氨酰胺 (22mg) 和三乙胺 (53mg)在 DMF(1ml) 的溶液中。将反应混合物在室温下放置 22 小时， 随后蒸发， 并用甲醇 (2ml) 和 水 (1ml) 结晶后得到标题化合物， 为白色固体。HPLC/MS ： 保留时间 1.80 分钟， M+H 443.1 和 M-H 441.2。
     步骤 64.1 ： 咪唑 -1- 甲酸 {4- 甲基 -5-[2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺
    在 室 温 下 将 羰 基 二 咪 唑 (38mg) 加 入 4- 甲 基 -5-[2-(2， 2， 2- 三 氟 -1， 1- 二 甲 基 - 乙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺 (65mg) 在 DCM(1ml) 和 DMF(0.2ml) 的溶液中， 并 随后在 25℃下放置 18 小时。冷却后经过滤分离标题化合物。
     步骤 64.2 ： 4- 甲基 -5-[2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基胺
    
    将粉末氢氧化钠 (0.42g) 加入 N′ -[5-((E)-3- 二甲基氨基 - 丙烯酰基 )-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 ]-N， N- 二 甲 基 - 甲 脒 (0.93g， 如 S.Wang 等 人 J.Med.Chem.2004， 47， 1662-1675 中所述制备 ) 和 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙脒盐酸化物 (0.54g) 在 2- 甲氧 基乙醇 (7ml) 的溶液中， 并将该混合物在搅拌中于 125℃下加热 1 小时。将反应混合物冷 却， 加入水， 并将水层用 10％甲醇的二氯甲烷溶液萃取 4 次。合并的有机层经反相色谱纯 化， 并将碳酸氢钠加入包含标题化合物的流份中， 得到白色沉淀， 其经过滤收集。HPLC/MS ： 保留时间 1.47 分钟， M+H 303.1。
     步骤 64.3 ： 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙脒盐酸化物
    
    按照步骤 61.3 中所述方法合成标题化合物， 并进行如下修改。使用 3， 3， 3- 三 氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酸丁酯代替 d9-2， 2- 二甲基 - 丙酸丁酯， 并将该混合物在 80℃下搅拌 3天。将粗产物溶于用少量 HCl 的 EtOH 溶液处理过的 DCM 中并蒸发。将残余物用 DCM 研磨， 过滤并干燥， 得到标题化合物， 为灰白色固体。
     步骤 64.4 ： 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酸丁酯
    将 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酸 (3.0g， 19.2mmol) 和一滴 DMF 溶于 30mL 的 DCM 中， 并在室温下用草酰氯 (1.85mL， 21.1mmol) 逐滴处理。2 小时后， 气体停止产生， 并将 该混合物用三乙胺 (5.36mL， 38.4mmol)、 随后用正丁醇 (2.1mL， 23mmol) 缓慢处理。将该混 合物搅拌过夜， 蒸发溶剂， 并将残余物用己烷搅拌。滤出固体， 并蒸发滤液得到褐 - 红色油 状物。Kuge)rohr 蒸馏 (10 毫巴， 60-80℃炉温 )， 得到标题化合物， 为无色液体。
     实施例 65(S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-( 乙基 - 甲基 - 氨基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    将 (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 甲 烷 亚 磺 酰 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }(60mg) 和 N- 乙基甲基胺 (45mg) 在密封的试管 中于 80℃下加热 18 小时。然后将粗产物用制备型反相色谱纯化。将包含标题化合物的流 份用 300mg 的 BondElut SPE、 SCX 柱捕获， 并随后用 7M 的氨在甲醇 (1ml) 中的溶液释放。 经蒸发获得标题化合物。ESI-MS ： M+H 390。
     步 骤 65.1 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 甲 烷 亚 磺 酰 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    在 0 ℃下将间 - 氯过氧苯甲酸 (0.50g) 加入 (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺1-{[4- 甲基 -5-(2- 甲基硫基 - 嘧啶 -4- 基 )- 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }(1.7g) 在二氯甲烷 (8.5ml) 的溶液中。1 小时后将反应混合物蒸发， 并经正相色谱纯化， 用二氯甲烷 / 甲醇梯 度洗脱， 得到标题化合物， 为黄色固体。ESI-MS ： M+H 395 和 M-H 393。
     步骤 65.2 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[4- 甲基 -5-(2- 甲基硫基 - 嘧 啶 -4- 基 )- 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    在 室 温 下 将 咪 唑 -1- 甲 酸 [4- 甲 基 -5-(2- 甲 基 硫 基 - 嘧 啶 -4- 基 )- 噻 唑 -2- 基 ]- 酰胺 (1.0g) 加入搅拌过的 L- 脯氨酰胺 (379mg) 和三乙胺 (0.51ml) 在 DMF(3ml) 的溶液中。 将反应混合物在 40℃下搅拌 2 小时， 然后蒸发， 用二氯甲烷和水沉淀后得到标题 化合物， 为橙色固体。ESI-MS ： M+H 379 和 M-H377。
     步 骤 65.3 ： 咪 唑 -1- 甲 酸 [4- 甲 基 -5-(2- 甲 基 硫 基 - 嘧 啶 -4- 基 )- 噻 唑 -2- 基 ]- 酰胺
    
    在室温下将羰基二咪唑 (1.77g) 加入 4- 甲基 -5-(2- 甲基硫基 - 嘧啶 -4- 基 )- 噻 唑 -2- 基胺 (1.3g) 在三乙胺 (0.84ml) 和 DMF(5.5ml) 的溶液中， 并在 80℃下搅拌 2 小时。 冷却后经过滤分离标题化合物。
     步骤 65.4 ： 4- 甲基 -5-(2- 甲基硫基 - 嘧啶 -4- 基 )- 噻唑 -2- 基胺
    
    将粉末氢氧化钠 (1.09g) 加入 N′ -[5-(3- 二甲基氨基 - 丙烯酰基 )-4- 甲基 - 噻 唑 -2- 基 ]-N， N- 二甲基 - 甲脒 (2.0g， 按照 S.Wang 等人 J.Med.Chem.2004， 47， 1662-1675 所述制备 ) 和硫脲 (0.57g) 在乙醇 (25ml) 的溶液中， 并将该混合物在搅拌中于回流下加热 3 小时。将反应混合物冷却至室温， 并随后加入水和碘甲烷 (0.47ml)。室温下 1 小时后， 蒸发除去乙醇， 并加入水， 用 2N 的盐酸水溶液将 pH 调至 7。经过滤得到标题化合物。ESI-MS ： M+H239 和 M-H 237。
     实施例 66(S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[5-(6- 环丙基 - 吡嗪 -2- 基 )-4- 甲 基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    在室温下将咪唑 -1- 甲酸 [5-(6- 环丙基 - 吡嗪 -2- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰 胺 (78mg) 加入搅拌过的 L- 脯氨酰胺 (30mg) 和三乙胺 (83μl) 在 DMF(1ml) 的溶液中。将 反应混合物在室温下放置 18 小时， 蒸发， 并在用甲醇 (1ml) 和水 (0， 5ml) 结晶后得到标题 化合物， 为黄 / 白色固体。HPLC/MS ： 保留时间 1.40 分钟， M+H 373.1 和 M-H 371.3。
     步骤 66.1 ： 咪唑 -1- 甲酸 [5-(6- 环丙基 - 吡嗪 -2- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰 胺
    
    在室温下将羰基二咪唑 (74mg) 加入 5-(6- 环丙基 - 吡嗪 -2- 基 )-4- 甲基 - 噻 唑 -2- 基胺 (96mg) 在 DMF(2ml) 的溶液中， 并在室温下放置 18 小时。将反应混合物过滤， 用二氯甲烷洗涤， 得到标题化合物。
     步骤 66.2 ： 5-(6- 环丙基 - 吡嗪 -2- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基胺
    
    在室温下将浓盐酸 (0.4ml) 加入 N-[5-(6- 环丙基 - 吡嗪 -2- 基 )-4- 甲基 - 噻 唑 -2- 基 ]- 乙酰胺 (120mg) 在乙醇 (9ml) 的溶液中， 并将该混合物在回流下加热 18 小时。 将冷却的反应混合物蒸发， 用碳酸氢钠水溶液中和， 并用 10％甲醇的 DCM 溶液萃取。 将合并 的有机萃取物用硫酸钠干燥并蒸发， 得到标题化合物。HPLC/MS ： 保留时间 0.93 分钟， M+H 233.3。
     步骤 66.3 ： N-[5-(6- 环丙基 - 吡嗪 -2- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 乙酰胺
    在室温下将氩气鼓入 2- 环丙基 -6- 氯吡嗪 (154mg， 按照 A.Fiirstner 等人 J.Am. Chem.Soc.2002， 214， 13856-13863 的方法制备 )、 2- 乙酰氨基 -4- 甲基噻唑 (200mg)、 乙酸 钯 (24mg)、 三叔丁基 四氟硼酸盐 (61mg) 和碳酸铯 (678mg) 在 DMF(3ml) 的混合物中持续5 分钟。将反应混合物在密封小瓶内在氩气中于 150℃下在 Biotage InitiatorTM 微波设备 中加热 45 分钟。将反应混合物过滤， 并经制备型 HPLC 纯化。将包含标题化合物的流份合 并， 并蒸发除去乙腈， 经过滤得到标题化合物， 为浅褐色固体。HPLC/MS ： 保留时间 1.65 分 钟， M+H 275.3。 实施例 67(S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[4- 甲基 -5-(5- 三氟甲基 - 吡 啶 -3- 基 )- 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    在 室 温 下 将 羰 基 二 咪 唑 (29mg) 加 入 搅 拌 过 的 4- 甲 基 -5-(5- 三 氟 甲 基 - 吡 啶 -3- 基 )- 噻唑 -2- 基胺 (42mg) 和三乙胺 (50μl) 在 DMF(1ml) 的溶液中， 并将该混合物 在室温下放置 18 小时。加入 L- 脯氨酰胺 (20mg)， 并将反应混合物在室温下再放置 8 小时， 蒸发， 并在用甲醇 (3ml) 和水 (1.5ml) 结晶后得到标题化合物， 为白色固体。ESI-MS ： M+H 400。
     步骤 67.1 ： 4- 甲基 -5-(5- 三氟甲基 - 吡啶 -3- 基 )- 噻唑 -2- 基胺
    
    在室温下将三甲基硅烷基氯化物 (0.3ml) 加入 N-[4- 甲基 -5-(5- 三氟甲基 - 吡 啶 -3- 基 )- 噻唑 -2- 基 ]- 乙酰胺 (44mg) 在乙醇 (2ml) 的溶液中， 并将该混合物在室温下搅拌 4.5 小时。 然后将反应物在 50℃加热 18 小时， 冷却， 蒸发， 并在用乙醚研磨后经过滤得 到标题化合物。
     步骤 67.2 ： N-[4- 甲基 -5-(5- 三氟甲基 - 吡啶 -3- 基 )- 噻唑 -2- 基 ]- 乙酰胺
    在 室 温 下 将 氩 气 鼓 入 5-( 三 氟 甲 基 )-3- 吡 啶 基 硼 酸 盐 酸 化 物 (263mg， 如 WO 2007/134828 中所述制备 )、 2- 乙酰氨基 -5- 碘 -4- 甲基噻唑 (260mg， 如 WO 2006/125807 中 所述制备 )、 1， 1′ - 二 -( 二苯基膦基 )- 二茂铁二氯化钯 (II)(38mg)、 碳酸钠 (488mg) 在 DME(2.3ml) 的溶液和水 (2.3ml) 的混合物中持续 5 分钟。将反应混合物在密封小瓶内在 氩气中于 80℃下在 BiotageInitiatorTM 微波设备中加热 30 分钟， 并随后在 80℃下加热 60 分钟。冷却后将反应混合物用 DCM 萃取， 用硅胶蒸发合并的有机层， 并经正相色谱纯化 ( 洗 脱剂 ； 从 DCM 到 DCM ： 乙酸乙酯 1 ∶ 1 梯度洗脱 )。随后将包含产物的流份用甲醇 (5ml)、 DMF(0.3ml) 和水 (1.3ml) 研磨并过滤， 得到标题化合物， 为浅褐色固体。
    
    
    实 施 例 68(S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(6-d10- 二 乙 基 氨 基 - 吡 嗪 -2- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }在室温下将咪唑 -1- 甲酸 [5-(6-d10- 二乙基氨基 - 吡嗪 -2- 基 )-4- 甲基 - 噻 唑 -2- 基 ]- 酰胺 (82mg) 加入搅拌过的 L- 脯氨酰胺 (28mg) 和三乙胺 (78μl) 在 DMF(1ml) 的溶液中。将反应混合物在室温下放置 14 小时， 蒸发， 并在用甲醇 (1ml) 和水 (0.5ml) 结 晶后得到标题化合物， 为黄 / 白色固体。HPLC/MS ： 保留时间 1.41 分钟， M+H 414.2 和 M-H 412.3。
     步骤 68.1 ： 咪唑 -1- 甲酸 [5-(6-d10- 二乙基氨基 - 吡嗪 -2- 基 )-4- 甲基 - 噻 唑 -2- 基 ]- 酰胺
    
    在室温下将羰基二咪唑 (78mg) 加入 5-(6-d10- 二乙基氨基 - 吡嗪 -2- 基 )-4- 甲 基 - 噻唑 -2- 基胺 (121mg) 在 DMF(2ml) 的溶液中， 并在室温下放置 3.5 小时。将反应混合 物过滤， 用二氯甲烷洗涤， 得到标题化合物。
     步骤 68.2 ： 5-(6-d10- 二乙基氨基 - 吡嗪 -2- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基胺
    
    在室温下将浓盐酸 (0.4ml) 加入 N-[5-(6-d10- 二乙基氨基 - 吡嗪 -2- 基 )-4- 甲 基 - 噻唑 -2- 基 ]- 乙酰胺 (140mg) 在乙醇 (9ml) 的溶液中， 并将该混合物在回流下加热 40 小时。将该冷却的反应混合物蒸发， 用碳酸氢钠水溶液中和， 并用 10％甲醇的 DCM 溶液萃 取。将合并的有机萃取物用硫酸钠干燥并蒸发， 得到标题化合物。HPLC/MS ： 保留时间 1.17 分钟， M+H 274.4。
     步骤 68.3 ： N-[5-(6-d10- 二乙基氨基 - 吡嗪 -2- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 乙 酰胺
    
    将氩气鼓入 2-d10- 二乙基氨基 -6- 氯吡嗪 (293mg)、 2- 乙酰氨基 -4- 甲基噻唑 四氟硼酸盐 (61mg) 和碳酸铯 (1.02g) 在 DMF(3ml)(300mg)、 乙酸钯 (24mg)、 三叔丁基的混合物中持续 5 分钟。将反应混合物在密封的小瓶内在氩气中于 150 ℃下在 Biotage InitiatorTM 微波设备中加热 45 分钟， 过滤并经制备型 HPLC 纯化。将包含标题化合物的流 份合并， 并蒸发除去乙腈， 经过滤得到标题化合物， 为浅褐色固体。HPLC/MS ： 保留时间 1.68 分钟， M+H 316.3。步骤 68.4 ： 2-d10- 二乙基氨基 -6- 氯吡嗪在室温下将 d10- 二乙基胺 (0.5g) 加入搅拌过的 2， 6- 二氯吡嗪 (0.93g) 和碳酸 钾 (1.41g) 在乙腈 (4ml) 的溶液中。随后将反应混合物在 55℃下加热 60 小时， 冷却， 加入 水并随后用二氯甲烷萃取。 将合并的有机萃取物用硫酸钠干燥， 蒸发并经正相色谱纯化， 用 DCM 洗脱， 得到标题化合物。HPLC/MS ： 保留时间 2.10 分钟， M+H 196.4 和 198.4。
     实 施 例 69(S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(6- 二 乙 基 氨 基 - 吡 嗪 -2- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    按照实施例 68 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用二乙基胺代替 d10- 二乙 基胺。HPLC/MS ： 保留时间 1.43 分钟， M+H 404.2 和 402.3。
     实 施 例 70 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 环 丙 基 甲 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    按 照 实 施 例 42 中 所 述 类 似 的 方 法 制 备 标 题 化 合 物， 但 使 用 咪 唑 -1- 甲 酸 [5-(2- 环丙基甲基 - 嘧啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺代替咪唑 -1- 甲酸 {4- 甲 基 -5-[2-(1- 甲 基 - 环 丙 基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 }- 酰 胺。M.p.220-222 ℃， ESI-MS[M+H]+387.1， TLC ： Rf ＝ 0.2(DCM/EtOH 95 ∶ 5)
     步 骤 70.1 ： 咪 唑 -1- 甲 酸 [5-(2- 环 丙 基 甲 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 ]- 酰胺
    
     按照步骤 42.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 5-(2- 环丙基甲基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环丙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 胺， 并 将 反 应 物 搅 拌 15 小 时。M.p.240-243 ℃， ESI-MS[M+H]+305.1， TLC ： Rf ＝ 0.35(DCM/EtOH 95 ∶ 5)。
     步骤 70.2 ： 5-(2- 环丙基甲基 - 嘧啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基胺
    
    按照步骤 42.2 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 2- 环丙基 - 乙脒盐酸 化物代替 1- 甲基 - 环丙烷甲脒盐酸化物。M.p.198-200℃， ESI-MS[M+H]+247.1， TLC ： Rf ＝ 0.25(DCM/EtOH 95 ∶ 5)。
     实施例 71 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(2- 氟 -1， 1- 二甲基 - 乙 基 )- 嘧啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按 照 实 施 例 42 中 所 述 类 似 的 方 法 制 备 标 题 化 合 物， 但 使 用 咪 唑 -1- 甲 酸 {5-[2-(2- 氟 -1， 1- 二 甲 基 - 乙 基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 }- 酰 胺 代 替 咪唑 -1- 甲酸 {4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环丙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺。 M.p.187-190℃， ESI-MS[M+H]+407.1， TLC ： Rf ＝ 0.3(DCM/EtOH 95 ∶ 5)
     步骤 71.1 ： 咪唑 -1- 甲酸 {5-[2-(2- 氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]-4- 甲 基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺
    
    按照步骤 42.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 5-[2-(2- 氟 -1， 1- 二 甲基 - 乙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环丙 基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺， 并将反应物在 80℃下搅拌 16 小时。
     步骤 71.2 ： 5-[2-(2- 氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 胺
    
    按照步骤 42.2 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 3- 氟 -2， 2- 二甲基 - 丙 + 脒盐酸化物代替 1- 甲基 - 环丙烷 - 甲脒盐酸化物。 ESI-MS[M+H] 267.1， TLC ： Rf ＝ 0.4(DCM/ EtOH 95 ∶ 5)。
     实施例 72 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[5-(2- 叔丁基 -6- 甲基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    按 照 实 施 例 42 中 所 述 类 似 的 方 法 制 备 标 题 化 合 物， 但 使 用 咪 唑 -1- 甲 酸 [5-(2- 叔丁基 -6- 甲基 - 嘧啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺代替咪唑 -1- 甲酸 {4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环丙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺。M.p.197-199℃， ESI-MS[M+H]+403.1， TLC ： Rf ＝ 0.3(DCM/EtOH 95 ∶ 5)
     步骤 72.1 ： 咪唑 -1- 甲酸 [5-(2- 叔丁基 -6- 甲基 - 嘧啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻 唑 -2- 基 ]- 酰胺
    
    按照步骤 42.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 5-(2- 叔丁基 -6- 甲 基 - 嘧啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环丙基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺， 并将反应物搅拌 16 小时。ESI-MS[M-H]-355.2。
     步骤 72.2 ： 5-(2- 叔丁基 -6- 甲基 - 嘧啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基胺
    
    按照步骤 1.2 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 N-[5-(2- 叔丁基 -6- 甲 基 - 嘧啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 乙酰胺代替 N-[5-(2- 叔丁基 - 吡啶 -4- 基 )-4- 甲 基 - 噻唑 -2- 基 ]- 乙酰胺， 并使用 2N HCl。将反应混合物在室温下搅拌 16 小时， 并随后在 + 90℃下搅拌 3 小时。ESI-MS[M+H] 263.1。
     步骤 72.3 ： N-[5-(2- 叔丁基 -6- 甲基 - 嘧啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 乙 酰胺
    
    按照步骤 1.3 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 溴 -2- 叔丁基 -6- 甲 + 基 - 嘧啶代替 4- 溴 -2- 叔丁基 - 吡啶。ESI-MS[M+H] 305.2。
     步骤 72.4 ： 4- 溴 -2- 叔丁基 -6- 甲基 - 嘧啶
    
    按 照 步 骤 1.4 中 所 述 类 似 的 方 法 制 备 标 题 化 合 物， 但 使 用 2- 叔 丁 基 -6- 甲 基 -3H- 嘧啶 -4- 酮代替 2- 叔丁基 -1H- 吡啶 -4- 酮。ESI-MS[M+H]+229/231.0。TLC ： Rf ＝ 0.58( 己烷 /DCM 7 ∶ 3)
     实施例 73 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(2- 氟 -1， 1- 二甲基 - 乙
     基 )- 吡啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 6 小时。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 15 小 时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 100℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步 骤 1.3 中， 将反应混合物在 120℃下搅拌 4 小时。在步骤 1.4 中， 将反应混合物在 85℃下搅 拌 30 分钟， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 70℃下搅拌 1 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 粗产物不再纯化。在步骤 1.7 中， 使用 3- 氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酰氯 ( 步骤 76.1)。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 406.1[M+H]+ ； tR ＝ 2.20min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.47(DCM/ MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 73.1 ： 3- 氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酰氯
    
    按照步骤 5.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 3- 氟 -2， 2- 二甲基 - 丙 酸 ( 步骤 73.2)。
     步骤 73.2 ： 3- 氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酸
    
    将 6.9g(38.6mmol)3- 氟 -2， 2- 二 甲 基 - 丙 酸 甲 酯 在 30mL 甲 醇 中 的 溶 液 用 38.6mL(77mmol) 的 2N NaOH 处理， 并将该混合物加热至回流持续 3 小时。将该混合物冷却 至室温， 并蒸发溶剂。将残余物在水和 DCM 之间分配。将水相通过加入 50mL 的 2N HCl 酸 化， 并用乙酸乙酯萃取。将有机相用盐水洗涤， 用硫酸钠干燥并蒸发。无色残余物用己烷搅 拌， 过滤除去不溶物， 蒸发滤液得到标题化合物， 为无色固体。ESI-MS ： 119.0[M-H]-。
     步骤 73.3 ： 3- 氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酸甲酯
    
    将 27mL 的 1M 四 丁 基 氟 化 铵 在 THF 中 的 溶 液 在 冰 冷 却 下 缓 慢 加 入 7.25g(27.4mmol) 的 2， 2- 二甲基 -3- 三氟甲磺酰基氧基 - 丙酸甲酯在 150mL 的 THF 中的溶 液。将所得溶液在 0℃下搅拌 6 小时， 并随后在室温下搅拌 10 小时。小心蒸发溶剂， 并将残余物在 DCM 和盐水之间分配。将有机相用盐水洗涤， 用硫酸钠干燥并小心蒸发。将褐色油 状物在 Kugelrohr 炉 ( 炉温 120-150℃ ) 中蒸馏， 得到标题化合物， 为无色液体。
     步骤 73.4 ： 2， 2- 二甲基 -3- 三氟甲磺酰基氧基 - 丙酸甲酯
    在 -70 ℃ 下 在 氩 气 中 向 3.64g(27.5mmol)3- 羟 基 -2， 2- 二 甲 基 - 丙 酸 甲 酯 和 4.82mL(41.3mmol)2， 6- 二甲基吡啶在 50mL 无水 DCM 的溶液中缓慢加入三氟甲磺酸酐 (5.12mL， 30.3mmol)。将该黄色溶液在 -70℃下搅拌 5 分钟， 随后移去冷却浴， 并将该混合 物在室温下搅拌 3 小时。颜色从黄色变为橙色再变为褐色。加入 DCM(50mL)， 并将该溶液 用 2N HCl 洗涤两次， 用硫酸钠干燥并蒸发至干。将该褐色残余物真空干燥， 且该标题化合 物不经进一步纯化直接使用。TLC ： Rf ＝ 0.72(EtOAc/ 己烷 1 ∶ 2)。
     分析型 HPLC 条件 ：
     5 分钟内线性梯度 20-100 ％溶剂 A+1.5 分钟 100 ％溶剂 A ； 在 215nm 检测， 流速 1mL/min， 于 30℃下。柱 ： Nucleosil 100-3C18(70x4.0mm)。溶剂 A ＝ CH3CN+0.1％ TFA ； 溶 剂 B ＝ H2O+0.1％ TFA。
     MS 条件 ：
     仪器 ： Micromass Platform II， 洗脱剂 ： 15％甲醇水溶液， 包含 0.2％的 25％氢氧 化铵溶液。 1
     H-NMR 波谱在 Varian Mercury 400 波谱仪上在指定溶剂中检测。缩写 ： br ： 宽； s： 单峰 ； d： 双峰 ； t： 三重峰 ； q： 四重峰 ； ppm ： 百万分之
     HPLC/MS 条件 ：
     仪器 ： Hewlett Packard Agilent 1100 系 列， 柱： XBridgeTM C182.5 微 米， 3.0X 30mm， 温度 ： 50℃， 洗脱剂 ： 2 通道系统 ： 通道 A 5％乙腈的水溶液， 通道 B 包含 1.0％甲酸的 乙腈
    
    检测 ： Agilent 1100DAD 210-350nm 和 Waters Micromass ZQ 2000ESI+ 和 ESI-。
     制备型 HPLC ：
     仪器 ： Gilson 制备型 HPLC 系统， 柱： SunfireTM Prep C18OBDTM 5 微米， 30X 100mm， 温度 ： 25 ℃， 洗脱剂 ： 20 分钟内， 在 0.05 ％三氟乙酸水溶液中的 5-100 ％乙腈梯度， 流速 ： 30ml/ 分钟， 检测 ： UV 254nm。
     缩写和首字母缩写 ：
    实施例 A ： 作为 PI3 激酶抑制剂的效能PI3K KinaseGlo 试验 ： 将 50nL 化合物稀释液分配在黑色 384 孔小体积非结合苯 乙烯 (NBS) 板 ( 卡西达 (Costar) 公司， 目录号 NBS#3676) 上。将作为 10mg/ml 溶液 ( 在甲 醇中 ) 提供的 L-a- 磷脂酰肌醇 (PI) 转移到玻璃管中， 在氮气流下干燥。然后通过涡旋将 其重新混悬在 3％辛基葡糖苷 (OG) 中， 于 4℃贮存。KinaseGlo 发光激酶检测试剂盒 ( 普洛 麦格 (Promega) 公司， 麦迪逊 /WI， 美国 ) 是通过对在激酶反应后溶液中剩余的 ATP 的量进 行定量来测定激酶活性的均一的 HTS 方法。
     加入 5μL PI/OG 与 PI3K 亚型的混合物 ( 表 1)。加入 5μl ATP 混合物 ( 在 10μL 终体积中含有 10mM TRIS-HCl pH7.5、 3mM MgCl2、 50mM NaCl、 0.05％ CHAPS、 1mM DTT 和 1μM ATP) 使激酶反应开始， 这些反应于室温进行。用 10μl KinaseGlo 使反应终止， 10 分钟后 在 Synergy2 读数器中使用 0.1 秒 / 孔的积分时间对板进行读数。 将 2.5μM 全种类 1PI3 激 酶抑制剂 ( 标准品 ) 加入到试验板中， 产生对激酶反应的 100％抑制， 溶剂载体 (90％ DMSO， 在水中 ) 给出了 0％抑制。使用标准品作为参考化合物， 并且在所有试验板中以 16 个稀释 点的形式包括标准品， 一式两份。
     表 1 使用 KinaseGlo 的 PI3K ： 试验条件和试剂方案
    PI3K 的克隆
     PI3Kα、 PI3Kβ 和 PI3Kδ 构建体是 p85αiSH2 结构域与各自的 p110 同工型的融 合体。通过 PCR、 由第一链 cDNA( 通过 RT-PCR 由市售的来自胎盘、 睾丸和脑的 RNA 产生 ) 按照下述方法产生了 p85α 片段和 p110 同工型基因。PI3Kγ 构建体获自罗杰· 威廉斯 (Roger Williams) 实验室 ( 分子生物学 MRC 实验室， 剑桥， 英国 )(2003 年 11 月 )， 并且有 描述 (Pacold， MichaelE. ； Suire， Sabine ； Perisic， Olga ； Lara-Gonzalez， Samuel ； Davis， Colin T. ； Walker， Edward H. ； Hawkins， Phillip T. ； Stephens， Len ； Eccleston， JohnF. ； Williams， Roger L.Crystal structure and functional analysis of Rasbinding to its effector phosphoinositide 3-kinase gamma.Cell(2000)， 103(6)， 931-943)。
     PI3Kα 构建体和蛋白质
    
     PI3Kαwt BV1075 p85iSH2(461-568)-GGGGGGGGGGGG-p110α(21-1068)-HisBV1075 ： 用于杆状病毒 BV-1075 的构建体由三部分连接物产生， 所述的三部分连 接物由克隆到载体 pBlueBac4.5 中的 p85 片段和 p110α 片段组成。p85 片段获自用 Nhe/ Spe 消化的质粒 p1661-2。获得的 p110α 片段是克隆， 其通过测序被证实并且作为 SpeI/ HindIII 片段用在 LR410 中。为了产生杆状病毒表达载体 LR410， 使用 Gateway LR 反应将 插入物转移到 Gateway 接头的 pBlueBac4.5( 英杰 (Invitrogen) 公司 ) 载体中。将克隆载 体 pBlueBac4.5( 英杰公司 ) 用 Nhe/HindIII 消化。这产生了构建体 PED 153.8。通过 PCR、 使用作为模板的 ORF 318( 上文所述 ) 以及一个正向引物 KAC1028(5’ -GCTAGCATGCGAGAATA TGATAGAT-TATATGAAG-AATATACC)(SEQ ID NO ： 1) 和两个反向引物 KAC1029 ： (5’ -GCCTCCACC AC-CTCCGCCTG-GTTTAATGCTGTTCATACGTTTGTC)(SEQ IDNO ： 2) 和 KAC1039(5′ -TACTAGTC-CGC CTCCAC-CACCTCCGCCTCCACCACCTCCGCC)(SEQ ID NO ： 3) 产生了 p85 组分 (iSH2)。两个反向 引物重叠， 将 12×Gly 连接子和 p110α 基因的 N- 末端序列引入 SpeI 位点。12×Gly 连接 子取代了 BV1052 构建体中的一个 Gly 连接子。PCR 片段被克隆到 pCR2.1TOPO( 英杰公司 ) 中。在所得克隆中， 通过测序确定了 p1661-2 是正确的。将该质粒用 Nhe 和 SpeI 消化， 将 所得片段进行凝胶分离和纯化以进行亚克隆。
     通过将克隆 LR410( 见上 ) 用 Spe I 和 HindIII 进行酶消化而产生了 p110α 克隆 片段。SpeI 位点在 p110α 基因的编码区内。将所得片段进行凝胶分离和纯化以进行亚克 隆。通过用 Nhe 和 HindIII 进行酶消化而制得克隆载体 pBlueBac4.5( 英杰公司 )。将切 割的载体用凯杰公司 (Qiagen) 柱进行纯化， 然后用小牛肠碱性磷酸酶 (CIP)( 生物实验室 公司 (BioLabs)) 脱磷酸。CIP 反应完成后， 将切割的载体再次进行柱纯化， 产生最终载体。 使用罗氏公司 (Roche) 快速连接酶和销售商说明书进行了三部分连接。通过测序证实了最 终质粒。
     激酶结构域。
     BV 1075 的蛋白质序列 ：
     1 MREYDRLYEE YTRTSQEIQM KRTAIEAFNE TIKIFEEQCQ TQERYSKEYI EKFKREGNEK
     61 EIQRIMHNYD KLKSRISEII DSRRRLEEDL KKQAAEYREI DKRMNSIKPG GGGGGGGGGG
     121 GLVECLLPNG MIVTLECLRE ATLITIKHEL FKEARKYPLH QLLQDESSYI FVSVTQEAER
     181 EEFFDETRRL CDLRLFQPFL KVIEPVGNRE EKILNREIGF AIGMPVCEFD MVKDPEVQDF
     241 RRNILNVCKE AVDLRDLNSP HSRAMYVYPP NVESSPELPK HIYNKLDKGQ IIVVIWVIVS
     301 PNNDKQKYTL KINHDCVPEQ VIAEAIRKKT RSMLLSSEQL KLCVLEYQGK YILKVCGCDE
     361 YFLEKYPLSQ YKYIRSCIML GRMPNLMLMA KESLYSQLPM DCFTMPSYSR RISTATPYMN
     421 GETSTKSLWV INSALRIKIL CATYVNVNIR DIDKIYVRTG IYHGGEPLCD NVNTQRVPCS
     481 NPRWNEWLNY DIYIPDLPRA ARLCLSICSV KGRKGAKEEH CPLAWGNINL FDYTDTLVSG
     541 KMALNLWPVP HGLEDLLNPI GVTGSNPNKE TPCLELEFDW FSSVVKFPDM SVIEEHANWS
     601 VSREAGFSYS HAGLSNRLAR DNELRENDKE QLKAISTRDP LSEITEQEKD FLWSHRHYCV
     661 TIPEILPKLL LSVKWNSRDE VAQMYCLVKD WPPIKPEQAM ELLDCNYPDP MVRGFAVRCL
     721 EKYLTDDKLS QYLIQLVQVL KYEQYLDNLL VRFLLKKALT NQRIGHFFFW HLKSEMHNKT
     781 VSQRFGLLLE SYCRACGMYL KHLNRQVEAM EKLINLTDIL KQEKKDETQK VQMKFLVEQM
     841 RRPDFMDALQ GFLSPLNPAH QLGNLRLEEC RIMSSAKRPL WLNWENPDIM SELLFQNNEI
     901 IFKNGDDLRQ DMLTLQIIRI MENIWQNQGL DLRMLPYGCL SIGDCVGLIE VVRNSHTIMQ97102149711 A CN 102149713
    
    
    
    
    
     PI3Kβ
     BV949说明书YDAAIDLFTR ERVPFVLTQD MPELQSFDDI LGGAHHHHHH89/100 页961 IQCKGGLKGA LQFNSHTLHQ 1021 NIMVKDDGQL FHIDFGHFLD 1081 FQEMCYKAYL AIRQHANLFI 1141 MKQMNDAHHG GWTTKMDWIF PI3Kβ 构建体和蛋白质WLKDKNKGEI HKKKKFGYKR NLFSMMLGSG HTIKQHALNESCAGYCVATF ILGIGDRHNS FLIVISKGAQ ECTKTREFER AYIRKTLALD KTEQEALEYF (SEQID NO ： 4)p85iSH2(461-N58K-568)-GGGGGG-p110β(2-1070)-HisBV949 ： 通过重叠 PCR 产生和融合了用于 p85PI3Kα、 PI3Kβ 和 PI3Kδ 亚基的 inter SH2 结构域 (iSH2) 以及用于全长 p110β 亚基的 PCR 产物。由第一链 cDNA( 通过 RT-PCR 由市售的来自胎盘、 睾丸和脑的人 RNA( 克隆技术公司 (Clontech) 产生 )， 起初使用 引物 gwG130-p01(5’ -CGAGAATATGATAGATTATATGAAGAAT-3’ )(SEQ ID NO ： 5) 和 gwG130-p02 (5’ -TGGTTT-AATGCTGTTCATACGTTTGTCAAT-3’ )(SEQ ID NO ： 6) 获得了 iSH2PCR 产物。随后， 在第二次 PCR 反应中， 分别在 p85iSH2 片段的 5’ 端和 3’ 端、 使用引物 gwG130-p03(5-GGGA CAAGTT-TGTACAAAAAAGCAGGCTACGAAGGAGATATACATATGCGAGAATATGATAGATTATATGAAGAAT-3’ ) (SEQ ID NO ： 7) 和 gwG130-p05(5’ -ACTGAAGCATCCTCCTC-CTCCTCCT-CCTGGTTTAATGCTGTTCA TACGTTTGTC-3’ )(SEQ ID NO ： 8) 加入 Gateway 重组 AttB1 位点和连接子序列。通过 PCR、 使用作为模板的 p110β 克隆 ( 来自未知来源， 其序列已被证实 )， 使用含有连接子序列和 p110β 的 5’ 端的引物 gwG130-p04(5’ -ATTAAACCAGGAGGAGGAGGAGGAGGATGCTT-CAGTTTCATA ATGCCTCCTGCT -3’ )(SEQ ID NO ： 9) 和含有与组氨酸标记融合的 p110-β 的 3’ 端序列的 ) gwG130-p06(5’ -AGCTCCGTGATGGTGATGGTGATGTGCTCCAGATC-TGTAGTCTTTCCGAA-CTGTGTG-3’ (SEQ ID NO ： 10) 得到了 p110β 片段。通过重叠 PCR、 在 iSH2 片段的 3’ 端和 p110β 片段 的 5’ 端进行的连接子反应， 使用上述 gwG130-p03 引物以及含有重叠的组氨酸标记和 AttB2 重组序列的引物 ： (5’ -GGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAAGCTCCGTGATGGTGATGGTGATGTGC TCC-3’ )(SEQ ID NO ： 11) 组建了 p85-iSH2/p110β 融合蛋白。该终产物在 Gateway( 英杰 公司 )OR 反应中被重组到供体载体 pDONR201( 英杰公司 ) 中， 产生 ORF253 输入克隆。通过 测序证实了该克隆， 其用于 Gateway LR 反应 ( 英杰公司 )， 使插入物转移到 Gateway 接头的 pBlueBac4.5( 英杰公司 ) 载体中， 以产生杆状病毒表达载体 LR280。该 LR280 具有 p85 序 列中的氨基酸突变。
     激酶结构域。
     BV949 的蛋白质序列 ：
     1 MREYDRLYEE YTRTSQEIQM KRTAIEAFNE TIKIFEEQCQ TQERYSKEYI EKFKREGKEK
     61 EIQRIMHNYD KLKSRISEII DSRRRLEEDL KKQAAEYREI DKRMNSIKPG GGGGGCFSFI
     121 MPPAMADILD IWAVDSQIAS DGSIPVDFLL PTGIYIQLEV PREATISYIK QMLWKQVHNY
     181 PMFNLLMDID SYMFACVNQT AVYEELEDET RRLCDVRPFL PVLKLVTRSC DPGEKLDSKI
     241 GVLIGKGLHE FDSLKDPEVN EFRRKMRKFS EEKILSLVGL SWMDWLKQTY PPEHEPSIPE
    
    
    301 NLEDKLYGGK LIVAVHFENC QDVFSFQVSP NMNPIKVNEL AIQKRLTIHG KEDEVSPYDY 361 VLQVSGRVEY VFGDHPLIQF QYIRNCVMNR ALPHFILVEC CKIKKMYEQE MIAIEAAINR 421 NSSNLPLPLP PKKTRIISHV WENNNPFQIV LVKGNKLNTE ETVKVHVRAG LFHGTELLCK98102149711 A CN 102149713
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
     PI3Kγ
     BV950说明书MARLCFAVYA IILHSWSSFP EIASSDSANV LLSIKWNKLE QYLLQLVQVL AYCRGSVGHM DLQSPLNPCV LQMLRLMDLL NKDALLNWLK DFGHILGNFK GNLFITLFAL VNWMAHTVRK90/100 页481 TIVSSEVSGK NDHIWNEPLE 541 TIRKAGKVHY PVAWVNTMVF 601 NATALHVKFP ENKKQPYYYP 661 LSQLCENEMD LIWTLRQDCR 721 LELLDFNYPD QYVREYAVGC 781 NRRIGQFLFW HLRSEVHIPA 841 KLNAVKLNRA KGKEAMHTCL 901 WLVYNNKVFG EDSVGVIFKN 961 RSGLIEVVST SETIADIQLN 1021 GYCVASYVLG IGDRHSDNIM 1081 VIQQGKTGNT EKFGRFRQCC 1141 SLALGKSEEE ALKQFKQKFD (SEQ ID NO ： 12) 激酶结构域。 PI3Kγ 构建体和蛋白质FDINICDLPR DFKGQLRTGD PFDKIIEKAA EIFPQSLPKL LRQMSDEELS VSVQFGVILE KQSAYREALS GDDLRQDMLT SSNVAAAAAF VKKTGQLFHI EDAYLILRRH EALRESWTTKVLDKVKTKKS TKTINPSKYQ DELEEMLNPM GTVQTNPYTE SSRGGKKFLP VLKEILDRDP DVAQLQALLQ IWPKLPPREA KYEPFLDCAL SRFLLERALG KVLSKQVEAL NKLKTLNSLI ILSELYVEKC KYMDSKMKPL WKEAGLDLRM LPYGCLATGD EYNSGDDLDR AIEEFTLSCA SKFGIKRERV PFILTYDFIH MLTAGLPELT SVKDIQYLKD DYRSGAHHHH HHGAp110γ(Δ143-[Met144-1102])-His构建体获自罗杰·威廉斯实验室 ( 分子生物学 MRC 实验室， 剑桥， 英国 )(2003 年 11 月 )。构建体在 (Pacold， Michael E. ； Suire， Sabine ； Perisic， Olga ； Lara-Gonzalez， Samuel ； DaVis， Colin T. ； Walker， Edward H. ； Hawkins， Phillip T. ； Stephens， Len ； Eccleston， John F. ； Williams， Roger L.Crystal structure and functional analysis of Ras binding to its effectorphosphoinositide 3-kinase gamma.Cell(2000)， 103(6)， 931-943) 中有描述。构建体缺少 N- 末端 144 氨基酸。
     BV950 的蛋白质序列 ：
     1 MSEESQAFQR QLTALIGYDV TDVSNVHDDE LEFTRRGLVT PRMAEVASRD PKLYAMHPWV
     61 TSKPLPEYLW KKIANNCIFI VIHRSTTSQT IKVSPDDTPG AILQSFFTKM AKKKSLMDIP
     121 ESQSEQDFVL RVCGRDEYLV GETPIKNFQW VRHCLKNGEE IHVVLDTPPD PALDEVRKEE
     181 WPLVDDCTGV TGYHEQLTIH GKDHESVFTV SLWDCDRKFR VKIRGIDIPV LPRNTDLTVF
     241 VEANIQHGQQ VLCQRRTSPK PFTEEVLWNV WLEFSIKIKD LPKGALLNLQ IYCGKAPALS
     301 SKASAESPSS ESKGKVRLLY YVNLLLIDHR FLLRRGEYVL HMWQISGKGE DQGSFNADKL
     361 TSATNPDKEN SMSISILLDN YCHPIALPKH QPTPDPEGDR VRAEMPNQLR KQLEAIIATD
     421 PLNPLTAEDK ELLWHFRYES LKHPKAYPKL FSSVKWGQQE IVAKTYQLLA RREVWDQSAL
     481 DVGLTMQLLD CNFSDENVRA IAVQKLESLE DDDVLHYLLQ LVQAVKFEPY HDSALARFLL
     541 KRGLRNKRIG HFLFWFLRSE IAQSRHYQQR FAVILEAYLR GCGTAMLHDF TQQVQVIEML
     601 QKVTLDIKSL SAEKYDVSSQ VISQLKQKLE NLQNSQLPES FRVPYDPGLK AGALAIEKCK
    
    
    661 VMASKKKPLW LEFKCADPTA LSNETIGIIF KHGDDLRQDM LILQILRIME SIWETESLDL 721 CLLPYGCIST GDKIGMIEIV KDATTIAKIQ QSTVGNTGAF KDEVLNHWLK EKSPTEEKFQ 781 AAVERFVYSC AGYCVATFVL GIGDRHNDNI MITETGNLFH IDFGHILGNY KSFLGINKER841 VPFVLTPDFL FVMGTSGKKT SPHFQKFQDI CVKAYLALRH HTNLLIILFS MMLMTGMPQL 901 TSKEDIEYIR DALTVGKNEE DAKKYFLDQI EVCRDKGWTV QFNWFLHLVL GIKQGEKHSA 961 HHHHHH (SEQ ID NO ： 13) PI3Kδ 构建体和蛋白质p55iSH2(461-568)-GGGGGG-p110δ(2-1044)-HisBV1060 ： 通过重叠 PCR 产生和融合了用于 p85 亚基的 inter SH2 结构域 (iSH2) 以及用于全长 p110δ 亚基的 PCR 产物。通过使用作为模板的 ORF318( 见上 ) 以及引物 g wG130-p03(5’ -GGGACAAGTT-TGTACAAAAAAGCAGGCTACGAAGGAGATATACATATGCGAGAATATGATAGAT TATATGAAGAAT-3’ )(SEQ ID NO ： 7) 和 gwG154-p04(5’ -TCCTCCTCCT-CCTCCTCCTGGTTTAATGCT GTTCATACGTTTGTC-3’ )(SEQ ID NO ： 14) 产生 iSH2PCR 产物。由第一链 cDNA( 通过 RT-PCR 由市售的来自胎盘、 睾丸和脑的人 RNA( 克隆技术公司 ) 产生 )、 首先使用引物 gwG154-p0 1(5’ -ATGCCCCCTGGGGTGGACTGCCCCAT-3’ )(SEQ ID NO ： 15) 和 gwG154-p02(5’ -CTACTGCCTG T-TGTCTTTGGACACGT-3’ )(SEQ ID NO ： 16) 获得 p110δ 片段。在随后 PCR 反应中， 分别在 p110δ 片段的 5’端和 3’端、 用引物 gw154-p03(5’ -ATTAAACCAGGAGGAGGAGGAGGAGGACCCC CTGGGGTGGAC-TGCCCCATGGA-3’ )(SEQ ID NO ： 17) 和 gwG154-p06(5’ -AGCTCCGTGATGGTGATGG TGAT-GTGCT-CCCTGCCTGTTGTCTTTGGACACGTTGT-3’ )(SEQ ID NO ： 18) 加入连接子序列和组氨 酸标记。在第三次 PCR 反应中， 通过 iSH2 片段的 3’ 端和 p110δ 片段的 5’ 端的重叠连接 子、 使用以上提到的 gwG130-p03 引物以及含有重叠的组氨酸标记和 Gateway( 英杰公司 ) AttB2 重组序列的引物 (5’ -GGG-ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAA-GCTCCGTGATGGTGATGGT GAGTGCTCC-3’ )(SEQ ID NO ： 19) 组装了 p85-iSH2/p110δ 融合蛋白。该终产物在 Gateway OR 反应中被重组到供体载体 pDONR201( 英杰公司 ) 中， 产生 ORF319 输入克隆。通过测序 证实了该克隆， 其用于 Gateway LR 反应 ( 英杰公司 ) 中， 使插入物转移到 Gateway 接头的 pBlueBac4.5( 英杰公司 ) 载体中， 以产生杆状病毒表达载体 LR415。
     BV1060 的蛋白质序列 ：
     1 MREYDRLYEE YTRTSQEIQM KRTAIEAFNE TIKIFEEQCQ TQERYSKEYI EKFKREGNEK
     61 EIQRIMHNYD KLKSRISEII DSRRRLEEDL KKQAAEYREI DKRMNSIKPG GGGGGPPGVD
     121 CPMEFWTKEE NQSVVVDFLL PTGVYLNFPV SRNANLSTIK QLLWHRAQYE PLFHMLSGPE
     181 AYVFTCINQT AEQQELEDEQ RRLCDVQPFL PVLRLVAREG DRVKKLINSQ ISLLIGKGLH
     241 EFDSLCDPEV NDFRAKMCQF CEEAAARRQQ LGWEAWLQYS FPLQLEPSAQ TWGPGTLRLP
     301 NRALLVNVKF EGSEESFTFQ VSTKDVPLAL MACALRKKAT VFRQPLVEQP EDYTLQVNGR
     361 HEYLYGSYPL CQFQYICSCL HSGLTPHLTM VHSSSILAMR DEQSNPAPQV QKPRAKPPPI
     421 PAKKPSSVSL WSLEQPFRIE LIQGSKVNAD ERMKLVVQAG LFHGNEMLCK TVSSSEVSVC
     481 SEPVWKQRLE FDINICDLPR MARLCFALYA VIEKAKKARS TKKKSKKADC PIAWANLMLF
    
    
    541 DYKDQLKTGE RCLYMWPSVP DEKGELLNPT GTVRSNPNTD SAAALLICLP EVAPHPVYYP 601 ALEKILELGR HSECVHVTEE EQLQLREILE RRGSGELYEH EKDLVWKLRH EVQEHFPEAL 661 ARLLLVTKWN KHEDVAQMLY LLCSWPELPV LSALELLDFS FPDCHVGSFA IKSLRKLTDD721 ELFQYLLQLV QVLKYESYLD CELTKFLLDR ALANRKIGHF LFWHLRSEMH VPSVALRFGL
     781 ILEAYCRGST HHMKVLMKQG EALSKLKALN DFVKLSSQKT PKPQTKELMH LCMRQEAYLE
     841 ALSHLQSPLD PSTLLAEVCV EQCTFMDSKM KPLWIMYSNE EAGSGGSVGI IFKNGDDLRQ
     901 DMLTLQMIQL MDVLWKQEGL DLRMTPYGCL PTGDRTGLIE VVLRSDTIAN IQLNKSNMAA
     961 TAAFNKDALL NWLKSKNPGE ALDRAIEEFT LSCAGYCVAT YVLGIGDRHS DNIMIRESGQ
     1021 LFHIDFGHFL GNFKTKFGIN RERVPFILTY DFVHVIQQGK TNNSEKFERF RGYCERAYTI
     1081 LRRHGLLFLH LFALMRAAGL PELSCSKDIQ YLKDSLALGK TEEEALKHFR VKFNEALRES
     1141 WKTKVNWLAH NVSKDNRQEL GGAHHHHHH
     (SEQ ID NO ： 20)
     PI3Kα、 PI3Kβ 和 PI3Kγ 构建体的纯化
     以两个色谱步骤纯化了 PI3Kα、 PI3Kβ 和 PI3Kγ ： 在 Ni 琼脂糖树脂 ( 通用电气 公司医疗保健部 (GE Healthcare)) 上进行固定化金属亲和层析 (IMAC) 以及采用 Superdex 20026/60 柱 ( 通用电气公司医疗保健部 ) 进行凝胶过滤。将所有缓冲液冷却至 4℃， 在冰 上冷却下进行裂解。于室温进行柱分级分离。除了以下描述的那些外， 用于纯化 PI3Kβ 的 所有缓冲液还含有 0.05％ Triton X100。
     通常， 将来自 10L Tn5 细胞培养物的冷冻细胞重新混悬在 “裂解缓冲液” (20mM Tris-Cl， pH7.5， 500mM NaCl， 5％甘油， 5mM 咪唑， 1mM NaF， 0.1ug/mL 冈田酸 (OAA)， 5mM BME， 1× 完全蛋白酶抑制剂混合物 - 不含 EDTA(20 片 /1L 缓冲液， 罗氏应用科学公司 (Roche Applied Sciences))， benzonase(25U/mL 缓冲液， EMD 生物科学公司 (EMD Biosciences)) ( 片状物 (pellet) 与裂解缓冲液的比例为 1 ： 6v/v)) 中， 通过使用紧密契合的研棒冲击 20 次而进行机械裂解。于 45,000g 将裂解物离心 30 分钟， 将上清液装到预平衡的 IMAC 柱上 (3mL 树脂 /100mL 裂解物 )。将柱用 3-5 个柱体积的裂解缓冲液冲洗， 然后用 3-5 个柱体 积的 20mM Tris-Cl， pH7.5， 500mMNaCl， 5％甘油， 45mM 咪唑， 1mM NaF， 0.1μg/mL OAA， 5mM BME， 1× 完全蛋白酶抑制剂混合物 - 不含 EDTA 进行第二次冲洗。 将蛋白质用 20mMTris-Cl， pH7.5， 0.5M NaCl， 5％甘油， 250mM 咪唑， 1mM NaF， 0.1μg/mLOAA， 5mM BME， 1× 完全蛋白酶 抑制剂混合物 - 不含 EDTA 进行洗脱。将有关流分通过 SDS-PAGE 进行分析， 从而将其合并。 通过在 Superdex20026/60 柱 ( 用 20mM Tris-Cl， pH7.5， 0.5M NaCl， 5％甘油， 1mM NaF， 5mM DTT， 1× 完全蛋白酶抑制剂混合物 - 不含 EDTA 进行平衡 ) 上进行凝胶过滤而将蛋白质进 一步纯化。将有关流分通过 SDS-PAGE 进行分析， 从而将其合并。将等体积的透析缓冲液 (20mM Tris-Cl， pH7.5， 500mM NaCl， 50％甘油， 5mM NaF， 5mM DTT) 加入到合并物中， 然后通 过透析缓冲液进行透析， 其间更换两次 ( 一次更换过夜 )。将蛋白质于 -20℃贮存。
     PI3Kδ 的纯化
     以三个色谱步骤纯化了 PI3Kδ ： 在 Ni 琼脂糖树脂 ( 通用电气公司医疗保健部 ) 上 进行固定化金属亲和层析， 采用 Superdex 20026/60 柱 ( 通用电气公司医疗保健部 ) 进行 凝胶过滤， 最后在 Q-HP 柱 ( 通用电气公司医疗保健部 ) 上进行离子交换步骤。将所有缓冲 液冷却至 4℃， 在冰上冷却进行裂解。于室温进行柱分级分离。
     通常， 将来自 10L Tn5 细胞培养物的冷冻细胞重新混悬在 “裂解缓冲液” (20mM Tris-Cl， pH7.5， 500mM NaCl， 5 ％ 甘 油， 5mM 咪 唑， 1mM NaF， 0.1μg/mL 冈 田 酸 (OAA)， 5mM BME， 1× 完全蛋白酶抑制剂混合物 - 不含 EDTA(20 片 /1L 缓冲液， 罗氏应用科学公司 )，benzonase(25U/mL 裂 解 缓 冲 液， EMD 生 物 科 学 公 司 )( 片 状 物 与 裂 解 缓 冲 液 的 比 例 为 1 ∶ 10v/v)) 中， 通过使用紧密契合的研棒冲击 20 次进行机械裂解。于 45,000g 将裂解物 离心 30 分钟， 将上清液装到预平衡的 IMAC 柱上 (5mL 树脂 /100mL 裂解物 )。将柱用 3-5 个 柱体积的裂解缓冲液冲洗， 然后用 3-5 个柱体积的 20mMTris-Cl， pH7.5， 500mM NaCl， 5％甘 油， 40mM 咪唑， 1mM NaF， 0.1ug/mLOAA， 5mM BME， 1× 完全蛋白酶抑制剂混合物 - 不含 EDTA 进行第二次冲洗。将蛋白质用 20mM Tris-Cl， pH7.5， 500mM NaCl， 5％甘油， 250mM 咪唑， 1mM NaF， 0.1μg/mL OAA， 5mM BME， 1× 完全蛋白酶抑制剂混合物 - 不含 EDTA 进行洗脱。将有 关流分通过 SDS-PAGE 进行分析， 从而将其合并。通过在 Superdex 200( 用 20mM Tris-Cl， pH7.5， 500mM NaCl， 5％甘油， 1mM NaF， 0.1ug/mL OAA， 5mM DTT， 1× 完全蛋白酶抑制剂混 合物 - 不含 EDTA 进行平衡 ) 上进行凝胶过滤而将蛋白质进一步纯化。将有关流分通过 SDS-PAGE 进行分析， 从而将其合并。将这些流分用 “缓冲液 A” (20mM Tris-Cl， pH8.2， 5％ 甘油， 1mM NaF， 0.1μg/mL OAA， 5mM DTT) 稀释 ( 合并物体积与缓冲液的比例为 1 ∶ 10v/ v)， 装到制备的 Q-HP 柱上。样品装载完成后， 我们用 3-5 个柱体积的缓冲液 A 和 5％ “缓冲 液 B” (20mMTris-Cl， pH8.2， 1M NaCl， 5％甘油， 1mM NaF， 0.1ug/mL OAA， 5mM DTT) 进行了冲 洗。我们使用缓冲液 B 的 5％ -30％梯度洗脱了蛋白质。通常， 以～ 200mM NaCl 洗脱出蛋 白质。将有关流分通过 SDS-PAGE 进行分析， 从而将其合并。将等体积的透析缓冲液 (20mM Tris-Cl， pH7.5， 500mM NaCl， 50％甘油， 1mM NaF， 0.1μg/mL OAA， 5mM DTT) 加入到合并物 中， 然后通过透析缓冲液进行透析， 其间更换两次 ( 一次更换过夜 )。将蛋白质于 -20℃贮 存。
     使用上述试验得到以下结果。
    本发明化合物， 特别是本发明优选的化合物对 PI3Kα 相对于 β 和 / 或 δ 和 / 或 γ 亚型 ( 例如在生化实验中检测的亚型 ) 而言显示出增强的选择性。 如细胞实验中所检测 的， 这些化合物还优选地对 PI3Kα 相对于 β 和 / 或 δ 和 / 或 γ 亚型而言显示出选择性。
    
    
    
    实施例 B ： 体外代谢清除率检测 缩写
    最终的检品和蛋白浓度以及孵育时间如下所示 ( 表 1)。 选择低检品浓度以符合下 述假设 ： 在低于 ( 或约等于 )Km 的浓度下评价反应动力学。
     已知 DMSO 对 CYP 活性有抑制作用。因此， 在孵育介质中的 DMSO 浓度被限制为 0.01％ (v/v)， 以使其对代谢过程的干扰最小化。
     表 1 在代谢清除孵育液中的最终的反应组分和浓度
    用来重建 UGT( 尿苷 5’ 二磷酸葡糖醛酸基转移酶 ) 活性所需的最佳成分。
     通常的试验在 96 孔板上在 37℃振荡孵育下进行。体外代谢清除速率根据在 4 个 时间点 ( 例如 0、 5、 15 和 30 分钟 ) 在含有辅因子 (NADPH 和 / 或 UDPGA) 的反应中收集的数 据获得。还进行了 30 分钟的阴性对照孵育 ( 不含辅因子 ) 来评价与 CYP 不相关的稳定性 问题 ( 例如化学不稳定性、 不依赖 CYP 的代谢 )。
     一般而言， 在 10mM DMSO 中的检品被 0.6％ ACN(v/v) 的 DiH2O 溶液 1 ∶ 1000 倍稀 释到 10μM。在即将开始试验之前， 将 1.25mg/mL 的微粒体蛋白悬浮在 50mM KPi 中。为了 评价 UGT- 介导的代谢， 悬浮液可以首先在冰上用阿拉霉素 (25μg/mg 微粒体蛋白 ) 孵育 5
     105a102149711 A CN 102149713说明书97/100 页分钟来进行预处理。将检品 (35μL) 加入 140μL 的微粒体混悬液中得到 175μL 酶 - 底物 混合物。该酶 - 底物混合物在 37℃预孵育 15 分钟。通过将 25μL 酶 - 底物混合物与等体 积的含有 4mM MgCl2 的 50mM KPi 合并来进行 30 分钟的阴性对照孵育。在 37℃孵育 30 分 钟后， 向混合物加入 50μL 含有 MS 内标 (2μM 阿普洛尔 ) 的 ACN 来猝灭。T ＝ 0 分钟的时 间点通过将 25μL 酶 - 底物混合物直接与 50μL 含有 MS 内标 (2μM 阿普洛尔 ) 的 ACN 合 并来进行。将 25μL 的辅因子加入 (2mM NADPH， 在 50mM KPi 中， 添加 4mM MgCl2 ； 任选含有 2mM UDPGA 用于 CYP+UGT 测定 )， 以刺激完全猝灭的反应混合物。
     对其余时间点的全部反应， 通过将 125μL 辅因子溶液 (2mM NADPH， 在 50mM KPi 中， 添加 4mM MgCl2) 加入到剩余 125μL 酶 - 底物混合物中。对于 UGT 代谢， 辅因子溶液 中包含 2mM UDPGA。在特定的反应时间点 ( 例如 5、 15、 30 分钟 ) 上， 取出反应的等份试样 (50μL)， 并加入含有质谱内标 (2μM 阿普洛尔 ) 的乙腈 (50μL) 来终止反应。所有样品都 在～ 3400xg、 在 4℃下离心 10 分钟， 上清液用 LC-MS/MS 分析， 对剩余的检品进行定量。剩 余的 TA 相对于 0 分钟的百分比被用来估计体外消除速率常数 (kmic)， 该常数可用于计算体 外代谢清除率。
     在高效液相色谱 - 串联质谱 (LC/MS) 系统上进行样品分析， 该系统包括 Waters Quattro Premiere 质谱仪、 ESI 离子源、 CTC-HTS Pal 自动进样器和安捷伦 LC 泵。样品在 Atlantic C18 柱 (2.1x30mm， 3.5 微米 ) 上分离， 使用表 2 中所概述的快速流动相。 流动相 A 由含有 10mM 甲酸铵的纯水组成。 流动相 B 由含有 0.01％甲酸的乙腈组成。 流速为 1mL/min。 进样体积为 10μL。 最初 30 秒的洗脱液被弃去， 用于样品净化。 化合物使用软件 MassLynx/ QuanLynx 检测， 其收集所有与供试化合物分子量相关的碎片的强度数据。在收集原始数据 后， 如果需要， 该软件可将最多 3 个质量碎片的曲线合并。通常， 对最大强度的碎片峰进行 积分。
     表 2HPLC 的流动相梯度
    每个微粒体消除速率 kmic 是基于单峰形式测试的 4- 个点的消除曲线。反应板的 LC-MS/MS 原始数据以对于检品和内标的积分的分析物峰面积形式返回。 这些数值可以转换 为分析物 ： 内标的峰面积之比， 以使数据的比较达到标准化。
     将反应时间点 ( 例如 0、 5、 20 或 30 分钟 ) 相对于剩余检品相对 0 分钟的百分比 ( 基于相对的峰面积之比 ) 的自然对数作图。清除曲线的斜率 kmic 用来计算体外半衰期 t1/2， 如方程 (1) 所示。为了集中于线性的反应动力学， 如果可能的话， 一般将代表剩余检 品＜ 10％的数据点排除在清除曲线的斜率限定之外。 该反应的 t1/2 是核心的试验数值， 用 于计算 CLint( 方程 2)
     方程 (1) ： t1/2 ＝ 0.693/-kmic 方程 (2) ： Clint ＝ 0.693/-kmic·V/M 使用上述方法获得以下结果 ：实施例 C ： 在荧光素酶发光试验中测定的 PI3Kα 突变体 E545K 和 H1047R 的抑制
     发光值是早已确立的用来测定 ATP 浓度的读数， 因此可以用来在不考虑其底物的 情况下追踪多种激酶的活性。KinaseGlo 发光激酶检测试剂盒 (Promega， Madison/WI， USA) 是在激酶反应后通过对溶液中剩余的 ATP 定量来测定激酶活性的均一的 HTS 方法。
     磷酸肌醇 3- 激酶在室温下在 50-μi 含有 1μM ATP、 5mM MgCl2、 50mM NaCl、 5μg/ ml 大豆磷脂酰肌醇 (Avanti Polar lipids， 目录号 840044C)、 0.015％八葡糖苷 (Sigma， 目 录号 O9882)、 0.01％ CHAPS、 1mM DTT、 2.5％ DMSO 和 10mM Tris-HCl pH 7.5 的介质中孵育。 激酶反应通过加入 ATP( 酶与抑制剂预孵育 15 分钟 ) 启动， 1 小时后用 50μl Kinase (Promega， 目录号 V6714) 终止， 用 Victor II 读数器 (0.1 秒积分 ) 测定发光度。使用逻辑 方程通过非线性回归来拟合曲线 (X 的模式 205， IDBusiness Solutions， Guildford， 英国 )。
     发光试验的测定原理 (KinaseGlo) ：
    
    使用上述试验系统和使用来自下表显示的构建体的 PI3K 蛋白， 评价了对野生型 和突变型 PI3Kα 的抑制活性。
    
    
    
    结果显示在下表中。 野生型和突变型 PI3Kα 的抑制 ：BV1147 ： 将在许多癌症中发现的激活突变 E545K 使用 QuickChangeXL 诱变试剂 盒 (Stratagene) 通过定点诱变引入 ORF318。使用生产商推荐的方法和突变引物 ： gwG152 -p15(5’ -CTCTCTGAAATCACTAAGCAGGAGAAAGATTTT-3’ )(SEQ ID NO ： 21)， 和 gwG152-p16(5’ AAAATCTTTCT-CCTGCTTAGTGATTTCAGAGAG-3’ )(SEQ ID NO ： 22)， 产生 ORF544。该克隆经测 序验证后， 用于 Gateway LR 反应 (Invitrogen)， 以便将插入片段转移到 Gateway 接头的 pBlueBac4.5(Invitrogen) 载体中， 用于生成杆状病毒表达载体 LR561。
     激酶结构域
     BV 1147 的蛋白序列 ：
     1 MREYDRLYEE YTRTSQEIQM KRTAIEAFNE TIKIFEEQCQ TQERYSKEYI EKFKREGNEK
     61 EIQRIMHNYD KLKSRISEII DSRRRLEEDL KKQAAEYREI DKRMNSIKPG GISGGGGGIM
     121 VLVECLLPNG MIVTLECLRE ATLITIKHEL FKEARKYPLH QLLQDESSYI FVSVTQEAER
     181 EEFFDETRRL CDLRLFQPFL KVIEPVGNRE EKILNREIGF AIGMPVCEFD MVKDPEVQDF
     241 RRNILNVCKE AVDLRDLNSP HSRAMYVYPP NVESSPELPK HIYNKLDKGQ IIVVIWVIVS
     301 PNNDKQKYTL KINHDCVPEQ VIAEAIRKKT RSMLLSSEQL KLCVLEYQGK YILKVCGCDE
     361 YFLEKYPLSQ YKYIRSCIML GRMPNLMLMA KESLYSQLPM DCFTMPSYSR RISTATPYMN
     421 GETSTKSLWV INSALRIKIL CATYVNVNIR DIDKIYVRTG IYHGGEPLCD NVNTQRVPCS
     481 NPRWNEWLNY DIYIPDLPRA ARLCLSICSV KGRKGAKEEH CPLAWGNINL FDYTDTLVSG
     541 KMALNLWPVP HGLEDLLNPI GVTGSNPNKE TPCLELEFDW FSSVVKFPDM SVIEEHANWS
     601 VSREAGFSYS HAGLSNRLAR DNELRENDKE QLKAISTRDP LSEITKQEKD FLWSHRHYCV
     661 TIPEILPKLL LSVKWNSRDE VAQMYCLVKD WPPIKPEQAM ELLDCNYPDP MVRGFAVRCL
     721 EKYLTDDKLS QYLIQLVQVL KYEQYLDNLL VRFLLKKALT NQRIGHFFFW HLKSEMHNKT
     781 VSQRFGLLLE SYCRACGMYL KHLNRQVEAM EKLINLTDIL KQEKKDETQK VQMKFLVEQM
     841 RRPDFMDALQ GFLSPLNPAH QLGNLRLEEC RIMSSAKRPL WLNWENPDIM SELLFQNNEI
     901 IFKNGDDLRQ DMLTLQIIRI MEMIWQNQGL DLRMLPYGCL SIGDCVGLIE VVRNSHTIMQ
     961 IQCKGGLKGA LQFNSHTLHQ WLKDKNKGEI YDAAIDLFTR SCAGYCVATF ILGIGDRHNS
     1021 NIMVKDDGQL FHIDFGHFLD HKKKKFGYKR ERVPFVLTQD FLIVISKGAQ ECTKTREFER
     1081 FQEMCYKAYL AIRQHANLFI NLFSMMLGSG MPELQSFDDI AYIRKTLALD KTEQEALEYF
     1141 MKQMNDAHHG GWTTKMDWIF HTIKQHALNE LGGAHHHHHH (SEQ ID NO ： 23).
     BV1097 ： 将许多癌症中发现的激活突变 H1047R 用 QuickChange XL 诱变试剂盒 (Stratagene) 通过定点诱变引入 ORF318。使用生产商推荐方法和突变引物 ： gwG152-p0 7(5’ -CAAATGAATGATGCACGTCATGGTGGCTGGACA-3’ )(SEQ ID NO ： 24)， 和 gwG152-p11(5’ -TG TCCAGCCA-CCATGACGTGCATCATTCATTTG-3’ )(SE Q ID NO ： 25)， 产生 ORF396。该克隆经测 序验证后， 用于 Gateway LR 反应 (Invitrogen)， 以便将插入片段转移到 Gateway 接头的 pBlueBac4.5(Invitrogen) 载体中， 用于生成杆状病毒表达载体 LR480。
     激酶结构域
     BV 1097 的蛋白序列 ：
     1 MREYDRLYEE YTRTSQEIQM KRTAIEAFNE TIKIFEEQCQ TQERYSKEYI EKFKREGNEK
     61 EIQRIMHNYD KLKSRISEII DSRRRLEEDL KKQAAEYREI DKRMNSIKPG GISGGGGGIM
     121 VLVECLLPNG MIVTLECLRE ATLITIKHEL FKEARKYPLH QLLQDESSYI FVSVTQEAER
     181 EEFFDETRRL CDLRLFQPFL KVIEPVGNRE EKILNREIGF AIGMPVCEFD MVKDPEVQDF
     241 RRNILNVCKE AVDLRDLNSP HSRAMYVYPP NVESSPELPK HIYNKLDKGQ IIVVIWVIVS
     301 PNNDKQKYTL KINHDCVPEQ VIAEAIRKKT RSMLLSSEQL KLCVLEYQGK YILKVCGCDE
     361 YFLEKYPLSQ YKYIRSCIML GRMPNLMLMA KESLYSQLPM DCFTMPSYSR RISTATPYMN
     421 GETSTKSLWV INSALRIKIL CATYVNVNIR DIDKIYVRTG IYHGGEPLCD NVNTQRVPCS
     481 NPRWNEWLNY DIYIPDLPRA ARLCLSICSV KGRKGAKEEH CPLAWGNINL FDYTDTLVSG
     541 KMALNLWPVP HGLEDLLNPI GVTGSNPNKE TPCLELEFDW FSSVVKFPDM SVIEEHANWS [1000] 601 VSREAGFSYS HAGLSNRLAR DNELRENDKE QLKAISTRDP LSEITEQEKD FLWSHRHYCV [1001] 661 TIPEILPKLL LSVKWNSRDE VAQMYCLVKD WPPIKPEQAM ELLDCNYPDP MVRGFAVRCL [1002] 721 EKYLTDDKLS QYLIQLVQVL KYEQYLDNLL VRFLLKKALT NQRIGHFFFW HLKSEMHNKT [1003] 781 VSQRFGLLLE SYCRACGMYL KHLNRQVEAM EKLINLTDIL KQEKKDETQK VQMKFIVEQM [1004] 841 RRPDFMDALQ GFLSPLNPAH QLGNLRLEEC RIMSSAKRPL WLNWENPDIM SELLFQNNEI [1005] 901 IFKNGDDLRQ DMLTLQIIRI MENIWQNQGL DLRMLPYGCL SIGDCVGLIE VVRNSHTIMQ [1006] 961 IQCKGGLKGA LQFNSHTLHQ WLKDKNKGEI YDAAIDLFTR SCAGYCVATF ILGIGDRHNS [1007] 1021 NIMVKDDGQL FHIDFGHFLD HKKKKFGYKR ERVPFVLTQD FLIVISKGAQ ECTKTREFER [1008] 1081 FQEMCYKAYL AIRQHANLFI NLFSMMLGSG MPELQSFDDI AYIRKTLALD KTEQEALEYF [1009] 1141 MKQMNDARHG GWTTKMDWIF HTIKQHALNE LGGAHHHHHH (SEQ ID NO ： 26).109102149711 A CN 102149713
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     本文所给的任意式意欲代表具有结构式所描述的结构的化合物以及某些变体或 形式。 特别是本文所给的任意式的化合物可以具有不对称中心并因此以不同的对映异构形 式存在。如果式 (I) 化合物中存在至少一个不对称碳原子， 则这类化合物可以以旋光活性 形式或以旋光异构体混合物的形式、 例如以外消旋混合物的形式存在。所有旋光异构体及 其混合物、 包括外消旋混合物是本发明的一部分。 因此， 本文所给的任意所给式意欲代表外 消旋物、 一种或多种对映异构形式、 一种或多种非对映异构形式、 一种或多种阻转异构体形 式及其混合物。而且， 某些结构还可以作为几何异构体 ( 即顺式和反式异构体 )、 互变异构 体或阻转异构体而存在。
     本文所给的任意式意欲代表这类化合物的水合物、 溶剂合物和多晶型物及其混合 物。
     本文所给的任意式还意欲代表化合物的未标记的形式以及同位素标记的形式。 除 了一个或多个原子被具有所选原子质量或质量数的原子所代替外， 同位素标记的化合物具 有本文所给的式所描述的结构。可以掺入本发明的化合物中的同位素的实例包括氢、 碳、 2 3 11 13 14 15 18 31 32 35 36 125 氮、 氧、 磷、 氟和氯的同位素， 例如分别有 H、 H、 C、 C、 C、 N、 F、 P、 P、 S、 Cl、 I。本发13 明包含多种如本文所定义的同位素标记的化合物， 例如有放射性同位素如 3H、 C 和 14C 存在 的那些。这类同位素标记的化合物可用于代谢研究 ( 优选用 14C)、 反应动力学研究 ( 例如 2 3 用 H 或 H)、 检测或显像技术、 例如正电子发射断层摄影术 (PET) 或单光子发射计算体层摄 影术 (SPECT)、 包括药物或底物组织分布测定， 或者可用于放射治疗患者。特别是 18F 或标 记的化合物可以特别优选用于 PET 或 SPECT 研究。通常可以通过进行在下文描述的流程图 或者实施例和制备中所公开的方法， 通过用容易得到的同位素标记的试剂取代非同位素标 记的试剂来制备同位素标记的本发明的化合物及其前药。
     此外， 被更重的同位素、 特别是氘 ( 即 2H 或 D) 所取代还可以获得由更高的代谢稳 定性引起的某些治疗益处， 例如延长体内半衰期或降低剂量要求或改善治疗指数。可以理 解， 上下文中的氘可被看作式 (I) 化合物的取代基。这类更重同位素、 特别是氘的浓度可以 由同位素富集因子来定义。如本文所用的术语 “同位素富集因子” 表示特定同位素的同位 素丰度和天然丰度之间的比值。如果本发明的化合物中的取代基标有氘， 则这类化合物具 有的对每个指定氘原子的同位素富集因子为至少 3500( 在每个指定氘原子处具有 52.5％ 氘掺入率 )、 至少 4000(60％氘掺入率 )、 至少 4500(67.5％氘掺入率 )、 至少 5000(75％氘掺 入率 )、 至少 5500(82.5％氘掺入率 )、 至少 6000(90％氘掺入率 )、 至少 6333.3(95％氘掺入 率 )、 至少 6466.7(97％氘掺入率 )、 至少 6600(99％氘掺入率 ) 或至少 6633.3(99.5％氘掺 入率 )。 在本发明的化合物中， 没有具体指定为特定同位素的任意原子意欲代表该原子的任 意稳定同位素。除非另有说明， 当位置被具体指定为 “H” 或 “氢” 时， 该位置可以理解为在 其天然丰度同位素组成上具有氢。因此， 在本发明的化合物中， 被具体指定为氘 (D) 的任意 原子意欲代表例如在以上所给范围内的氘。
     当参考本文所给的任意式时， 从可能种类的名单中为规定变量选择特定部分并不 表示用来定义在别处出现的变量的部分。 换言之， 当变量出现一次以上时， 从规定名单中选择种类不依赖于为该式中别处的相同变量选择的种类 ( 当实施方案中一个或多个直至所 有更一般的表述 ( 其特征为上文或下文所优选的 ) 可以被更具体的定义代替时， 由此分别 产生本发明的更优选的实施方案 )。
     当使用复数形式 ( 例如多种化合物、 盐 ) 时， 其包括单数 ( 例如一种化合物、 一种 盐 )。 “化合物” 不排除 ( 例如在药物制剂中 ) 存在一种以上的式 (I) 化合物 ( 或其盐 )。
     以下一般定义将适用于本说明书， 除非另有说明 ：
     卤素表示氟、 溴、 氯或碘， 特别是氟、 氯。卤素取代的基团和部分， 例如被卤素取代 的烷基 ( 卤代烷基 ) 可以被单、 多或全卤代。
     杂原子是除碳和氢外的原子， 优选氮 (N)、 氧 (O) 或硫 (S)， 特别是氮。
     含碳的基团、 部分或分子含有 1 至 7 个、 优选 1 至 6 个、 更优选 1 至 4 个、 最优选 1 或 2 个碳原子。具有 1 个以上碳原子的任意非环状含碳的基团或部分是直链或支链的。
     前缀 “低级” 或 “C1-C7” 表示具有最多且包括 7 个、 尤其是最多且包括 4 个碳原子 的基团， 所述基团是直链或者具有一个或多个分支的支链。
     “烷基” 指直链或支链烷基， 优选代表直链或支链 C1-12 烷基， 特别优选代表直链或 支链 C1-7 烷基 ； 例如甲基、 乙基、 正或异丙基、 正、 异、 仲或叔丁基、 正戊基、 正己基、 正庚基、 正辛基、 正壬基、 正癸基、 正十一烷基、 正十二烷基， 特别优选甲基、 乙基、 正丙基、 异丙基以 及正丁基和异丁基。烷基可以是未取代的或取代的。示例性取代基包括但不限于氘、 羟基、 烷氧基、 卤素和氨基。取代的烷基的实例有三氟甲基。环烷基也可以是烷基的取代基。这 类情况的实例有部分 ( 烷基 )- 环丙基或亚烷基 - 环丙基， 如 -CH2- 环丙基。C1-C7- 烷基优 选是具有从 1 且包括 1 至 7 且包括 7、 优选从 1 且包括 1 至 4 且包括 4 的烷基， 并且是直链 或支链 ； 优选低级烷基是丁基如正丁基、 仲丁基、 异丁基、 叔丁基、 丙基如正丙基或异丙基、 乙基或者优选甲基。
     其它基团如 “烷氧基” 、 “烷氧基烷基” 、 “烷氧基羰基” 、 “烷氧基 - 羰基烷基” 、 “烷基 磺酰基” 、 “烷基磺酰基 (alkylsulfoxyl)” 、 “烷基氨基” 、 “卤代烷基” 中的每个烷基部分将具 有以上提到的 “烷基” 定义中描述的相同含义。
     “亚烷基” 指通过两个不同碳原子与部分结合的直链或支链亚烷基， 它优选代表直 链或支链 C1-12 亚烷基， 特别优选代表直链或支链 C1-6 亚烷基 ； 例如亚甲基 (-CH2-)、 1， 2- 亚 乙基 (-CH2-CH2-)、 1， 1- 亚乙基 ((-CH(CH3)-)、 1， 1-， 1， 2-， 1， 3- 亚丙基和 1， 1-， 1， 2-， 1， 3-， 1， 4- 亚丁基， 特别优选亚甲基、 1， 1- 亚乙基、 1， 2- 亚乙基、 1， 3- 亚丙基、 1， 4- 亚丁基。
     “亚链烯基” 指通过两个不同碳原子与分子结合的直链或支链亚链烯基， 它优选 代表直链或支链 C2-6 亚烷基 ； 例如 -CH ＝ CH-、 -CH ＝ C(CH3)-、 -CH ＝ CH-CH2-、 -C(CH3) ＝ CH-CH2-、 -CH ＝ C(CH3)-CH2-、 -CH ＝ CH-C(CH3)H-、 -CH ＝ CH-CH ＝ CH-、 -C(CH3) ＝ CH-CH ＝ CH-、 -CH ＝ C(CH3)-CH ＝ CH-， 特别优选 -CH ＝ CH-CH2-、 -CH ＝ CH-CH ＝ CH-。亚链烯基可 以是取代的或未取代的。
     “环烷基” 指饱和或部分饱和的单环、 稠合多环或螺多环碳环， 每个碳环具有 3 至 12 个环原子。环烷基的说明性实例包括以下部分 ： 环丙基、 环丁基、 环戊基和环己基。环 烷基可以是未取代的或取代的 ； 示例性取代基在对烷基的定义中提供， 且还包括烷基自身 ( 如甲基 )。例如 -(CH3) 环丙基的基团被认为是被取代的环烷基。
     “芳基” 指具有 6 个或更多个碳原子的芳香族同素环系统 ( 即仅有碳作为成环原子 )， 芳基优选是具有 6 至 14 个环碳原子、 更优选具有 6 至 10 个环碳原子的芳香族部分， 例如苯基或萘基， 优选苯基。芳基可以是未取代的或者被一个或多个、 优选最多三个、 更 优选最多两个取代基所取代， 所述的取代基独立地选自 ： 如下描述的未取代的或取代的杂 环基， 尤其是吡咯烷基如吡咯烷子基、 氧代吡咯烷基如氧代 - 吡咯烷子基、 C 1-C7- 烷基 - 吡 咯烷基、 2， 5- 二 -(C1-C7 烷基 ) 吡咯烷基如 2， 5- 二 -(C1-C7 烷基 )- 吡咯烷子基、 四氢呋 喃基、 噻吩基、 C1-C7- 烷基吡唑烷基、 吡啶基、 C1-C7- 烷基哌啶基、 哌啶子基、 被氨基或者 N- 单 - 或 N， N- 二 -[ 低级烷基、 苯基、 C1-C7- 烷酰基和 / 或苯基 - 低级烷基 )- 氨基所取代 的哌啶子基、 未取代的或 N- 低级烷基取代的通过环碳原子结合的哌啶基、 哌嗪子基、 低级 烷基哌嗪子基、 吗啉代基、 硫代吗啉代基、 S- 氧代 - 硫代吗啉代基或 S， S- 二氧代硫代吗啉 代基 ； C1-C7- 烷基、 氨基 -C1-C7- 烷基、 N-C1-C7- 烷酰基氨基 -C1-C7- 烷基、 N-C1-C7- 烷基磺 酰基 - 氨基 -C1-C7- 烷基、 氨甲酰基 -C1-C7- 烷基、 [N- 单 - 或 N， N- 二 -(C1-C7- 烷基 )- 氨 甲酰基 ]-C1-C7- 烷基、 C1-C7- 烷基亚磺酰基 -C1-C7- 烷基、 C1-C7- 烷基磺酰基 -C1-C7- 烷基、 苯基、 萘基、 单至三 -[C1-C7- 烷基、 卤素和 / 或氰基 ]- 苯基或单至三 -[C1-C7- 烷基、 卤素 和 / 或氰基 ]- 萘基 ； C3-C8- 环烷基、 单至三 -[C1-C7- 烷基和 / 或羟基 ]-C3-C8- 环烷基 ； 卤 素、 羟基、 低级烷氧基、 低级烷氧基 - 低级烷氧基、 ( 低级 - 烷氧基 )- 低级烷氧基 - 低级烷 氧基、 卤代 -C1-C7- 烷氧基、 苯氧基、 萘氧基、 苯基 - 或萘基 - 低级烷氧基 ； 氨基 -C1-C7- 烷 氧基、 低级烷酰基氧基、 苯甲酰基氧基、 萘甲酰基氧基、 甲酰基 (CHO)、 氨基、 N- 单 - 或 N， N- 二 -(C1-C7- 烷基 )- 氨基、 C1-C7- 烷酰基氨基、 C1-C7- 烷基磺酰基氨基、 羧基、 低级烷氧基羰 基， 例如 ； 苯基 - 或萘基 - 低级烷氧基羰基， 例如苄基氧基羰基 ； C1-C7- 烷酰基如乙酰基、 苯 甲酰基、 萘甲酰基、 氨甲酰基、 N- 单 - 或 N， N- 二取代的氨甲酰基如 N- 单 - 或 N， N- 二 - 取代 的氨甲酰基， 其中取代基选自低级烷基、 ( 低级 - 烷氧基 )- 低级烷基和羟基 - 低级烷基 ； 脒 基、 胍基、 脲基、 巯基、 低级烷硫基、 苯基 - 或萘基硫基、 苯基 - 或萘基 - 低级烷硫基、 低级烷 基 - 苯硫基、 低级烷基 - 萘基硫基、 卤素 - 低级烷基巯基、 磺基 (-SO3H)、 低级烷基磺酰基、 苯 基 - 或萘基 - 磺酰基、 苯基 - 或萘基 - 低级烷基磺酰基、 烷基苯基磺酰基、 卤素 - 低级烷基磺 酰基如三氟甲磺酰基 ； 磺酰氨基 (sulfonamido)、 苯磺酰氨基、 叠氮基、 叠氮基 -C1-C7- 烷基、 尤其是叠氮基甲基、 C1-C7- 烷基磺酰基、 氨磺酰基、 N- 单 - 或 N， N- 二 -(C1-C7- 烷基 )- 氨磺 酰基、 吗啉代基磺酰基、 硫代吗啉代基磺酰基、 氰基和硝基 ； 其中作为取代基或作为取代的 烷基 ( 或者还有本文提到的取代的芳基、 杂环基等 ) 的取代基的一部分的以上提到的苯基 或萘基 ( 和在苯氧基或萘氧基中的 ) 各自本身是未取代的或者被一个或多个、 例如最多三 个、 优选 1 或 2 个取代基所取代， 所述取代基独立地选自卤素、 卤代 - 低级烷基如三氟甲基、 羟基、 低级烷氧基、 叠氮基、 氨基、 N- 单 - 或 N， N- 二 -( 低级烷基和 / 或 C1-C7- 烷酰基 )- 氨 基、 硝基、 羧基、 低级烷氧基羰基、 氨甲酰基、 氰基和 / 或氨磺酰基。
     “杂环基” 指如下定义的杂环基团 ： 其为不饱和的 ( ＝环中带有最高可能数目的共 轭双键 )、 饱和或部分饱和的并且优选是单环或者在本发明的更广泛方面是二环、 三环或螺 环； 并且具有 3 至 24 个、 更优选 4 至 16 个、 最优选 5 至 10 个且最优选 5 或 6 个环原子 ； 其中 一个或多个、 优选 1 至 4 个、 尤其是 1 或 2 个环原子是杂原子 ( 因此剩余环原子是碳 )。 键合 环 ( 即与分子连接的环 ) 优选具有 4 至 12 个、 尤其是 5 至 7 个环原子。术语杂环基还包括 杂芳基。 杂环基团 ( 杂环基 ) 可以是未取代的或者被一个或多个、 尤其是 1 至 3 个取代基所 取代， 所述的取代基独立地选自以上对取代的烷基所定义的取代基和 / 或选自一个或多个以下取代基 ： 氧代 ( ＝ O)、 硫代羰基 ( ＝ S)、 亚氨基 ( ＝ NH)、 亚氨基 - 低级烷基。 此外， 杂环 基尤其是选自如下的杂环基 ： 氧杂环丙烷基、 氮杂环丙烯基、 吖丙啶基、 1， 2- 氧杂硫杂环戊 烷基、 噻吩基、 呋喃基、 四氢呋喃基、 吡喃基、 噻喃基、 噻蒽基、 异苯并呋喃基、 苯并呋喃基、 色 烯基、 2H- 吡咯基、 吡咯基、 吡咯啉基、 吡咯烷基、 咪唑基、 咪唑烷基、 苯并咪唑基、 吡唑基、 吡 嗪基、 吡唑烷基、 噻唑基、 异噻唑基、 二噻唑基、 唑基、 异 唑基、 吡啶基、 吡嗪基、 嘧啶基、 哌啶基、 哌嗪基、 哒嗪基、 吗啉基、 硫代吗啉基、 (S- 氧代或 S， S- 二氧代 )- 硫代吗啉基、 吲嗪 基、 氮杂环庚基、 二氮杂环庚基、 尤其是 1， 4- 二氮杂环庚基、 异吲哚基、 3H- 吲哚基、 吲哚基、 苯并咪唑基、 香豆基 (cumaryl)、 吲唑基、 三唑基、 四唑基、 嘌呤基、 4H- 喹嗪基、 异喹啉基、 喹 啉基、 四氢喹啉基、 四氢异喹啉基、 十氢喹啉基、 八氢异喹啉基、 苯并呋喃基、 二苯并呋喃基、 苯并噻吩基、 二苯并噻吩基、 酞嗪基、 萘啶基、 喹喔啉基、 喹唑啉基、 喹唑啉基、 噌啉基、 蝶啶 菲咯啉基、 呋咱基、 吩嗪基、 吩噻嗪基、 吩 基、 咔唑基、 β- 咔啉基、 菲啶基、 吖啶基、 啶基、 嗪基、 色烯基、 异苯并二氢吡喃基、 苯并二氢吡喃基、 苯并 [1， 3] 二氧杂环戊烯 -5- 基和 2， 3- 二氢 - 苯并 [1， 4] 二 烯 -6- 基， 这些基团各自是未取代的或者被一个或多个、 优选 最多三个取代基所取代， 所述的取代基选自以上对取代的芳基提到的那些和 / 或选自一个 或多个以下取代基 ： 氧代 ( ＝ O)、 硫代羰基 ( ＝ S)、 亚氨基 ( ＝ NH)、 亚氨基 - 低级烷基。 “芳基烷基” 指通过烷基如甲基或乙基与分子结合的芳基， 优选苯乙基或苄基， 特 别是苄基。类似地， 环烷基烷基和杂环基烷基代表通过烷基与分子结合的环烷基或者通过 烷基与分子结合的杂环基。在每种情况中， 芳基、 杂环基、 环烷基和烷基可以如上定义的那 样被取代。
     “治疗” 包括预防性 ( 防护性 ) 和治疗性治疗以及延缓疾病或紊乱的进展。
     “PI3 激酶介导的疾病” ( 尤其是 PI3Kα 介导的疾病或者由 PI3Kα 的过表达或扩 增、 PIK3CA 的体细胞突变或 PTEN 的种系突变或体细胞突变或用于正调节 p85-p110 复合物 的 p85α 的突变和易位的激酶所介导的疾病 ) 尤其是以有益的方式 ( 例如改善一种或多种 症状、 延缓疾病发作、 直至暂时或完全治愈疾病 ) 对抑制 PI3 激酶、 尤其是抑制 PI3Kα 或其 突变形式有响应的这类病症 ( 其中在所治疗的疾病中， 增殖性疾病例如肿瘤疾病和白血病 是尤其被提到的 )。
     “盐” ( 其以 “或其盐” 表示 ) 可以单独或与游离式 (I) 化合物混合存在， 并且优选 是可药用盐。这类盐例如作为酸加成盐、 优选与有机或无机酸从含有碱性氮原子的式 (I) 化合物而形成， 尤其是可药用盐。适宜的无机酸例如有氢卤酸如盐酸、 硫酸或磷酸。适宜的 有机酸例如有羧酸或磺酸， 如富马酸或甲磺酸。 为了分离或纯化的目的， 还可能使用不可药 用的盐， 例如苦味酸盐或高氯酸盐。对于治疗用途， 仅采用可药用盐或游离化合物 ( 其中可 以以药物制剂的形式应用 )， 因此优选这些盐。 由于游离形式的新化合物以及其盐形式 ( 包 括例如在新化合物的纯化或鉴定中可以用作中间体的那些盐 ) 之间的密切关系， 因此上下 文中涉及游离化合物的地方可以适当和有利地理解为还指相应的盐。式 (I) 化合物的盐优 选是可药用的盐 ； 形成可药用盐的合适的抗衡离子是本领域已知的。
     “组合” 是指一种剂量单位形式的固定组合， 或者用于组合施用的成套药盒， 其中 式 (I) 化合物和组合伙伴 ( 例如如下解释的其它药物， 还称为 “治疗剂” 或 “共用物质” )可 以同时独立施用或在时间间隔内分别施用， 尤其是当这些时间间隔使组合伙伴显示出协作
     作用、 例如协同作用时。如本文所用的术语 “共同施用” 或 “组合施用” 等意欲囊括将所选 的组合伙伴施用于需要其的单个个体 ( 例如患者 )， 并且意欲包括其中物质不必通过相同 施用途径或同时施用的治疗方案。如本文所用的术语 “药物组合产品” 表示将一种以上活 性成分混合或组合所得到的产品， 并且既包括活性成分的固定组合也包括非固定组合。术 语 “固定组合” 表示活性成分如式 I 化合物和组合伙伴以单一实体或剂量的形式同时施用 于患者。术语 “非固定组合” 表示活性成分如式 I 化合物和组合伙伴均作为单独实体同时、 共同或无特定时间限制地先后施用于患者， 其中该施用在患者体内提供了两种化合物的治 疗有效水平。后者还适用于鸡尾酒疗法， 例如施用 3 种或更多种活性成分。
     在优选的实施方案 ( 其独立地、 共同地或以任意组合或亚组合进行优选 ) 中， 本发 明涉及游离碱形式或酸加成盐形式的式 I 化合物， 其中取代基如本文所定义。
     在一项有利的实施方案中， 本发明涉及式 IA 化合物
    
    
    其中， 取代基如式 (I) 化合物所定义。 在另一项有利的实施方案中， 本发明涉及式 IB 化合物其中， 取代基如式 (I) 化合物所定义。
     因此， 式 (I) 化合物还包括式 (IA) 和 (IB) 化合物。在本发明的全文中， 以下定义 也都适用。
     A 优选地代表具有一个或两个氮原子和 5-10 个成环原子的杂芳基。
     A 特别优选地代表选自以下基团的杂芳基 ：
    
    A 非常特别优选地代表选自以下基团的杂芳基 ：
    
    A 最优选代表选自以下基团的杂芳基 ：R1 优选地代表以下取代基之一 ：
     (1) 未取代或取代的， 优选取代的 C1-C7- 烷基， 其中所述取代基独立地选自一个或 多个， 优选一至九个以下基团 ： 氘、 卤素、 氰基、 C3-C12- 环烷基、 C1-C7- 烷基氨基、 二 (C1-C7- 烷 基 ) 氨基、 C1-C7- 烷基氨基羰基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基羰基、 C1-C7- 烷氧基、 苯基 ( 其是 未取代的或者被一个或多个， 优选一个 C1-C7- 烷基、 C1-C7- 烷氧基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨 苯氧基 ( 其是未取代的或者被一个或多个， 优选一个 C1-C7- 烷基、 基 -C1-C7- 烷氧基取代 )、 C1-C7- 烷氧基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基 -C1-C7- 烷氧基 ) ；
     (2) 未取代或取代的 C3-C12- 环烷基， 其中所述取代基独立地选自一个或多个， 优 选一至四个以下基团 ： 氘、 卤素、 氰基、 C1-C7- 烷基、 C1-C7- 烷基氨基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨 基、 氨基羰基、 C1-C7- 烷基氨基羰基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基羰基、 C1-C7- 烷氧基、 苯基 ( 其 是未取代的或者被一个或多个， 优选一个 C1-C7- 烷基、 C1-C7- 烷氧基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨 基 -C1-C7- 烷氧基 )、 苯氧基 ( 其是未取代的或者被一个或多个， 优选一个 C1-C7- 烷基、 C1-C7- 烷氧基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基 -C1-C7- 烷氧基 ) ；
     (3) 未取代或取代的苯基， 其中所述取代基独立地选自一个或多个， 优选一至两个 以下基团 ： 氘、 卤素、 氰基、 C1-C7- 烷基、 C1-C7- 烷基氨基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基、 C1-C7- 烷基 氨基羰基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基羰基、 C1-C7- 烷氧基 ；
     (4) 未取代的、 单 - 或二取代的胺 ； 其中所述取代基独立地选自以下基团 ： 氘、 C1-C7- 烷基 ( 其是未取代的或被一个或多个选自氘、 氟、 氯、 羟基的基团取代 )、 C1-C7- 烷 基羰基、 苯基 ( 其是未取代的或被一个或多个， 优选一个 C1-C7- 烷基、 C1-C7- 烷氧基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基 -C1-C7- 烷氧基取代 )、 苯基磺酰基 ( 其是未取代的或被一个或多个， 优 选一个 C1-C7- 烷基、 C1-C7- 烷氧基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基 -C1-C7- 烷氧基取代 )，
     (5) 取代的磺酰基 ； 其中所述取代基选自以下基团 ： C1-C7- 烷基 ( 其是未取代的或 被一个或多个选自氘、 氟、 氯、 羟基的基团取代 )、 C1-C7- 烷基氨基 ( 其中烷基部分是未取代 的或被一个或多个选自氘、 氟、 氯、 羟基的基团取代 )、 二 -C1-C7- 烷基氨基 ( 其中烷基部分 是未取代的或被一个或多个选自氘、 氟、 氯、 羟基的基团取代 ) ；
     (6) 氟、 氯。 1
     R 特别优选地代表以下取代基之一 ：
     (1) 未取代或取代的， 优选取代的 C1-C7- 烷基， 其中所述取代基独立地选自一个或 多个， 优选一至九个以下基团 ： 氘、 氟， 或者一个或两个以下基团 ： C3-C5- 环烷基 ；
     (2) 任选被取代的 C3-C5- 环烷基， 其中所述取代基独立地选自一个或多个， 优选一 至四个以下基团 ： 氘、 C1-C4- 烷基 ( 优选甲基 )、 氟、 氰基、 氨基羰基 ；
     (3) 任选被取代的苯基， 其中所述取代基独立地选自一个或多个， 优选一至两个以 下基团 ： 氘、 卤素、 氰基、 C1-C7- 烷基、 C1-C7- 烷基氨基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基、 C1-C7- 烷基氨 基羰基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基羰基、 C1-C7- 烷氧基 ；
     (4) 任 选 的 单 - 或 二 取 代 的 胺 ； 其中所述取代基独立地选自以下基团 ： 氘、 C1-C7- 烷基 ( 其是未取代的或被一个或多个选自氘、 氟、 氯、 羟基的基团取代 )、 苯基磺酰基 ( 其是未取代的或被一个或多个， 优选一个 C1-C7- 烷基、 C1-C7- 烷氧基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨 基 -C1-C7- 烷氧基取代 )，
     (5) 取代的磺酰基 ； 其中所述取代基选自以下基团 ： C1-C7- 烷基 ( 其是未取代的 或被一个或多个选自氘、 氟的基团取代 )、 吡咯烷子基 ( 其是未取代的或被一个或多个选自 氘、 羟基、 氧代的基团取代 ； 特别是被一个氧代取代 )，
     (6) 氟、 氯。 1
     R 非常特别优选地代表 ：
     (1) 环丙基甲基， 或任选被取代的、 支链的 C3-C7- 烷基， 其中所述取代基独立地选 自一个或多个， 优选一至九个以下基团 ： 氘、 氟；
     (2) 任选被取代的环丙基或环丁基， 其中所述取代基独立地选自一个或多个， 优选 一至四个以下基团 ： 甲基、 氘、 氟、 氰基、 氨基羰基 ；
     (3) 任选被取代的苯基， 其中所述取代基独立地选自一个或多个， 优选一至两个以 下基团 ： 氘、 卤素、 氰基、 C1-C7- 烷基、 C1-C7- 烷基氨基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基、 C1-C7- 烷基氨 基羰基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基羰基、 C1-C7- 烷氧基 ；
     (4) 任 选 的 单 - 或 二 取 代 的 胺 ； 其中所述取代基独立地选自以下基团 ： 氘、 C1-C7- 烷基 ( 其是未取代的或被一个或多个选自氘、 氟、 氯、 羟基的基团取代 )、 苯基磺酰基 ( 其是未取代的或被一个或多个， 优选一个 C1-C7- 烷基、 C1-C7- 烷氧基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨 基 -C1-C7- 烷氧基取代 )，
     (5) 取代的磺酰基 ； 其中所述取代基选自以下基团 ： C1-C7- 烷基 ( 其是未取代的 或被一个或多个选自氘、 氟的基团取代 )、 吡咯烷子基 ( 其是未取代的或被一个或多个选自 氘、 羟基、 氧代的基团取代 ； 特别是被一个氧代取代 )，
     (6) 氟、 氯。 1
     R 非常特别优选地代表以下取代基之一 ： -C(CH3)2CF3、 C(CD3)3、 1- 甲基环丙基 ； 优 选在 (I-A) 和 (I-B) 的背景中。
     R2 优选地代表如 R1 所定义的取代基。
     R2 进一步优选地代表氢或氘。
     R2 特别优选地代表氢。
     R2 在一项可选择的实施方案中代表甲基。
     R3 优选地代表 (1) 氢， (2) 卤素， (3) 任选被取代的 C1-C7- 烷基， 其中所述取代基独 立地选自一个或多个， 优选一至三个以下基团 ： 氘、 卤素、 C1-C7- 烷基氨基、 二 (C1-C7- 烷基 ) 氨基。
     R3 特别优选地代表 (1) 氢， (2) 氟、 氯， (3) 任选被取代的甲基， 其中所述取代基独立地选自一个或多个， 优选一至三个以下基团 ： 氘、 氟、 氯、 二甲基氨基。 3
     R 非常特别优选地代表氢、 甲基、 CD3、 CH2Cl、 CH2F、 CH2N(CH3)3 ； 优选甲基。 1 2
     本发明还涉及如本文所定义的式 (I) 化合物， 其中 R 和 / 或 R 代表叔丁基的化合 物除外。
     本发明还涉及式 (I) 化合物的可药用前药。
     本发明还涉及式 (I) 化合物的可药用代谢物。
     本发明尤其涉及实施例中以及本文所述制备方法中给出的式 (I) 化合物。
     本发明还涉及式 (I) 化合物的制备方法。基本上所有已知的将两种不同的胺转化 为相应的脲衍生物的方法都是适合的， 且可以通过使用各自的起始原料进行应用。
     因此， 本发明特别涉及式 (I) 化合物的制备方法， 其包括将式 (II) 化合物
    
    与式 (IIIA) 化合物
    
    其中取代基如本文所定义， 且 R3 可以另外代表氯， 在活化试剂的存在下反应 ( “方 法 A” )， 或者与式 (IIIB) 化合物反应其中 R1 和 R2 如本文所定义， R3 如本文所定义且可以另外代表氯， 且 RG 代表反应 基团， 例如咪唑基羰基， 其可以直接反应或者通过形成 (IIIE) 的异氰酸酯中间体进行反应 (“方法 B” )，
    
    其中所述取代基如 (IIIB) 中所定义，
     在每种情况中任选在稀释剂的存在下并且任选在反应助剂的存在下反应， 和回收 所得的游离形式或盐形式的式 (I) 化合物， 以及
     任选将根据方法 A 或方法 B 可得到的式 (I) 化合物转化为不同的式 (I) 化合物， 和 / 或将可得到的式 (I) 化合物的盐转化为其不同的盐， 和 / 或将可得到的游离式 (I) 化 合物转化为其盐， 和 / 或从一种或多种不同的可得到的式 (I) 的异构体中分离可得到的式 (I) 化合物的异构体。
     反应条件
     可以根据本领域已知的方法或者按照以下实施例中公开的方法进行该方法。例 如， 可以使式 II 化合物与式 III 化合物在溶剂如二甲基甲酰胺中、 在碱、 例如有机胺如三乙 胺的存在下反应。
     当温度在上文或下文中被给出时， 应当加入 “约” ， 因为所给数值的小偏差、 例如 ±10％的变化是容许的。
     所有反应可以在一种或多种稀释剂和 / 或溶剂的存在下进行。原料可以以等摩尔 量使用 ； 或者， 化合物可以过量使用， 例如作为溶剂而发挥作用或使平衡移动或通常加快反 应速率。
     可以如本领域已知的、 反应所需要的那样并且按照通常已知的操作加入适宜量的 反应助剂， 例如酸、 碱或催化剂。
     保护基团
     如果一个或多个其它官能团， 例如羧基、 羟基、 氨基、 巯基等在如本文描述的原料 或任意其它前体中被保护或需要被保护， 因为它们不应参与反应或干扰反应， 则这些基团 是如通常在肽化合物、 头孢菌素类和青霉素类以及核酸衍生物和糖类的合成中使用的这类 基团。保护基团是一旦它们被除去就不再在最终化合物中存在的这类基团， 而在此处所用 的意义上作为取代基保留的基团不是保护基团， 保护基团是在原料或中间体阶段被加入， 并且被除去以得到最终化合物的基团。此外， 对于式 (I) 化合物转化为不同的式 (I) 化合 物而言， 如果有用或需要的话， 可以加入和除去保护基团。
     保护基团可以已经在前体中存在， 并且应该保护有关的官能团以防止不需要的二 次反应如酰化、 醚化、 酯化、 氧化、 溶剂解以及类似的反应。 保护基团的特征是它们自身易于 ( 即没有不需要的二次反应 ) 除去， 通常通过乙酰解、 质子解、 溶剂解、 还原、 光解或通过酶 活性、 例如在类似于生理条件的条件下除去， 并且它们在终产物中不存在。 专业人员知道或
     可以容易确定哪些保护基团适于上下文提到的反应。
     这类保护基团对这些官能团的保护、 保护基团本身及其去除反应例如在如下 标准参考著作中有描述 ： 例如 J.F.W.McOmie， 《有机化学中的保护基团》 (“Protective Groups in Organic Chemistry” )， 普 莱 姆 出 版 社 (Plenum Press)， 伦 敦 和 纽 约 1973， T.W.Greene， 《有机合成中的保护基团》 (“Protective Groups in Organic Synthesis” )， 第 三 版，威 利 (Wiley) 公 司，纽 约 1999， 《肽》 (“The Peptides” )； 第 3 卷 ( 编 者： E.Gross 和 J.Meienhofer)， 学术出版社 (Academic Press)， 伦敦和纽约 1981， “Methoden derorganischen Chemie” ( 有 机 化 学 方 法 )， Houben Weyl， 第 4 版， 第 15 卷 /I， Georg Thieme Verlag， 斯 图 加 特 1974， H.-D.Jakubke 和 H.Jescheit， Peptide， Proteine” ( 氨基酸、 肽、 蛋白质 )， Verlag Chemie， Weinheim， Deerfield Beach 和 Basel 1982，和 Jochen Lehmann， “Chemieder Kohlenhydrate ： Monosaccharide und Derivate” ( 碳水化合物化学 ： 单糖和衍生物 )， Georg Thieme Verlag， 斯图加特 1974。
     任选的反应和转化
     一种式 (I) 化合物可以被转化为不同的式 (I) 化合物。
     在其中 R3 代表氟的式 (I) 化合物中， 可以通过将相应的氯衍生物转化为氟化合物 而得到这类化合物。这类反应是已知的并且被称为取代反应。该转化可以在式 (IIIA 或 B) 的原料的步骤进行或者通过将相应的式 (I) 化合物转化而进行。
     在其中取代基带有氨基或氨基 -C1-C7- 烷基取代基的式 (I) 化合物中， 可以通过与 相应的 C1-C7- 烷酰基卤化物或 C1-C7- 烷基磺酰基卤化物、 例如相应的氯化物在如下条件下 反应将氨基转化为酰基氨基、 例如 C1-C7- 烷酰基氨基或 C1-C7- 烷基磺酰基氨基 ： 在叔氮碱 如三乙胺或吡啶的存在下， 在有或没有适当溶剂如二氯甲烷的存在下， 例如在 -20 至 50℃ 范围内的温度下如在约室温下进行。
     在其中取代基带有氰基取代基的式 (I) 化合物中， 可以例如通过在如下条件下氢 化将氰基转化为氨基甲基 ： 在适当的金属催化剂如阮内镍或阮内钴的存在下， 在适当溶剂、 例如低级链烷醇如甲醇和 / 或乙醇中， 例如在 -20 至 50℃范围内的温度下如在约室温下进 行。
     具有成盐基团的式 (I) 化合物的盐可以按照本身已知的方式来制备。 因此， 式 (I) 化合物的酸加成盐可以通过用酸或用适宜的阴离子交换试剂处理而得到。 具有两个酸分子 的盐 ( 例如式 (I) 化合物的二卤化物 ) 还可以被转化为每个化合物具有一个酸分子的盐 ( 例如单卤化物 ) ； 这可以通过如下方法做到 ： 加热至熔化物， 或者例如作为固体在高真空 下、 在高温如从 130 至 170℃下加热， 此时每分子的式 (I) 化合物排出一分子酸。通常可以 例如通过用适宜的碱性化合物、 例如用碱金属碳酸盐、 碱金属碳酸氢盐或碱金属氢氧化物、 通常为碳酸钾或氢氧化钠处理而将盐转化为游离化合物。
     可以按照本身已知的方式、 通过适宜的分离方法将立体异构混合物、 例如非对映 异构体的混合物分离为其相应的异构体。 例如可以通过分步结晶、 色谱法、 溶剂分配和类似 方法将非对映异构混合物分离为其单独的非对映异构体。 该分离可以在起始化合物的水平 或者在式 (I) 化合物本身中进行。可以通过形成非对映异构盐、 例如通过与对映异构体纯 的手性酸形成盐或者通过色谱法、 例如通过 HPLC、 使用具有手性配体的色谱基质来分离对 映异构体。应该强调， 与本章中所提到的转化类似的反应也可以在适当中间体的水平进行 ( 并且因此可用于制备相应的原料 )。
     原料 ：
     式 II 和 III 的原料以及本文如下文提到的其它原料可以按照或类似于本领域已 知的方法来制备， 它们是本领域已知的和 / 或可市售获得。在对于原料的制备没有特别描 述的情况下， 化合物是已知的或者可以按照类似于本领域已知的方法、 例如 WO 05/021519 或 WO04/096797 中的方法或者按照下文公开的方法来制备。新原料及其制备方法同样是本 发明的实施方案。在优选的实施方案中， 使用这类原料并选择所选反应以便能够得到优选 的化合物。
     在也可以适当和有利地作为盐形式使用和 / 或得到的原料 ( 包括中间体 ) 中， 取 代基优选如对式 (I) 化合物所定义。
     本发明还涉及式 (IIIA) 化合物或其盐
    其中所述取代基如式 (I) 化合物所定义。
     本发明还涉及式 (IIIA) 化合物的制备方法。基本上， 全部已知的将两种或芳基 / 杂芳基组分偶联 ( 例如 Heck 型反应 ) 成对应的脲衍生物的方法都是适合的， 且可以通过使 用各自的起始原料进行应用。因此本发明还涉及式 (IIIA) 的制备方法， 其包括
     ( 步骤 1) 将式 (IV) 化合物
    
    
    其中 R3 如本文所定义且可以另外代表卤素， PG 代表保护基团， 例如酰基基团， 与式 (V) 化合物其中 R1、 R2、 A 如本文所定义， 且 Hal 代表卤素， 例如溴， 在 Heck 条件下反应 ； 任选 地在稀释剂的存在下且任选地在反应助剂的存在下反应 ；
     ( 步骤 2) 然后除去保护基团， 例如在酸性条件下 ； 任选地在稀释剂的存在下且任
     选地在反应助剂的存在下反应 ； 并
     回 收 所 得 到 的 游 离 形 式 或 盐 形 式 的 式 (IIIA) 化 合 物， 并任选地将所得的式 (IIIA) 化合物转化为不同的式 (IIIA) 化合物， 和 / 或将所得的式 (IIIA) 化合物的盐转化 为其不同的盐， 和 / 或将所得的游离的式 (IIIA) 化合物转化为其盐， 和 / 或从得到的一种 或多种不同的式 (IIIA) 的异构体中分离式 (IIIA) 化合物的一种可得到的异构体。
     本发明还涉及式 (IIIB) 化合物或其盐
    其中 R1、 R2、 A 如式 (I) 化合物所定义， RG 代表反应基团， 特别是咪唑基羰基， 其可 以直接反应或者通过形成 (IIIE) 的异氰酸酯中间体进行反应， 且 R3 如本文所定义并可以 另外代表卤素。
     本发明还涉及式 (IIIB) 化合物的制备方法。基本上， 全部已知的将胺或其盐转化 成对应的活化衍生物的方法都是适合的， 且可以通过使用各自的起始原料进行应用。因此 本发明还涉及式 (IIIB) 化合物的制备方法， 其包括将式 (IIIA) 化合物
    
    其中取代基如本文所定义， 与活化试剂， 例如 1， 1’ - 羰基二咪唑， 任选地在稀释剂 的存在下且任选地在反应助剂的存在下反应 ； 并且
     回收得到的游离形式或盐形式的式 (IIIB) 化合物， 和任选地将所得的式 (IIIB) 化合物转化为不同的式 (IIIB) 化合物， 和 / 或将所得的式 (IIIB) 化合物的盐转化为其不 同的盐， 和 / 或将所得的游离的式 (IIIB) 化合物转化为其盐， 和 / 或从得到的一种或多种 不同的式 (IIIB) 的异构体中分离式 (IIIB) 化合物的一种可得到的异构体。
     本发明还涉及式 (IIIC) 化合物或其盐
    
    其中取代基如式 (I) 化合物所定义。
     本发明还涉及式 (IIIC) 化合物的制备方法。基本上， 全部环合反应都是适合的， 且可以通过使用各自的起始原料进行应用。因此本发明还涉及式 (IIIC) 化合物的制备方 法， 其包括将式 (VI) 化合物
    
    
    其中 R3 如本文所定义且可以另外代表卤素， 与式 (VII) 化合物其中 R1 如本文所定义 ； 任选地在稀释剂的存在下且任选地在反应助剂的存在下进 行反应 ； 并且
     回收得到的游离形式或盐形式的式 (IIIC) 化合物， 并任选地将所得的式 (IIIC) 化合物转化为不同的式 (IIIC) 化合物， 和 / 或将所得的式 (IIIC) 化合物的盐转化为其不 同的盐， 和 / 或将所得的游离的式 (IIIC) 化合物转化为其盐， 和 / 或从得到的一种或多种 不同的式 (IIIC) 的异构体中分离式 (IIIC) 化合物的一种可得到的异构体。
     本发明还涉及式 (IIID) 化合物或其盐
    
    其中 R1 如本文所定义， RG 代表反应基团， 特别是咪唑基羰基， R3 如本文所定义， 且 可以另外代表卤素。
     本发明还涉及式 (IIID) 化合物的制备方法。基本上， 全部已知的将胺或其盐转化 成对应的活化衍生物的方法都是适合的， 且可以通过使用各自的起始原料进行应用。因此 本发明还涉及式 (IIID) 化合物的制备方法， 其包括将式 (IIIC) 化合物
    
     其中取代基如上文所定义， 与活化试剂， 例如 1， 1’ - 羰基二咪唑， 任选地在稀释剂 的存在下且任选地在反应助剂的存在下反应 ； 并且
     回收得到的游离形式或盐形式的式 (IIID) 化合物， 和任选地将所得的式 (IIID) 化合物转化为不同的式 (IIID) 化合物， 和 / 或将所得的式 (IIID) 化合物的盐转化为其不 同的盐， 和 / 或将所得的游离的式 (IIID) 化合物转化为其盐， 和 / 或从得到的一种或多种 不同的式 (IIID) 的异构体中分离式 (IIID) 化合物的一种可得到的异构体。
     本发明还涉及式 (VI) 化合物或其盐
    
    其中 R3 如本文所定义且可以另外代表卤素。
     本发明还涉及式 (VI) 化合物的制备方法。基本上， 全部已知的适合用于此类转化 的方法都可以通过使用各自的起始原料进行应用。因此本发明还涉及式 (IIID) 化合物的 制备方法， 其包括将式 (IIX) 化合物
    
    其中 R3 如式 (I) 所定义且可以另外代表卤素， 与二甲基甲酰胺的缩醛， 例如 DMF- 二甲基缩醛反应， 得到式 (VI) 化合物 ；
     回收得到的游离形式或盐形式的式 (IIID) 化合物， 并任选地将所得的式 (IIX) 化 合物转化为不同的式 (IIX) 化合物， 和 / 或将所得的式 (IIX) 化合物的盐转化为其不同的 盐， 和 / 或将所得的游离的式 (IIX) 化合物转化为其盐， 和 / 或从得到的一种或多种不同的 式 (IIX) 的异构体中分离式 (IIX) 化合物的一种可得到的异构体。
    
    
    式 (I) 化合物还包括亚式 (IA)、 (IB) 及其可药用盐， 可用作药物， 其中
     A 代表杂芳基 ；
     R1 代表 (1) 任选被取代的烷基 ； (2) 任选被取代的环烷基 ； (3) 任选被取代的芳基 ； (4) 任选被取代的胺 ； (5) 任选被取代的磺酰基 ； (6) 卤素 ； 2 1
     R 代表氢、 氘或如 R 所定义的取代基 ； 3
     R 代表氢、 卤素、 任选被取代的烷基。
     因此， 本发明涉及其中表明 PI3K 抑制的用于人类或兽用的组合物的一项实施 方案。该实施方案还包含 (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-( 叔丁基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺， 但或者不包含所述化合物。
     在一项实施方案中， 本发明涉及治疗由 PI3K 介导的细胞增殖性疾病、 例如肿瘤和 / 或癌性细胞生长。疾病包括那些显示 PI3Kα 的过表达或扩增、 PIK3CA 的体细胞突变或 PTEN 的种系突变或体细胞突变或用于正调节 p85-p110 复合物的 p85α 的突变和易位的 激酶所介导的疾病。具体而言， 化合物可用于治疗人或动物 ( 例如鼠类 ) 癌症， 包括例如 肉瘤 ； 肺癌 ； 支气管癌 ； 前列腺癌 ； 乳腺癌 ( 包括散发的乳腺癌和考登病患者 ) ； 胰腺癌 ； 胃 肠癌 ； 结肠癌 ； 直肠癌 ； 结肠癌 ； 结肠直肠腺瘤 ； 甲状腺癌 ； 肝癌 ； 肝内胆管癌 ； 肝细胞癌 ； 肾 上腺癌 ； 胃癌 ； 胃癌 ； 神经胶质瘤 ； 胶质母细胞瘤 ； 子宫内膜癌 ； 黑素瘤 ； 肾癌 ； 肾盂癌 ； 膀胱 癌； 子宫体癌 ； 子宫颈癌 ； 阴道癌 ； 卵巢癌 ； 多发性骨髓瘤 ； 食管癌 ； 白血病 ； 急性髓性白血 病； 慢性髓性白血病 ； 淋巴细胞白血病 ； 髓性白血病 ； 脑癌 ； 脑癌 ； 口腔和咽癌 ； 喉癌 ； 小肠 癌； 非霍奇金淋巴瘤 ； 黑素瘤和绒毛状结肠腺瘤 ； 瘤形成 ； 上皮特征的瘤形成 ； 淋巴瘤 ； 乳 癌； 基底细胞癌 ； 鳞状细胞癌 ； 光化性角化病 ； 肿瘤疾病， 包括实体瘤 ； 颈或头部肿瘤 ； 真性 红细胞增多症 ； 原发性血小板增多症 ； 骨髓纤维化伴骨髓化生 ； 和瓦尔登斯特伦病。
     在其它实施方案中， 病症或紊乱 ( 如 PI3K 介导的 ) 选自 ： 真性红细胞增多症、 原 发性血小板增多症、 骨髓纤维化伴骨髓化生、 哮喘、 COPD、 ARDS、 勒夫勒综合征、 嗜酸细胞性 肺炎、 寄生虫 ( 特别是后生动物 ) 侵染 ( 包括热带肺嗜酸细胞增多 )、 支气管肺曲霉病、 结 节性多动脉炎 ( 包括丘 - 斯综合征 )、 嗜酸细胞肉芽肿、 由药物反应引起的影响气道的与嗜 酸性细胞有关的紊乱、 银屑病、 接触性皮炎、 特应性皮炎、 斑秃、 多形性红斑、 疱疹样皮炎、 硬 皮病、 白癜风、 变应性血管炎、 荨麻疹、 大疱性类天疱疮、 红斑狼疮、 天疱疮 (pemphisus)、 后 天性大疱性表皮松解、 自身免疫性血液病 ( 例如溶血性贫血、 再生障碍性贫血、 纯红细胞贫 血和特发性血小板减少 )、 系统性红斑狼疮、 多发性软骨炎、 硬皮病、 韦格纳肉芽肿病、 皮肌 炎、 慢性活动性肝炎、 重症肌无力、 斯 - 琼氏综合征、 特发性口炎性腹泻、 自身免疫性炎性肠 病 ( 例如溃疡性结肠炎和克罗恩病 )、 内分泌性眼病、 格雷夫斯病、 结节病、 肺泡炎、 慢性过
    敏性肺炎、 多发性硬化症、 原发性胆汁性肝硬化、 ( 前和后 ) 眼色素层炎、 肺间质纤维化、 银屑病关节炎、 肾小球肾炎、 心血管疾病、 动脉粥样硬化、 高血压、 深部静脉血栓形成、 中风、 心 肌梗塞、 不稳定心绞痛、 血栓栓塞、 肺栓塞、 血栓溶解性疾病、 急性动脉缺血、 外周血栓性阻 塞和冠状动脉疾病、 再灌注损伤、 视网膜病、 例如糖尿病性视网膜病或高压氧引起的视网膜 病， 以及以升高眼内压或眼房水分泌为特征的病症、 例如青光眼。
     对于以上用途， 所需的剂量当然将根据施用方式、 所治疗的具体病症和所期望的 作用而改变。通常， 以约 0.03 至约 100.0mg/kg 体重， 例如约 0.03 至约 10.0mg/kg 体重的 日剂量全身施用表明可获得满意的结果。大型哺乳动物、 例如人的指示日剂量的范围为约 0.5mg 至约 3g， 例如约 5mg 至约 1.5g， 其方便地例如以一天最多四次的分份剂量或以缓释 形式施用。适合于口服施用的单位剂量形式包含约 0.1 至约 500mg， 例如约 1.0 至约 500mg 活性成分。
     式 (I) 化合物可以通过任意常规途径施用， 特别是经肠施用、 例如口服施用， 如以 片剂或胶囊剂的形式施用， 或经胃肠道外施用、 例如以可注射的溶液或混悬液的形式施用， 局部施用、 例如以洗剂、 凝胶剂、 软膏剂或乳膏剂的形式施用， 通过吸入施用， 鼻内施用， 或 以栓剂形式施用。
     式 (I) 化合物可以以游离形式或以可药用盐的形式、 例如如上所示的那样施用。 这类盐可以以常规方式来制备并且显示出与游离化合物相同级别的活性。 因此， 本发明还提供了 ：
     ■在需要这类治疗的个体中预防或治疗通过激活 PI3K( 如 PI3 激酶 α) 酶所介导 的病症、 紊乱或疾病的方法， 例如以上所示的那些疾病， 该方法包括给所述个体施用有效量 的式 (I) 化合物或其可药用盐。
     ■游离形式或可药用盐形式的式 (I) 化合物， 其例如在如本文所示的任意方法中 作为药物。
     ■游离形式或可药用盐形式的式 (I) 化合物， 其例如在如本文所示的任意方法中 用作药物， 特别是用于一种或多种磷脂酰肌醇 3- 激酶介导的疾病。
     ■游离形式或可药用盐形式的式 (I) 化合物在如本文所示的任意方法中的用途， 特别是用于治疗一种或多种磷脂酰肌醇 3- 激酶介导的疾病。
     ■游离形式或可药用盐形式的式 (I) 化合物在如本文所示的任意方法中的用途， 特别是用于制备治疗一种或多种磷脂酰肌醇 3- 激酶介导的疾病的药物。
     PI3K 充当整合平行的信号传导途径的第二信使节点， 有证据正在表明， PI3K 抑制 剂和其它途径的抑制剂的组合将可用于治疗人类癌症和增殖性疾病。
     约 20-30 ％的人乳腺癌过表达 Her-2/neu-ErbB2( 药物曲妥珠单抗的靶标 )。虽 然曲妥珠单抗在表达 Her2/neu-ErbB2 的一些患者中已经证明了持久的响应， 但是只有部 分这些患者有响应。近来的工作已经表明， 该有限的响应速率可以通过曲妥珠单抗和 PI3K 或 PI3K/AKT 途径的抑制剂的组合来显著提高 (Chan 等人， Breast Can.Res.Treat.91 ： 187(2005)， WoodsIgnatoski 等 人， Brit.J.Cancer 82 ： 666(2000)， Nagata 等 人， Cancer Cell6 ： 117(2004))。
     多种人恶性瘤表达激活突变或增加 Her1/EGFR 水平， 已经开发了许多抗体和小分 子抑制剂来对抗该受体酪氨酸激酶， 包括特罗凯、 吉非替尼和爱必要。但是， 虽然 EGFR 抑 制剂证明在某些人肿瘤 ( 例如 NSCLC) 中具有抗肿瘤活性， 可是它们不能在患有表达 EGFR
     的肿瘤的所有患者中增加总的患者存活。这可以由如下事实来合理解释 ： Her1/EGFR 的许 多下游靶点在多种恶性瘤中以高频率发生突变或失调， 包括 PI3K/Akt 途径。例如， 吉非替 尼在体外试验中可抑制腺癌细胞系的生长。但是， 可以挑选出对吉非替尼有抗性的这些细 胞系的亚克隆， 证明 PI3/Akt 途径的激活增加了。向下调节或抑制该途径使有抗性的亚克 隆对吉非替尼敏感 (Kokubo 等人， Brit.J.Cancer 92 ： 1711(2005))。而且， 在具有含 PTEN 突变并且过表达 EGFR 的细胞系的乳腺癌的体外模型中， 既抑制 PI3K/Akt 途径又抑制 EGFR 产生了协同作用 (She 等人， Cancer Cell 8 ： 287-297(2005))。这些结果表明， 吉非替尼和 PI3K/Akt 途径抑制剂的组合将是癌症中有吸引力的治疗策略。
     AEE778(Her-2/neu/ErbB2、 VEGFR 和 EGFR 的抑制剂 ) 和 RAD001(mTOR(Akt 的下游 靶标 ) 的抑制剂 ) 的组合在胶质母细胞瘤异种移植物模型中产生了比单独的任一物质更大 的组合效能 (Goudar 等人， Mol.Cancer.Ther.4 ： 101-112(2005))。
     抗雌激素剂如他莫昔芬可通过诱导细胞周期停滞 ( 其需要细胞周期抑制物 p27Kip 的作用 ) 而抑制乳腺癌生长。近来， 已经表明 Ras-Raf-MAP 激酶途径的激活可改变 p27Kip 的磷酸化状态， 结果其在使细胞周期停滞中的抑制活性被减弱， 由此引起抗雌激素 抗性 (Donovan 等人， J.Biol.Chem.276 ： 40888， (2001))。如 Donovan 等人所报道的那样， 通过用 MEK 抑制剂处理来抑制 MAPK 信号传导在激素抵抗的乳腺癌细胞系中逆转了 p27 的 异常磷酸化状态， 并且由此恢复了激素敏感性。类似地， 通过 Akt 使 p27Kip 磷酸化也可取 消其对使细胞周期停滞的作用 (Viglietto 等人， Nat Med.8 ： 1145(2002))。
     因此， 在另一方面， 式 I 化合物可用于治疗激素依赖性癌症、 例如乳腺和前列腺 癌。该用途的目标是用常规的抗癌剂来逆转这些癌症中常见的激素抗性。
     在血液癌症如慢性髓性白血病 (CML) 中， 染色体易位负责组成性激活的 BCR-Abl 酪氨酸激酶。受影响的患者由于 Abl 激酶活性的抑制而对伊马替尼 ( 一种小分子酪氨酸激 酶抑制剂 ) 作出响应。但是， 患有晚期疾病的许多患者起初对伊马替尼有响应， 可是后来由 于在 Abl 激酶结构域中发生了给予抗性的突变而复发。体外研究已经表明， BCR-Ab1 利用 Ras-Raf 激酶途径来引起其作用。 此外， 抑制相同途径中一种以上的激酶可提供另外的保护 以防止给予抗性的突变。
     因此， 在另一方面， 式 I 化合物与至少一种选自激酶抑制剂如 的另外 的物质组合使用来治疗血液癌症如慢性髓性白血病 (CML)。 通过该用途可知， 目标是逆转或 阻止对所述的至少一种另外的物质的抗性。
     因为激活 PI3K/Akt 途径可驱动细胞存活， 所以与驱动癌细胞中细胞凋亡的疗 法 ( 包括放射治疗和化学治疗 ) 组合来抑制该途径将使响应提高 (Ghobrial 等人， CA Cancer J.Clin 55 ： 178-194(2005))。作为实例， PI3 激酶抑制剂和卡铂的组合表明在体外 增殖和细胞凋亡试验中以及在卵巢癌的异种移植物模型的体内肿瘤效能中具有协同作用 (Westfall 和 Skinner， Mol.Cancer Ther.4 ： 1764-1771(2005))。
     除了癌症和增殖性疾病外， 有越来越多的证据表明 1A 和 1B 类 PI3 激酶的抑制剂 将在治疗上可用于其它疾病领域。抑制 p110β(PIK3CB 基因的 PI3K 同工型产物 ) 已经表 明可参与剪切引起的血小板激活 (Jackson 等人， Nature Medicine 11 ： 507-514(2005))。 因此， 抑制 p110β 的 PI3K 抑制剂将在抗血栓治疗中可用作单独的药物或可组合使用。同 工型 p110δ(PIK3CD 基因的产物 ) 在 B 细胞功能和分化 (Clayton 等人， J.Exp.Med.196 ：753-763(2002))、 T 细 胞 依 赖 性 和 非 依 赖 性 抗 原 响 应 (Jou 等 人， Mol.Cell.Biol.22 ： 8580-8590(2002)) 及肥大细胞分化 (Ali 等人， Nature 431 ： 1007-1011(2004)) 中是重要 的。因此， 期望 p110δ 抑制剂将可用于治疗 B 细胞驱动的自身免疫性疾病和哮喘。最后， 抑制 p110γ(PI3KCG 基因的同工型产物 ) 使 T 细胞而非 B 细胞的响应减少 (Reif 等人， J.Immunol.173 ： 2236-2240(2004))， 这种抑制证明在自身免疫性疾病的动物模型中具有效 能 (Camps 等人， Nature Medicine 11 ： 936-943(2005)， Barber 等人， Nature Medicine11 ： 933-935(2005))。
     本发明还提供了药物组合物， 其包含单独的或者与其它抗癌剂一起的至少一种式 (I) 化合物以及适合施用于人或动物个体的可药用赋形剂。
     本发明还提供了治疗患有细胞增殖性疾病如癌症的人或动物个体的方法。因此， 本发明提供了治疗需要这类治疗的人或动物个体的方法， 包括给该个体单独施用或者与一 种或多种其它抗癌剂组合施用治疗有效量的式 (I) 化合物。特别是组分将被配制在一起作 为组合治疗剂或者分别施用。适于与式 (I) 化合物使用的抗癌剂包括但不限于一种或多 种选自以下所述的激酶抑制剂、 抗雌激素剂、 抗雄激素剂、 其它抑制剂、 癌症化疗药物、 烷化 剂、 螯合剂、 生物效应调节剂、 癌症疫苗、 用于反义治疗的物质的化合物 ：
     A. 激酶抑制剂 ： 作为抗癌剂与式 (I) 化合物联合使用的激酶抑制剂包括 ： 表 皮生长因子受体 (EGFR) 激酶抑制剂， 例如小分子喹唑啉类如吉非替尼 (US 5457105、 US 5616582 和 US 5770599)、 ZD-6474(WO 01/32651)、 厄洛替尼 ( US 5,747,498 和 WO 96/30347) 和 lapatinib(US6,727,256 和 WO 02/02552) ； 血管内皮生长因子 受 体 (VEGFR) 激 酶 抑 制 剂， 包 括 SU-11248(WO 01/60814)、 SU 5416(US 5,883,113 和 WO 99/61422)、 SU 6668(US 5,883,113 和 WO 99/61422)、 CHIR-258(US 6,605,617 和 US6,774,237)、 伐 他 拉 尼 或 PTK-787(US 6,258,812)、 VEGF-Trap(WO02/57423)、 B43- 染 料木黄酮 (WO-09606116)、 芬维 A 胺 ( 维甲酸对 - 羟基苯胺 )(US 4,323,581)、 IM-862(WO 02/62826)、 贝伐单抗或 (WO94/10202)、 KRN-951、 3-[5-( 甲 基 磺 酰 基 哌 啶 甲 基 )- 吲哚基 ]- 喹诺酮、 AG-13736 和 AG-13925、 吡咯并 [2， 1-f][1， 2， 4] 三嗪、 ZK-304709、 VMDA-3601、 EG-004、 CEP-701(US 5,621,100)、 Cand5(WO 04/09769) ； Erb2 酪 氨酸激酶抑制剂， 例如 pertuzumab(WO 01/00245)、 曲妥珠单抗和利妥昔单抗 ； Akt 蛋白激 酶抑制剂， 例如 RX-0201 ； 蛋白激酶 C(PKC) 抑制剂， 例如 LY-317615(WO 95/17182) 和哌 立福辛 (US 2003171303) ； Raf/Map/MEK/Ras 激酶抑制剂， 包括索拉非尼 (BAY 43-9006)、 ARQ-350RP、 LErafAON、 BMS-354825AMG-548， 和在 WO 03/82272 中公开的其它化合物 ； 成纤 维细胞生长因子受体 (FGFR) 激酶抑制剂 ； 细胞依赖性激酶 (CDK) 抑制剂， 包括 CYC-202 或 Roscovitine(WO 97/20842 和 WO 99/02162) ； 血小板衍生生长因子受体 (PDGFR) 激酶抑制 剂， 例如 CHIR-258、 3G3mAb、 AG-13736、 SU-11248 和 SU6668 ； 以及 Bcr-Abl 激酶和融合蛋白 抑制剂如 STI-571 或
    ( 伊马替尼 )。B. 抗雌激素剂 ： _ 在抗癌治疗中与式 (I) 化合物联合使用的雌激素靶向的物质 包括 ： 选择性雌激素受体调节剂 (SERMs)， 包括他莫昔芬、 托瑞米芬、 雷洛昔芬 ； 芳香酶抑制 剂， 包括 司群。29或阿那曲唑 ； 雌激素受体负调节物 (ERDs)， 包括或氟维102149711 A CN 102149713
    说明书21/100 页C. 抗雄激素剂 ： _ 在抗癌治疗中与式 (I) 化合物联合使用的雄激素靶向的物质包 括氟他胺、 比卡鲁胺、 非那雄胺、 氨鲁米特、 酮康唑和皮质类固醇。
     D. 其它抑制剂 ： _ 作为抗癌剂与式 (I) 化合物联合使用的其它抑制剂包括 ： 蛋 白法尼基转移酶抑制剂， 包括替匹法尼或 R-115777(US 2003134846 和 WO 97/21701)、 BMS-214662、 AZD-3409 和 FTI-277 ； 拓 扑 异 构 酶 抑 制 剂， 包 括 merbarone 和 二 氟 替 康 (BN-80915) ； 有丝分裂纺锤体驱动蛋白 (KSP) 抑制剂， 包括 SB-743921 和 MKI-833 ； 蛋白酶 体调节剂， 例如硼替佐米或 (US 5,780,454)、 XL-784 ； 和环加氧酶 2(COX-2) 抑 制剂， 包括非甾体抗炎药 I(NSAIDs)。
     E. 癌症化疗药物 ： 作为抗癌剂与式 (I) 化合物联合使用的具体的癌症化学治疗 剂包括阿那曲唑 白消安 比卡鲁胺 白消安注射液 硫酸博来霉素 卡培他滨 卡莫司汀 克拉屈滨 环磷酰胺 阿糖胞苷脂质体注射液 N4- 戊 氧 基 苯丁酸氮芥 或羰 基 -5- 脱 氧 -5- 氟 胞 苷、 卡铂 顺铂 阿糖胞苷、 阿糖胞苷 达 卡 巴 嗪 (DTIC-)、 放 线 菌 素 D( 放 线 菌 素 D， Cosmegan)、 盐酸柔红霉素 地塞米松、 多西他赛 依托泊苷 氟他胺 伊达比星 L- 门 冬 酰 胺 酶 甲氨蝶呤 亚 米 磷枸橼酸柔红霉素脂质体注射液 盐酸多柔比星 酸氟达拉滨 5- 氟尿嘧啶tezacitibine、 吉西他滨 ( 二氟脱氧胞苷 )、 羟基脲 异环磷酰胺 叶 酸 钙、 美法仑 托蒽醌 伊立替康 6- 巯 基 嘌 呤 麦 罗 塔、 紫杉醇phoenix( 钇 90/MX-DTPA)、 喷司 枸橼酸他莫昔芬 注射用盐酸 和长春瑞滨他 丁、 聚 苯 丙 生 20 和 卡 莫 司 汀 植 入 物 替尼泊苷 托泊替康6- 硫 鸟 嘌 呤、 塞 替 派、 替拉扎明 长春碱 长春新碱F. 烷化剂 ： _ 与式 (I) 化合物联合使用的烷化剂包括 VNP-40101M 或 cloretizine、 奥沙利铂 (US 4,169,846、 WO 03/24978 和 WO 03/04505)、 葡磷酰胺、 马磷酰胺、 凡毕复 (US 5,041,424)、 泼尼莫司汀 ； 曲奥舒凡 ； 白消安 ； irofluven( 酰基富烯 ) ； penclomedine ； 吡唑 并吖啶 (PD-115934) ； O6- 苄基鸟嘌呤 ； 地西他滨 (5- 氮杂 -2- 脱氧胞苷 ) ； brostallicin ；
    丝 裂 霉 素 C(MitoExtra) ； TLK-286替莫唑胺 ； 曲 贝 替 定 (US 5,478,932) ；AP-5280( 顺铂的铂酸盐制剂 ) ； 泊非霉素 ； 和 clearazide(meclorethamine)。
     G. 螯合剂 ： _ 与式 (I) 化合物联合使用的螯合剂包括四硫钼酸盐 (WO01/60814) ；RP-697 ； 嵌合的 T84.66(cT84.66) ； 钆膦维司 (EPT) 组合的博来霉素。
    去铁胺 ； 以及任选与电穿孔法H. 生 物 效 应 调 节 剂 ： _ 与 式 (I) 化 合 物 联 合 使 用 的 生 物 效 应 调 节 剂、 例如免 疫调节剂包括 ： 星型包菌素及其大环类似物， 包括 UCN-01、 CEP-701 和米哚妥林 ( 参见 WO 02/30941、 WO 97/07081、 WO 89/07105、 US5,621,100、 WO 93/07153、 WO 01/04125、 WO 02/30941、 WO 93/08809、 WO 94/06799、 WO 00/27422、 WO 96/13506 和 WO 88/07045) ； 角鲨胺 (WO01/79255) ； DA-9601(WO 98/04541 和 US 6,025,387) ； 阿仑单抗 ； 干扰素 ( 例 如 IFN-a、 IFN-b 等 ) ； 白 细 胞 介 素， 特 别 是 IL-2 或 阿 地 白 介 素 以 及 IL-1、 IL-3、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-7、 IL-8、 IL-9、 IL-10、 IL-11、 IL-12， 及具有多于 70 ％天然人序列的氨 基酸序列的其活性生物变体 ； 六甲蜜胺 SU 101 或来氟米特 (WO 04/06834 和 US 6,331,555) ； 咪唑并喹啉， 例如瑞喹莫德和咪喹莫特 (US 4,689,338、 5,389,640、 5,268,376 、 4,929,624 、 5,266,575 、 5,352,784 、 5,494,916 、 5,482,936 、 5,346,905 、 5,395,937、 5,238,944 和 5,525,612) ； 以及 SMIPs， 包括苯并唑类、 蒽醌类、 缩氨基硫脲类和 色胺酮类 (WO 04/87153、 WO 04/64759 和 WO 04/60308)。
    I. 癌 症 疫 苗 ： _ 与 式 (I) 化 合 物 联 合 使 用 的 抗 癌 疫 苗 包 括(Tetrahedron Lett.26 ： 2269-70(1974)) ； oregovomab (STn-KLH) ； 黑素瘤疫苗 ； 针对 Ras 蛋白中 5 个突变的 GI-4000 系列 (GI-4014、 GI-4015 和 GI-4016) ； GlioVax-1 ； MelaVax ； 或 INGN-201(WO 95/12660) ； Sig/E7/LAMP-1， 编码 HPV-16E7 ； MAGE-3 疫苗或 M3TK(WO 94/05304) ； HER-2VAX ； 刺激对肿瘤特异的 T 细胞的 ACTIVE ； GM-CSF 癌症疫苗 ； 和基于利斯特菌属 (Listeria) 单细胞质基因的疫苗。
     J. 反 义 治 疗 ： _ 与 式 (I) 化 合 物 联 合 使 用 的 抗 癌 剂 还 包 括 反 义 组 分， 例如 AEG-35156(GEM-640) ； AP-12009 和 AP-11014(TGF-β2 特异性反义寡核苷酸 ) ； AVI-4126 ； AVI-4557 ； AVI-4472 ； oblimersen JFS2 ； aprinocarsen(WO 97/29780) ； GTI-2040(R2 核 糖 核 苷 酸 还 原 酶 mRNA 反 义 寡 核 苷 酸 )(WO 98/05769) ； GTI-2501(WO 98/05769) ； 脂 质 体 包 囊 的 c-Raf 反 义 寡 脱 氧 核 苷 酸 (LErafAON)(WO 98/43095) ； 和 Sirna-027( 基于 RNAi 的靶向于 VEGFR-1mRNA 的治疗剂 )。
     式 (I) 化合物还可以在药物组合物中与支气管扩张或抗组胺药物组合。这类支 气管扩张药物包括抗胆碱能或抗毒蕈碱剂， 特别是异丙托溴铵、 氧托溴铵和噻托溴铵， 以及 β-2- 肾上腺素受体激动剂， 例如沙丁胺醇、 特布他林、 沙美特罗、 卡莫特罗、 milveterol 以 及尤其是福莫特罗和茚达特罗。共同治疗的抗组胺药物包括盐酸西替利嗪、 富马酸氯马斯 汀、 异丙嗪、 氯雷他定、 地氯雷他定、 苯海拉明和盐酸非索非那定。
     在另外的方面， 本发明提供了组合， 其包含式 (I) 化合物以及一种或多种可用于 治疗血栓性疾病、 心脏病、 中风等的化合物。 这类化合物包括阿司匹林、 链激酶、 组织纤溶酶 原激活剂、 尿激酶、 抗凝血剂、 抗血小板药 ( 例如 PLAVIX ； 氯吡格雷硫酸氢盐 )、 他汀类化合 物 ( 例如立普妥或阿托伐他汀钙、 舒降之 ( 辛伐他汀 )、 可定 ( 罗苏伐他汀 ) 等 )、 β 阻滞 剂 ( 例如阿替洛尔 )、 络活喜 ( 苯磺酸氨氯地平 ) 和 ACE 抑制剂 ( 例如赖诺普利 )。
     在另外的方面， 本发明提供了组合， 其包含式 (I) 化合物以及一种或多种可用于 治疗高血压的化合物。这类化合物包括 ACE 抑制剂、 降脂药物如他汀类、 立普妥 ( 阿托伐他汀钙 )、 钙通道阻滞剂如络活喜 ( 苯磺酸氨氯地平 )。
     在另外的方面， 本发明提供了组合， 其包含式 (I) 化合物以及一种或多种选自贝 特类 (fibrates)、 β- 阻滞剂、 NEPI 抑制剂、 血管紧张素 -2 受体拮抗剂和血小板聚集抑制 剂的化合物。
     在另外的方面， 本发明提供了组合， 其包含式 (I) 化合物以及适于治疗炎性疾病、 包括类风湿性关节炎的化合物。这类化合物可以选自 TNF-α 抑制剂如抗 -TNF-α 单克隆 抗体 ( 例如类克、 CDP-870) 和 D2E7(HUMIRA) 及 TNF 受体免疫球蛋白融合分子 ( 例如依那 西普 )、 IL-1 抑制剂、 受体拮抗剂或可溶性 IL-1Rα( 例如 KINERET 或 ICE 抑制剂 )、 非甾体 抗炎药 (NSAIDS)、 吡罗昔康、 双氯芬酸、 萘普生、 氟比洛芬、 非诺洛芬、 酮洛芬、 布洛芬、 灭酸 酯类 (fenamates)、 甲芬那酸、 吲哚美辛、 舒林酸、 阿扎丙宗、 吡唑啉酮类、 保泰松、 阿司匹林、 COX-2 抑制剂 ( 例如西乐葆 ( 塞来考昔 )、 PREXIGE( 芦米考昔 ))、 金属蛋白酶抑制剂 ( 优选 MMP-13 选择性抑制剂 )、 p2x7 抑制剂、 α2α 抑制剂、 NEUROTIN、 普瑞巴林、 低剂量甲氨蝶呤、 来氟米特、 羟氯喹、 d- 青霉胺、 金诺芬或者胃肠道外或口服金。
     在另外的方面， 本发明提供了组合， 其包含式 (I) 化合物以及适于治疗骨关节炎 的化合物。这类化合物可以选自标准的非甾体抗炎药 ( 下文为 NSAIDs) 如吡罗昔康、 双氯 芬酸、 丙酸类如萘普生、 氟比洛芬、 非诺洛芬、 酮洛芬和布洛芬、 灭酸酯类如甲芬那酸、 吲哚 美辛、 舒林酸、 阿扎丙宗、 吡唑啉酮类如保泰松、 水杨酸类如阿司匹林、 COX-2 抑制剂如塞来 考昔、 伐地考昔、 芦米考昔和艾托考昔、 镇痛药以及关节内治疗剂如皮质类固醇及透明质酸 如海尔根和欣维可。 在另外的方面， 本发明提供了组合， 其包含式 (I) 化合物以及抗病毒剂和 / 或抗菌 化合物。所述抗病毒剂可以选自泛罗赛、 AZT、 阿昔洛韦和泛昔洛韦。所述抗菌化合物可以 选自 Valant。
     在另外的方面， 本发明提供了组合， 其包含式 (I) 化合物以及一种或多种选自如 下的物质 ： CNS 药物， 例如抗抑郁药 ( 舍曲林 )、 抗帕金森症药 ( 例如地普雷尼尔、 L- 多巴、 Requip、 普拉克索 ； MAOB 抑制剂 ( 例如司来吉兰 (selegine) 和雷沙吉兰 ) ； comP 抑制剂 ( 例 如托卡朋 ) ； A-2 抑制剂 ； 多巴胺重吸收抑制剂 ； NMDA 拮抗剂 ； 烟碱激动剂 ； 多巴胺激动剂 ； 和神经元的一氧化氮合酶抑制剂 )。
     在另外的方面， 本发明提供了组合， 其包含式 (I) 化合物以及一种或多种抗阿 尔茨海默病药物。所述抗阿尔茨海默病药物可以选自多奈哌齐、 他克林、 α2δ 抑制剂、 NEUROTIN、 普瑞巴林、 COX-2 抑制剂、 丙戊茶碱或美曲膦酯。
     在另外的方面， 本发明提供了组合， 其包含式 (I) 化合物以及抗骨质疏松症药物 和 / 或免疫抑制剂。所述骨质疏松症药物可以选自易维特 ( 盐酸雷洛昔芬 )、 屈洛昔芬、 拉 索昔芬或 Fosomax。所述免疫抑制剂可以选自 FK-506 和雷帕霉素。
     在优选实施方案的另一方面， 提供了药盒， 其包括一种或多种式 (I) 化合物和如 本文公开的组合伙伴。代表性药盒包括 PI3K 抑制剂化合物 ( 例如式 (I) 化合物 ) 以及包 装插页或其它标记， 包括通过施用 PI3K 抑制量的化合物来治疗细胞增殖性疾病的说明书。
     通常， 式 (I) 化合物将以治疗有效量、 通过对任何发挥类似功效的物质而言可接 受的施用方式来施用。式 (I) 化合物、 即活性成分的实际量将取决于多种因素， 例如所治疗 疾病的严重性、 个体的年龄和相对健康、 所用化合物的效能、 施用的途径和形式以及其它因
     素。药物可以一天施用一次以上， 优选一天施用一次或两次。所有这些因素都在主治医师 的技能之内。式 (I) 化合物的治疗有效量的范围可以在约 0.05 至约 50mg/ 公斤受者体重 /天； 优选约 0.1-25mg/kg/ 天， 更优选约 0.5 至 10mg/kg/ 天。因此， 对于施用于 70kg 的人 而言， 剂量范围将最优选为约 35-70mg/ 天。
     通常， 式 (I) 化合物将作为药物组合物、 通过任意一种以下途径施用 ： 口服、 全身 ( 例如透皮、 鼻内或通过栓剂 ) 或胃肠道外 ( 例如肌内、 静脉内或皮下 ) 施用。优选的施 用方式是使用方便的日剂量方案进行口服， 所述的日剂量方案可以根据病痛的程度进行调 整。组合物可以采取片剂、 丸剂、 胶囊剂、 半固体、 粉末、 缓释制剂、 溶液、 混悬液、 酏剂、 气雾 剂的形式或任意其它适当的组合物。另一种优选的施用式 I 化合物的方式是吸入。这是将 治疗剂直接传递到呼吸道的有效方法。
     制剂的选择取决于多种因素， 例如药物施用的方式和药物物质的生物利用度。对 于通过吸入传递而言， 化合物可以被配制成液体溶液、 混悬液、 气雾喷射剂或干粉， 并且可 以被装入适于施用的分配器中。有数种类型的药物吸入装置 - 喷雾器吸入器、 定量吸入器 (MDI) 和干粉吸入器 (DPI)。喷雾器装置可产生高速空气流， 使治疗剂 ( 以液体形式配制 ) 喷成薄雾， 其被带入患者的呼吸道。MDI 通常是用压缩气体包装的制剂。启动后， 该装置通 过压缩气体释放出定量的治疗剂， 由此提供施用指定量的物质的可靠方法。 DPI 可分配自由 流动的粉末形式的治疗剂， 这些治疗剂可以在通过该装置进行呼吸的过程中被分散到患者 的吸入气流中。为了获得自由流动的粉末， 治疗剂可与赋形剂如乳糖进行配制。定量的治 疗剂以胶囊形式贮存， 并且用每次启动进行分配。 本发明还涉及其中式 (I) 化合物的粒度在 10-1000nm、 优选 10-400nm 之间的制 剂。尤其对于显示出生物利用度差的药物， 根据可以通过增加表面积、 即减小粒度来提 高生物利用度的原理， 已经开发了这类药物制剂。例如， U.S.4,107,288 描述了具有大小 范围为 10 至 1,000nm 的颗粒的药物制剂， 其中活性物质被支持在交联的大分子基质上。 U.S.5,145,684 描述了药物制剂的制备， 其中在表面修饰剂的存在下药物物质被粉碎成纳 米粒 ( 平均粒度为 400nm)， 然后被分散在液体介质中， 得到显示出非常高的生物利用度的 药物制剂。这两篇文献均被包括在本文内作为参考。
     在另外的方面， 本发明提供了药物组合物， 其包含 ( 治疗有效量 ) 的式 (I) 化合物 以及至少一种可药用赋形剂。可接受的赋形剂是无毒的、 可帮助施用并且不会不利地影响 式 I 化合物的治疗益处。这类赋形剂可以是任意固体、 液体、 半固体， 或者对于气雾剂组合 物而言可以是本领域技术人员通常可得到的气体赋形剂。
     固体药物赋形剂包括淀粉、 纤维素、 滑石粉、 葡萄糖、 乳糖、 蔗糖、 明胶、 麦芽、 米、 面 粉、 白垩、 硅胶、 硬脂酸镁、 硬脂酸钠、 单硬脂酸甘油酯、 氯化钠、 脱脂奶粉等。
     液体和半固体赋形剂可以选自甘油、 丙二醇、 水、 乙醇和多种油类、 包括石油、 动 物、 植物或合成来源的那些、 例如花生油、 大豆油、 矿油、 芝麻油等。特别用于可注射溶液的 优选的液体载体包括水、 盐水、 葡萄糖水和二醇类。
     压缩气体可以用于分散气雾剂形式的式 (I) 化合物。适于该目的的惰性气体有氮 气、 二氧化碳等。其它适宜的药物赋形剂及其制剂在 E.W.Martin 编写的 《雷明顿药物科学》 (Remington′ s Pharmaceutical Sciences)( 马克 (Mack) 出版公司， 第 18 版， 1990) 中有 描述。
     制剂中化合物的量可以在本领域技术人员所采用的全部范围内改变。通常， 基于 重量百分数 ( 重量％ ) 计算， 制剂将含有约 0.01-99.99 重量％的式 (I) 化合物 ( 基于总制 剂计算 )， 而剩余物质为一种或多种适宜的药物赋形剂。优选化合物以约 1-80 重量％的水 平存在。
     本发明还涉及药物组合物， 其包含 ( 即含有或包括 ) 至少一种式 (I) 化合物以及 至少一种可药用赋形剂。
     包含游离形式或可药用盐形式的式 (I) 化合物以及至少一种可药用赋形剂 ( 例如 载体和 / 或稀释剂 ) 的药物组合物可以按照常规方式、 通过将组分混合来制备。
     包含游离形式或可药用盐形式的式 (I) 化合物并且还包含组合伙伴 ( 作为一个剂 量单位形式或作为成套药盒 ) 以及至少一种可药用的载体和 / 或稀释剂的组合的药物组合 物可以按照常规方式、 通过将可药用的载体和 / 或稀释剂与所述的活性成分混合来制备。
     因此， 在另外的方面， 本发明提供了 ：
     ■组合的药物组合物， 例如用于本文描述的任意方法， 其包含游离形式或可药用 盐形式的式 (I) 化合物以及可药用的稀释剂和 / 或载体。
     ■组合的药物组合物， 其包含作为活性成分的游离形式或可药用盐形式的式 (I) 化合物 ； 一种或多种可药用的载体物质和 / 或稀释剂以及任选的一种或多种另外的药物物 质。这类组合的药物组合物可以是一种剂量单位形式或作为成套药盒。
     ■组合的药物组合物， 其包含治疗有效量的游离形式或可药用盐形式的式 (I) 化 合物以及第二种药物物质， 它们可同时或先后施用。
     ■如上定义的方法， 该方法包括共同施用， 例如同时或先后施用治疗有效的无毒 量的式 (I) 化合物或其可药用盐以及至少第二种药物物质、 例如如上所示的第二种药物物 质。
     ■药物组合产品， 例如药盒， 其包含 a) 第一种物质， 它是游离形式或可药用盐形 式的如本文公开的式 (I) 化合物， 和 b) 至少一种共用药物、 例如如上所示的共用药物 ； 其中 这类药盒可以包含其施用说明书。
     以下的式 (I) 化合物的实施例说明了本发明而非限制其范围。制备这类化合物的 方法在下文有描述。
     实 施 例 1： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 叔 丁 基 - 吡 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    在氩气中将 Et3N(1.54mL， 11.1mmol， 3 当量 ) 加入咪唑 -1- 甲酸 [5-(2- 叔丁基 - 吡 啶 -4- 基 )-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 ]- 酰 胺 ( 步 骤 1.1)(1.26g， 3.7mmol) 和 L- 脯 氨 酰 胺 (0.548g， 4.8mmol， 1.3 当量 ) 在 DMF(25mL) 的溶液中。 将反应混合物在室温下搅拌 14 小时， 通过加入饱和 NaHCO3 溶液猝灭， 并用 EtOAc 萃取。将有机相用饱和 NaHCO3 溶液洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱 (DCM/MeOH， 1 ∶ 0 → 94 ∶ 6) 纯化， 然后用 + Et2O 研磨， 得到 1.22g 标题化合物， 为灰白色固体 ： ESI-MS ： 388.1[M+H] ； tR ＝ 2.35min( 系 1 统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.36(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。 H NMR(400MHz， DMSO-d6)δ(ppm) ： 1.32(s， 9H)1.75-1.95(m ， 3H)1.97-2.13(m ， 1H)2.39(s ， 3H)3.38-3.50(m ， 1H)3.52-3.65(m. ， 1H)4.10-4.40(m， 1H)6.94(b r.s.， 1H)7.22(d， 1H)7.30-7.48(m， 2H)8.49(d， 1H)10.87(b r.s.， 1H)
     步骤 1.1 ： 咪唑 -1- 甲酸 [5-(2- 叔丁基 - 吡啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰 胺
    
    将 5-(2- 叔丁基 - 吡啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基胺 ( 步骤 1.2)(1g， 4.05mmol) 和 1， 1’ - 羰 基 二 咪 唑 (0.984g， 6.07mmol， 1.5 当 量 ) 在 DCM(50mL) 中 的 混 合 物 回 流 搅 拌 4 小时， 并冷却。经过滤收集所得沉淀， 得到 1.26g 标题化合物， 为白色固体 ： ESI-MS ： 340.2[M-H] ； tR ＝ 2.85min( 系统 1)。
     步骤 1.2 ： 5-(2- 叔丁基 - 吡啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基胺将 N-[5-(2- 叔丁基 - 吡啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 乙酰胺 ( 步骤 1.3)(2g， 7mmol)、 6N 的 HCl 水溶液 (10mL) 和 EtOH(50mL) 的混合物在 85℃下搅拌 2 小时， 冷却， 通过 加入饱和 NaHCO3 溶液猝灭并用 DCM/MeOH(9 ∶ 1， v/v) 萃取。将有机相用饱和 NaHCO3 溶液 洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。 将残余物经硅胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH， 1 ∶ 0 → 96 ∶ 4) + 得 到 1.21g 标 题 化 合 物， 为黄色固体 ： ESI-MS ： 248.1[M+H] ； TLC ： Rf ＝ 0.36(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 1.3 ： N-[5-(2- 叔丁基 - 吡啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 乙酰胺
    
    在 氩 气 中 将 2- 乙 酰 氨 基 -4- 甲 基 噻 唑 (1.2g， 7.7mmol， 1.1 当 量 )、 碳酸铯 四氟硼酸盐 (0.406g， 1.4mmol， 0.2 当量 )、 乙酸钯(4.55g， 14mmol， 2 当量 )、 三叔丁基(II)(0.15g， 0.7mmol， 0.1 当量 ) 和 4- 溴 -2- 叔丁基 - 吡啶 ( 步骤 1.4)(1.5g， 7mmol) 在 DMF(50mL) 中的混合物在 90℃下搅拌 1.5 小时， 冷却， 通过加入饱和 NaHCO3 溶液猝灭， 并经 硅藻土垫过滤。将滤液用 EtOAc 萃取。将有机相用饱和 NaHCO3 溶液洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过 滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH， 1 ∶ 0 → 97 ∶ 3) 得到 2.02g 标题化合 + 物， 为黄色固体 ： ESI-MS ： 290.1[M+H] ； TLC ： Rf ＝ 0.35(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 1.4 ： 4- 溴 -2- 叔丁基 - 吡啶
    将 2- 叔丁基 -1H- 吡啶 -4- 酮 ( 步骤 1.5)(4.25g， 28mmol) 和 POBr3(8.88g， 31mmol， 1.1 当量 ) 的混合物加热至 120℃， 搅拌 15 分钟， 冷却， 通过加入饱和 NaHCO3 溶液猝灭， 并用 DCM/MeOH(9 ∶ 1， v/v) 萃取。 将有机相用饱和 NaHCO3 溶液洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。 将残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 95 ∶ 5) 得到 5.18g 标题化合物， 为黄色油状物 ： + ESI-MS ： 214.0/216.0[M+H] ； tR ＝ 2.49min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.35(Hex/EtOAc， 1 ∶ 1)。
     步骤 1.5 ： 2- 叔丁基 -1H- 吡啶 -4- 酮
    
    将 2- 叔丁基 - 吡喃 -4- 酮 ( 步骤 1.6)(5.74g， 37.7mmol) 和 30％的氢氧化铵水溶 液 (100mL) 回流下搅拌 1 小时， 冷却并浓缩。 将残余物用 MeOH(200mL) 研磨并过滤。 浓缩滤 aq 液并将残余物经硅胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH/NH3 ， 94 ∶ 5 ∶ 1 → 92 ∶ 7 ∶ 1) 得到 4.46g 标 + 题化合物， 为黄色固体 ： ESI-MS ： 152.0[M+H] ； tR ＝ 1.45min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.11(DCM/ MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 1.6 ： 2- 叔丁基 - 吡喃 -4- 酮
    
    将 5- 羟基 -1- 甲氧基 -6， 6- 二甲基 - 庚 -1， 4- 二烯 -3- 酮 ( 步骤 1.7)(6.8g， 36.9mmol) 和 TFA(5.65mL， 74mmol， 2 当量 ) 在苯 (250mL) 中的混合物在室温下搅拌 14 小时 并浓缩。 残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 1 ∶ 0 → 75 ∶ 25)， 得到 5.74g 标题化合物， + 为黄色油状物 ： ESI-MS ： 153.1[M+H] ； tR ＝ 3.21min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.22(Hex/EtOAc，
    1 ∶ 1)。
     步骤 1.7 ： 5- 羟基 -1- 甲氧基 -6， 6- 二甲基 - 庚 -1， 4- 二烯 -3- 酮
    将 LiHMDS(1M 的 THF 溶 液， 100mL， 2 当 量 ) 逐 滴 加 入 冷 却 的 (-78 ℃ )4- 甲 氧 基 -3- 丁烯 -2- 酮 (10mL， 100mmol， 2 当量 ) 在 THF(400mL) 的溶液中。在 -78℃搅拌 30 分 钟后， 加入特戊酰氯 (6.12mL， 50mmol) 在 THF(100mL) 中的溶液。将所得混合物历经 2 小时 加温至室温， 并通过加入饱和 NH4Cl 溶液猝灭。真空除去 THF。将该浓缩的混合物用 Et2O 萃取。有机相用盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/ EtOAc， 1 ∶ 0 → 85 ∶ 15) 得到 6.83g 标题化合物， 为黄色油状物 ： ESI-MS ： 185.1[M+H]+ ； TLC ： Rf ＝ 0.87(Hex/EtOAc， 1 ∶ 1)。
     实 施 例 2： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 环 丙 基 - 吡 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    按照与实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。 在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 4 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 85℃搅拌 2 小时。 在步骤 1.3 中， 使用 4- 氯 -2-(1- 甲基 - 环丙基 )- 吡啶 ( 步骤 2.1)， 并将反应混合物在 + 150℃下搅拌 2 小时。 标题化合物 ： ESI-MS ： 372.1[M+H] ； TLC ： Rf ＝ 0.35(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 2.1 ： 4- 氯 -2- 环丙基 - 吡啶
    按照文献 [Comins， D.L. ； Mantlo， N.B.， Journal of Organic Chemistry， (1985)， 50， 4410-4411] 中所述方法的修改方法制备标题化合物。
     将环丙基溴化镁 (0.5M 的 THF 溶液， 100mL， 50mmol， 2.2 当量 ) 一次加入冷却的 (-78℃ )4- 氯吡啶盐酸化物 (3.4g， 22mmol) 在 THF(68mL) 的溶液中。在 -78 ℃搅拌 10 分 钟后， 逐滴加入氯甲酸苯基酯 (2.76mL， 22mmol)。将反应混合物在 -78℃搅拌 15 分钟， 加温 至室温， 通过加入 20％的 NH4Cl 水溶液猝灭， 并用 Et2O 萃取 (2x100mL)。将有机相用饱和
    NaHCO3 溶液 (50mL) 洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。 向溶于甲苯 (100mL) 的残余物中加入 邻 - 氯醌 (6g， 24.2mmol， 1.1 当量 ) 在冰醋酸 (50mL) 中的溶液。将反应混合物在室温下搅 拌 14 小时， 冷却至 0℃， 通过加入 10％ NaOH 水溶液碱化， 并经硅胶垫过滤。 将滤液中的有机 层用 H2O(20mL) 洗涤， 并用 10％的 HCl 水溶液萃取 (3x25mL)。通过加入 20％的 NaOH 水溶 液将合并的酸层碱化， 并用 DCM 萃取 (3x25mL)。 将有机相用 H2O(50mL) 洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。残余物经硅胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH， 1 ∶ 0 → 99 ∶ 1) 得到 0.951g 标题化 + 合物， 为无色油状物 ： ESI-MS ： 154.1[M+H] ； tR ＝ 1.41min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.85(DCM/ MeOH， 9 ∶ 1)。
     实施例3： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-({5-[2-(2- 氟 - 苯 基 )- 吡 啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    按 照 实 施 例 1 中 所 述 类 似 的 方 法 制 备 标 题 化 合 物， 但 在 步 骤 1.3 中 使 用 4- 氯 -2-(2- 氟 - 苯基 )- 吡啶 ( 步骤 3.1)， 并在 150℃下搅拌对应的混合物 2 小时 ： ESI-MS ： + 426.1[M+H] ； tR ＝ 2.60min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.40(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 3.1 ： 4- 氯 -2-(2- 氟 - 苯基 )- 吡啶
    在 105℃下在氩气中将 2- 氟苯基硼酸 (141mg， 1mmol， 1.2 当量 ) 在 EtOH(1mL) 中 的混合物加入 4- 氯 -2- 碘 - 吡啶 [Choppin， S. ； Gros， P. ； Fort， Y.， European Journal of Organic Chemistry(2001)， (3)， 603-606](200mg， 0.84mmol)， PdCl2(dPPf)(18mg， 0.025mmol， 0.03 当量 ) 和 Na2CO3(2M 的 H2O 溶液， 1.68mL， 3.36mmol， 4 当量 ) 在甲苯 (2mL) 的混合物中。将反应混合物在 105℃下搅拌 1 小时， 冷却至室温， 通过加入饱和 NaHCO3 溶液 猝灭， 并用 EtOAc 萃取。将有机相用饱和 NaHCO3 溶液洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将 残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 1 ∶ 0 → 97 ∶ 3) 得到 127mg 标题化合物， 为白色固 + 体： ESI-MS ： 208.1[M+H] ； tR ＝ 4.66min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.27(Hex/EtOAc， 9 ∶ 1)。
     实 施 例 4： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 环 丁 基 - 吡 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 4 小时， 用 EtOAc 和 H2O 稀释， 并用 EtOAc 萃取。干燥并浓 缩有机相后， 将残余物在 DCM 中研磨进行纯化。在步骤 1.3 中， 将反应混合物在 120℃下搅 拌 2 小时， 冷却， 用 EtOAc 和 H2O 稀释， 经硅藻土垫过滤， 并用 EtOAc 萃取。干燥并浓缩有机 相后， 将残余物在 Et2O 中研磨进行纯化。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 80℃下搅拌 1 小 时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.7 中， 将 4- 甲氧基 -3- 丁烯 -2- 酮在 THF 中的溶液 加入冷却的 (-78℃ )LiHMDS 在 THF 中的溶液。30 分钟后， 加入环丁基甲酰氯的 THF 溶液， 并将反应混合物历经 18 小时达到室温。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 386.1[M+H]+ ； TLC ： Rf ＝ 0.11(DCM/MeOH， 95 ∶ 5)。
     实施例 5 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环丙 基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在步骤 1.1中， 将反应混合物在回流下搅拌 14 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 85℃下搅拌 1 小 时。在步骤 1.3 中， 将反应混合物在 120 ℃下搅拌 3 小时。在步骤 1.5 中， 将反应混合物 65-70℃下搅拌 1 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.7 中， 使用 1- 甲基 - 环丙烷甲 酰氯 ( 步骤 5.1)。
     标 题 化 合 物： ESI-MS ： 386.1[M+H]+ ； TLC ： Rf ＝ 0.40(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。 1 H NMR(400MHz ，DMSO-d6) δ (ppm) ： 0.71-0.87(m ， 2H)1.11-1.26(m ， 2H)1.47(s ， 3H)1.74-1.96(m ， 3H)2.00-2.15(m ， 1H)2.39(s ， 3H)3.35-3.52(m ， 1H)3.52-3.73(m ， 1H)4.10-4.40(m ， 1H)6.93(br.s. ， 1H)7.15(dd ， 1H)7.27(s ， 1H)7.35(s ， 1H)8.40(d ， 1H)10.99(b r.s.， 1H)
     步骤 5.1 ： 1- 甲基 - 环丙烷甲酰氯
    将 1- 甲基 - 环丙烷甲酸 (10g， 100mmol) 和草酰氯 (10.49ml， 120mmol， 1.2 当量 ) 在 CHCl3(80ml) 中的混合物在 70℃下搅拌 4 小时。 浓缩反应混合物得到 11.8g 标题化合物， 为黄色油状物， 其不经进一步纯化直接使用。
     实施例 6 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环丁 基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物通过加入 EtOAc 和 H2O 稀释进行猝灭， 并用 EtOAc 萃取。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 100℃下搅拌 2 小时。在步骤 1.3 中， 将反应混合物在 100℃下搅拌 3 小 时， 用 EtOAc/H2O 稀释， 并用 EtOAc 萃取。干燥并浓缩有机相后， 将残余物经硅胶柱色谱纯 化 (Hex/EtOAc， 1 ∶ 4)。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 80℃下搅拌 2 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.7 中， 将 4- 甲氧基 -3- 丁烯 -2- 酮 (50mmol) 在 THF(100mL) 中的溶液 加入冷却的 (-78℃ )LiHMDS(1M 的 THF 溶液， 100mL) 在 THF(200mL) 的溶液中。30 分钟后， 加入 1- 甲基 - 环丁烷氯化物 ( 步骤 6.1)， 并将反应混合物历经 18 小时达到室温。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 400.1[M+H]+ ； TLC ： Rf ＝ 0.06(DCM/MeOH/NH3aq， 94 ∶ 5 ∶ 1)。
     步骤 6.1 ： 1- 甲基 - 环丁烷甲酰氯
    
    按照如步骤 5.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 1- 甲基 - 环丁烷甲酸 [Cowling， S.J. ； Goodby， J.W.， Chemical Communications， (2006)， (39)， 4107-4109]。实施例 7 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[5-(2- 叔丁基 - 吡啶 -4- 基 )- 噻 唑 -2- 基 ]- 酰胺 }按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 16 小时， 通过加入 EtOAc 和 H2O 稀释进行猝灭， 并用 EtOAc 萃 取。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 2 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 100℃下搅拌 1 小时。在步骤 1.3 下， 使用 N- 噻唑 -2- 基 - 乙酰胺。将反应混合物在 120℃ 搅拌 2 小时， 用 EtOAc/H2O 稀释， 并用 EtOAc 萃取。干燥并浓缩有机相后， 将残余物经硅胶 柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 1 ∶ 1)， 然后在 Et2O 中研磨。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 374.1[M+H]+ ； tR ＝ 2.16min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.10(DCM/ aq MeOH/NH3 ， 94 ∶ 5 ∶ 1)。
     实 施 例 8： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 异 丙 基 - 吡 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 16 小时， 通过加入 EtOAc 和 H2O 稀释进行猝灭， 并用 EtOAc 萃取。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 100℃搅拌 2 小时。在步骤 1.3 中， 使用 4- 氯 -2- 异 丙基 - 吡啶 ( 步骤 8.1)。 将反应混合物在 150℃搅拌 3 小时， 用 EtOAc/H2O 稀释， 并用 EtOAc 萃取。干燥并浓缩有机相后， 将残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 25 ∶ 75)。 +
     标题化合物 ： ESI-MS ： 374.1[M+H] ； tR ＝ 1.99min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.10(DCM/ aq MeOH/NH3 ， 94 ∶ 5 ∶ 1)。
     步骤 8.1 ： 4- 氯 -2- 异丙基 - 吡啶
    
    按照步骤 2.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用异丙基氯化镁 (2M 在 THF + 中的溶液 ) ： ESI-MS ： 156.0[M+H] ； TLC ： Rf ＝ 0.32(DCM)。
     实施例 9 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[5-(2- 环丁基 - 吡啶 -4- 基 )- 噻 唑 -2- 基 ]- 酰胺 }按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 16 小时， 用 DCM/H2O 稀释， 并用 DCM 萃取。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 100 ℃下搅拌 2 小时， 且粗产物不再纯化。在步骤 1.3 中， 使用 N- 噻 唑 -2- 基 - 乙酰胺。将反应混合物在 120 ℃下搅拌 3 小时， 通过加入 EtOAc 和 H2O 稀释进 行猝灭， 并用 EtOAc 萃取。干燥并浓缩有机相后， 将残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 2 ∶ 3)。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 80℃下搅拌 1 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在 步骤 1.7 中， 将 4- 甲氧基 -3- 丁烯 -2- 酮 (50mmol) 在 THF(100mL) 中的溶液加入冷却的 (-78℃ )LiHMDS(1M 的 THF 溶液， 100mL) 在 THF(200mL) 的溶液中。30 分钟后， 加入环丁基 甲酰氯， 并将反应混合物历经 18 小时达到室温。
    标 题 化 合 物： ESI-MS ： 372.1[M+H] + ； TLC ： Rf ＝ 0.13(DCM/MeOH/NH3aq， 91.5 ∶ 7.5 ∶ 1)。
     实施例 10 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(1- 甲基 - 环丙基 )- 吡 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 14 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 85℃下搅拌 1 小 时。在步骤 1.3 中， 使用 N- 噻唑 -2- 基 - 乙酰胺， 并将反应混合物在 120℃下搅拌 4 小时。 在步骤 1.5 中， 不再进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.7 中， 使用 1- 甲基 - 环丙烷甲酰氯 ( 步骤 5.1)。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 372.1[M+H]+ ； TLC ： Rf ＝ 0.43(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。
     实 施 例 11 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-({5-[2-(1- 三 氟 甲 基 - 环 丙 基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 14 小时。在步骤 1.3 中， 使用 N- 噻唑 -2- 基 - 乙酰胺。 将反应混合物在 120℃下搅拌 2 小时。在步骤 1.4 中， 使用 1， 2- 二氯乙烷 ( 每 mmol 的吡 啶 -4- 酮用 2.55mL) 作为溶剂。将反应混合物在 83℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 65℃下搅拌 1 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步 骤 1.7 中， 使用 1- 三氟甲基 - 环丙烷甲酰氯 ( 步骤 11.1)。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 426.0[M+H]+ ； tR ＝ 2.35min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.25(DCM/ MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 11.1 ： 1- 三氟甲基 - 环丙烷甲酰氯
    
    按照步骤 5.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 1- 三氟甲基 - 环丙烷甲酸。
    
    实施例 12 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲 基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 5 小时。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 14 小 时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 85℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步 骤 1.3 中， 使用 N- 噻唑 -2- 基 - 乙酰胺。将反应混合物在 120℃下搅拌 2.5 小时。在步骤 1.4 中， 将反应混合物在 83℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.5 中， 将 反应混合物在 65℃下搅拌 1 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 粗产物不再纯 化。在步骤 1.7 中， 使用 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酰氯 ( 步骤 12.1)。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 428.0[M+H]+ ； tR ＝ 2.75min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.21(DCM/ MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 12.1 ： 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酰氯
    
    按照步骤 5.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲 基 - 丙酸。
     实 施 例 13 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-({5-[2-(1- 三 氟 甲 基 - 环 丁 基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 18 小时， 通过用 DCM/H2O 稀释猝灭， 并用 DCM 萃取。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 1 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 100℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。在步骤 1.3 中， 使用 N- 噻唑 -2- 基 - 乙酰胺。将反应混合 物在 120℃下搅拌 5 小时， 通过用 EtOAc/H2O 稀释猝灭， 并用 EtOAc 萃取。在步骤 1.4 中， 使 用 1， 2- 二氯乙烷 ( 每 mmol 的吡啶 -4- 酮用 2.26mL) 作为溶剂。将反应混合物在回流下搅 拌 1 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在室温下搅拌 1 小时， 不 进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 将反应混合物在室温下搅拌 18 小时。在步骤 1.7 中， 将 4- 甲氧基 -3- 丁烯 -2- 酮在 THF 中的溶液加入冷却的 (-78℃ )LiHMDS 在 THF 的溶液 中。30 分钟后， 加入 1- 三氟甲基 - 环丁烷甲酰氯 ( 步骤 13.1) 在 THF 中的溶液。将反应混 合物历经 18 小时达到室温， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 440.0[M+H]+ ； tR ＝ 2.68min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.08(DCM/ aq MeOH/NH3 ， 91.5 ∶ 7.5 ∶ 1)。
     步骤 13.1 ： 1- 三氟甲基 - 环丁烷甲酰氯
    
    按照步骤 5.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 1- 三氟甲基 - 环丁烷甲 酸， 并将反应混合物在回流下搅拌 2 小时。
     实施例 14 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2-(1- 三氟甲基 - 环 丙基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 14 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 85℃下搅拌 1 小 时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.3 中， 将反应混合物在 120℃下搅拌 2 小时。在步 骤 1.4 中， 使用 1， 2- 二氯乙烷 ( 每 mmol 的吡啶 -4- 酮用 2.55mL) 作为溶剂。将反应混合 物在 83℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 65℃ 下搅拌 1 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.7 中， 使用 1- 三氟甲基 - 环丙烷甲酰氯 ( 步骤 11.1)。
     标 题 化 合 物： ESI-MS ： 440.0[M+H]+ ； tR ＝ 2.65min( 系 统 1) ； TLC ： Rf ＝ 1 0.36(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。 H NMR(400MHz， DMSO-d6)δ(ppm) ： 1.41(s， 4H)1.70-1.90(m， 3H)2.00-2.10(m ， 1H)2.40(s ， 3H)3.36-3.52(m ， 1H)3.52-3.65(m ， 1H)4.10-4.40(m ， 1H)6.95(b r.s.， 1H)7.37(d， 2H)7.47(s， 1H)8.52(d， 1H)10.94(b r.s.， 1H)
     实施例 15 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 14 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 85℃下搅拌 1 小 时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。 在步骤 1.3 中， 将反应混合物在 120℃下搅拌 2.5 小时。 在步 骤 1.4 中， 将反应混合物在 83℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 65℃下搅拌 1 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 粗产物不再 纯化。在步骤 1.7 中， 使用 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酰氯 ( 步骤 12.1)。
     标 题 化 合 物： ESI-MS ： 442.0[M+H]+ ； tR ＝ 3.02min( 系 统 1) ； TLC ： Rf ＝ 1 0.35(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。 H NMR(400MHz， DMSO-d6)δ(ppm) ： 1.60(s， 6H)1.70-1.95(m， 3H)1.99-2.16(m ， 1H)2.40(s ， 3H)3.38-3.51(m ， 1H)3.51-3.69(m ， 1H)4.10-4.40(m ， 1H)6.95(b r.s.， 1H)7.39(d， 2H)7.53(s， 1H)8.58(d， 1H)10.93(br.s.， 1H)
     在一项可选择的方法中， 按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进 行以下修改 ： 使用 N， N- 二甲基乙酰胺代替 DMF， 并将该混合物在 65℃下搅拌 2 小时。在步 骤 1.1 中， 使用氯甲酸苯基酯 ( 缓慢加入 ) 代替 1， 1’ - 羰基二咪唑， 并将该反应在 THF 中在 N， N- 二乙基 - 异丙基胺的存在下于室温下进行 (1.5h)。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在搅 拌下加热 5 小时 ( 回流 )， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。 在步骤 1.3 中， 将反应混合物在 100℃ 下搅拌 2 小时。在步骤 1.4 中， 该反应在甲苯中进行， 使用 1.1 当量的 POBr3 和 1.1 当量的 三丙基胺， 并将该混合物在 80℃下搅拌 2 小时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 65℃下搅拌 1 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 使用甲苯代 替苯， 且粗产物不再纯化。在步骤 1.7 中， 使用 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酰氯 ( 步骤 12.1)。
     实施例 16 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2-(1- 三氟甲基 - 环 丁基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 72 小时， 通过用 DCM/H2O 稀释猝灭， 并用 DCM 萃取。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 1 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 100℃下搅拌 2 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。在步骤 1.3 中， 将反应混合物在 120℃下搅拌 6 小时， 通过 加入 EtOAc 和 H2O 稀释进行猝灭， 经硅藻土垫过滤并用 EtOAc 萃取。在步骤 1.4 中， 使用 1， 2- 二氯乙烷 ( 每 mmol 的吡啶 -4- 酮用 2.26mL) 作为溶剂。将反应混合物在回流下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在室温下搅拌 1 小时， 不进行 在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 将反应混合物在室温下搅拌 18 小时。在步骤 1.7 中， 将 4- 甲氧基 -3- 丁烯 -2- 酮在 THF 中的溶液加入冷却的 (-78℃ )LiHMDS 在 THF 的溶液中。30 分钟后， 加入 1- 三氟甲基 - 环丁烷甲酰氯 ( 步骤 13.1) 的 THF 溶液。将反应混合物历经 18 小时达到室温， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 454.1[M+H]+ ； tR ＝ 2.90min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.22(DCM/ aq MeOH/NH3 ， 91.5 ∶ 7.5 ∶ 1)。
     实施例 17 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(1- 甲基 - 环丁基 )- 吡 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 24 小时， 通过加入 EtOAc 和 H2O 稀释进行猝灭， 并用 EtOAc 萃取。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 100℃下搅拌 2 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。在步 骤 1.3 中， 使用 N- 噻唑 -2- 基 - 乙酰胺。将反应混合物在 100℃下搅拌 3 小时， 用 EtOAc/ H2O 稀释， 并用 EtOAc 萃取。 干燥并浓缩有机相后， 将残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 25 ∶ 75)。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 80℃下搅拌 2 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。 在步骤 1.7 中， 将 4- 甲氧基 -3- 丁烯 -2- 酮在 THF 中的溶液加入冷却的 (-78℃ )LiHMDS 在 THF 的溶液中。30 分钟后， 加入 1- 甲基 - 环丁烷氯化物 ( 步骤 6.1) 在 THF 中的溶液， 并将 反应混合物历经 18 小时达到室温。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 386.1[M+H]+ ； tR ＝ 2.32min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.05(DCM/ aq MeOH/NH3 ， 94 ∶ 5 ∶ 1)。
     实施例 18 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(1- 氰基 - 环丙基 )- 吡 啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 16 小时， 通过加入 EtOAc 和 H2O 稀释进行猝灭， 并用 EtOAc 萃取。在步骤 1.1 中， 使用 1-[4-(2- 氨基 -4- 甲基 - 噻唑 -5- 基 )- 吡啶 -2- 基 ]- 环丙烷 甲腈 ( 步骤 18.1)， 并将反应混合物在回流下搅拌 2 小时。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 397.0[M+H]+ ； tR ＝ 2.90min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.08(DCM/ 1 aq 94 ∶ 5 ∶ 1)。 H NMR(400MHz， DMSO-d6)δ(ppm) ： 1.69-1.93(m， 7H)2.00-2.20(m， MeOH/NH3 ， 1H)2.42(s ， 3H)3.38-3.50(m ， 1H)3.50-3.65(m ， 1H)4.10-4.40(m ， 1H)6.94(b r.s. ， 1H)7.34(dd， 1H)7.37(b r.s.， 1H)7.47(s， 1H)8.47(d， 1H)
     步骤 18.1 ： 1-[4-(2- 氨基 -4- 甲基 - 噻唑 -5- 基 )- 吡啶 -2- 基 ]- 环丙烷甲腈
    
    将 {5-[2-(1- 氰 基 - 环 丙 基 )- 吡 啶 -4- 基 ]-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 }- 氨 基 甲 酸叔丁基酯 ( 步骤 18.2)(295mg)、 DCM(4mL) 和 TFA(1mL) 的混合物在室温下搅拌 2 小时， 并随后浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH/NH3aq， 94 ∶ 5 ∶ 1) 得到 182mg 标题 + 化合物 ： ESI-MS ： 257.1[M+H] ； tR ＝ 2.54min( 系 统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.30((DCM/MeOH/NH3aq， 94 ∶ 5 ∶ 1)。
    
    
    步骤 18.2 ： {5-[2-(1- 氰基 - 环丙基 )- 吡啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 氨 基甲酸叔丁基酯按 照 步 骤 1.3 中 所 述 类 似 的 方 法 制 备 标 题 化 合 物， 但 使 用 1-(4- 溴 - 吡 啶 -2- 基 )- 环丙烷甲腈 ( 步骤 18.3) 和 (4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 )- 氨基甲酸叔丁基酯 ( 步 骤 18.4)。将反应混合物在 100℃下搅拌 2 小时， 通过加入 EtOAc 和 H2O 稀释进行猝灭， 并用
     EtOAc 萃取。粗产物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 1 ∶ 1)， 得到 122mg 标题化合物， 为白 + 色固体 ： ESI-MS ： 357.1[M+H] ； tR ＝ 4.86min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.29(Hex/EtOAc， 1 ∶ 1)。
     步骤 18.3 ： 1-(4- 溴 - 吡啶 -2- 基 )- 环丙烷甲腈
    将 LiHMDS(1M 甲 苯 溶 液， 17.6mL， 17.6mmol， 3.1 当 量 ) 逐 滴 加 入 冷 却 的 (-5℃ )4- 溴 -2- 氟 - 吡啶 [Marsais， F. 等人， Journal of Organic Chemistry， (1992)， 57， 565-573](1g， 5.7mmol)、 环丙烷甲腈 (1.25mL， 17mmol， 3 当量 )、 4 分子筛和甲苯 (20mL)的混合物中。 将反应混合物加温至室温， 搅拌 16 小时， 倒入 H2O 中并过滤。 将滤液用 EtOAc/ H2O 稀释并用 EtOAc 萃取。有机相用 H2O 和盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将残余 物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 9 ∶ 1)， 得到 620mg 标题化合物， 为白色固体 ： ESI-MS ： + 223.1/225.1[M+H] ； tR ＝ 4.22min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.25(Hex/EtOAc， 9 ∶ 1)。
     步骤 18.4 ： (4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 )- 氨基甲酸叔丁基酯
    将二碳酸二叔丁基酯 (21g， 96.5mmol， 1.1 当量 ) 在 t-BuOH(50mL) 中的溶液加入 4- 甲基 -2- 氨基噻唑 (10g， 87.7mmol) 和 DMAP(1.1g， 8.8mmol， 0.1 当量 ) 在 t-BuOH(50mL) 的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌 72 小时并浓缩。将残余物用 EtOAc/H2O 稀释并用 EtOAc 萃取。有机相用 H2O 和盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色 谱纯化 (DCM/MeOH， 98 ∶ 2)， 得到 15.2g 标题化合物， 为白色固体 ： ESI-MS ： 215.1[M+H]+ ； tR ＝ 3.43min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.30(DCM/MeOH， 98 ∶ 2)。
     实施例 19 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(1- 氰基 - 环丁基 )- 吡 啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 6 小时。在步骤 1.1 中， 使用 1-[4-(2- 氨基 -4- 甲基 - 噻 唑 -5- 基 )- 吡啶 -2- 基 ]- 环丁烷甲腈 ( 步骤 19.1)， 并将反应混合物在回流下搅拌 3 小 时。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 411.1[M+H]+ ； TLC ： Rf ＝ 0.36(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。 步骤 19.1 ： 1-[4-(2- 氨基 -4- 甲基 - 噻唑 -5- 基 )- 吡啶 -2- 基 ]- 环丁烷甲腈将 {5-[2-(1- 氰 基 - 环 丁 基 )- 吡 啶 -4- 基 ]-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 }- 氨 基 甲 酸叔丁基酯 ( 步骤 19.2)(300mg)、 DCM(5mL) 和 TFA(1mL) 的混合物在室温下搅拌 4 小时， 通过加入饱和 NaHCO3 溶液猝灭 (50mL)， 并用 DCM 萃取 (3x75mL)。有机相用饱和 NaHCO3 溶 液 洗 涤 (2x50mL)， 干 燥 (Na2SO4)， 过 滤 并 浓 缩。 将 残 余 物 经 硅 胶 柱 色 谱 纯 化 (DCM/ MeOH， 1 ∶ 0 → 96 ∶ 4) 得到 181mg 标题化合物， 为黄色固体 ： ESI-MS ： 271.1[M+H]+ ； tR ＝ 2.48min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.45(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 19.2 ： {5-[2-(1- 氰基 - 环丁基 )- 吡啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 氨 基甲酸叔丁基酯
    
    按 照 步 骤 1.3 中 所 述 类 似 的 方 法 制 备 标 题 化 合 物， 但 使 用 1-(4- 溴 - 吡 啶 -2- 基 )- 环丁烷甲腈 ( 步骤 19.3) 和 (4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 )- 氨基甲酸叔丁基酯 ( 步 骤 18.4)。将反应混合物在 100℃下搅拌 3 小时。标题化合物 ： ESI-MS ： 371.1[M+H]+ ； tR ＝ 4.86min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.66(Hex/EtOAc， 1 ∶ 1)。
     步骤 19.3 ： 1-(4- 溴 - 吡啶 -2- 基 )- 环丁烷甲腈
    
    将 LiHMDS(1M 甲 苯 溶 液， 17.7mL， 17.7mmol， 3.1 当 量 ) 逐 滴 加 入 冷 却 的 (-5℃ )4- 溴 -2- 氟 - 吡啶 [Marsais， F. 等人， Journal of Organic Chemistry， (1992)， 57， 565-573](1g， 5.7mmol) 和环丁烷甲腈 (1.39g， 17.1mmol， 3 当量 ) 在甲苯中的溶液 (20mL)。 将反应混合物加温至室温， 搅拌 5 小时， 通过加入饱和 NaHCO3 溶液猝灭 (50mL)， 并经硅藻 土垫过滤。将滤液用 EtOAc 萃取 (3x75mL)。有机相用饱和 NaHCO3 溶液洗涤 (2x50mL)， 干 燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 1 ∶ 0 → 95 ∶ 5) 得 + 到 933mg 标题化合物， 为黄色油状物 ： ESI-MS ： 237.0/239.0[M+H] ； tR ＝ 4.27min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.30(Hex/EtOAc， 9 ∶ 1)。
     实施例 20 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(1- 氨基甲酰基 - 环丁 基 )- 吡啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 3 小时。在步骤 1.1 中， 使用 1-[4-(2- 氨基 -4- 甲基 - 噻 唑 -5- 基 )- 吡啶 -2- 基 ]- 环丁烷甲酰胺 ( 步骤 20.1)， 并将反应混合物在回流下搅拌 12 小时。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 429.1[M+H]+ ； tR ＝ 2.90min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.11(DCM/ MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 20.1 ： 1-[4-(2- 氨基 -4- 甲基 - 噻唑 -5- 基 )- 吡啶 -2- 基 ]- 环丁烷甲酰胺
    
    将 {5-[2-(1- 氰基 - 环丁基 )- 吡啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 氨基甲酸 叔丁基酯 ( 步骤 19.2)(640mg， 1.73mmol) 和浓硫酸的混合物在 0℃下搅拌 40 分钟， 加温至 室温， 搅拌 1 小时， 通过加入饱和 NaHCO3 溶液猝灭 (50mL)， 并用 DCM 萃取 (3x75mL)。有机相 用饱和 NaHCO3 溶液洗涤 (2x50mL)， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。残余物经硅胶柱色谱纯化 aq (DCM/MeOH/NH3 ， 99 ∶ 0 ∶ 1 → 93 ∶ 6 ∶ 1) 得到 35mg 标题化合物， 为黄色固体 ： ESI-MS ： + 289.1[M+H] ； TLC ： Rf ＝ 0.32(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。
     实施例 21 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(2- 二甲基氨基 -1， 1- 二 甲基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在步骤 1.1 中， 使用 5-[2-(2- 二甲基氨基 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 胺 ( 步骤 21.1)， 并将反应混合物在回流下搅拌 14 小时。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 431.1[M+H]+ ； TLC ： Rf ＝ 0.12(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 21.1 ： 5-[2-(2- 二甲基氨基 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻 唑 -2- 基胺
    
     按照步骤 19.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 {5-[2-(2- 二甲基氨 基 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 氨基甲酸叔丁基酯 ( 步 骤 21.2)， 并将反应混合物在室温下搅拌 2 小时。标题化合物 ： ESI-MS ： 291.1[M+H]+ ； tR ＝ 2.48min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.11(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 21.2 ： {5-[2-(2- 二甲基氨基 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]-4- 甲 基 - 噻唑 -2- 基 }- 氨基甲酸叔丁基酯
    
    将甲醛 (36 ％的 H2O 溶液， 0.144mL， 1.87mmol， 2 当量 ) 加入 {5-[2-(2- 氨基 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 氨基甲酸叔丁基酯 ( 步骤 21.3) (0.34g， 0.94mmol) 和乙酰氧基硼氢化钠 (0.6g， 2.82mmol， 3 当量 ) 在 1， 2- 二氯乙烷 (10mL) 中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌 1 小时并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (DCM/ MeOH/NH3aq， 99 ∶ 0 ∶ 1 → 97 ∶ 2 ∶ 1) 得 到 0.222g 标 题 化 合 物， 为白色固体 ： ESI-MS ： + 391.2[M+H] ； tR ＝ 4.27min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.15(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。
     步 骤 21.3 ： {5-[2-(2- 氨 基 -1， 1- 二 甲 基 - 乙 基 )- 吡 啶 -4- 基 ]-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 }- 氨基甲酸叔丁基酯
    
    在氩气中将 LiAlH4(1M 的 THF 溶液， 3.06mL， 3.06mmol， 1.5 当量 ) 加入 {5-[2-( 氰 基 - 二 甲 基 - 甲 基 )- 吡 啶 -4- 基 ]-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 }- 氨 基 甲 酸 叔 丁 基 酯 ( 步 骤 21.4)(0.73g， 2.04mmol) 在 THF(10mL) 的 溶 液 中。 将 反 应 混 合 物 在 室 温 下 搅 拌 2 小 时， 通 过 加 入 H2O(20mL) 猝 灭 并 用 EtOAc 萃 取 (2x75mL)。 有 机 相 用 饱 和 NaHCO3 溶 液 洗 涤 (2x50mL)， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH/NH3aq， 99 ∶ 0 ∶ 1 → 94 ∶ 5 ∶ 1) 得到 318mg 标题化合物， 为褐色固体 ： ESI-MS ： 363.1[M+H]+ ； TLC ： Rf ＝ 0.11(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。
     步 骤 21.4 ： {5-[2-( 氰 基 - 二 甲 基 - 甲 基 )- 吡 啶 -4- 基 ]-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 }- 氨基甲酸叔丁基酯
    
    按 照 步 骤 1.3 中 所 述 类 似 的 方 法 制 备 标 题 化 合 物， 但 使 用 2-(4- 碘 - 吡 啶 -2- 基 )-2- 甲基 - 丙腈 ( 步骤 21.5) 和 (4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 )- 氨基甲酸叔丁基酯 ( 步骤 18.4)。将反应混合物在 100℃下搅拌 3 小时。标题化合物 ： ESI-MS ： 359.1[M+H]+ ； TLC ： Rf ＝ 0.47(Hex/EtOAc， 1 ∶ 1)。
     步骤 21.5 ： 2-(4- 碘 - 吡啶 -2- 基 )-2- 甲基 - 丙腈
    
    按照步骤 19.3 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 2- 氟 -4- 碘吡啶。 标题 + 化合物 ： ESI-MS ： 273.0[M+H] ； tR ＝ 4.22min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.36(Hex/EtOAc， 9 ∶ 1)。
    
    
    实 施 例 22 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 二 乙 基 氨 基 - 吡 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 18 小时， 通过用 DCM/H2O 稀释猝灭， 并用 DCM 萃取。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 1 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 100℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。在步骤 1.3 中， 使用二乙基 -(4- 碘 - 吡啶 -2- 基 )- 胺 ( 步 骤 22.1)。将反应混合物在 120℃下搅拌 16 小时， 通过加入 EtOAc 和 H2O 稀释进行猝灭， 经 硅藻土垫过滤， 并用 EtOAc 萃取。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 403.2[M+H]+ ； tR ＝ 2.38min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.10(DCM/ MeOH/NH3aq， 91.5 ∶ 7.5 ∶ 1)。
     步骤 22.1 ： 二乙基 -(4- 碘 - 吡啶 -2- 基 )- 胺
    
    将 2- 氟 -4- 碘 吡 啶 (2g， 8.97mmol)、二 乙 胺 (2.77ml， 26.9mmol， 3当量)和K2CO3(2.48g， 17.94mmol， 2 当量 ) 在 DMF(20mL) 中的混合物在 100℃下搅拌 18 小时， 冷却至 室温， 用 EtOAc/H2O 稀释并用 EtOAc 萃取。有机相用 H2O 和盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并 浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/Et2O， 98 ∶ 2) 得到 2.3g 标题化合物， 为黄色油状 + 物： ESI-MS ： 277.1[M+H] ； TLC ： Rf ＝ 0.52(Hex/Et2O， 98 ∶ 2)。
     实 施 例 23 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 二 乙 基 氨 基 - 吡 啶 -4- 基 )- 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 18 小时， 通过用 DCM/H2O 稀释猝灭， 并用 DCM 萃取。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 1 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 100℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。在步骤 1.3 中， 使用二乙基 -(4- 碘 - 吡啶 -2- 基 )- 胺 ( 步 骤 22.1) 和 N- 噻唑 -2- 基 - 乙酰胺。将反应混合物在 120℃下搅拌 5 小时， 通过加入 EtOAc 经硅藻土垫过滤， 并用 EtOAc 萃取。 和 H2O 稀释进行猝灭，
     标题化合物 ： ESI-MS ： 389.2[M+H]+ ； tR ＝ 2.28min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.34(DCM/ aq MeOH/NH3 ， 91.5 ∶ 7.5 ∶ 1)。
     实 施 例 24 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(3- 叔 丁 基 -3H- 苯 并 咪 唑 -5- 基 )- 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 5 小时。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 14 小 时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 85℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.3 中， 使用 6- 溴 -1- 叔丁基 -1H- 苯并咪唑 ( 步骤 24.1) 和 N- 噻唑 -2- 基 - 乙酰胺。将 反应混合物在 120℃下搅拌 7 小时。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 413.2[M+H]+ ； tR ＝ 2.29min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.45(DCM/ MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 241.6- 溴 -1- 叔丁基 -1H- 苯并咪唑
    
    将 4- 溴 -N ＊ 2 ＊ - 叔丁基 - 苯 -1， 2- 二胺 ( 步骤 24.2)(2.14g， 8.80mmol) 和原甲 酸三乙酯 (14.7mL， 88mmol) 的混合物在 148℃下搅拌 1 小时， 冷却并浓缩。将残余物经硅 胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH， 1 ∶ 0 → 99 ∶ 1) 得到 1.74g 标题化合物， 为白色固体 ： ESI-MS ： + 253.0/255.0[M+H] ； tR ＝ 2.88min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.54(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。 ＊ ＊
     步骤 24.2 ： 4- 溴 -N 2 - 叔丁基 - 苯 -1， 2- 二胺
    
    室温下将 (5- 溴 -2- 硝基 - 苯基 )- 叔丁基 - 胺 ( 步骤 24.3)(6g， 21.97mmol) 和 兰尼镍 (2g) 在 MeOH/THF(1 ∶ 1v/v， 600mL) 中的混悬液在氢气中搅拌 9 小时。将反应混合 物经硅藻土垫过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 97 ∶ 3 → 3 ∶ 1) 得 + tR ＝ 2.75min( 系统 1) ； 到 4.4g 标题化合物， 为黑色油状物 ： ESI-MS ： 243.0/245.0[M+H] ； TLC ： Rf ＝ 0.89(Hex/EtOAc， 1 ∶ 1)。
     步骤 24.3 ： (5- 溴 -2- 硝基 - 苯基 )- 叔丁基 - 胺
    
    将 4- 溴 -2- 氟 - 硝基苯 (4g， 18.2mmol) 和叔丁基胺 (4.78mL， 45.5mmol， 2.5 当 量 ) 在 EtOH(80mL) 中的溶液在 85 ℃下搅拌 15 小时， 冷却并浓缩。将残余物经硅胶柱 色 谱 纯 化 (Hex/EtOAc， 1 ∶ 0 → 99 ∶ 1) 得 到 4.8g 标 题 化 合 物， 为橙色固体 ： ESI-MS ： + 273.0/275.0[M+H] ； tR ＝ 5.68min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.49(Hex/EtOAc， 9 ∶ 1)。
     实施例 25 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[5-(3- 叔丁基 -2- 甲基 -3H- 苯 并咪唑 -5- 基 )- 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 14 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 85℃下搅拌 1 小
     时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.3 中， 使用 6- 溴 -1- 叔丁基 -2- 甲基 -1H- 苯并咪 唑 ( 步骤 25.1) 和 N- 噻唑 -2- 基 - 乙酰胺。将反应混合物在 120℃下搅拌 5 小时。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 427.2[M+H]+ ； tR ＝ 2.37min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.38(DCM/ MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 25.1 ： 6- 溴 -1- 叔丁基 -2- 甲基 -1H- 苯并咪唑
    将 6- 溴 -1- 叔丁基 -2- 乙氧基甲基 -2- 甲基 -2， 3- 二氢 -1H- 苯并咪唑 ( 步骤 25.2)(2.04g， 6.51mmol) 和 TFA(10ml) 的混合物在室温下搅拌过夜， 通过加入饱和 NaHCO3 溶液猝灭 (100mL)， 并用 EtOAc 萃取 (2x150mL)。有机相用饱和 NaHCO3 溶液洗涤 (2x50mL)， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH， 1 ∶ 0 → 98 ∶ 2) 得到 + 1.05g 标题化合物， 为白色固体 ： ESI-MS ： 267.0/269.0[M+H] ； tR ＝ 2.99min( 系统 1) ； TLC ： 9 ∶ 1)。 Rf ＝ 0.58(DCM/MeOH，
     步骤 25.2 ： 6- 溴 -1- 叔丁基 -2- 乙氧基甲基 -2- 甲基 -2， 3- 二氢 -1H- 苯并咪唑
    
    将 4- 溴 -N ＊ 2 ＊ - 叔丁基 - 苯 -1， 2- 二胺 ( 步骤 24.2)(2.14g， 8.80mmol) 和原乙 酸三乙酯 (16.2mL， 88mmol， 10 当量 ) 的混合物在 142℃下搅拌 1 小时， 冷却并浓缩。将残 余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 1 ∶ 0 → 95 ∶ 5) 得到 2.04g 标题化合物， 为紫色油状 + 物： ESI-MS ： 313.0/315.0[M+H] ； TLC ： Rf ＝ 0.67(Hex/EtOAc， 9 ∶ 1)。
     实 施 例 26 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(3- 乙 基 -3H- 苯 并 咪 唑 -5- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 15 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 85℃下搅拌 3 小 时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.3 中， 使用 6- 溴 -1- 乙基 -1H- 苯并咪唑 ( 步骤 26.1) 和 N- 噻唑 -2- 基 - 乙酰胺。将反应混合物在 120℃下搅拌 14 小时。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 399.1[M+H]+ ； tR ＝ 1.73min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.25(DCM/ MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 26.1 ： 6- 溴 -1- 乙基 -1H- 苯并咪唑
    将 4- 溴 -N ＊ 2 ＊ - 乙基 - 苯 -1， 2- 二胺 ( 步骤 26.2)(2g， 9.3mmol) 和原甲酸三乙 酯 (15.5mL， 93mmol， 10 当量 ) 的混合物在 148℃下搅拌 1 小时， 冷却并浓缩。将残余物经硅 胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH， 1 ∶ 0 → 98 ∶ 2) 得到 2.05g 标题化合物， 为白色固体 ： ESI-MS ： + 225.1/227.1[M+H] ； tR ＝ 2.31min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.58(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。 ＊ ＊
     步骤 26.2 ： 4- 溴 -N 2 - 乙基 - 苯 -1， 2- 二胺
    
    在室温下将 (5- 溴 -2- 硝基 - 苯基 )- 乙基 - 胺 ( 步骤 26.3)(6g， 24.48mmol) 和兰 尼镍 (2g) 在 MeOH/THF(1 ∶ 1v/v， 600mL) 中的混悬液在氢气中搅拌 9 小时。将反应混合物 经硅藻土垫过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 95 ∶ 5 → 85 ∶ 15) 得 到 4.51g 标题化合物， 为黑色油状物 ： ESI-MS ： 213.1/215.1[M-H] ； tR ＝ 2.53min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.57(Hex/EtOAc， 1 ∶ 1)。
     步骤 26.3 ： (5- 溴 -2- 硝基 - 苯基 )- 乙基 - 胺
    
    将 4- 溴 -2- 氟 - 硝 基 苯 (6g， 27.3mmol)、 甲 基 胺 (2M 的 MeOH 溶 液， 34.1mL， 68.2mmol， 2.5 当量 ) 和 EtOH(80mL) 的混合物在 85℃下搅拌 15 小时， 冷却并浓缩。将残余 物经研磨纯化， 得到 6g 标题化合物， 为黄色固体 ： tR ＝ 5.13min( 系统 1)。
    
    
    实 施 例 27 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-[(5-{2-[1-(4- 甲 氧 基 - 苯 基 )-1- 甲基 - 乙基 ]- 吡啶 -4- 基 }-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 24 小时， 用 EtOAc/H2O 稀释猝灭。在步骤 1.2 中， 将反应混 合物在 100℃下搅拌 2 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。 在步骤 1.3 中， 将反应混合物在 100℃ 下搅拌 3 小时， 通过用 EtOAc/H2O 稀释猝灭， 并用 EtOAc 萃取。在步骤 1.4 中， 使用 1， 2- 二 氯乙烷 ( 每 mmol 的吡啶 -4- 酮用 4.3mL) 作为溶剂。将反应混合物在回流下搅拌 1 小时， 倒入饱和 NaHCO3 溶液中， 并用 DCM 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 80℃下搅拌 23 小 时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 将反应混合物在室温下搅拌 21 小时。在步骤 1.7 中， 将 4- 甲氧基 -3- 丁烯 -2- 酮在 THF 中的溶液加入冷却的 (-78℃ )LiHMDS 在 THF 的 溶液中。30 分钟后， 加入 2-(4- 甲氧基 - 苯基 )-2- 甲基 - 丙酰氯 ( 步骤 27.1) 在 THF 中的 溶液， 并将反应混合物历经 16 小时达到室温。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 480.0[M+H]+ ； tR ＝ 3.05min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.13(DCM/ aq MeOH/NH3 ， 94 ∶ 5 ∶ 1)。
     步骤 27.1 ： 2-(4- 甲氧基 - 苯基 )-2- 甲基 - 丙酰氯
    按照步骤 5.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 2-(4- 甲氧基 - 苯 基 )-2- 甲基 - 丙酸， 并将反应混合物在回流下搅拌 3 小时。
     实 施 例 28 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-[(5-{2-[1-(4- 甲 氧 基 - 苯 基 )-1- 甲基 - 乙基 ]- 吡啶 -4- 基 }- 噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 16 小时， 用 EtOAc/H2O 稀释猝灭。 在步骤 1.2 中， 将反应混合 物在 100℃下搅拌 2 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。在步骤 1.3 中， 使用 N- 噻唑 -2- 基 - 乙 酰胺。将反应混合物在 100℃下搅拌 5 小时， 通过用 EtOAc/H2O 稀释猝灭， 并用 EtOAc 萃取。 在步骤 1.4 中， 使用 1， 2- 二氯乙烷 ( 每 mmol 的吡啶 -4- 酮用 4.3mL) 作为溶剂。将反应混 合物在回流下搅拌 1 小时， 倒入饱和 NaHCO3 溶液中， 并用 DCM 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应 混合物在 80℃下搅拌 23 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 将反应混合物在室 温下搅拌 21 小时。在步骤 1.7 中， 将 4- 甲氧基 -3- 丁烯 -2- 酮在 THF 中的溶液加入冷却 的 (-78℃ )LiHMDS 在 THF 中的溶液。30 分钟后， 加入 2-(4- 甲氧基 - 苯基 )-2- 甲基 - 丙 酰氯 ( 步骤 27.1) 在 THF 中的溶液， 并将反应混合物历经 16 小时达到室温。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 466.1[M+H]+ ； tR ＝ 2.91min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.23(DCM/ aq MeOH/NH3 ， 94 ∶ 5 ∶ 1)。
     实施例 29 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(5-{2-[1-(4- 甲氧基 - 苯基 )- 环 丙基 ]- 吡啶 -4- 基 }-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 21 小时， 用 EtOAc/H2O 稀释猝灭。在步骤 1.2 中， 将反应混 合物在 100℃下搅拌 3 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。 在步骤 1.3 中， 将反应混合物在 100℃ 下搅拌 6 小时， 通过用 EtOAc/H2O 稀释猝灭， 并用 EtOAc 萃取。在步骤 1.4 中， 使用 1， 2- 二 氯乙烷 ( 每 mmol 的吡啶 -4- 酮用 4.3mL) 作为溶剂。将反应混合物在回流下搅拌 1 小时， 倒入饱和 NaHCO3 溶液中， 并用 DCM 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 80℃下搅拌 18 小 时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 将反应混合物在室温下搅拌 18 小时。在步骤 1.7 中， 将 4- 甲氧基 -3- 丁烯 -2- 酮在 THF 中的溶液加入冷却的 (-78℃ )LiHMDS 在 THF 中 的溶液。30 分钟后， 加入 1-(4- 甲氧基 - 苯基 )- 环丙烷甲酰氯 ( 步骤 29.1) 在 THF 中的溶
    液， 并将反应混合物历经 16 小时达到室温。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 478.1[M+H]+ ； tR ＝ 2.65min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.09(DCM/ aq MeOH/NH3 ， 94 ∶ 5 ∶ 1)。
     步骤 29.1 ： 1-(4- 甲氧基 - 苯基 )- 环丙烷甲酰氯
    按照步骤 5.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 1-(4- 甲氧基 - 苯 基 )- 环丙基甲酸， 并将反应混合物在回流下搅拌 3 小时。
     实施例 30 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(5-{2-[1-(4- 甲氧基 - 苯基 )- 环 丙基 ]- 吡啶 -4- 基 }- 噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 16 小时， 用 EtOAc/H2O 稀释猝灭。 在步骤 1.2 中， 将反应混合 物在 100℃下搅拌 3 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。在步骤 1.3 中， 使用 N- 噻唑 -2- 基 - 乙 酰胺。 将反应混合物在 100℃下搅拌 28 小时， 通过用 EtOAc/H2O 稀释猝灭， 并用 EtOAc 萃取。
     在步骤 1.4 中， 使用 1， 2- 二氯乙烷 ( 每 mmol 的吡啶 -4- 酮用 4.3mL) 作为溶剂。将反应混 合物在回流下搅拌 1 小时， 倒入饱和 NaHCO3 溶液中， 并用 DCM 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应 混合物在 80℃下搅拌 18 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 将反应混合物在室 温下搅拌 18 小时。在步骤 1.7 中， 将 4- 甲氧基 -3- 丁烯 -2- 酮在 THF 中的溶液加入冷却 的 (-78℃ )LiHMDS 在 THF 中的溶液。30 分钟后， 加入 1-(4- 甲氧基 - 苯基 )- 环丙烷甲酰 氯 ( 步骤 29.1) 在 THF 中的溶液， 并将反应混合物历经 16 小时达到室温。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 464.1[M+H]+ ； tR ＝ 2.90min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.06(DCM/ aq MeOH/NH3 ， 94 ∶ 5 ∶ 1)。
     实 施 例 31 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2-{1-[4-(3- 二 甲 基 氨 基 - 丙氧基 )- 苯基 ]-1- 甲基 - 乙基 }- 吡啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 18 小时， 用 EtOAc/H2O 稀释猝灭。 在步骤 1.2 中， 将反应混合 物在 100℃下搅拌 7 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。 在步骤 1.3 中， 使用 (3-{4-[1-(4- 溴 - 吡 啶 -2- 基 )-1- 甲基 - 乙基 ]- 苯氧基 }- 丙基 )- 二甲基 - 胺 ( 步骤 31.1)。将反应混合物 在 120℃下搅拌 2 小时， 通过用 EtOAc/H2O 稀释猝灭， 并用 EtOAc 萃取。 +
     标题化合物 ： ESI-MS ： 551.1[M+H] ； tR ＝ 2.38min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.05(DCM/ aq MeOH/NH3 ， 94 ∶ 5 ∶ 1)。
     步骤 31.1 ： (3-{4-[1-(4- 溴 - 吡啶 -2- 基 )-1- 甲基 - 乙基 ]- 苯氧基 }- 丙基 )- 二 甲基 - 胺
    
    将氢氧化钠 ( 精细研磨的颗粒， 0.488g， 12.2mmol， 5 当量 ) 加入 4-[1-(4- 溴 - 吡 啶 -2- 基 )-1- 甲基 - 乙基 ]- 苯酚 ( 步骤 31.2)(0.714g， 2.44mmol) 在 DMF(5mL) 的溶液中。 将该混合物在室温下搅拌 20 分钟。加入 3- 二甲基氨基 -1- 丙基氯化物盐酸化物 (0.611g， 3.87mmol， 1.6 当量 )。将反应混合物加热至 90℃， 搅拌 10 小时， 冷却， 用 EtOAc/H2O 稀释， 并用 EtOAc 萃取。有机相用 H2O 和盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将残余物经硅胶 aq 柱色谱纯化 (DCM/MeOH/NH3 ， 94 ∶ 5 ∶ 1) 得到 0.398g 标题化合物， 为不纯的褐色油状物， + 其不经进一步纯化直接使用 ： ESI-MS ： 377.1/379.0[M+H] ； TLC ： Rf ＝ 0.22(DCM/MeOH/NH3aq， 94 ∶ 5 ∶ 1)。
     步骤 31.2 ： 4-[1-(4- 溴 - 吡啶 -2- 基 )-1- 甲基 - 乙基 ]- 苯酚
     在 氩 气 中 将 BBr3(1M 的 DCM 溶 液， 23mmol， 8当 量)逐 滴 加 入 冷 却 的 (0 ℃ )4- 溴 -2-[1-(4- 甲 氧 基 - 苯 基 )-1- 甲 基 - 乙 基 ]- 吡 啶 ( 步 骤 31.3)(0.878g， 2.87mmol) 在 DCM(42mL) 的溶液中。将反应混合物在 0℃下搅拌 1 小时， 加温至室温， 搅拌 18 小时， 冷却至 0℃， 并通过加入无水 MeOH 猝灭。浓缩该混合物， 用 6M 的 HCl 水溶液稀释， 搅拌 1 小时， 中和至 pH 7， 并用 DCM 萃取。干燥 (Na2SO4) 有机相， 过滤并浓缩。残余物不经 纯化直接使用。
     步骤 31.3 ： 4- 溴 -2-[1-(4- 甲氧基 - 苯基 )-1- 甲基 - 乙基 ]- 吡啶
    
    按照步骤 1.4 到 1.7 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。 在步骤 1.4 中， 使用 1， 2- 二氯乙烷 ( 每 mmol 的吡啶 -4- 酮用 4.3mL) 作为溶剂。将反应混合物在 回流下搅拌 1 小时， 倒入饱和 NaHCO3 水溶液， 并用 DCM 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应混合物 在 80℃下搅拌 23 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 将反应混合物在室温下搅 拌 21 小时。在步骤 1.7 中， 4- 甲氧基 -3- 丁烯 -2- 酮在 THF 中的溶液加入冷却的 (-78℃ ) LiHMDS 在 THF 中的溶液。30 分钟后， 加入 2-(4- 甲氧基 - 苯基 )-2- 甲基 - 丙酰氯 ( 步骤 27.1) 在 THF 中的溶液， 并将反应混合物历经 16 小时达到室温。
     标题化合物： ESI-MS ： 306.0/308.0[M+H]+ ； tR ＝ 3.94min( 系 统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.55(Hex/EtOAc， 7 ∶ 3)。
     实施例 32 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2-(1-d3- 甲基 - 环 丁基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 18 小时， 通过用 DCM/H2O 稀释猝灭， 并用 DCM 萃取。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 1 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 100℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。 在步骤 1.3 中， 将钯催化剂加入加热的剩余试剂的混合物中， 并将所得混合物在 120℃下搅拌 1 小时， 用 EtOAc/H2O 稀释并用 EtOAc 萃取。干燥并浓缩有 机相后， 将残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 1 ∶ 4)。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在
     80℃下搅拌 3 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.7 中， 4- 甲氧基 -3- 丁烯 -2- 酮在 THF 中的溶液加入冷却的 (-78℃ )LiHMDS 在 THF 中的溶液。 30 分钟后， 加入 1-d3- 甲基 - 环 丁烷氯化物 ( 步骤 32.1) 在 THF 中的溶液， 并将反应混合物历经 16 小时达到室温。
     标 题 化 合 物： ESI-MS ： 403.2[M+H] + ； TLC ： Rf ＝ 0.22(DCM/MeOH/NH3aq， 91.5 ∶ 7.5 ∶ 1)。
     步骤 32.1 ： 1-d3- 甲基 - 环丁烷甲酰氯
    按照步骤 5.1 中所述类似方法制备标题化合物， 但使用 1-d3- 甲基 - 环丁烷甲 酸，其 按 照 [Cowling， S.J. ； Goodby， J.W.， Chemical Communications， (2006)， (39)， 4107-4109] 中所述的方法制备， 但使用 d3- 甲基 - 碘化物。
     实施例 33 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(1-d3- 甲基 - 环丁基 )- 吡 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 18 小时， 通过用 DCM/H2O 稀释猝灭， 并用 DCM 萃取。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 1 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 100℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。在步骤 1.3 中， 使用 N- 噻唑 -2- 基 - 乙酰胺。将钯催化剂加 入加热的剩余试剂的混合物中。将所得混合物在 120℃下搅拌 7 小时， 用 EtOAc/H2O 稀释， 经硅藻土垫过滤并用 EtOAc 萃取。 干燥并浓缩有机相后， 将残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/ EtOAc， 1 ∶ 4)。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 80℃下搅拌 3 小时， 不进行在 MeOH 中的研 磨。在步骤 1.7 中， 4- 甲氧基 -3- 丁烯 -2- 酮在 THF 中的溶液加入冷却的 (-78℃ )LiHMDS 在 THF 中的溶液。30 分钟后， 加入 1-d3- 甲基 - 环丁烷氯化物 ( 步骤 32.1) 在 THF 中的溶 液， 并将反应混合物历经 16 小时达到室温。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 389.2[M+H]+ ； tR ＝ 2.30min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.11(DCM/ aq MeOH/NH3 ， 91.5 ∶ 7.5 ∶ 1)。
     实施例 34 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4-d3- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环 丙基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 8 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 85℃下搅拌 1 小 时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.3 中， 使用 2- 乙酰氨基 -4-d3- 甲基 - 噻唑 ( 步骤 34.1)。将反应混合物在 120℃下搅拌 2 小时。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 65-70℃下 搅拌 1 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.7 中， 使用 1- 甲基 - 环丙烷甲酰氯 ( 步骤 5.1)。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 389.2[M+H]+ ； tR ＝ 2.12min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.35(DCM/ MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 34.1 ： 2- 乙酰氨基 -4-d3- 甲基 - 噻唑
    
    将 1- 溴 - 丙 烷 -2- 酮 -d 5[Challacombe ， K. 等 人， Journal of the ChemicalSociety Perkin Trans.I， (1988)， 2213-2218](1.25g， 8.8mmol) 和 1- 乙 酰 基 -2- 硫脲 (1g， 8.8mmol) 在 EtOH(20mL) 中的混合物在 85℃下搅拌 2 小时， 冷却并浓缩。 将残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 85 ∶ 15 → 1 ∶ 1)， 得到 1.08g 标题化合物， 为橙 + 色固体 ： ESI-MS ： 160.0[M+H] ； TLC ： Rf ＝ 0.25(Hex/EtOAc， 1 ∶ 1)。
     实施例 35 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4-d3- 甲基 -5-[2-(2， 2， 2- 三 氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 8 小时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 85℃下搅拌 1 小 时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.3 中， 使用 2- 乙酰氨基 -4-d3- 甲基 - 噻唑 ( 步骤 34.1)。将反应混合物在 120℃下搅拌 2 小时。在步骤 1.4 中， 将反应混合物在 83℃下搅 拌 1 小时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 65℃下搅拌 1 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 粗产物不再纯化。在步骤 1.7 中， 使用 3， 3， 3- 三 氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酰氯 ( 步骤 12.1)。
     标 题 化 合 物： API-ES-MS ： 445.1[M+H]+ ； tR ＝ 3.00min( 系 统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.51(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。
     实 施 例 36 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-({4- 二 甲 基 氨 基 甲 基 -5-[2-(1-d3- 甲基 - 环丁基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 18 小时， 通过用 DCM/H2O 稀释猝灭， 并用 DCM 萃取。在步 骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 2 小时。在步骤 1.2 中， 使用 N-{4- 二甲基氨基甲 基 -5-[2-(1-d3- 甲基 - 环丁基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 乙酰胺 ( 步骤 36.1)。将 反应混合物在 100℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 446.1[M+H]+ ； TLC ： Rf ＝ 0.40(DCM/MeOH/NH3aq， 89 ∶ 10 ∶ 1)。
     步骤 36.1 ： N-{4- 二甲基氨基甲基 -5-[2-(1-d3- 甲基 - 环丁基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 }- 乙酰胺
    
    将 N-{4- 溴甲基 -5-[2-(1-d3- 甲基 - 环丁基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 乙 酰胺 ( 步骤 36.2)(150mg， 0.391mmol)、 二甲基胺盐酸化物 (38.3mg， 0.470mmol， 1.2 当量 ) 和碳酸铯 (293mg， 0.900mmol， 2.3 当量 ) 在 DMF(2mL) 中的混合物在室温下搅拌 2 小时， 用 EtOAc/H2O 稀释， 并用 EtOAc 萃取。有机相用 H2O 和盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。 将残余物在 Et2O 中研磨纯化， 得到 89mg 标题化合物， 为白色固体 ： ESI-MS ： 348.2[M+H]+。
     步 骤 36.2 ： N-{4- 溴 甲 基 -5-[2-(1-d3- 甲 基 - 环 丁 基 )- 吡 啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 }- 乙酰胺
    
    将 NBS(554mg， 3.06mmol， 1.1 当 量 ) 加 入 N-{4- 甲 基 -5-[2-(1-d3- 甲 基 - 环 丁 基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 乙酰胺 ( 步骤 36.3)(846mg， 2.78mmol) 在 CCl4(20mL) 和 CHCl3(16mL) 的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌 1 小时， 用 H2O 和盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (Hex/EtOAc， 1 ∶ 4) 得到 572mg 标题 + 化 合 物， 为浅黄色固体 ： ESI-MS ： 383.0/385.0[M+H] ； tR ＝ 3.12min( 系 统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.45(Hex/EtOAc， 1 ∶ 4)。
     步 骤 36.3 ： N-{4- 甲 基 -5-[2-(1-d3- 甲 基 - 环 丁 基 )- 吡 啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 }- 乙酰胺
    
    按照步骤 1.3-1.7 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在步骤 1.3 中， 将反应混合物在 120℃下搅拌 1 小时， 并用 EtOAc/H2O 稀释猝灭。 在步骤 1.5 中， 将反 应混合物在 80℃下搅拌 3 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.7 中， 4- 甲氧基 -3- 丁 烯 -2- 酮在 THF 中的溶液加入冷却的 (-78 ℃ )LiHMDS 在 THF 中的溶液。30 分钟后， 加入 1-d3- 甲基 - 环丁烷氯化物 ( 步骤 32.1) 在 THF 中的溶液， 并将反应混合物历经 16 小时达 到室温。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 305.2[M+H]+ ； TLC ： Rf ＝ 0.24(Hex/EtOAc， 1 ∶ 4)。
     实施例 37 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 氯 -5-[2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    将 4- 氯 -5-[2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 胺 ( 步骤 37.1)(100mg， 0.311mmol) 和光气 (0.164mL， 0.311mmol) 在吡啶 (2mL) 中的混合 物在 105℃下搅拌 1 小时。加入 L- 脯氨酰胺 (106mg， 0.932mmol， 3 当量 )。将所得混合物 在 105 ℃下搅拌 30 分钟， 冷却， 通过加入饱和 NaHCO3 溶液猝灭 (100mL)， 并用 EtOAc 萃取(2x100mL)。有机相用饱和 NaHCO3 溶液洗涤 (100mL)， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将残余 物经硅胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH， 99 ∶ 1 → 94 ∶ 6) 得到 46mg 标题化合物， 为黄色固体 ： + ESI-MS ： 461.9[M+H] ； tR ＝ 3.60min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.28(DCM/MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 37.1 ： 4- 氯 -5-[2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基胺
    按照步骤 1.2-1.7 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 85℃下搅拌 3 小时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.3 中， 使 用 N-(4- 氯 - 噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺 ( 步骤 37.2)。将反应混合物在 120℃下搅拌 2 小时。 在步骤 1.4 中， 将反应混合物在 83℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 65℃下搅拌 1 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 粗产物不 再纯化。在步骤 1.7 中， 使用 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酰氯 ( 步骤 12.1)。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 322.1[M+H]+ ； tR ＝ 3.58min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.45(DCM/ MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 37.2 ： N-(4- 氯 - 噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺
    
    将 N-(4- 氧代 -4， 5- 二氢 - 噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺 ( 步骤 37.3)(14.8g， 94mmol) 和 POCl3(175mL， 20 当量 ) 的混合物加热至 105℃， 搅拌 15 分钟， 冷却并浓缩。将残余物倒 在冰 -H2O 上， 并用 EtOAc 萃取 (2x100mL)。有机相用饱和 NaHCO3 溶液洗涤 (2x100mL)， 干 燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH， 99 ∶ 1) 得到 13.9g 标 + 题化合物， 为白色固体 ： ESI-MS ： 177.0[M+H] ； tR ＝ 2.74min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.66(DCM/ MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 37.3 ： N-(4- 氧代 -4， 5- 二氢 - 噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺
    
    将假乙内酰硫脲 (16g， 138mmol) 和乙酸酐 (16.9mL， 179mmol， 1.3 当量 ) 在吡啶 (150mL) 中的混合物加热至 115℃， 搅拌 1 小时并冷却。经过滤收集所得沉淀， 得到 12.64g + 标题化合物， 为褐色固体 ： ESI-MS ： 159.0[M+H] 。
     实施例 38 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 氟甲基 -5-[2-(2， 2， 2- 三 氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 18 小时， 通过用 DCM/H2O 稀释猝灭， 并用 DCM 萃取。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 1 小时， 浓缩， 且所得粗物质不经纯化直接使用。 在步骤 1.2 中， 使用 N-{4- 氟甲基 -5-[2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 }- 乙酰胺 ( 步骤 38.1)。将反应混合物在 100℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 DCM 萃取。粗物质不经纯化。
     标 题 化 合 物： ESI-MS ： 460.0[M+H] + ； TLC ： Rf ＝ 0.44(DCM/MeOH/NH3aq， 91.5 ∶ 7.5 ∶ 1]
     步 骤 38.1 ： N-{4- 氟 甲 基 -5-[2-(2， 2， 2- 三 氟 -1， 1- 二 甲 基 - 乙 基 )- 吡 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 乙酰胺
    
    按照步骤 1.3-1.7 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在步骤 1.3 中， 使用 N-(4- 氟甲基 - 噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺 ( 步骤 38.2)。将反应混合物在 90℃下 搅拌 7 小时， 在 100℃下搅拌 5 小时， 并通过用 EtOAc 和 H2O 稀释猝灭。在步骤 1.5 中， 将 反应混合物在 65℃下搅拌 1 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 粗产物不再纯 化。在步骤 1.7 中， 使用 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酰氯 ( 步骤 12.1)。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 362.1[M+H]+ ； tR ＝ 4.18min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.29(Hex/ EtOAc， 1 ∶ 1)。
     步骤 38.2 ： N-(4- 氟甲基 - 噻唑 -2- 基 )- 乙酰胺
    
    将 1- 氯 -3- 氟 - 丙烷 -2- 酮 ( 步骤 38.3)(1.14g， 10.3mmol) 和 N- 乙酰基 -2- 硫脲 (1.22g， 10.3mmol) 在 EtOH(10mL) 中的混合物在回流下搅拌 1.5 小时， 冷却并浓缩。 将残余 物溶于 DCM/H2O， 并用 DCM 萃取。 干燥 (Na2SO4) 有机相， 过滤并浓缩。 将残余物经硅胶柱色谱 纯化 (Hex/EtOAc， 1 ∶ 1) 得到 0.143g 标题化合物 ： ESI-MS ： 173.1[M-H]- ； tR ＝ 1.98min( 系
     统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.21(Hex/EtOAc， 1 ∶ 1)。
     步骤 38.3 ： 1- 氯 -3- 氟 - 丙烷 -2- 酮
    将 1- 氟 -3- 氯异丙醇 (2.7mL， 31.2mmol) 缓慢加入装有 30mL 琼斯试剂 ( 通过将 230mL 浓硫酸加入 267g 三氧化铬在 700mL H2O 的溶液中， 并用 H2O 稀释至 1L 来制备 ) 的冷 却至 5℃的烧瓶中。将反应混合物加温至室温， 搅拌 18 小时， 倒入饱和 NaHCO3 溶液中， 并用 Et2O 萃取。将有机相用盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (DCM)， 得到 1.14g 标题化合物， 为不纯的黄色油状物。
     实施例 39 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[5-(5- 苯磺酰基氨基 -6- 氯 - 吡 啶 -3- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    按 照 步 骤 1.3 中 所 述 类 似 的 方 法 制 备 标 题 化 合 物， 但 进 行 如 下 修 改。 使 用 (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-[(4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 )- 酰 胺 ]( 步 骤 39.2) 和 N-(5- 溴 -2- 氯 - 吡啶 -3- 基 )- 苯磺酰胺 ( 步骤 39.1)。将钯催化剂加入加热的剩余试剂 的混合物中， 并将所得混合物在 135℃下搅拌 3 小时， 用 EtOAc 和 H2O 稀释， 经硅藻土垫过滤 并用 EtOAc 萃取。干燥并浓缩有机相后， 将残余物经硅胶柱色谱及反相 HPLC 纯化。标题化 合物 ： ESI-MS ： 519.0/521.1[M-H]- ； tR ＝ 3.33min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.09(DCM/MeOH/NH3aq， 84 ∶ 15 ∶ 1)。
     步骤 39.1 ： N-(5- 溴 -2- 氯 - 吡啶 -3- 基 )- 苯磺酰胺
    
    在氩气中将苯磺酰氯 (1.23mL， 9.62mmol， 2 当量 ) 在 DCM(50mL) 中的溶液历经 15 分钟逐滴加入 3- 氨基 -5- 溴 -2- 氯吡啶 [Jouve， K. ； Bergman， J.， Journal of Heterocyclic Chemistry， (2003)， 40(2)， 261-268](1g， 4.81mmol) 和 吡 啶 (1.94ml， 24mmol， 5 当量 ) 在 DCM(20mL) 的溶液中。将所得混合物在室温下搅拌 20 小时， 浓缩， 用 H2O 稀释， 并用 DCM 萃 取。将有机相用盐水洗涤， 干燥 (Na2SO4)， 过滤并浓缩。将残余物经硅胶柱色谱纯化 (DCM) 得到 163mg 标题化合物， 为白色固体 ： ESI-MS ： 346.9[M-H]- ； tR ＝ 4.33min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.23(DCM)。
     步骤 39.2 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用咪唑 -1- 甲酸 (4- 甲 基 - 噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ( 步骤 39.3)。将反应混合物在室温下搅拌 18 小时并浓缩。将残 余物经硅胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH/NH3aq， 94 ∶ 5 ∶ 1)， 然后在 Et2O 中研磨。标题化合物 ： ESI-MS ： 253.2[M-H]- ； TLC ： Rf ＝ 0.18(DCM/MeOH/NH3aq， 84 ∶ 15 ∶ 1)。
     步骤 39.3 ： 咪唑 -1- 甲酸 (4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 )- 酰胺
    
    按照步骤 1.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 2- 乙酰氨基 -4- 甲基噻 唑， 并将反应混合物在回流下搅拌 5.5 小时。
     实施例 40 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[5-(5- 苯磺酰基氨基 -6- 氯 - 吡 啶 -3- 基 )- 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    按照步骤 1.3 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。使用 (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1- 噻 唑 -2- 基 酰 胺 ( 步 骤 40.1) 和 N-(5- 溴 -2- 氯 - 吡 啶 -3- 基 )- 苯磺酰胺 ( 步骤 39.1)。 将钯催化剂加入加热的剩余试剂的混合物中， 并将所得 混合物在 120℃下搅拌 6 小时， 浓缩， 用 DCM/MeOH 稀释， 经硅藻土垫过滤， 并浓缩滤液。 将残 + 余物经硅胶柱色谱及反相 HPLC 纯化。 标题化合物 ： ESI-MS ： 506.9[M+H] ； tR ＝ 3.21min( 系 统 1)。
     步骤 40.1 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1- 噻唑 -2- 基酰胺
    
    按 照 实 施 例 1 中 所 述 类 似 的 方 法 制 备 标 题 化 合 物， 但 使 用 咪 唑 -1- 甲 酸 噻 唑 -2- 基酰胺 ( 步骤 40.2)。将反应混合物在室温下搅拌 18 小时并浓缩。残余物经硅 胶柱色谱纯化 (DCM/MeOH/NH3aq， 94 ∶ 5 ∶ 1)， 然后用 EtOAc 研磨。标题化合物 ： ESI-MS ： aq 239.2[M-H] ； TLC ： Rf ＝ 0.11(DCM/MeOH/NH3 ， 84 ∶ 15 ∶ 1)。
     步骤 40.2 ： 咪唑 -1- 甲酸噻唑 -2- 基酰胺
    按照步骤 1.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 N- 噻唑 -2- 基 - 乙酰胺， 并将反应混合物在回流下搅拌 5 小时。
     实施例 41 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[5-(6- 氨基 -5- 三氟甲基 - 吡 啶 -3- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    按照步骤 1.3 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。使用 (S)- 吡 咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-[(4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]( 步骤 39.2) 和 5- 溴 -3- 三 氟甲基 - 吡啶 -2- 基胺 (WO2007095588)。将钯催化剂加入加热的剩余试剂的混合物中， 并 并用 DCM 萃取。干燥并浓缩有机相后， 将所得混合物在 120℃搅拌 3 小时， 用 DCM/H2O 稀释， 将残余物经硅胶柱色谱及反相 HPLC 纯化。标题化合物 ： ESI-MS ： 413.1[M-H]- ； TLC ： Rf ＝ aq 0.27(DCM/MeOH/NH3 ， 89 ∶ 10 ∶ 1)。
     实施例 42 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环丙 基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    在室温下将咪唑 -1- 甲酸 {4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环丙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 }- 酰胺 (4.0g) 加入搅拌过的 L- 脯氨酰胺 (1.48g) 和三乙胺 (4.1ml) 在 DMF(46ml) 的溶液中。将反应混合物在室温下放置 22 小时， 蒸发， 在用甲醇 (60ml) 和水 (20ml) 结晶
     后得到标题化合物， 为白色固体。HPLC/MS ： 保留时间 1.24 分钟， M+H 387.1 和 M-H 385.2。
     步骤 42.1 ： 咪唑 -1- 甲酸 {4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环丙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 }- 酰胺
    在 室 温 下 将 羰 基 二 咪 唑 (4.56g) 加 入 4- 甲 基 -5-[2-(1- 甲 基 - 环 丙 基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺 (10.5g) 和三乙胺 (4.28ml) 在 DMF(26ml) 的溶液中， 并随后在 80℃下加热 2 小时。冷却后， 经过滤分离标题化合物。
     步骤 42.2 ： 4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环丙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺
    
    将粉末的氢氧化钠 (5.86g) 加入 N ′ -[5-(3- 二甲基氨基 - 丙烯酰基 )-4- 甲 基 - 噻唑 -2- 基 ]-N， N- 二甲基 - 甲脒 (13g， 如 S.Wang 等人 J.Med.Chem.2004， 47， 1662-1675 中所述制备 ) 和 1- 甲基 - 环丙烷甲脒盐酸化物 (7.2g， 如 EP0227415 中所述制备 ) 在 2- 甲 氧基乙醇 (98ml) 的溶液中， 并将该混合物在搅拌中于 125℃下加热 1 小时。将反应混合物 冷却， 加入水， 经过滤分离标题化合物。ESI-MS ： M+H 247 和 M-H 245。
     实 施 例 43 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 异 丙 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    在室温下将咪唑 -1- 甲酸 [5-(2- 异丙基 - 嘧啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰 胺 (50mg) 加入 L- 脯氨酰胺 (19mg) 和三乙胺 (26μl) 在 DMF(152μl) 的溶液中。 将该混合 物在 40℃下搅拌 2 小时， 并随后用制备型反相色谱纯化。 将包含标题化合物的流份用 300mg 的 BondElut SPE、 SCX 柱捕获， 并随后用 7M 的氨在甲醇 (1ml) 中的溶液释放。经蒸发获得
     标题化合物。ESI-MS ： M+H 275 和 M-H 273。
     步骤 43.1 ： 咪唑 -1- 甲酸 {4- 甲基 -5-[2- 异丙基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰 胺
    按照实施例 42 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2- 异丙 基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环丙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基胺。
     实施例 44 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[5-(2- 苄基 - 嘧啶 -4- 基 )-4- 甲 基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    按照实施例 43 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2- 苄 基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2- 异丙基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 胺。ESI-MS ： M+H 423 和 M-H 421。
     实施例 45 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[5-(2- 乙基 - 嘧啶 -4- 基 )-4- 甲 基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    按照实施例 43 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2- 乙 基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2- 异丙基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 胺。ESI-MS ： M+H 361 和 M-H 359。
     实 施 例 46 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 甲 氧 基 甲 基 - 嘧
     啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    按照实施例 43 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2- 甲氧基 甲基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2- 异丙基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 胺。ESI-MS ： M+H 377 和 M-H 375。
     实施例 47 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(2， 6- 二氯 - 苄基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 43 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2-(2， 6- 二氯 - 苄基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2- 异丙基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基胺。ESI-MS ： M+H 491， 493 和 M-H 489， 491。
     实 施 例 48 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 异 丁 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    按照实施例 43 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2- 异丁 基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2- 异丙基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 胺。ESI-MS ： M+H 389 和 M-H 387。
     实施例 49 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(4- 甲氧基 - 苯氧基甲 基 )- 嘧啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
     按照实施例 43 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2-(4- 甲 氧 基 - 苯 氧 基 甲 基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 胺 代 替 4- 甲 基 -5-[2- 异 丙 基 - 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺。ESI-MS ： M+H 469 和 M-H 467。
     实施例 50 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(3- 甲氧基 - 苯氧基甲 基 )- 嘧啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 43 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2-(3- 甲 氧 基 - 苯 氧 基 甲 基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 胺 代 替 4- 甲 基 -5-[2- 异 丙 基 - 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺。ESI-MS M-H 467。
     实 施 例 51 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-({5-[2-(2- 氟 - 苯 基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    在 室 温 下 将 咪 唑 -1- 甲 酸 {5-[2-(2- 氟 - 苯 基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 }- 酰胺 (415mg) 加入 L- 脯氨酰胺 (137mg) 和三乙胺 (182μl) 在 DMF(1.1ml) 的 溶液中。将该混合物在 40℃下搅拌 18 小时， 蒸发并在甲醇 (8ml) 和水 (2ml) 中结晶， 得到 标题化合物， 为白色固体。ESI-MS ： M+H 427 和 M-H 425。
     步 骤 51.1 ： 咪 唑 -1- 甲 酸 {5-[2-(2- 氟 - 苯 基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 }- 酰胺
    
     按 照 实 施 例 43 中 所 述 类 似 的 方 法 制 备 标 题 化 合 物，但 使 用 4- 甲 基 -5-[2-(2- 氟 - 苯基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环 丙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺。
     实 施 例 52 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 三 氟 甲 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    在 室 温 下 将 L- 脯 氨 酰 胺 (9mg) 加 入 咪 唑 -1- 甲 酸 [5-(2- 三 氟 甲 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 (25mg) 和三乙胺 (12μl) 在 DMF(71μl) 的溶液 中。将该混合物在 25℃下搅拌 18 小时， 并经制备型反相色谱纯化。将包含标题化合物的 流份用 300mg 的 BondElut SPE、 SCX 柱捕获， 并随后用 7M 的氨在甲醇 (1ml) 中的溶液释放。 经蒸发获得标题化合物。ESI-MS ： M+H401 和 M-H 399。
     步 骤 52.1 ： 咪 唑 -1- 甲 酸 {4- 甲 基 -5-[2- 三 氟 甲 基 - 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 }- 酰胺
    
    按照实施例 43 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2- 三氟甲 基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环丙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基胺。
     实施例 53 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 一甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2-(1， 1， 2- 三甲 基 - 丙基 )- 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
     按照实施例 51 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2-(1， 1， 2- 三甲基 - 丙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2-(2- 氟 - 苯基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺。ESI-MS ： M+H 417 和 M-H 415。
     实 施 例 54 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-[(5-{2-[1-(4- 甲 氧 基 - 苯 基 )-1- 甲基 - 乙基 ]- 嘧啶 -4- 基 }-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 )- 酰胺 ]
    
    按 照 实 施 例 51 中 所 述 类 似 的 方 法 制 备 标 题 化 合 物， 但 使 用 5-{2-[1-(4- 甲 氧 基 - 苯 基 )-1- 甲 基 - 乙 基 ]- 嘧 啶 -4- 基 }-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 胺 代 替 4- 甲 基 -5-[2-(2- 氟 - 苯基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺。E SI-MS ： M+H 495 和 M-H 493。 实施例 55 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(2- 氟 -1- 氟甲基 -1- 甲 基 - 乙基 )- 吡啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 6 小时。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 15 小 时。 在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 100℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。 在步骤 1.3 中， 将反应混合物在 120℃下搅拌 2 小时。在步骤 1.4 中， 将反应混合物在 85℃下搅拌 30 分钟， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 65℃下搅拌 1 小时， 不 进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 粗产物不再纯化。在步骤 1.7 中， 使用 3- 氟 -2- 氟 甲基 -2- 甲基 - 丙酰氯 ( 步骤 55.1)。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 424.1[M+H]+ ； tR ＝ 2.40min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.35(DCM/
     MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 55.1 ： 3- 氟 -2- 氟甲基 -2- 甲基 - 丙酰氯
    按照步骤 5.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 3- 氟 -2- 氟甲基 -2- 甲 基 - 丙酸 ( 步骤 55.2)。
     步骤 55.2 ： 3- 氟 -2- 氟甲基 -2- 甲基 - 丙酸
    
    按照步骤 73.2 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 3- 氟 -2- 氟甲基 -2- 甲 基 - 丙酸甲酯 ( 制备 WO 2007/053394)。ESI-MS ： 137.0[M-H]-。
     实施例 56 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2-(1， 1- 二甲基 - 丙 基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 43 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2-(1， 1- 二 甲 基 - 丙 基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 胺 代 替 4- 甲 基 -5-[2- 异 丙 基 - 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺。ESI-MS ： M+H 403 和 M-H 401。
     实施例 57 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 -1- 对 甲苯基 - 乙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 43 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2-(1- 甲 基 -1- 对甲苯基 - 乙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2- 异丙基 - 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺。E SI-MS ： M+H 479 和 M-H 477。
     实施例 58 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2-(1- 苯基 - 环戊 基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )按照实施例 43 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2-(1- 苯 基 - 环戊基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2- 异丙基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基胺。E SI-MS ： M+H 477 和 M-H 475。
     实施例 59 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2- 环丙基 - 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 43 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2- 环丙 基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2- 异丙基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 胺。ESI-MS ： M+H 373 和 M-H 371。
     实施例 60 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2- 环丁基 - 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按照实施例 52 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 甲基 -5-[2- 环丁 基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2- 三氟甲基 - 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 胺。ESI-MS ： M+H 387 和 M-H 385。
     实 施 例 61 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2-d9- 叔 丁 基 - 嘧
     啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    在 室 温 下 将 咪 唑 -1- 甲 酸 [5-(2-d9- 叔 丁 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 ]- 酰 胺 (0.82g) 加 入 搅 拌 过 的 L- 脯 氨 酰 胺 (0.29g) 和 三 乙 胺 (0.81ml) 在 DMF(5ml) 的溶液中。将反应混合物在室温下放置 22 小时， 随后蒸发， 并用 2 ∶ 1 的甲醇 ： 水结晶两次后得到标题化合物， 为白色固体。HPLC/MS ： 保留时间 1.27 分钟， M+H 398.3 和 M-H 396.3。
     步 骤 61.1 ： 咪 唑 -1- 甲 酸 [5-(2-d9- 叔 丁 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 ]- 酰胺
    
    在 室 温 下 将 羰 基 二 咪 唑 (0.77g) 加 入 搅 拌 过 的 5-(2-d9- 叔 丁 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基胺 (1.11g) 在 DMF(4.3ml) 的溶液中。随后将反应混合物 在 25℃下放置 18 小时， 然后经过滤分离标题化合物。
     步骤 61.2 ： 5-(2-d9- 叔丁基 - 嘧啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基胺
    
    将粉末氢氧化钠 (3.71g) 加入 N′ -[5-(3- 二甲基氨基 - 丙烯酰基 )-4- 甲基 - 噻 唑 -2- 基 ]-N， N- 二甲基 - 甲脒 (5.51g) 和 d9-2， 2- 二甲基 - 丙脒盐酸化物 (4.50g) 在 2- 甲 氧基乙醇 (41ml) 的溶液中， 并将该混合物在搅拌中于 125℃下加热 1 小时。将反应混合物
     冷却， 加入水， 并经过滤分离粗产物。将粗产物经制备型 HPLC 纯化， 并将包含标题化合物的 流份在二氯甲烷和碳酸氢钠水溶液之间分配。 蒸发干燥过的二氯甲烷层之后得到标题化合 物， 为黄色固体。HPLC/MS ： 保留时间 1.12 分钟， M+H 258.4。
     步骤 61.3 ： d9-2， 2- 二甲基 - 丙脒盐酸化物
    将 2M 的三甲基铝在甲苯 (61ml) 中的溶液逐滴加入用冰浴冷却的氯化铵 (6.53g) 在甲苯 (46ml) 的混悬液中。 将反应混合物在室温下搅拌 4 小时， 并加入 d9-2， 2- 二甲基 - 丙 酸丁酯 (6.3g)。在 80℃加热 4 天后， 将反应混合物冷却至 0℃， 并逐滴加入甲醇 (200ml)。 在室温下搅拌并超声处理 1 小时后， 将反应混合物经 Hyflo 过滤， 用甲醇洗涤， 并蒸发滤液， 得到标题化合物， 为灰白色固体。
     步骤 61.4 ： d9-2， 2- 二甲基 - 丙酸丁酯
    
    将 d9- 叔丁基氯 (5.0g) 分批加入镁 (1.50g) 在四氢呋喃 (20ml) 的混悬液中， 用 催化量的碘活化， 加热以保持稳定回流持续 1 小时。然后将反应混合物再加热 1 小时， 以保 证格氏试剂形成完全。随后将上述格氏试剂溶液逐滴加入用冰浴冷却的咪唑 -1- 甲酸丁酯 (7.5g， 如 T.Werner 和 A.G.M.Barrett J.Org.Chem.2006， 71， 4302-4304 中所述制备 ) 在四 氢呋喃 (40ml) 的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌 18 小时， 加入水 (200ml)， 将该混合 物经 Hyflo 过滤， 滤液用乙醚萃取， 并将乙醚层用硫酸钠干燥并蒸发， 得到标题化合物。
     实施例 62 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2-(2- 甲基 - 环丙 基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    在室温下将咪唑 -1- 甲酸 {4- 甲基 -5-[2-(2- 甲基 - 环丙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 }- 酰 胺 (50mg) 加 入 搅 拌 过 的 L- 脯 氨 酰 胺 (18mg) 和 三 乙 胺 (25μl) 在
     DMF(147μl) 的溶液中。将反应混合物在 40℃下搅拌 2 小时， 并经制备型反相色谱纯化。 将包含标题化合物的流份用 300mg 的 BondElut SPE、 SCX 柱捕获， 并随后用 7M 的氨在甲醇 (1ml) 中的溶液释放。经蒸发获得标题化合物。ESI-MS ： M+H 387 和 M-H 385。
     步骤 62.1 ： 咪唑 -1- 甲酸 {4- 甲基 -5-[2-(2- 甲基 - 环丙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 }- 酰胺
    在 室 温 下 将 羰 基 二 咪 唑 (487mg) 加 入 4- 甲 基 -5-[2-(2- 甲 基 - 环 丙 基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺 (370mg) 和三乙胺 (251μl) 在 DMF(1.5ml) 的溶液中， 并随后在 40℃下加热 2 小时。将反应混合物蒸发， 并用氯仿研磨。经过滤分离标题化合物。
    
    
    步骤 62.2 ： 4- 甲基 -5-[2-(2- 甲基 - 环丙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺将粉末氢氧化钠 (300mg) 加入 N′ -[5-(3- 二甲基氨基 - 丙烯酰基 )-4- 甲基 - 噻 唑 -2- 基 ]-N， N- 二甲基 - 甲脒 (1g， 如 S.Wang 等人 J.Med.Chem.2004， 47， 1662-1675 中所 述制备 ) 和顺式 / 反式 2- 甲基 - 环丙烷甲脒盐酸化物 (0.61g， 如 WO 03/087064 中所述制 备 ) 在 2- 甲氧基乙醇 (3.8ml) 的溶液中， 并将该混合物在搅拌中于 125℃下加热 1 小时。 将反应混合物冷却， 过滤， 用水洗涤， 得到标题化合物。MS ： M+H 247 和 M-H 245。
    实 施 例 63(S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 二 乙 基 氨 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    在 室 温 下 将 咪 唑 -1- 甲 酸 [5-(2- 二 乙 基 氨 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲 基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰 胺 (40mg) 加 入 搅 拌 过 的 L- 脯 氨 酰 胺 (14mg) 和 三 乙 胺 (19μl) 在 DMF(147μl) 的溶液中。将反应混合物在 40℃下搅拌 2 小时， 并经制备型反相色谱纯化。 将包含标题化合物的流份用 300mg 的 BondElut SPE、 SCX 柱捕获， 并随后用 7M 的氨在甲醇 (1ml) 中的溶液释放。经蒸发获得标题化合物。ESI-MS ： M+H 404 和 M-H 402。
     步 骤 63.1 ： 咪 唑 -1- 甲 酸 [5-(2- 二 乙 基 氨 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 ]- 酰胺
    在室温下将羰基二咪唑 (437mg) 加入 [4-(2- 氨基 -4- 甲基 - 噻唑 -5- 基 )- 嘧 啶 -2- 基 ]- 二乙基 - 胺 (355mg) 和三乙胺 (207μl) 在 DMF(1.4ml) 的溶液中， 并随后在 80℃下加热 18 小时。将反应混合物蒸发并用氯仿研磨。经过滤分离标题化合物。
     步骤 63.2 ： [4-(2- 氨基 -4- 甲基 - 噻唑 -5- 基 )- 嘧啶 -2- 基 ]- 二乙基 - 胺
    
    将粉末氢氧化钠 (150mg) 加入 N′ -[5-(3- 二甲基氨基 - 丙烯酰基 )-4- 甲基 - 噻 唑 -2- 基 ]-N， N- 二甲基 - 甲脒 (0.5g， 如 S.Wang 等人 J.Med.Chem.2004， 47， 1662-1675 中 所述制备 ) 和 1， 1- 二乙基胍 (259mg) 在 2- 甲氧基乙醇 (1.9ml) 的溶液中， 并将该混合物 在搅拌中于 125℃下加热 1 小时。 将反应混合物真空浓缩， 并经正相色谱纯化， 洗脱剂 ； DCM/ EtOAc， 得到标题化合物。ESI-MS ： M+H 264 和 M-H 262。
     实施例 64 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({4- 甲基 -5-[2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    在室温下将咪唑 -1- 甲酸 {4- 甲基 -5-[2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 (69mg) 加入搅拌过的 L- 脯氨酰胺 (22mg) 和三乙胺 (53mg)在 DMF(1ml) 的溶液中。将反应混合物在室温下放置 22 小时， 随后蒸发， 并用甲醇 (2ml) 和 水 (1ml) 结晶后得到标题化合物， 为白色固体。HPLC/MS ： 保留时间 1.80 分钟， M+H 443.1 和 M-H 441.2。
     步骤 64.1 ： 咪唑 -1- 甲酸 {4- 甲基 -5-[2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺
    在 室 温 下 将 羰 基 二 咪 唑 (38mg) 加 入 4- 甲 基 -5-[2-(2， 2， 2- 三 氟 -1， 1- 二 甲 基 - 乙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺 (65mg) 在 DCM(1ml) 和 DMF(0.2ml) 的溶液中， 并 随后在 25℃下放置 18 小时。冷却后经过滤分离标题化合物。
     步骤 64.2 ： 4- 甲基 -5-[2-(2， 2， 2- 三氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基胺
    
    将粉末氢氧化钠 (0.42g) 加入 N′ -[5-((E)-3- 二甲基氨基 - 丙烯酰基 )-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 ]-N， N- 二 甲 基 - 甲 脒 (0.93g， 如 S.Wang 等 人 J.Med.Chem.2004， 47， 1662-1675 中所述制备 ) 和 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙脒盐酸化物 (0.54g) 在 2- 甲氧 基乙醇 (7ml) 的溶液中， 并将该混合物在搅拌中于 125℃下加热 1 小时。将反应混合物冷 却， 加入水， 并将水层用 10％甲醇的二氯甲烷溶液萃取 4 次。合并的有机层经反相色谱纯 化， 并将碳酸氢钠加入包含标题化合物的流份中， 得到白色沉淀， 其经过滤收集。HPLC/MS ： 保留时间 1.47 分钟， M+H 303.1。
     步骤 64.3 ： 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙脒盐酸化物
    
    按照步骤 61.3 中所述方法合成标题化合物， 并进行如下修改。使用 3， 3， 3- 三 氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酸丁酯代替 d9-2， 2- 二甲基 - 丙酸丁酯， 并将该混合物在 80℃下搅拌 3天。将粗产物溶于用少量 HCl 的 EtOH 溶液处理过的 DCM 中并蒸发。将残余物用 DCM 研磨， 过滤并干燥， 得到标题化合物， 为灰白色固体。
     步骤 64.4 ： 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酸丁酯
    将 3， 3， 3- 三氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酸 (3.0g， 19.2mmol) 和一滴 DMF 溶于 30mL 的 DCM 中， 并在室温下用草酰氯 (1.85mL， 21.1mmol) 逐滴处理。2 小时后， 气体停止产生， 并将 该混合物用三乙胺 (5.36mL， 38.4mmol)、 随后用正丁醇 (2.1mL， 23mmol) 缓慢处理。将该混 合物搅拌过夜， 蒸发溶剂， 并将残余物用己烷搅拌。滤出固体， 并蒸发滤液得到褐 - 红色油 状物。Kuge)rohr 蒸馏 (10 毫巴， 60-80℃炉温 )， 得到标题化合物， 为无色液体。
     实施例 65(S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-( 乙基 - 甲基 - 氨基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    将 (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 甲 烷 亚 磺 酰 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }(60mg) 和 N- 乙基甲基胺 (45mg) 在密封的试管 中于 80℃下加热 18 小时。然后将粗产物用制备型反相色谱纯化。将包含标题化合物的流 份用 300mg 的 BondElut SPE、 SCX 柱捕获， 并随后用 7M 的氨在甲醇 (1ml) 中的溶液释放。 经蒸发获得标题化合物。ESI-MS ： M+H 390。
     步 骤 65.1 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 甲 烷 亚 磺 酰 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    在 0 ℃下将间 - 氯过氧苯甲酸 (0.50g) 加入 (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺1-{[4- 甲基 -5-(2- 甲基硫基 - 嘧啶 -4- 基 )- 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }(1.7g) 在二氯甲烷 (8.5ml) 的溶液中。1 小时后将反应混合物蒸发， 并经正相色谱纯化， 用二氯甲烷 / 甲醇梯 度洗脱， 得到标题化合物， 为黄色固体。ESI-MS ： M+H 395 和 M-H 393。
     步骤 65.2 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[4- 甲基 -5-(2- 甲基硫基 - 嘧 啶 -4- 基 )- 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    在 室 温 下 将 咪 唑 -1- 甲 酸 [4- 甲 基 -5-(2- 甲 基 硫 基 - 嘧 啶 -4- 基 )- 噻 唑 -2- 基 ]- 酰胺 (1.0g) 加入搅拌过的 L- 脯氨酰胺 (379mg) 和三乙胺 (0.51ml) 在 DMF(3ml) 的溶液中。 将反应混合物在 40℃下搅拌 2 小时， 然后蒸发， 用二氯甲烷和水沉淀后得到标题 化合物， 为橙色固体。ESI-MS ： M+H 379 和 M-H377。
     步 骤 65.3 ： 咪 唑 -1- 甲 酸 [4- 甲 基 -5-(2- 甲 基 硫 基 - 嘧 啶 -4- 基 )- 噻 唑 -2- 基 ]- 酰胺
    
    在室温下将羰基二咪唑 (1.77g) 加入 4- 甲基 -5-(2- 甲基硫基 - 嘧啶 -4- 基 )- 噻 唑 -2- 基胺 (1.3g) 在三乙胺 (0.84ml) 和 DMF(5.5ml) 的溶液中， 并在 80℃下搅拌 2 小时。 冷却后经过滤分离标题化合物。
     步骤 65.4 ： 4- 甲基 -5-(2- 甲基硫基 - 嘧啶 -4- 基 )- 噻唑 -2- 基胺
    
    将粉末氢氧化钠 (1.09g) 加入 N′ -[5-(3- 二甲基氨基 - 丙烯酰基 )-4- 甲基 - 噻 唑 -2- 基 ]-N， N- 二甲基 - 甲脒 (2.0g， 按照 S.Wang 等人 J.Med.Chem.2004， 47， 1662-1675 所述制备 ) 和硫脲 (0.57g) 在乙醇 (25ml) 的溶液中， 并将该混合物在搅拌中于回流下加热 3 小时。将反应混合物冷却至室温， 并随后加入水和碘甲烷 (0.47ml)。室温下 1 小时后， 蒸发除去乙醇， 并加入水， 用 2N 的盐酸水溶液将 pH 调至 7。经过滤得到标题化合物。ESI-MS ： M+H239 和 M-H 237。
     实施例 66(S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[5-(6- 环丙基 - 吡嗪 -2- 基 )-4- 甲 基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    在室温下将咪唑 -1- 甲酸 [5-(6- 环丙基 - 吡嗪 -2- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰 胺 (78mg) 加入搅拌过的 L- 脯氨酰胺 (30mg) 和三乙胺 (83μl) 在 DMF(1ml) 的溶液中。将 反应混合物在室温下放置 18 小时， 蒸发， 并在用甲醇 (1ml) 和水 (0， 5ml) 结晶后得到标题 化合物， 为黄 / 白色固体。HPLC/MS ： 保留时间 1.40 分钟， M+H 373.1 和 M-H 371.3。
     步骤 66.1 ： 咪唑 -1- 甲酸 [5-(6- 环丙基 - 吡嗪 -2- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰 胺
    
    在室温下将羰基二咪唑 (74mg) 加入 5-(6- 环丙基 - 吡嗪 -2- 基 )-4- 甲基 - 噻 唑 -2- 基胺 (96mg) 在 DMF(2ml) 的溶液中， 并在室温下放置 18 小时。将反应混合物过滤， 用二氯甲烷洗涤， 得到标题化合物。
     步骤 66.2 ： 5-(6- 环丙基 - 吡嗪 -2- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基胺
    
    在室温下将浓盐酸 (0.4ml) 加入 N-[5-(6- 环丙基 - 吡嗪 -2- 基 )-4- 甲基 - 噻 唑 -2- 基 ]- 乙酰胺 (120mg) 在乙醇 (9ml) 的溶液中， 并将该混合物在回流下加热 18 小时。 将冷却的反应混合物蒸发， 用碳酸氢钠水溶液中和， 并用 10％甲醇的 DCM 溶液萃取。 将合并 的有机萃取物用硫酸钠干燥并蒸发， 得到标题化合物。HPLC/MS ： 保留时间 0.93 分钟， M+H 233.3。
     步骤 66.3 ： N-[5-(6- 环丙基 - 吡嗪 -2- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 乙酰胺
    在室温下将氩气鼓入 2- 环丙基 -6- 氯吡嗪 (154mg， 按照 A.Fiirstner 等人 J.Am. Chem.Soc.2002， 214， 13856-13863 的方法制备 )、 2- 乙酰氨基 -4- 甲基噻唑 (200mg)、 乙酸 钯 (24mg)、 三叔丁基 四氟硼酸盐 (61mg) 和碳酸铯 (678mg) 在 DMF(3ml) 的混合物中持续5 分钟。将反应混合物在密封小瓶内在氩气中于 150℃下在 Biotage InitiatorTM 微波设备 中加热 45 分钟。将反应混合物过滤， 并经制备型 HPLC 纯化。将包含标题化合物的流份合 并， 并蒸发除去乙腈， 经过滤得到标题化合物， 为浅褐色固体。HPLC/MS ： 保留时间 1.65 分 钟， M+H 275.3。 实施例 67(S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[4- 甲基 -5-(5- 三氟甲基 - 吡 啶 -3- 基 )- 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    在 室 温 下 将 羰 基 二 咪 唑 (29mg) 加 入 搅 拌 过 的 4- 甲 基 -5-(5- 三 氟 甲 基 - 吡 啶 -3- 基 )- 噻唑 -2- 基胺 (42mg) 和三乙胺 (50μl) 在 DMF(1ml) 的溶液中， 并将该混合物 在室温下放置 18 小时。加入 L- 脯氨酰胺 (20mg)， 并将反应混合物在室温下再放置 8 小时， 蒸发， 并在用甲醇 (3ml) 和水 (1.5ml) 结晶后得到标题化合物， 为白色固体。ESI-MS ： M+H 400。
     步骤 67.1 ： 4- 甲基 -5-(5- 三氟甲基 - 吡啶 -3- 基 )- 噻唑 -2- 基胺
    
    在室温下将三甲基硅烷基氯化物 (0.3ml) 加入 N-[4- 甲基 -5-(5- 三氟甲基 - 吡 啶 -3- 基 )- 噻唑 -2- 基 ]- 乙酰胺 (44mg) 在乙醇 (2ml) 的溶液中， 并将该混合物在室温下搅拌 4.5 小时。 然后将反应物在 50℃加热 18 小时， 冷却， 蒸发， 并在用乙醚研磨后经过滤得 到标题化合物。
     步骤 67.2 ： N-[4- 甲基 -5-(5- 三氟甲基 - 吡啶 -3- 基 )- 噻唑 -2- 基 ]- 乙酰胺
    在 室 温 下 将 氩 气 鼓 入 5-( 三 氟 甲 基 )-3- 吡 啶 基 硼 酸 盐 酸 化 物 (263mg， 如 WO 2007/134828 中所述制备 )、 2- 乙酰氨基 -5- 碘 -4- 甲基噻唑 (260mg， 如 WO 2006/125807 中 所述制备 )、 1， 1′ - 二 -( 二苯基膦基 )- 二茂铁二氯化钯 (II)(38mg)、 碳酸钠 (488mg) 在 DME(2.3ml) 的溶液和水 (2.3ml) 的混合物中持续 5 分钟。将反应混合物在密封小瓶内在 氩气中于 80℃下在 BiotageInitiatorTM 微波设备中加热 30 分钟， 并随后在 80℃下加热 60 分钟。冷却后将反应混合物用 DCM 萃取， 用硅胶蒸发合并的有机层， 并经正相色谱纯化 ( 洗 脱剂 ； 从 DCM 到 DCM ： 乙酸乙酯 1 ∶ 1 梯度洗脱 )。随后将包含产物的流份用甲醇 (5ml)、 DMF(0.3ml) 和水 (1.3ml) 研磨并过滤， 得到标题化合物， 为浅褐色固体。
    
    
    实 施 例 68(S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(6-d10- 二 乙 基 氨 基 - 吡 嗪 -2- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }在室温下将咪唑 -1- 甲酸 [5-(6-d10- 二乙基氨基 - 吡嗪 -2- 基 )-4- 甲基 - 噻 唑 -2- 基 ]- 酰胺 (82mg) 加入搅拌过的 L- 脯氨酰胺 (28mg) 和三乙胺 (78μl) 在 DMF(1ml) 的溶液中。将反应混合物在室温下放置 14 小时， 蒸发， 并在用甲醇 (1ml) 和水 (0.5ml) 结 晶后得到标题化合物， 为黄 / 白色固体。HPLC/MS ： 保留时间 1.41 分钟， M+H 414.2 和 M-H 412.3。
     步骤 68.1 ： 咪唑 -1- 甲酸 [5-(6-d10- 二乙基氨基 - 吡嗪 -2- 基 )-4- 甲基 - 噻 唑 -2- 基 ]- 酰胺
    
    在室温下将羰基二咪唑 (78mg) 加入 5-(6-d10- 二乙基氨基 - 吡嗪 -2- 基 )-4- 甲 基 - 噻唑 -2- 基胺 (121mg) 在 DMF(2ml) 的溶液中， 并在室温下放置 3.5 小时。将反应混合 物过滤， 用二氯甲烷洗涤， 得到标题化合物。
     步骤 68.2 ： 5-(6-d10- 二乙基氨基 - 吡嗪 -2- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基胺
    
    在室温下将浓盐酸 (0.4ml) 加入 N-[5-(6-d10- 二乙基氨基 - 吡嗪 -2- 基 )-4- 甲 基 - 噻唑 -2- 基 ]- 乙酰胺 (140mg) 在乙醇 (9ml) 的溶液中， 并将该混合物在回流下加热 40 小时。将该冷却的反应混合物蒸发， 用碳酸氢钠水溶液中和， 并用 10％甲醇的 DCM 溶液萃 取。将合并的有机萃取物用硫酸钠干燥并蒸发， 得到标题化合物。HPLC/MS ： 保留时间 1.17 分钟， M+H 274.4。
     步骤 68.3 ： N-[5-(6-d10- 二乙基氨基 - 吡嗪 -2- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 乙 酰胺
    
    将氩气鼓入 2-d10- 二乙基氨基 -6- 氯吡嗪 (293mg)、 2- 乙酰氨基 -4- 甲基噻唑 四氟硼酸盐 (61mg) 和碳酸铯 (1.02g) 在 DMF(3ml)(300mg)、 乙酸钯 (24mg)、 三叔丁基的混合物中持续 5 分钟。将反应混合物在密封的小瓶内在氩气中于 150 ℃下在 Biotage InitiatorTM 微波设备中加热 45 分钟， 过滤并经制备型 HPLC 纯化。将包含标题化合物的流 份合并， 并蒸发除去乙腈， 经过滤得到标题化合物， 为浅褐色固体。HPLC/MS ： 保留时间 1.68 分钟， M+H 316.3。步骤 68.4 ： 2-d10- 二乙基氨基 -6- 氯吡嗪在室温下将 d10- 二乙基胺 (0.5g) 加入搅拌过的 2， 6- 二氯吡嗪 (0.93g) 和碳酸 钾 (1.41g) 在乙腈 (4ml) 的溶液中。随后将反应混合物在 55℃下加热 60 小时， 冷却， 加入 水并随后用二氯甲烷萃取。 将合并的有机萃取物用硫酸钠干燥， 蒸发并经正相色谱纯化， 用 DCM 洗脱， 得到标题化合物。HPLC/MS ： 保留时间 2.10 分钟， M+H 196.4 和 198.4。
     实 施 例 69(S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(6- 二 乙 基 氨 基 - 吡 嗪 -2- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    按照实施例 68 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用二乙基胺代替 d10- 二乙 基胺。HPLC/MS ： 保留时间 1.43 分钟， M+H 404.2 和 402.3。
     实 施 例 70 ： (S)- 吡 咯 烷 -1， 2- 二 甲 酸 2- 酰 胺 1-{[5-(2- 环 丙 基 甲 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    按 照 实 施 例 42 中 所 述 类 似 的 方 法 制 备 标 题 化 合 物， 但 使 用 咪 唑 -1- 甲 酸 [5-(2- 环丙基甲基 - 嘧啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺代替咪唑 -1- 甲酸 {4- 甲 基 -5-[2-(1- 甲 基 - 环 丙 基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 }- 酰 胺。M.p.220-222 ℃， ESI-MS[M+H]+387.1， TLC ： Rf ＝ 0.2(DCM/EtOH 95 ∶ 5)
     步 骤 70.1 ： 咪 唑 -1- 甲 酸 [5-(2- 环 丙 基 甲 基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 ]- 酰胺
    
     按照步骤 42.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 5-(2- 环丙基甲基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环丙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻 唑 -2- 基 胺， 并 将 反 应 物 搅 拌 15 小 时。M.p.240-243 ℃， ESI-MS[M+H]+305.1， TLC ： Rf ＝ 0.35(DCM/EtOH 95 ∶ 5)。
     步骤 70.2 ： 5-(2- 环丙基甲基 - 嘧啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基胺
    
    按照步骤 42.2 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 2- 环丙基 - 乙脒盐酸 化物代替 1- 甲基 - 环丙烷甲脒盐酸化物。M.p.198-200℃， ESI-MS[M+H]+247.1， TLC ： Rf ＝ 0.25(DCM/EtOH 95 ∶ 5)。
     实施例 71 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(2- 氟 -1， 1- 二甲基 - 乙 基 )- 嘧啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    
    按 照 实 施 例 42 中 所 述 类 似 的 方 法 制 备 标 题 化 合 物， 但 使 用 咪 唑 -1- 甲 酸 {5-[2-(2- 氟 -1， 1- 二 甲 基 - 乙 基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]-4- 甲 基 - 噻 唑 -2- 基 }- 酰 胺 代 替 咪唑 -1- 甲酸 {4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环丙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺。 M.p.187-190℃， ESI-MS[M+H]+407.1， TLC ： Rf ＝ 0.3(DCM/EtOH 95 ∶ 5)
     步骤 71.1 ： 咪唑 -1- 甲酸 {5-[2-(2- 氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]-4- 甲 基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺
    
    按照步骤 42.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 5-[2-(2- 氟 -1， 1- 二 甲基 - 乙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环丙 基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺， 并将反应物在 80℃下搅拌 16 小时。
     步骤 71.2 ： 5-[2-(2- 氟 -1， 1- 二甲基 - 乙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 胺
    
    按照步骤 42.2 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 3- 氟 -2， 2- 二甲基 - 丙 + 脒盐酸化物代替 1- 甲基 - 环丙烷 - 甲脒盐酸化物。 ESI-MS[M+H] 267.1， TLC ： Rf ＝ 0.4(DCM/ EtOH 95 ∶ 5)。
     实施例 72 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-{[5-(2- 叔丁基 -6- 甲基 - 嘧 啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺 }
    
    按 照 实 施 例 42 中 所 述 类 似 的 方 法 制 备 标 题 化 合 物， 但 使 用 咪 唑 -1- 甲 酸 [5-(2- 叔丁基 -6- 甲基 - 嘧啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 酰胺代替咪唑 -1- 甲酸 {4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环丙基 )- 嘧啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基 }- 酰胺。M.p.197-199℃， ESI-MS[M+H]+403.1， TLC ： Rf ＝ 0.3(DCM/EtOH 95 ∶ 5)
     步骤 72.1 ： 咪唑 -1- 甲酸 [5-(2- 叔丁基 -6- 甲基 - 嘧啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻 唑 -2- 基 ]- 酰胺
    
    按照步骤 42.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 5-(2- 叔丁基 -6- 甲 基 - 嘧啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基胺代替 4- 甲基 -5-[2-(1- 甲基 - 环丙基 )- 嘧 啶 -4- 基 ]- 噻唑 -2- 基胺， 并将反应物搅拌 16 小时。ESI-MS[M-H]-355.2。
     步骤 72.2 ： 5-(2- 叔丁基 -6- 甲基 - 嘧啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基胺
    
    按照步骤 1.2 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 N-[5-(2- 叔丁基 -6- 甲 基 - 嘧啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 乙酰胺代替 N-[5-(2- 叔丁基 - 吡啶 -4- 基 )-4- 甲 基 - 噻唑 -2- 基 ]- 乙酰胺， 并使用 2N HCl。将反应混合物在室温下搅拌 16 小时， 并随后在 + 90℃下搅拌 3 小时。ESI-MS[M+H] 263.1。
     步骤 72.3 ： N-[5-(2- 叔丁基 -6- 甲基 - 嘧啶 -4- 基 )-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 ]- 乙 酰胺
    
    按照步骤 1.3 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 4- 溴 -2- 叔丁基 -6- 甲 + 基 - 嘧啶代替 4- 溴 -2- 叔丁基 - 吡啶。ESI-MS[M+H] 305.2。
     步骤 72.4 ： 4- 溴 -2- 叔丁基 -6- 甲基 - 嘧啶
    
    按 照 步 骤 1.4 中 所 述 类 似 的 方 法 制 备 标 题 化 合 物， 但 使 用 2- 叔 丁 基 -6- 甲 基 -3H- 嘧啶 -4- 酮代替 2- 叔丁基 -1H- 吡啶 -4- 酮。ESI-MS[M+H]+229/231.0。TLC ： Rf ＝ 0.58( 己烷 /DCM 7 ∶ 3)
     实施例 73 ： (S)- 吡咯烷 -1， 2- 二甲酸 2- 酰胺 1-({5-[2-(2- 氟 -1， 1- 二甲基 - 乙
     基 )- 吡啶 -4- 基 ]-4- 甲基 - 噻唑 -2- 基 }- 酰胺 )
    按照实施例 1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但进行如下修改。在实施例 1 中， 将反应混合物在室温下搅拌 6 小时。在步骤 1.1 中， 将反应混合物在回流下搅拌 15 小 时。在步骤 1.2 中， 将反应混合物在 100℃下搅拌 1 小时， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步 骤 1.3 中， 将反应混合物在 120℃下搅拌 4 小时。在步骤 1.4 中， 将反应混合物在 85℃下搅 拌 30 分钟， 并在猝灭后用 EtOAc 萃取。在步骤 1.5 中， 将反应混合物在 70℃下搅拌 1 小时， 不进行在 MeOH 中的研磨。在步骤 1.6 中， 粗产物不再纯化。在步骤 1.7 中， 使用 3- 氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酰氯 ( 步骤 76.1)。
     标题化合物 ： ESI-MS ： 406.1[M+H]+ ； tR ＝ 2.20min( 系统 1) ； TLC ： Rf ＝ 0.47(DCM/ MeOH， 9 ∶ 1)。
     步骤 73.1 ： 3- 氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酰氯
    
    按照步骤 5.1 中所述类似的方法制备标题化合物， 但使用 3- 氟 -2， 2- 二甲基 - 丙 酸 ( 步骤 73.2)。
     步骤 73.2 ： 3- 氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酸
    
    将 6.9g(38.6mmol)3- 氟 -2， 2- 二 甲 基 - 丙 酸 甲 酯 在 30mL 甲 醇 中 的 溶 液 用 38.6mL(77mmol) 的 2N NaOH 处理， 并将该混合物加热至回流持续 3 小时。将该混合物冷却 至室温， 并蒸发溶剂。将残余物在水和 DCM 之间分配。将水相通过加入 50mL 的 2N HCl 酸 化， 并用乙酸乙酯萃取。将有机相用盐水洗涤， 用硫酸钠干燥并蒸发。无色残余物用己烷搅 拌， 过滤除去不溶物， 蒸发滤液得到标题化合物， 为无色固体。ESI-MS ： 119.0[M-H]-。
     步骤 73.3 ： 3- 氟 -2， 2- 二甲基 - 丙酸甲酯
    
    将 27mL 的 1M 四 丁 基 氟 化 铵 在 THF 中 的 溶 液 在 冰 冷 却 下 缓 慢 加 入 7.25g(27.4mmol) 的 2， 2- 二甲基 -3- 三氟甲磺酰基氧基 - 丙酸甲酯在 150mL 的 THF 中的溶 液。将所得溶液在 0℃下搅拌 6 小时， 并随后在室温下搅拌 10 小时。小心蒸发溶剂， 并将残余物在 DCM 和盐水之间分配。将有机相用盐水洗涤， 用硫酸钠干燥并小心蒸发。将褐色油 状物在 Kugelrohr 炉 ( 炉温 120-150℃ ) 中蒸馏， 得到标题化合物， 为无色液体。
     步骤 73.4 ： 2， 2- 二甲基 -3- 三氟甲磺酰基氧基 - 丙酸甲酯
    在 -70 ℃ 下 在 氩 气 中 向 3.64g(27.5mmol)3- 羟 基 -2， 2- 二 甲 基 - 丙 酸 甲 酯 和 4.82mL(41.3mmol)2， 6- 二甲基吡啶在 50mL 无水 DCM 的溶液中缓慢加入三氟甲磺酸酐 (5.12mL， 30.3mmol)。将该黄色溶液在 -70℃下搅拌 5 分钟， 随后移去冷却浴， 并将该混合 物在室温下搅拌 3 小时。颜色从黄色变为橙色再变为褐色。加入 DCM(50mL)， 并将该溶液 用 2N HCl 洗涤两次， 用硫酸钠干燥并蒸发至干。将该褐色残余物真空干燥， 且该标题化合 物不经进一步纯化直接使用。TLC ： Rf ＝ 0.72(EtOAc/ 己烷 1 ∶ 2)。
     分析型 HPLC 条件 ：
     5 分钟内线性梯度 20-100 ％溶剂 A+1.5 分钟 100 ％溶剂 A ； 在 215nm 检测， 流速 1mL/min， 于 30℃下。柱 ： Nucleosil 100-3C18(70x4.0mm)。溶剂 A ＝ CH3CN+0.1％ TFA ； 溶 剂 B ＝ H2O+0.1％ TFA。
     MS 条件 ：
     仪器 ： Micromass Platform II， 洗脱剂 ： 15％甲醇水溶液， 包含 0.2％的 25％氢氧 化铵溶液。 1
     H-NMR 波谱在 Varian Mercury 400 波谱仪上在指定溶剂中检测。缩写 ： br ： 宽； s： 单峰 ； d： 双峰 ； t： 三重峰 ； q： 四重峰 ； ppm ： 百万分之
     HPLC/MS 条件 ：
     仪器 ： Hewlett Packard Agilent 1100 系 列， 柱： XBridgeTM C182.5 微 米， 3.0X 30mm， 温度 ： 50℃， 洗脱剂 ： 2 通道系统 ： 通道 A 5％乙腈的水溶液， 通道 B 包含 1.0％甲酸的 乙腈
    
    检测 ： Agilent 1100DAD 210-350nm 和 Waters Micromass ZQ 2000ESI+ 和 ESI-。
     制备型 HPLC ：
     仪器 ： Gilson 制备型 HPLC 系统， 柱： SunfireTM Prep C18OBDTM 5 微米， 30X 100mm， 温度 ： 25 ℃， 洗脱剂 ： 20 分钟内， 在 0.05 ％三氟乙酸水溶液中的 5-100 ％乙腈梯度， 流速 ： 30ml/ 分钟， 检测 ： UV 254nm。
     缩写和首字母缩写 ：
    实施例 A ： 作为 PI3 激酶抑制剂的效能PI3K KinaseGlo 试验 ： 将 50nL 化合物稀释液分配在黑色 384 孔小体积非结合苯 乙烯 (NBS) 板 ( 卡西达 (Costar) 公司， 目录号 NBS#3676) 上。将作为 10mg/ml 溶液 ( 在甲 醇中 ) 提供的 L-a- 磷脂酰肌醇 (PI) 转移到玻璃管中， 在氮气流下干燥。然后通过涡旋将 其重新混悬在 3％辛基葡糖苷 (OG) 中， 于 4℃贮存。KinaseGlo 发光激酶检测试剂盒 ( 普洛 麦格 (Promega) 公司， 麦迪逊 /WI， 美国 ) 是通过对在激酶反应后溶液中剩余的 ATP 的量进 行定量来测定激酶活性的均一的 HTS 方法。
     加入 5μL PI/OG 与 PI3K 亚型的混合物 ( 表 1)。加入 5μl ATP 混合物 ( 在 10μL 终体积中含有 10mM TRIS-HCl pH7.5、 3mM MgCl2、 50mM NaCl、 0.05％ CHAPS、 1mM DTT 和 1μM ATP) 使激酶反应开始， 这些反应于室温进行。用 10μl KinaseGlo 使反应终止， 10 分钟后 在 Synergy2 读数器中使用 0.1 秒 / 孔的积分时间对板进行读数。 将 2.5μM 全种类 1PI3 激 酶抑制剂 ( 标准品 ) 加入到试验板中， 产生对激酶反应的 100％抑制， 溶剂载体 (90％ DMSO， 在水中 ) 给出了 0％抑制。使用标准品作为参考化合物， 并且在所有试验板中以 16 个稀释 点的形式包括标准品， 一式两份。
     表 1 使用 KinaseGlo 的 PI3K ： 试验条件和试剂方案
    PI3K 的克隆
     PI3Kα、 PI3Kβ 和 PI3Kδ 构建体是 p85αiSH2 结构域与各自的 p110 同工型的融 合体。通过 PCR、 由第一链 cDNA( 通过 RT-PCR 由市售的来自胎盘、 睾丸和脑的 RNA 产生 ) 按照下述方法产生了 p85α 片段和 p110 同工型基因。PI3Kγ 构建体获自罗杰· 威廉斯 (Roger Williams) 实验室 ( 分子生物学 MRC 实验室， 剑桥， 英国 )(2003 年 11 月 )， 并且有 描述 (Pacold， MichaelE. ； Suire， Sabine ； Perisic， Olga ； Lara-Gonzalez， Samuel ； Davis， Colin T. ； Walker， Edward H. ； Hawkins， Phillip T. ； Stephens， Len ； Eccleston， JohnF. ； Williams， Roger L.Crystal structure and functional analysis of Rasbinding to its effector phosphoinositide 3-kinase gamma.Cell(2000)， 103(6)， 931-943)。
     PI3Kα 构建体和蛋白质
    
     PI3Kαwt BV1075 p85iSH2(461-568)-GGGGGGGGGGGG-p110α(21-1068)-HisBV1075 ： 用于杆状病毒 BV-1075 的构建体由三部分连接物产生， 所述的三部分连 接物由克隆到载体 pBlueBac4.5 中的 p85 片段和 p110α 片段组成。p85 片段获自用 Nhe/ Spe 消化的质粒 p1661-2。获得的 p110α 片段是克隆， 其通过测序被证实并且作为 SpeI/ HindIII 片段用在 LR410 中。为了产生杆状病毒表达载体 LR410， 使用 Gateway LR 反应将 插入物转移到 Gateway 接头的 pBlueBac4.5( 英杰 (Invitrogen) 公司 ) 载体中。将克隆载 体 pBlueBac4.5( 英杰公司 ) 用 Nhe/HindIII 消化。这产生了构建体 PED 153.8。通过 PCR、 使用作为模板的 ORF 318( 上文所述 ) 以及一个正向引物 KAC1028(5’ -GCTAGCATGCGAGAATA TGATAGAT-TATATGAAG-AATATACC)(SEQ ID NO ： 1) 和两个反向引物 KAC1029 ： (5’ -GCCTCCACC AC-CTCCGCCTG-GTTTAATGCTGTTCATACGTTTGTC)(SEQ IDNO ： 2) 和 KAC1039(5′ -TACTAGTC-CGC CTCCAC-CACCTCCGCCTCCACCACCTCCGCC)(SEQ ID NO ： 3) 产生了 p85 组分 (iSH2)。两个反向 引物重叠， 将 12×Gly 连接子和 p110α 基因的 N- 末端序列引入 SpeI 位点。12×Gly 连接 子取代了 BV1052 构建体中的一个 Gly 连接子。PCR 片段被克隆到 pCR2.1TOPO( 英杰公司 ) 中。在所得克隆中， 通过测序确定了 p1661-2 是正确的。将该质粒用 Nhe 和 SpeI 消化， 将 所得片段进行凝胶分离和纯化以进行亚克隆。
     通过将克隆 LR410( 见上 ) 用 Spe I 和 HindIII 进行酶消化而产生了 p110α 克隆 片段。SpeI 位点在 p110α 基因的编码区内。将所得片段进行凝胶分离和纯化以进行亚克 隆。通过用 Nhe 和 HindIII 进行酶消化而制得克隆载体 pBlueBac4.5( 英杰公司 )。将切 割的载体用凯杰公司 (Qiagen) 柱进行纯化， 然后用小牛肠碱性磷酸酶 (CIP)( 生物实验室 公司 (BioLabs)) 脱磷酸。CIP 反应完成后， 将切割的载体再次进行柱纯化， 产生最终载体。 使用罗氏公司 (Roche) 快速连接酶和销售商说明书进行了三部分连接。通过测序证实了最 终质粒。
     激酶结构域。
     BV 1075 的蛋白质序列 ：
     1 MREYDRLYEE YTRTSQEIQM KRTAIEAFNE TIKIFEEQCQ TQERYSKEYI EKFKREGNEK
     61 EIQRIMHNYD KLKSRISEII DSRRRLEEDL KKQAAEYREI DKRMNSIKPG GGGGGGGGGG
     121 GLVECLLPNG MIVTLECLRE ATLITIKHEL FKEARKYPLH QLLQDESSYI FVSVTQEAER
     181 EEFFDETRRL CDLRLFQPFL KVIEPVGNRE EKILNREIGF AIGMPVCEFD MVKDPEVQDF
     241 RRNILNVCKE AVDLRDLNSP HSRAMYVYPP NVESSPELPK HIYNKLDKGQ IIVVIWVIVS
     301 PNNDKQKYTL KINHDCVPEQ VIAEAIRKKT RSMLLSSEQL KLCVLEYQGK YILKVCGCDE
     361 YFLEKYPLSQ YKYIRSCIML GRMPNLMLMA KESLYSQLPM DCFTMPSYSR RISTATPYMN
     421 GETSTKSLWV INSALRIKIL CATYVNVNIR DIDKIYVRTG IYHGGEPLCD NVNTQRVPCS
     481 NPRWNEWLNY DIYIPDLPRA ARLCLSICSV KGRKGAKEEH CPLAWGNINL FDYTDTLVSG
     541 KMALNLWPVP HGLEDLLNPI GVTGSNPNKE TPCLELEFDW FSSVVKFPDM SVIEEHANWS
     601 VSREAGFSYS HAGLSNRLAR DNELRENDKE QLKAISTRDP LSEITEQEKD FLWSHRHYCV
     661 TIPEILPKLL LSVKWNSRDE VAQMYCLVKD WPPIKPEQAM ELLDCNYPDP MVRGFAVRCL
     721 EKYLTDDKLS QYLIQLVQVL KYEQYLDNLL VRFLLKKALT NQRIGHFFFW HLKSEMHNKT
     781 VSQRFGLLLE SYCRACGMYL KHLNRQVEAM EKLINLTDIL KQEKKDETQK VQMKFLVEQM
     841 RRPDFMDALQ GFLSPLNPAH QLGNLRLEEC RIMSSAKRPL WLNWENPDIM SELLFQNNEI
     901 IFKNGDDLRQ DMLTLQIIRI MENIWQNQGL DLRMLPYGCL SIGDCVGLIE VVRNSHTIMQ97102149711 A CN 102149713
    
    
    
    
    
     PI3Kβ
     BV949说明书YDAAIDLFTR ERVPFVLTQD MPELQSFDDI LGGAHHHHHH89/100 页961 IQCKGGLKGA LQFNSHTLHQ 1021 NIMVKDDGQL FHIDFGHFLD 1081 FQEMCYKAYL AIRQHANLFI 1141 MKQMNDAHHG GWTTKMDWIF PI3Kβ 构建体和蛋白质WLKDKNKGEI HKKKKFGYKR NLFSMMLGSG HTIKQHALNESCAGYCVATF ILGIGDRHNS FLIVISKGAQ ECTKTREFER AYIRKTLALD KTEQEALEYF (SEQID NO ： 4)p85iSH2(461-N58K-568)-GGGGGG-p110β(2-1070)-HisBV949 ： 通过重叠 PCR 产生和融合了用于 p85PI3Kα、 PI3Kβ 和 PI3Kδ 亚基的 inter SH2 结构域 (iSH2) 以及用于全长 p110β 亚基的 PCR 产物。由第一链 cDNA( 通过 RT-PCR 由市售的来自胎盘、 睾丸和脑的人 RNA( 克隆技术公司 (Clontech) 产生 )， 起初使用 引物 gwG130-p01(5’ -CGAGAATATGATAGATTATATGAAGAAT-3’ )(SEQ ID NO ： 5) 和 gwG130-p02 (5’ -TGGTTT-AATGCTGTTCATACGTTTGTCAAT-3’ )(SEQ ID NO ： 6) 获得了 iSH2PCR 产物。随后， 在第二次 PCR 反应中， 分别在 p85iSH2 片段的 5’ 端和 3’ 端、 使用引物 gwG130-p03(5-GGGA CAAGTT-TGTACAAAAAAGCAGGCTACGAAGGAGATATACATATGCGAGAATATGATAGATTATATGAAGAAT-3’ ) (SEQ ID NO ： 7) 和 gwG130-p05(5’ -ACTGAAGCATCCTCCTC-CTCCTCCT-CCTGGTTTAATGCTGTTCA TACGTTTGTC-3’ )(SEQ ID NO ： 8) 加入 Gateway 重组 AttB1 位点和连接子序列。通过 PCR、 使用作为模板的 p110β 克隆 ( 来自未知来源， 其序列已被证实 )， 使用含有连接子序列和 p110β 的 5’ 端的引物 gwG130-p04(5’ -ATTAAACCAGGAGGAGGAGGAGGAGGATGCTT-CAGTTTCATA ATGCCTCCTGCT -3’ )(SEQ ID NO ： 9) 和含有与组氨酸标记融合的 p110-β 的 3’ 端序列的 ) gwG130-p06(5’ -AGCTCCGTGATGGTGATGGTGATGTGCTCCAGATC-TGTAGTCTTTCCGAA-CTGTGTG-3’ (SEQ ID NO ： 10) 得到了 p110β 片段。通过重叠 PCR、 在 iSH2 片段的 3’ 端和 p110β 片段 的 5’ 端进行的连接子反应， 使用上述 gwG130-p03 引物以及含有重叠的组氨酸标记和 AttB2 重组序列的引物 ： (5’ -GGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAAGCTCCGTGATGGTGATGGTGATGTGC TCC-3’ )(SEQ ID NO ： 11) 组建了 p85-iSH2/p110β 融合蛋白。该终产物在 Gateway( 英杰 公司 )OR 反应中被重组到供体载体 pDONR201( 英杰公司 ) 中， 产生 ORF253 输入克隆。通过 测序证实了该克隆， 其用于 Gateway LR 反应 ( 英杰公司 )， 使插入物转移到 Gateway 接头的 pBlueBac4.5( 英杰公司 ) 载体中， 以产生杆状病毒表达载体 LR280。该 LR280 具有 p85 序 列中的氨基酸突变。
     激酶结构域。
     BV949 的蛋白质序列 ：
     1 MREYDRLYEE YTRTSQEIQM KRTAIEAFNE TIKIFEEQCQ TQERYSKEYI EKFKREGKEK
     61 EIQRIMHNYD KLKSRISEII DSRRRLEEDL KKQAAEYREI DKRMNSIKPG GGGGGCFSFI
     121 MPPAMADILD IWAVDSQIAS DGSIPVDFLL PTGIYIQLEV PREATISYIK QMLWKQVHNY
     181 PMFNLLMDID SYMFACVNQT AVYEELEDET RRLCDVRPFL PVLKLVTRSC DPGEKLDSKI
     241 GVLIGKGLHE FDSLKDPEVN EFRRKMRKFS EEKILSLVGL SWMDWLKQTY PPEHEPSIPE
    
    
    301 NLEDKLYGGK LIVAVHFENC QDVFSFQVSP NMNPIKVNEL AIQKRLTIHG KEDEVSPYDY 361 VLQVSGRVEY VFGDHPLIQF QYIRNCVMNR ALPHFILVEC CKIKKMYEQE MIAIEAAINR 421 NSSNLPLPLP PKKTRIISHV WENNNPFQIV LVKGNKLNTE ETVKVHVRAG LFHGTELLCK98102149711 A CN 102149713
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
     PI3Kγ
     BV950说明书MARLCFAVYA IILHSWSSFP EIASSDSANV LLSIKWNKLE QYLLQLVQVL AYCRGSVGHM DLQSPLNPCV LQMLRLMDLL NKDALLNWLK DFGHILGNFK GNLFITLFAL VNWMAHTVRK90/100 页481 TIVSSEVSGK NDHIWNEPLE 541 TIRKAGKVHY PVAWVNTMVF 601 NATALHVKFP ENKKQPYYYP 661 LSQLCENEMD LIWTLRQDCR 721 LELLDFNYPD QYVREYAVGC 781 NRRIGQFLFW HLRSEVHIPA 841 KLNAVKLNRA KGKEAMHTCL 901 WLVYNNKVFG EDSVGVIFKN 961 RSGLIEVVST SETIADIQLN 1021 GYCVASYVLG IGDRHSDNIM 1081 VIQQGKTGNT EKFGRFRQCC 1141 SLALGKSEEE ALKQFKQKFD (SEQ ID NO ： 12) 激酶结构域。 PI3Kγ 构建体和蛋白质FDINICDLPR DFKGQLRTGD PFDKIIEKAA EIFPQSLPKL LRQMSDEELS VSVQFGVILE KQSAYREALS GDDLRQDMLT SSNVAAAAAF VKKTGQLFHI EDAYLILRRH EALRESWTTKVLDKVKTKKS TKTINPSKYQ DELEEMLNPM GTVQTNPYTE SSRGGKKFLP VLKEILDRDP DVAQLQALLQ IWPKLPPREA KYEPFLDCAL SRFLLERALG KVLSKQVEAL NKLKTLNSLI ILSELYVEKC KYMDSKMKPL WKEAGLDLRM LPYGCLATGD EYNSGDDLDR AIEEFTLSCA SKFGIKRERV PFILTYDFIH MLTAGLPELT SVKDIQYLKD DYRSGAHHHH HHGAp110γ(Δ143-[Met144-1102])-His构建体获自罗杰·威廉斯实验室 ( 分子生物学 MRC 实验室， 剑桥， 英国 )(2003 年 11 月 )。构建体在 (Pacold， Michael E. ； Suire， Sabine ； Perisic， Olga ； Lara-Gonzalez， Samuel ； DaVis， Colin T. ； Walker， Edward H. ； Hawkins， Phillip T. ； Stephens， Len ； Eccleston， John F. ； Williams， Roger L.Crystal structure and functional analysis of Ras binding to its effectorphosphoinositide 3-kinase gamma.Cell(2000)， 103(6)， 931-943) 中有描述。构建体缺少 N- 末端 144 氨基酸。
     BV950 的蛋白质序列 ：
     1 MSEESQAFQR QLTALIGYDV TDVSNVHDDE LEFTRRGLVT PRMAEVASRD PKLYAMHPWV
     61 TSKPLPEYLW KKIANNCIFI VIHRSTTSQT IKVSPDDTPG AILQSFFTKM AKKKSLMDIP
     121 ESQSEQDFVL RVCGRDEYLV GETPIKNFQW VRHCLKNGEE IHVVLDTPPD PALDEVRKEE
     181 WPLVDDCTGV TGYHEQLTIH GKDHESVFTV SLWDCDRKFR VKIRGIDIPV LPRNTDLTVF
     241 VEANIQHGQQ VLCQRRTSPK PFTEEVLWNV WLEFSIKIKD LPKGALLNLQ IYCGKAPALS
     301 SKASAESPSS ESKGKVRLLY YVNLLLIDHR FLLRRGEYVL HMWQISGKGE DQGSFNADKL
     361 TSATNPDKEN SMSISILLDN YCHPIALPKH QPTPDPEGDR VRAEMPNQLR KQLEAIIATD
     421 PLNPLTAEDK ELLWHFRYES LKHPKAYPKL FSSVKWGQQE IVAKTYQLLA RREVWDQSAL
     481 DVGLTMQLLD CNFSDENVRA IAVQKLESLE DDDVLHYLLQ LVQAVKFEPY HDSALARFLL
     541 KRGLRNKRIG HFLFWFLRSE IAQSRHYQQR FAVILEAYLR GCGTAMLHDF TQQVQVIEML
     601 QKVTLDIKSL SAEKYDVSSQ VISQLKQKLE NLQNSQLPES FRVPYDPGLK AGALAIEKCK
    
    
    661 VMASKKKPLW LEFKCADPTA LSNETIGIIF KHGDDLRQDM LILQILRIME SIWETESLDL 721 CLLPYGCIST GDKIGMIEIV KDATTIAKIQ QSTVGNTGAF KDEVLNHWLK EKSPTEEKFQ 781 AAVERFVYSC AGYCVATFVL GIGDRHNDNI MITETGNLFH IDFGHILGNY KSFLGINKER841 VPFVLTPDFL FVMGTSGKKT SPHFQKFQDI CVKAYLALRH HTNLLIILFS MMLMTGMPQL 901 TSKEDIEYIR DALTVGKNEE DAKKYFLDQI EVCRDKGWTV QFNWFLHLVL GIKQGEKHSA 961 HHHHHH (SEQ ID NO ： 13) PI3Kδ 构建体和蛋白质p55iSH2(461-568)-GGGGGG-p110δ(2-1044)-HisBV1060 ： 通过重叠 PCR 产生和融合了用于 p85 亚基的 inter SH2 结构域 (iSH2) 以及用于全长 p110δ 亚基的 PCR 产物。通过使用作为模板的 ORF318( 见上 ) 以及引物 g wG130-p03(5’ -GGGACAAGTT-TGTACAAAAAAGCAGGCTACGAAGGAGATATACATATGCGAGAATATGATAGAT TATATGAAGAAT-3’ )(SEQ ID NO ： 7) 和 gwG154-p04(5’ -TCCTCCTCCT-CCTCCTCCTGGTTTAATGCT GTTCATACGTTTGTC-3’ )(SEQ ID NO ： 14) 产生 iSH2PCR 产物。由第一链 cDNA( 通过 RT-PCR 由市售的来自胎盘、 睾丸和脑的人 RNA( 克隆技术公司 ) 产生 )、 首先使用引物 gwG154-p0 1(5’ -ATGCCCCCTGGGGTGGACTGCCCCAT-3’ )(SEQ ID NO ： 15) 和 gwG154-p02(5’ -CTACTGCCTG T-TGTCTTTGGACACGT-3’ )(SEQ ID NO ： 16) 获得 p110δ 片段。在随后 PCR 反应中， 分别在 p110δ 片段的 5’端和 3’端、 用引物 gw154-p03(5’ -ATTAAACCAGGAGGAGGAGGAGGAGGACCCC CTGGGGTGGAC-TGCCCCATGGA-3’ )(SEQ ID NO ： 17) 和 gwG154-p06(5’ -AGCTCCGTGATGGTGATGG TGAT-GTGCT-CCCTGCCTGTTGTCTTTGGACACGTTGT-3’ )(SEQ ID NO ： 18) 加入连接子序列和组氨 酸标记。在第三次 PCR 反应中， 通过 iSH2 片段的 3’ 端和 p110δ 片段的 5’ 端的重叠连接 子、 使用以上提到的 gwG130-p03 引物以及含有重叠的组氨酸标记和 Gateway( 英杰公司 ) AttB2 重组序列的引物 (5’ -GGG-ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAA-GCTCCGTGATGGTGATGGT GAGTGCTCC-3’ )(SEQ ID NO ： 19) 组装了 p85-iSH2/p110δ 融合蛋白。该终产物在 Gateway OR 反应中被重组到供体载体 pDONR201( 英杰公司 ) 中， 产生 ORF319 输入克隆。通过测序 证实了该克隆， 其用于 Gateway LR 反应 ( 英杰公司 ) 中， 使插入物转移到 Gateway 接头的 pBlueBac4.5( 英杰公司 ) 载体中， 以产生杆状病毒表达载体 LR415。
     BV1060 的蛋白质序列 ：
     1 MREYDRLYEE YTRTSQEIQM KRTAIEAFNE TIKIFEEQCQ TQERYSKEYI EKFKREGNEK
     61 EIQRIMHNYD KLKSRISEII DSRRRLEEDL KKQAAEYREI DKRMNSIKPG GGGGGPPGVD
     121 CPMEFWTKEE NQSVVVDFLL PTGVYLNFPV SRNANLSTIK QLLWHRAQYE PLFHMLSGPE
     181 AYVFTCINQT AEQQELEDEQ RRLCDVQPFL PVLRLVAREG DRVKKLINSQ ISLLIGKGLH
     241 EFDSLCDPEV NDFRAKMCQF CEEAAARRQQ LGWEAWLQYS FPLQLEPSAQ TWGPGTLRLP
     301 NRALLVNVKF EGSEESFTFQ VSTKDVPLAL MACALRKKAT VFRQPLVEQP EDYTLQVNGR
     361 HEYLYGSYPL CQFQYICSCL HSGLTPHLTM VHSSSILAMR DEQSNPAPQV QKPRAKPPPI
     421 PAKKPSSVSL WSLEQPFRIE LIQGSKVNAD ERMKLVVQAG LFHGNEMLCK TVSSSEVSVC
     481 SEPVWKQRLE FDINICDLPR MARLCFALYA VIEKAKKARS TKKKSKKADC PIAWANLMLF
    
    
    541 DYKDQLKTGE RCLYMWPSVP DEKGELLNPT GTVRSNPNTD SAAALLICLP EVAPHPVYYP 601 ALEKILELGR HSECVHVTEE EQLQLREILE RRGSGELYEH EKDLVWKLRH EVQEHFPEAL 661 ARLLLVTKWN KHEDVAQMLY LLCSWPELPV LSALELLDFS FPDCHVGSFA IKSLRKLTDD721 ELFQYLLQLV QVLKYESYLD CELTKFLLDR ALANRKIGHF LFWHLRSEMH VPSVALRFGL
     781 ILEAYCRGST HHMKVLMKQG EALSKLKALN DFVKLSSQKT PKPQTKELMH LCMRQEAYLE
     841 ALSHLQSPLD PSTLLAEVCV EQCTFMDSKM KPLWIMYSNE EAGSGGSVGI IFKNGDDLRQ
     901 DMLTLQMIQL MDVLWKQEGL DLRMTPYGCL PTGDRTGLIE VVLRSDTIAN IQLNKSNMAA
     961 TAAFNKDALL NWLKSKNPGE ALDRAIEEFT LSCAGYCVAT YVLGIGDRHS DNIMIRESGQ
     1021 LFHIDFGHFL GNFKTKFGIN RERVPFILTY DFVHVIQQGK TNNSEKFERF RGYCERAYTI
     1081 LRRHGLLFLH LFALMRAAGL PELSCSKDIQ YLKDSLALGK TEEEALKHFR VKFNEALRES
     1141 WKTKVNWLAH NVSKDNRQEL GGAHHHHHH
     (SEQ ID NO ： 20)
     PI3Kα、 PI3Kβ 和 PI3Kγ 构建体的纯化
     以两个色谱步骤纯化了 PI3Kα、 PI3Kβ 和 PI3Kγ ： 在 Ni 琼脂糖树脂 ( 通用电气 公司医疗保健部 (GE Healthcare)) 上进行固定化金属亲和层析 (IMAC) 以及采用 Superdex 20026/60 柱 ( 通用电气公司医疗保健部 ) 进行凝胶过滤。将所有缓冲液冷却至 4℃， 在冰 上冷却下进行裂解。于室温进行柱分级分离。除了以下描述的那些外， 用于纯化 PI3Kβ 的 所有缓冲液还含有 0.05％ Triton X100。
     通常， 将来自 10L Tn5 细胞培养物的冷冻细胞重新混悬在 “裂解缓冲液” (20mM Tris-Cl， pH7.5， 500mM NaCl， 5％甘油， 5mM 咪唑， 1mM NaF， 0.1ug/mL 冈田酸 (OAA)， 5mM BME， 1× 完全蛋白酶抑制剂混合物 - 不含 EDTA(20 片 /1L 缓冲液， 罗氏应用科学公司 (Roche Applied Sciences))， benzonase(25U/mL 缓冲液， EMD 生物科学公司 (EMD Biosciences)) ( 片状物 (pellet) 与裂解缓冲液的比例为 1 ： 6v/v)) 中， 通过使用紧密契合的研棒冲击 20 次而进行机械裂解。于 45,000g 将裂解物离心 30 分钟， 将上清液装到预平衡的 IMAC 柱上 (3mL 树脂 /100mL 裂解物 )。将柱用 3-5 个柱体积的裂解缓冲液冲洗， 然后用 3-5 个柱体 积的 20mM Tris-Cl， pH7.5， 500mMNaCl， 5％甘油， 45mM 咪唑， 1mM NaF， 0.1μg/mL OAA， 5mM BME， 1× 完全蛋白酶抑制剂混合物 - 不含 EDTA 进行第二次冲洗。 将蛋白质用 20mMTris-Cl， pH7.5， 0.5M NaCl， 5％甘油， 250mM 咪唑， 1mM NaF， 0.1μg/mLOAA， 5mM BME， 1× 完全蛋白酶 抑制剂混合物 - 不含 EDTA 进行洗脱。将有关流分通过 SDS-PAGE 进行分析， 从而将其合并。 通过在 Superdex20026/60 柱 ( 用 20mM Tris-Cl， pH7.5， 0.5M NaCl， 5％甘油， 1mM NaF， 5mM DTT， 1× 完全蛋白酶抑制剂混合物 - 不含 EDTA 进行平衡 ) 上进行凝胶过滤而将蛋白质进 一步纯化。将有关流分通过 SDS-PAGE 进行分析， 从而将其合并。将等体积的透析缓冲液 (20mM Tris-Cl， pH7.5， 500mM NaCl， 50％甘油， 5mM NaF， 5mM DTT) 加入到合并物中， 然后通 过透析缓冲液进行透析， 其间更换两次 ( 一次更换过夜 )。将蛋白质于 -20℃贮存。
     PI3Kδ 的纯化
     以三个色谱步骤纯化了 PI3Kδ ： 在 Ni 琼脂糖树脂 ( 通用电气公司医疗保健部 ) 上 进行固定化金属亲和层析， 采用 Superdex 20026/60 柱 ( 通用电气公司医疗保健部 ) 进行 凝胶过滤， 最后在 Q-HP 柱 ( 通用电气公司医疗保健部 ) 上进行离子交换步骤。将所有缓冲 液冷却至 4℃， 在冰上冷却进行裂解。于室温进行柱分级分离。
     通常， 将来自 10L Tn5 细胞培养物的冷冻细胞重新混悬在 “裂解缓冲液” (20mM Tris-Cl， pH7.5， 500mM NaCl， 5 ％ 甘 油， 5mM 咪 唑， 1mM NaF， 0.1μg/mL 冈 田 酸 (OAA)， 5mM BME， 1× 完全蛋白酶抑制剂混合物 - 不含 EDTA(20 片 /1L 缓冲液， 罗氏应用科学公司 )，benzonase(25U/mL 裂 解 缓 冲 液， EMD 生 物 科 学 公 司 )( 片 状 物 与 裂 解 缓 冲 液 的 比 例 为 1 ∶ 10v/v)) 中， 通过使用紧密契合的研棒冲击 20 次进行机械裂解。于 45,000g 将裂解物 离心 30 分钟， 将上清液装到预平衡的 IMAC 柱上 (5mL 树脂 /100mL 裂解物 )。将柱用 3-5 个 柱体积的裂解缓冲液冲洗， 然后用 3-5 个柱体积的 20mMTris-Cl， pH7.5， 500mM NaCl， 5％甘 油， 40mM 咪唑， 1mM NaF， 0.1ug/mLOAA， 5mM BME， 1× 完全蛋白酶抑制剂混合物 - 不含 EDTA 进行第二次冲洗。将蛋白质用 20mM Tris-Cl， pH7.5， 500mM NaCl， 5％甘油， 250mM 咪唑， 1mM NaF， 0.1μg/mL OAA， 5mM BME， 1× 完全蛋白酶抑制剂混合物 - 不含 EDTA 进行洗脱。将有 关流分通过 SDS-PAGE 进行分析， 从而将其合并。通过在 Superdex 200( 用 20mM Tris-Cl， pH7.5， 500mM NaCl， 5％甘油， 1mM NaF， 0.1ug/mL OAA， 5mM DTT， 1× 完全蛋白酶抑制剂混 合物 - 不含 EDTA 进行平衡 ) 上进行凝胶过滤而将蛋白质进一步纯化。将有关流分通过 SDS-PAGE 进行分析， 从而将其合并。将这些流分用 “缓冲液 A” (20mM Tris-Cl， pH8.2， 5％ 甘油， 1mM NaF， 0.1μg/mL OAA， 5mM DTT) 稀释 ( 合并物体积与缓冲液的比例为 1 ∶ 10v/ v)， 装到制备的 Q-HP 柱上。样品装载完成后， 我们用 3-5 个柱体积的缓冲液 A 和 5％ “缓冲 液 B” (20mMTris-Cl， pH8.2， 1M NaCl， 5％甘油， 1mM NaF， 0.1ug/mL OAA， 5mM DTT) 进行了冲 洗。我们使用缓冲液 B 的 5％ -30％梯度洗脱了蛋白质。通常， 以～ 200mM NaCl 洗脱出蛋 白质。将有关流分通过 SDS-PAGE 进行分析， 从而将其合并。将等体积的透析缓冲液 (20mM Tris-Cl， pH7.5， 500mM NaCl， 50％甘油， 1mM NaF， 0.1μg/mL OAA， 5mM DTT) 加入到合并物 中， 然后通过透析缓冲液进行透析， 其间更换两次 ( 一次更换过夜 )。将蛋白质于 -20℃贮 存。
     使用上述试验得到以下结果。
    本发明化合物， 特别是本发明优选的化合物对 PI3Kα 相对于 β 和 / 或 δ 和 / 或 γ 亚型 ( 例如在生化实验中检测的亚型 ) 而言显示出增强的选择性。 如细胞实验中所检测 的， 这些化合物还优选地对 PI3Kα 相对于 β 和 / 或 δ 和 / 或 γ 亚型而言显示出选择性。
    
    
    
    实施例 B ： 体外代谢清除率检测 缩写
    最终的检品和蛋白浓度以及孵育时间如下所示 ( 表 1)。 选择低检品浓度以符合下 述假设 ： 在低于 ( 或约等于 )Km 的浓度下评价反应动力学。
     已知 DMSO 对 CYP 活性有抑制作用。因此， 在孵育介质中的 DMSO 浓度被限制为 0.01％ (v/v)， 以使其对代谢过程的干扰最小化。
     表 1 在代谢清除孵育液中的最终的反应组分和浓度
    用来重建 UGT( 尿苷 5’ 二磷酸葡糖醛酸基转移酶 ) 活性所需的最佳成分。
     通常的试验在 96 孔板上在 37℃振荡孵育下进行。体外代谢清除速率根据在 4 个 时间点 ( 例如 0、 5、 15 和 30 分钟 ) 在含有辅因子 (NADPH 和 / 或 UDPGA) 的反应中收集的数 据获得。还进行了 30 分钟的阴性对照孵育 ( 不含辅因子 ) 来评价与 CYP 不相关的稳定性 问题 ( 例如化学不稳定性、 不依赖 CYP 的代谢 )。
     一般而言， 在 10mM DMSO 中的检品被 0.6％ ACN(v/v) 的 DiH2O 溶液 1 ∶ 1000 倍稀 释到 10μM。在即将开始试验之前， 将 1.25mg/mL 的微粒体蛋白悬浮在 50mM KPi 中。为了 评价 UGT- 介导的代谢， 悬浮液可以首先在冰上用阿拉霉素 (25μg/mg 微粒体蛋白 ) 孵育 5
     105a102149711 A CN 102149713说明书97/100 页分钟来进行预处理。将检品 (35μL) 加入 140μL 的微粒体混悬液中得到 175μL 酶 - 底物 混合物。该酶 - 底物混合物在 37℃预孵育 15 分钟。通过将 25μL 酶 - 底物混合物与等体 积的含有 4mM MgCl2 的 50mM KPi 合并来进行 30 分钟的阴性对照孵育。在 37℃孵育 30 分 钟后， 向混合物加入 50μL 含有 MS 内标 (2μM 阿普洛尔 ) 的 ACN 来猝灭。T ＝ 0 分钟的时 间点通过将 25μL 酶 - 底物混合物直接与 50μL 含有 MS 内标 (2μM 阿普洛尔 ) 的 ACN 合 并来进行。将 25μL 的辅因子加入 (2mM NADPH， 在 50mM KPi 中， 添加 4mM MgCl2 ； 任选含有 2mM UDPGA 用于 CYP+UGT 测定 )， 以刺激完全猝灭的反应混合物。
     对其余时间点的全部反应， 通过将 125μL 辅因子溶液 (2mM NADPH， 在 50mM KPi 中， 添加 4mM MgCl2) 加入到剩余 125μL 酶 - 底物混合物中。对于 UGT 代谢， 辅因子溶液 中包含 2mM UDPGA。在特定的反应时间点 ( 例如 5、 15、 30 分钟 ) 上， 取出反应的等份试样 (50μL)， 并加入含有质谱内标 (2μM 阿普洛尔 ) 的乙腈 (50μL) 来终止反应。所有样品都 在～ 3400xg、 在 4℃下离心 10 分钟， 上清液用 LC-MS/MS 分析， 对剩余的检品进行定量。剩 余的 TA 相对于 0 分钟的百分比被用来估计体外消除速率常数 (kmic)， 该常数可用于计算体 外代谢清除率。
     在高效液相色谱 - 串联质谱 (LC/MS) 系统上进行样品分析， 该系统包括 Waters Quattro Premiere 质谱仪、 ESI 离子源、 CTC-HTS Pal 自动进样器和安捷伦 LC 泵。样品在 Atlantic C18 柱 (2.1x30mm， 3.5 微米 ) 上分离， 使用表 2 中所概述的快速流动相。 流动相 A 由含有 10mM 甲酸铵的纯水组成。 流动相 B 由含有 0.01％甲酸的乙腈组成。 流速为 1mL/min。 进样体积为 10μL。 最初 30 秒的洗脱液被弃去， 用于样品净化。 化合物使用软件 MassLynx/ QuanLynx 检测， 其收集所有与供试化合物分子量相关的碎片的强度数据。在收集原始数据 后， 如果需要， 该软件可将最多 3 个质量碎片的曲线合并。通常， 对最大强度的碎片峰进行 积分。
     表 2HPLC 的流动相梯度
    每个微粒体消除速率 kmic 是基于单峰形式测试的 4- 个点的消除曲线。反应板的 LC-MS/MS 原始数据以对于检品和内标的积分的分析物峰面积形式返回。 这些数值可以转换 为分析物 ： 内标的峰面积之比， 以使数据的比较达到标准化。
     将反应时间点 ( 例如 0、 5、 20 或 30 分钟 ) 相对于剩余检品相对 0 分钟的百分比 ( 基于相对的峰面积之比 ) 的自然对数作图。清除曲线的斜率 kmic 用来计算体外半衰期 t1/2， 如方程 (1) 所示。为了集中于线性的反应动力学， 如果可能的话， 一般将代表剩余检 品＜ 10％的数据点排除在清除曲线的斜率限定之外。 该反应的 t1/2 是核心的试验数值， 用 于计算 CLint( 方程 2)
     方程 (1) ： t1/2 ＝ 0.693/-kmic 方程 (2) ： Clint ＝ 0.693/-kmic·V/M 使用上述方法获得以下结果 ：实施例 C ： 在荧光素酶发光试验中测定的 PI3Kα 突变体 E545K 和 H1047R 的抑制
     发光值是早已确立的用来测定 ATP 浓度的读数， 因此可以用来在不考虑其底物的 情况下追踪多种激酶的活性。KinaseGlo 发光激酶检测试剂盒 (Promega， Madison/WI， USA) 是在激酶反应后通过对溶液中剩余的 ATP 定量来测定激酶活性的均一的 HTS 方法。
     磷酸肌醇 3- 激酶在室温下在 50-μi 含有 1μM ATP、 5mM MgCl2、 50mM NaCl、 5μg/ ml 大豆磷脂酰肌醇 (Avanti Polar lipids， 目录号 840044C)、 0.015％八葡糖苷 (Sigma， 目 录号 O9882)、 0.01％ CHAPS、 1mM DTT、 2.5％ DMSO 和 10mM Tris-HCl pH 7.5 的介质中孵育。 激酶反应通过加入 ATP( 酶与抑制剂预孵育 15 分钟 ) 启动， 1 小时后用 50μl Kinase (Promega， 目录号 V6714) 终止， 用 Victor II 读数器 (0.1 秒积分 ) 测定发光度。使用逻辑 方程通过非线性回归来拟合曲线 (X 的模式 205， IDBusiness Solutions， Guildford， 英国 )。
     发光试验的测定原理 (KinaseGlo) ：
    
    使用上述试验系统和使用来自下表显示的构建体的 PI3K 蛋白， 评价了对野生型 和突变型 PI3Kα 的抑制活性。
    
    
    
    结果显示在下表中。 野生型和突变型 PI3Kα 的抑制 ：BV1147 ： 将在许多癌症中发现的激活突变 E545K 使用 QuickChangeXL 诱变试剂 盒 (Stratagene) 通过定点诱变引入 ORF318。使用生产商推荐的方法和突变引物 ： gwG152 -p15(5’ -CTCTCTGAAATCACTAAGCAGGAGAAAGATTTT-3’ )(SEQ ID NO ： 21)， 和 gwG152-p16(5’ AAAATCTTTCT-CCTGCTTAGTGATTTCAGAGAG-3’ )(SEQ ID NO ： 22)， 产生 ORF544。该克隆经测 序验证后， 用于 Gateway LR 反应 (Invitrogen)， 以便将插入片段转移到 Gateway 接头的 pBlueBac4.5(Invitrogen) 载体中， 用于生成杆状病毒表达载体 LR561。
     激酶结构域
     BV 1147 的蛋白序列 ：
     1 MREYDRLYEE YTRTSQEIQM KRTAIEAFNE TIKIFEEQCQ TQERYSKEYI EKFKREGNEK
     61 EIQRIMHNYD KLKSRISEII DSRRRLEEDL KKQAAEYREI DKRMNSIKPG GISGGGGGIM
     121 VLVECLLPNG MIVTLECLRE ATLITIKHEL FKEARKYPLH QLLQDESSYI FVSVTQEAER
     181 EEFFDETRRL CDLRLFQPFL KVIEPVGNRE EKILNREIGF AIGMPVCEFD MVKDPEVQDF
     241 RRNILNVCKE AVDLRDLNSP HSRAMYVYPP NVESSPELPK HIYNKLDKGQ IIVVIWVIVS
     301 PNNDKQKYTL KINHDCVPEQ VIAEAIRKKT RSMLLSSEQL KLCVLEYQGK YILKVCGCDE
     361 YFLEKYPLSQ YKYIRSCIML GRMPNLMLMA KESLYSQLPM DCFTMPSYSR RISTATPYMN
     421 GETSTKSLWV INSALRIKIL CATYVNVNIR DIDKIYVRTG IYHGGEPLCD NVNTQRVPCS
     481 NPRWNEWLNY DIYIPDLPRA ARLCLSICSV KGRKGAKEEH CPLAWGNINL FDYTDTLVSG
     541 KMALNLWPVP HGLEDLLNPI GVTGSNPNKE TPCLELEFDW FSSVVKFPDM SVIEEHANWS
     601 VSREAGFSYS HAGLSNRLAR DNELRENDKE QLKAISTRDP LSEITKQEKD FLWSHRHYCV
     661 TIPEILPKLL LSVKWNSRDE VAQMYCLVKD WPPIKPEQAM ELLDCNYPDP MVRGFAVRCL
     721 EKYLTDDKLS QYLIQLVQVL KYEQYLDNLL VRFLLKKALT NQRIGHFFFW HLKSEMHNKT
     781 VSQRFGLLLE SYCRACGMYL KHLNRQVEAM EKLINLTDIL KQEKKDETQK VQMKFLVEQM
     841 RRPDFMDALQ GFLSPLNPAH QLGNLRLEEC RIMSSAKRPL WLNWENPDIM SELLFQNNEI
     901 IFKNGDDLRQ DMLTLQIIRI MEMIWQNQGL DLRMLPYGCL SIGDCVGLIE VVRNSHTIMQ
     961 IQCKGGLKGA LQFNSHTLHQ WLKDKNKGEI YDAAIDLFTR SCAGYCVATF ILGIGDRHNS
     1021 NIMVKDDGQL FHIDFGHFLD HKKKKFGYKR ERVPFVLTQD FLIVISKGAQ ECTKTREFER
     1081 FQEMCYKAYL AIRQHANLFI NLFSMMLGSG MPELQSFDDI AYIRKTLALD KTEQEALEYF
     1141 MKQMNDAHHG GWTTKMDWIF HTIKQHALNE LGGAHHHHHH (SEQ ID NO ： 23).
     BV1097 ： 将许多癌症中发现的激活突变 H1047R 用 QuickChange XL 诱变试剂盒 (Stratagene) 通过定点诱变引入 ORF318。使用生产商推荐方法和突变引物 ： gwG152-p0 7(5’ -CAAATGAATGATGCACGTCATGGTGGCTGGACA-3’ )(SEQ ID NO ： 24)， 和 gwG152-p11(5’ -TG TCCAGCCA-CCATGACGTGCATCATTCATTTG-3’ )(SE Q ID NO ： 25)， 产生 ORF396。该克隆经测 序验证后， 用于 Gateway LR 反应 (Invitrogen)， 以便将插入片段转移到 Gateway 接头的 pBlueBac4.5(Invitrogen) 载体中， 用于生成杆状病毒表达载体 LR480。
     激酶结构域
     BV 1097 的蛋白序列 ：
     1 MREYDRLYEE YTRTSQEIQM KRTAIEAFNE TIKIFEEQCQ TQERYSKEYI EKFKREGNEK
     61 EIQRIMHNYD KLKSRISEII DSRRRLEEDL KKQAAEYREI DKRMNSIKPG GISGGGGGIM
     121 VLVECLLPNG MIVTLECLRE ATLITIKHEL FKEARKYPLH QLLQDESSYI FVSVTQEAER
     181 EEFFDETRRL CDLRLFQPFL KVIEPVGNRE EKILNREIGF AIGMPVCEFD MVKDPEVQDF
     241 RRNILNVCKE AVDLRDLNSP HSRAMYVYPP NVESSPELPK HIYNKLDKGQ IIVVIWVIVS
     301 PNNDKQKYTL KINHDCVPEQ VIAEAIRKKT RSMLLSSEQL KLCVLEYQGK YILKVCGCDE
     361 YFLEKYPLSQ YKYIRSCIML GRMPNLMLMA KESLYSQLPM DCFTMPSYSR RISTATPYMN
     421 GETSTKSLWV INSALRIKIL CATYVNVNIR DIDKIYVRTG IYHGGEPLCD NVNTQRVPCS
     481 NPRWNEWLNY DIYIPDLPRA ARLCLSICSV KGRKGAKEEH CPLAWGNINL FDYTDTLVSG
     541 KMALNLWPVP HGLEDLLNPI GVTGSNPNKE TPCLELEFDW FSSVVKFPDM SVIEEHANWS [1000] 601 VSREAGFSYS HAGLSNRLAR DNELRENDKE QLKAISTRDP LSEITEQEKD FLWSHRHYCV [1001] 661 TIPEILPKLL LSVKWNSRDE VAQMYCLVKD WPPIKPEQAM ELLDCNYPDP MVRGFAVRCL [1002] 721 EKYLTDDKLS QYLIQLVQVL KYEQYLDNLL VRFLLKKALT NQRIGHFFFW HLKSEMHNKT [1003] 781 VSQRFGLLLE SYCRACGMYL KHLNRQVEAM EKLINLTDIL KQEKKDETQK VQMKFIVEQM [1004] 841 RRPDFMDALQ GFLSPLNPAH QLGNLRLEEC RIMSSAKRPL WLNWENPDIM SELLFQNNEI [1005] 901 IFKNGDDLRQ DMLTLQIIRI MENIWQNQGL DLRMLPYGCL SIGDCVGLIE VVRNSHTIMQ [1006] 961 IQCKGGLKGA LQFNSHTLHQ WLKDKNKGEI YDAAIDLFTR SCAGYCVATF ILGIGDRHNS [1007] 1021 NIMVKDDGQL FHIDFGHFLD HKKKKFGYKR ERVPFVLTQD FLIVISKGAQ ECTKTREFER [1008] 1081 FQEMCYKAYL AIRQHANLFI NLFSMMLGSG MPELQSFDDI AYIRKTLALD KTEQEALEYF [1009] 1141 MKQMNDARHG GWTTKMDWIF HTIKQHALNE LGGAHHHHHH (SEQ ID NO ： 26).109102149711 A CN 102149713
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