富锌灭活乳酸菌微生态制剂及其制备方法 【技术领域】
本发明涉及饲料添加剂领域， 尤其涉及一种富锌灭活乳酸菌微生态制剂及其制备方法。 背景资料
锌是动物的必需元素， 由于其广泛的生理生化功能而被称为 “生命元素” 。锌是 多种酶的组成成份， 它参与机体蛋白质的合成、 脂肪、 碳水化合物和维生素等营养物质的代 谢， 骨骼发育和角质的生成也需要锌的参与 ； 锌还能增强机体免疫力， 提高抗感染能力及促 进创伤愈合。缺锌时， 会导致机体物质代谢紊乱， 影响动物的生长、 免疫等。
目前， 在动物养殖过程中广泛应用的锌的种类有无机锌和有机锌两种。无机锌主 要包括 ： 氧化锌、 硫酸锌和碱式氯化锌等。 在饲料中添加无机锌是一条较为廉价的补充锌元 素途径， 但是其在动物体内的吸收率和生物利用率较低， 且易与其他矿物质元素产生颉颃 作用。有机锌主要包括 ： 络合锌、 有机螯合锌、 蛋白锌和多糖锌复合体等几种。相对于无机 锌， 有机锌作为锌源， 低剂量使用就可以取得高剂量无机锌的补充锌效果。
在各种锌源中， 只有氧化锌对动物幼仔 ( 如仔猪 ) 不仅具有补充锌元素的效用， 而 且还兼具药理作用， 对肠道致病菌具有抑制作用， 达到预防和治疗腹泻的目的。但是， 氧化 锌在动物体内吸收率和生物利用率非常低 ( 约 10％以下 )， 且受胃酸中和作用的影响， 因此 必须高水平添加才能达到明显的效果。研究证明， 在饲料中添加 2500-3500mg/kg 氧化锌 对于促进断奶仔猪生长和预防腹泻具有相当明显的作用， 降低 “断奶综合症” 对断奶仔猪的 影响。 目前， 在养猪业中使用高水平氧化锌主要用于断奶初期的仔猪料， 起防腹泻和促生长 作用 ； 使用低剂量锌时， 通常是用硫酸锌或氨基酸螯合锌， 主要目的是提供生长所需的锌元 素。
目前使用高水平氧化锌的危害已被人们充分认识。高水平氧化锌会导致仔猪 “锌 中毒” ， 并且对仔猪后期生长发育造成负面影响。 其次， 日粮中添加超过正常需要量 20 ～ 30 倍的高水平锌， 必然打破原有各种元素的平衡， 对铜、 铁的吸收不利， 导致动物出现铁、 铜继 发性缺乏， 出现贫血。不仅如此， 若一旦停止添加高水平锌， 更换日粮， 仔猪又会发生腹泻， 原因可能是氧化锌对肠道内的有害菌具抑制作用。
动物对普通氧化锌的生物利用率低， 只可以利用其中的 10％左右， 大部分随粪便 排泄到环境中。辜玉红等 (2004) 研究表明， 饲喂高剂量氧化锌 (3000mg/kg) 通过猪体消化 吸收后， 其每日锌排出量是饲喂基础日粮组的 33 倍。因此， 添加高水平氧化锌会造成资源 浪费和金属残留， 且造成环境不可逆污染。
中华人民共和国农业部发布的第 1224 号公告 《饲料添加剂安全使用规范》 规定， 仔猪断奶后前 2 周配合饲料中氧化锌形式的锌的添加量不超过 2250mg/kg， 这种高锌日粮 只能用于断奶后前 2 周的仔猪。可见， 国家已经进一步限制和规范氧化锌使用 ( 注 ： 已经 废止农业行业标准 “NY 929-2005” 中断奶仔猪前 2 周日粮氧化锌添加量是不超过 3000mg/ kg)。 人们已经意识到使用高水平氧化锌所带来的副作用， 较早地开展了高效锌化合物的研 究和开发， 在饲喂断奶仔猪用中可以替代或减少饲粮中使用普通氧化锌， 并达到与高水平
氧化锌相同的预防腹泻效果。纳米氧化锌便应运而生， 有研究表明， 在饲料可添加 375mg/ kg 纳米氧化锌， 对促进断奶仔猪的生长性能和预防腹泻效果显著， 可以替代高水平氧化锌 (3000mg/kg)， 是一种理想的锌源， 但是纳米氧化锌技术还不成熟， 还需要更深入的研究。 发明内容 为解决上述养殖过程中使用高水平氧化锌带来的问题， 本发明目的在于提供一种 富锌灭活乳酸菌微生态制剂， 可替代普通氧化锌， 从根本上减少断奶仔猪饲料中氧化锌的 使用量， 除有效预防断奶仔猪出现的断奶综合症， 补充生长所需锌元素， 促进生长， 抑制肠 道有害菌和预防下痢， 同时由于氧化锌使用量减少， 可大大降低猪粪便中残留的锌污染环 境的风险。另外， 本发明产品也可以为家禽提供高效锌源。
本发明的第二个目的在于提供一种富锌灭活乳酸菌微生态制剂的制备方法。
为达到上述目的， 本发明采用如下技术方案 ：
一种富锌灭活乳酸菌微生态制剂， 由如下质量配比的组分组成 ： 富锌乳酸菌发酵 产物 30-60 份， 赋形剂 40-70 份 ； 其中富锌乳酸菌发酵产物包括以下组分 ： 灭活乳酸菌细胞 8 10 10 -10 个 /g， 锌元素 0.1-1mg/g， 培养基和水。
所述乳酸菌选自但不限于嗜酸乳杆菌、 唾液乳杆菌、 乳酸乳球菌、 青春双歧杆菌、 婴儿双歧杆菌中的一种或一种以上。
所述的乳酸菌细胞对锌元素的吸附率为 0.10％ -1.20％。
所述赋形剂是 60-100 目玉米芯粉和沉淀二氧化硅的混合物、 玉米淀粉和沉淀二 氧化硅的混合物、 或者玉米芯粉、 玉米淀粉和沉淀二氧化硅三者的混合物。
所述的锌元素来自但不限于硫酸锌、 氯化锌或者氧化锌。
富锌灭活乳酸菌微生态制剂的制备方法， 包括以下步骤 ：
1) 选取乳酸菌发酵培养 ；
2) 在发酵培养液中加入质量分数为 0.01％ -0.17％的锌化合物 ；
3) 发酵结束后在发酵液中加入质量分数为 0.1-0.5％的保护剂 ；
4) 热灭活或冷灭活， 离心收集菌体 ；
5) 将步骤 4) 获得的菌体与赋形剂混合， 干燥， 使残留水分的含量小于 15％。
所述步骤 2) 中， 在发酵前将锌化合物加入培养液中， 或者在发酵的过程中将锌化 合物加入培养液中， 或者在发酵结束后将锌化合物加入培养液中进行吸附处理。
所述的锌化合物选自并不限于硫酸锌、 氯化锌以及其他可溶性锌盐或者氧化锌。
所述的保护剂为海藻酸钠和甘油的混合物， 或者脱脂牛奶。
所述的海藻酸钠和甘油的质量比例为 1 ∶ 1。
本发明所述的富锌灭活乳酸菌微生态制剂， 利用乳酸菌细胞壁上一些具有络合、 配位功能的基团， 如胞壁多糖和糖蛋白等， 与金属离子形成离子或共价键来吸附金属离子， 以乳酸菌作为锌离子的载体， 将锌元素携带到肠道表面细胞附近， 促进肠道对锌的吸收， 提 高锌的利用率， 从而满足动物对锌元素的需求 ； 同时富锌灭活乳酸菌微生态制剂可以有效 调节动物肠道微生态平衡， 有效地抑制动物肠道的致病菌， 达到预防和辅助治疗动物腹泻 的目的。所述富锌灭活乳酸菌微生态制剂可以减少氧化锌的使用， 降低断奶仔猪日粮中氧 化锌的添加水平， 减少猪只粪便中残留的锌对土壤的不可逆污染。
实施案例
实施案例 1
一种富锌灭活嗜酸乳杆菌微生态制剂， 其组分为每公斤富锌灭活嗜酸乳杆菌微生 态制剂含有 ：
1) 富锌嗜酸乳杆菌发酵产物 350 克， 其中灭活嗜酸乳杆菌细胞 108 个 /g， 锌元素含 量 0.57mg/g( 嗜酸乳杆菌对锌元素的吸附率为 0.16％ )， 培养基和水， 吸附率计算公式为 ：
2) 规格为 80 目的玉米芯粉和沉淀二氧化硅共 650 克， 其中玉米芯粉和沉淀二氧化 硅各 325 克。
在一吨全价饲料中的用量为 1-2 公斤， 此组分比例和添加量可以用于仔猪养殖。
实施案例 2
实施案例 1 所述的富锌灭活嗜酸乳杆菌微生态制剂制备方法， 包括以下步骤 ：
1) 嗜酸乳杆菌先进行菌种制备， 菌种筛选以固体 MRS 培养基作为基本培养基， 加 入 0.1％ CaCO3， pH 值为 6.4。培养基经 121℃灭菌 20-30 分钟， 冷却至 37℃， 备用。
2) 嗜酸乳杆菌的发酵培养， 发酵培养基是以液体 MRS 培养基作为基本培养基， pH 值为 6.4， 培养基经 121℃灭菌 20-30 分钟， 冷却至 37℃， 加入 0.12％的 ZnSO4， 混匀， 备用。 种子菌龄 12-18 小时， 接种量为 3％ -5％ (V/V 或者 V/W)。发酵时间 36-48 小时， 发酵温度 37℃， pH 值维持在 5.5 左右。
3) 在发酵结束后将发酵液中加入质量分数 0.1-0.5％ (w/v) 的保护剂， 所述保护 剂是脱脂牛奶。
4) 灭活 ： 热灭活， 发酵液升温至 60-80℃， 维持 30-60 分钟， 发酵液 3000 转 / 分钟 离心 15 分钟， 去上清液， 收集菌体。
5) 菌体加入赋形剂， 350 克富锌嗜酸乳杆菌发酵产物加入赋形剂 650 克， 所述赋形 剂是 80 目玉米淀粉和沉淀二氧化硅的混合物， 二者比例 1 ∶ 1， 混合并搅拌 20-30 分钟， 使 之充分混合与吸附。
6) 已同赋形剂充分混合的富锌灭活嗜酸乳杆菌于 90℃ -105℃干燥， 使残留水分 ≤ 15％。
实施案例 3
一种富锌灭活唾液乳杆菌微生态制剂， 其各组分为每公斤富锌灭活唾液乳杆菌微 生态制剂含有 ： 1) 富锌唾液乳杆菌发酵产物 600 克， 其中灭活唾液乳杆菌细胞含量为 108 个 /g， 锌元素含量 0.20mg/g( 唾液乳杆菌对锌元素的吸附率为 0.13％ )， 培养基和水 ； 2) 规格 为 100 目的玉米芯粉和沉淀二氧化硅 400 克， 其中玉米芯粉和沉淀二氧化硅各 200 克。在 一吨全饲价料的用量为 1-2 公斤， 此组分比例和添加量可以用于仔猪养殖。
实施案例 4
实施案例 3 所述的富锌灭活唾液乳杆菌微生态制剂的制备方法， 包括以下步骤 ：
1) 唾液乳杆菌先进行菌种制备， 菌种筛选培养基是以固体 MRS 培养基作为基本培 养基， 加入 0.1％ CaCO3， pH 值为 6.4。培养基 121℃灭菌 20-30 分钟， 冷却至 37℃， 备用。
2) 唾液乳杆菌的发酵培养， 发酵培养基是以液体 MRS 培养基作为基本培养基， pH
值为 6.4。培养基 121℃灭菌 20-30 分钟， 冷却至 37℃， 备用。种子菌龄 12-18 小时， 接种量 3％ -5％ (V/V 或 V/W)。发酵时间 36-48 小时， 发酵温度 37℃， pH 值维持在 5.5 左右。
3) 发酵结束后， 向发酵液中加入 0.07％ ZnSO4·7H2O， 维持 2-8 小时， 即可。
4) 在发酵结束后将发酵液中加入质量分数 0.1-0.5％ (w/v) 的保护剂， 所述保护 剂由海藻酸钠和甘油组成， 二者的质量比例为 1 ∶ 1。
5) 发酵液 3000 转 / 分钟离心 15 分钟， 去上清液， 收集菌体。
6) 灭活 ： 冷冻灭活， 将收集的菌体降温至 4℃左右， 维持 2-5 小时。
7) 菌体加入赋形剂， 600 克唾液乳杆菌发酵产物加入赋形剂 400 克， 所述赋形剂是 100 目玉米芯粉和沉淀二氧化硅的混合物， 两者比例为 1 ∶ 1， 混合搅拌 20-30 分钟， 使之充 分混合与吸附。
8) 已同赋形剂充分混合的富锌灭活唾液乳杆菌于 90℃ -105℃干燥， 使残留水分 ≤ 15％。
实施案例 5
一种富锌灭活双歧杆菌微生态制剂， 其各组分为每公斤富锌灭活双歧杆菌微生态 制剂含有 ： 1) 富锌双歧杆菌发酵产物 300 克， 其中灭活双歧杆菌细胞 109 个 /g， 锌元素含量 0.35mg/g( 双歧杆菌对锌元素的吸附率为 0.14％ )， 培养基和水 ； 2) 规格为 100 目的玉米芯 粉和沉淀二氧化硅 700 克， 其中玉米芯粉和沉淀二氧化硅各 350 克。在一吨全价饲料的用 量为 1-2 公斤， 此组分比例和添加量可以用于仔猪养殖。 实施案例 6
实施例 1 所述富锌灭活嗜酸乳杆菌微生态制剂饲喂仔猪试验
(1) 试验时间 ： 14 天
(2) 试验组合 ： 共分四组，
A 组为对照组， 饲料中不添加氧化锌喂养 ；
B 组为常规饲料喂养 ( 锌含量 ( 以氧化锌计 ) ： ≥ 2250mg/kg) ；
C 组饲料中添加了 2kg/t 实施例 1 所述的富锌灭活嗜酸乳杆菌微生态制剂 ；
D 组饲料添加了 2kg/t 的普通灭活嗜酸乳杆菌微生态制剂。
(3) 试验对象 ： 选取 28 日龄， 体态相近， 健康状况良好的长 × 大二元杂仔猪 40 头， 平均分成四组。
(4) 数据收集与分析 ： 日采食量、 总增重、 料肉比和腹泻头数等。
(5) 养殖管理 ： 各组别的饲料配方除了氧化锌添加量不同外， 其他成分均为一致。 试验期间， 由专人负责饲养， 环境条件一致， 自由采食、 饮水。进行常规免疫和消毒， 保持圈 舍清洁卫生。观察生长情况， 做好有关记录。
(6) 结果 ：
数据总结 ：
表一富锌灭活嗜酸乳杆菌微生态制剂对断奶仔猪的生长性能影响
结论 ：1. 由上表可得， 试验组 C 使用富锌灭活嗜酸乳杆菌微生态制剂， 可以有效降低断 奶仔猪饲料中的氧化锌添加量， 即使在不额外添加氧化锌的情况下， 断奶仔猪的生长性能 仍不受影响， 甚至要比添加高水平氧化锌 (2250mg/kg) 的对照组要好。 C 组的料肉比要比对 照组 A 降低 13.3％， 比高锌 B 组降低 11.5％， 效果明显。
2. 在饲养过程中， C 组仔猪精神状况良好， 采食量明显要比无氧化锌组要大， 只有 1 头仔猪出现过腹泻状况， 与添加高水平锌相当， 而且无氧化锌组则有 3 头。
3.D 组为普通灭活嗜酸乳杆菌微生态制剂组， 其料肉比是所有组别中最高的， 达到 1.72， 可以说明， 锌元素是对仔猪生长的重要性， 所以应该在日粮中适当地补充锌元素。 D组 中没有出现腹泻现象， 是由于乳酸菌微生态制剂起到的调整肠道微生态平衡和预防腹泻的 作用。
实施案例 7
实施案例 3 所述的富锌灭活唾液乳杆菌微生态制剂配合添加氧化锌， 饲喂仔猪试 验
(1) 试验时间 ： 14 天
(2) 试验组合 ： 在仔猪基础日粮添加 0.1％富锌灭活唾液乳杆菌微生态制剂的基 础上， 与添加一定量氧化锌进行配合 ( 对照组除外 )， 测试其效果。 本试验共份四组， 分组如 下：
表二试验分组
(3) 试验对象 ： 选取 28 日龄， 体态相近， 健康状况良好的长 × 白二元杂仔猪 (4) 数据收集与分析 ： 日采食量、 总增重、 料肉比等。(5) 养殖管理 ： 各组别的饲料配方除了氧化锌添加量不同外， 其他成分均为一致。 试验期间， 由专人负责饲养， 环境条件一致， 自由采食、 饮水。进行常规免疫和消毒， 保持圈 舍清洁卫生。观察生长情况， 做好有关记录。
(6) 结果 ：
数据总结 ：
表三富锌灭活唾液乳杆菌微生态制剂对断奶仔猪的生长性能影响
结论 ：
1. 结果表明， 富锌灭活唾液乳杆菌微生态制剂， 可以与氧化锌配合使用， 即使 氧化锌在低添加量 (500mg/kg) 的情况下， 试验组仔猪生长性能要比添加高水平氧化锌 (2500mg/kg) 的对照组要好。 试验组一、 试验组二和试验组三的料肉比分别比对照组降低了 0.9％、 降低 1.8％和降低 4.5％。
2. 从结论 1 中可以得出， 富锌灭活唾液乳杆菌微生态制剂配合使用氧化锌， 既可 以降低氧化锌在饲料中的添加量， 仔猪生长性能不受影响， 又可以减少添加成本， 提高养殖 户的经济效益。这是本发明的富锌灭活乳酸菌微生态制剂较为理想的使用方法之一。
3. 试验组一、 二、 三的结果表明， 在仔猪基础日粮中添加 0.1％富锌灭活唾液乳杆 菌微生态制剂的基础上， 随着氧化锌的添加量的增加， 生长性能也得到提高， 但是提升幅度 与氧化锌的添加量不成比例。
4. 经试验证明， 富锌灭活乳酸菌微生态制剂可以与氧化锌配合使用， 比单独使用 氧化锌的效果更好， 可以有效降低在饲料中氧化锌的添加水平 ( 可以低至 500mg/kg)， 减少 动物粪便中锌的残留， 在环境保护与经济效益之间取得平衡。
实施案例 8
实施案例 1 所述的富锌灭活嗜酸乳杆菌微生态制剂饲喂肉鸡
(1) 试验时间 ： 21 天
(2) 试验组合 ： 试验共分三组， 共用基础日粮 ( 锌含量 ( 以氧化锌计 ) ： 40mg/kg)， 分别添加不同锌水平，
对照组 ： 饲喂基础日粮 ；
试验 A 组 ： 在基础日粮的基础上， 添加 0.1％实施案例 1 所述的富锌灭活嗜酸乳杆
菌微生态制剂 ；
试验 B 组 ： 添加了高锌的基础日粮 ( 锌含量 ( 以氧化锌计 ) ： 178mg/kg) ；
试验 C 组 ： 在基础日粮的基础上， 添加 0.1％普通灭活嗜酸乳杆菌微生态制剂。
(3) 试验鸡 ： 选择 21 日龄， 同一批次， 个体差异不大， 健康情况良好的肉鸡 180 羽， 平均分为 3 组， 每组 30 羽， 组间个体差异不大。
(4) 数据收集与分析 ： 采食量、 日增重和料肉比。
(5) 饲养管理 ： 按照养殖场日常操作进行， 试验期间， 由专人负责饲养， 环境条件 一致， 自由采食、 饮水。进行常规免疫和消毒， 保持圈舍清洁卫生。观察生长情况， 做好有关 记录。
(6) 结果 ：
数据总结 ：
表四富锌灭活唾液乳杆菌微生态制剂对肉鸡的生长性能影响
结论 ：
1. 在基础日粮中， 配合使用富锌灭活乳酸菌微生态制剂可以提高肉鸡的生长性 能， 采食量和日增重比对照组分别提高 5.7％和 8.9％， 料肉比降低 3.1％。
2. 试验组 B 的锌含量 (178mg/kg) 远高于试验组 A(40mg/kg)， 但是生长性能下降， 采食量和日增重分别降低了 6.9％和 9.6％， 可见高锌日粮对肉鸡的生长性能有负面效果。
3. 从上述各组数据比较可得， 基础日粮配合使用富锌灭活乳酸菌微生态制剂可以 使肉鸡的生长性能得到提高， 降低料肉比， 因此， 在高锌对肉鸡的生长性能产生负面影响的 情况， 在日粮中适当补充一些锌源， 可以提高肉鸡的生长性能。 本发明产品便是这样一种高 效锌源， 可以给家禽的生长补充锌， 还以调节家禽肠道的微生态平衡。
本发明所述富锌灭活乳酸菌微生态制剂具有如下优点 ：
1) 可以有效防治断奶仔猪早期断奶应激带来的腹泻问题， 促进仔猪的生长 ；
2) 从根本上降低断奶仔猪饲料中氧化锌的添加量 ；
3) 有效降低动物粪便中锌的排出量， 减少锌对土环境造成的污染 ；
4) 本发明产品还可用于家禽养殖， 满足家禽对锌的需要。
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