一种治疗 HBV-GN 的中药有效部位及其制剂的制备方法 【技术领域】
本发明涉及一种用于 HBV-GN 的中药有效部位及其制剂的制备方法， 属于中药制剂领域。 背景技术 乙 型 肝 炎 病 毒 相 关 性 肾 炎 (hepatitis B virus associated glomerulonephritis， HBV-GN) 是由乙型肝炎病毒 (HBV) 诱发的肾小球肾炎。HBV-GN 常见 的病理类型为膜性肾病 (MN)、 膜增生性肾小球肾炎 (MPGN)、 IgA 肾病 (IgAN) 及系膜增生性 肾小球肾炎 (MsPGN)。GBV-GN 的发病机制复杂多变， 目前提出的可能的发病机制主要有免 疫复合物引起的损伤、 细胞免疫、 病毒对肾脏的直接作用、 自身免疫及遗传因素等。国内外 学者认为 HBV 感染的多种病理类型中， 最常见的是 MN， 其次为 MPGN、 IgAN、 MsPGN、 局灶阶段 性肾小球硬化 (FSGS) 和硬化性肾炎 (SGN)。HBV-GN 的临床表现与相同病理类型的原发性 肾小球肾炎相似， 有镜下血尿、 肉眼血尿、 肾病综合征 (NS)、 高血压及肝功能异常， 与原发性 肾小球肾炎不同的是， HBV-GN 患者在诊断中血清 HBV 抗原呈阳性并且肾切片中有 HBV 抗原 或肾组织切片有 HBV 抗原而血清 HBV 抗原检测阴性。
目前治疗 HBV-GN 的西药主要分为免疫抑制剂类药物和抗病毒类药物两大类， 而 以糖皮质激素、 吗替麦考酚酯 (MMF)、 来氟米特为代表的免疫抑制剂为主要的治疗方法， 此 类药物虽然在原发性及与免疫相关的继发肾脏疾病的治疗中起着非常重要的作用， 但却存 在诱导 HBV 复制而加重病情的副作用。
中医将 HBV-GN 的主要病因归为湿热毒邪， “邪之所凑， 其气必虚” ， 人体正气不足是 导致该病发生的根本原因， 故本病多呈正虚邪实， 气虚为本， 湿热郁阻为标。研究发现本病 初起湿热蕴结于肝， 下及于肾 ； 中期湿热瘀毒互结 ； 后期则渐至木乘脾土和肝病及肾， 导致 肝、 脾、 肾三脏功能失调。HBV-GN 的中医病理特点表现为毒侵、 正虚、 气郁、 血阻。
从中医的整体观念、 辨证论治的原则出发， HBV-GN 属于本虚标实之证， 治疗的药物 如果能标本兼顾， 驱除湿热之邪的同时又能扶助脏器之正气， 则将在治疗 HBV-GN 上实现重 大的突破。
发明内容 本发明的目的之一在于提供一种安全、 有效的治疗 HBV-GN 的中药制剂。
本发明研究人员根据 HBV-GN 的病理病变特点， 选用了具有清热解毒、 凉血平肝功 效的筋骨草作为研究对象， 通过药理药效试验从中筛选出了具有治疗 HBV-GN 作用的有效 部位， 并进一步 对该有效部位的制剂工艺进行了研究。
本发明中， 所用的原料药为筋骨草。筋骨草 (Ajuga decumbens Thunb.)， 又名金 疮小草、 白毛夏枯草、 苦草等， 为唇形科植物。 主要分布在秦岭以南各省， 民间主要用于止咳 化痰、 清热、 凉血、 消肿、 解毒、 腹泻、 肝炎、 疔毒疖肿、 外伤出血等。筋骨草性味苦寒， 按中医 药理论， 苦能燥湿解毒、 寒能清热泻火， 其对多种细菌具有抑制功能。研究发现服用筋骨草
后， 临床检测到白细胞增加， 血清谷丙转氨酶活力显著下降， 表明筋骨草对病毒性疾病确有 疗效。 (Jiangsu New Medical College.Dictionary of Chinese Materia Medica( 中药大 辞典 )[M].Shanghai ： Shanghai People’ s Publishing House， 1997) 筋骨草中含有多种环 烯醚萜、 黄酮、 植物甾酮、 甾酮、 二萜等化合物 ( 郭新东， 等， 筋骨草的化学成分研究 [J]， 中 草药， 2005， 36(5) ： 646-648)。
本发明中治疗 HBV-GN 的有效部位化学成分主要为筋骨草中的黄酮类和苷类化合 物。体内药效学研究发现， 筋骨草经提取纯化获得的有效部位， 具有明显的降低尿蛋白、 保 护肾功能、 保肝、 抗炎、 降脂活性， 进一步研究发现该有效部位化学成分主要为黄酮类和苷 类。
本发明治疗 HBV-GN 的药物， 所制成的单元制剂形式为口服给药制剂， 优选为片 剂、 颗粒剂、 胶囊剂、 丸剂、 酊剂或口服液中的任意一种， 更优选为胶囊剂。
本发明中， 制剂过程中， 除原料药活性成分外， 还含有制药上可接受的赋形剂。其 中赋形剂为制成各种剂型所需要的赋形剂， 填充剂如乳糖、 糊精、 微晶纤维、 淀粉等 ； 崩解 剂如交联聚维酮， 交联羧甲基纤维素钠、 羧甲基淀粉钠等， 粘合剂如淀粉浆、 淀粉浆钠、 羟丙 甲纤维素、 聚维酮等， 表面活性剂如十二烷基磺酸钠， 润滑剂如硬脂酸镁、 滑石粉、 聚乙二醇 等， 还可以有助悬剂、 助溶剂、 矫味剂、 防腐剂等， 具体选用什么赋形剂搭配， 根据制剂而定， 制成普通的制剂时， 选用何种赋形剂是本领域技术人员根据现有技术就能知道的。 本发明的再一目的在于提供一种制备本发明所述治疗 HBV-GN 药物的制备方法， 包括如下步骤 ： 取一定量的筋骨草粉碎成粗粉， 取一定量的筋骨草， 粉碎成粗粉， 待用 ； 加 原料药重量 6-12 倍的水浸泡 30min， 再煎煮提取 2-4 次， 每次 1-3h， 过滤， 合并所有滤液， 滤 液减压浓缩成浸膏 ； 浸膏处理后上大孔树脂柱， 6-12 倍量的水冲柱， 弃去洗脱液， 再用 6-12 倍量的 20％ -60％的乙醇冲柱， 收集洗脱液， 减压浓缩即得有效部位。
本发明中， 获取原料药有效部位的方法还可以为 ： 取一定量的筋骨草， 粉碎成粗 粉， 待用 ； 加原料药重量 6-12 倍的 20％ -60％乙醇回流提取， 2-4 次， 每次 1-3h， 过滤， 合并 所有滤液， 滤 液减压浓缩成浸膏 ； 浸膏处理后上大孔树脂柱， 6-12 倍量的水冲柱， 弃去洗 脱液， 再用 6-12 倍量的 20％ -60％的乙醇冲柱， 收集洗脱液， 减压浓缩即得有效部位。加入 所需的辅料适量， 按照常规的制剂工艺制成所需的剂型。
具体实施方式
以下从制备实施例来进一步说明本发明的制备方法， 以下所列举的实施例， 并不 是为了限制本发明的具体实施方式， 本领域的普通技术人员， 可以很容易根据本发明的所 允许的范围， 做出合理的改变替换。
实施例 1
称取一定量的筋骨草全草， 粉碎成粗粉， 待用 ； 加原料药重量 6-12 倍的 20％ -60％ 乙醇回流提取， 2-4 次， 每次 1-3h， 过滤， 合并所有滤液， 滤液减压浓缩成浸膏 ； 浸膏处理后 上大孔树脂柱， 6-12 倍量的水冲柱， 弃去洗脱液， 再用 6-12 倍量的 20％ -60％的乙醇冲柱， 收集洗脱液， 减压浓缩即得有效部位， 干燥， 以 1 ∶ 0.5-2 的比例加入淀粉， 混合均匀， 用乙 醇作为润湿剂制成软材， 过筛制粒， 置烘箱干燥得干燥颗粒， 然后灌装入 0.4g 规格的硬胶 囊中， 密封， 包装即得胶囊剂。实施例 2
称取一定量的筋骨草全草， 粉碎成粗粉， 待用 ； 加原料药重量 6-12 倍的 20％ -60％ 乙醇回流提取， 2-4 次， 每次 1-3h， 过滤， 合并所有滤液， 滤液减压浓缩成浸膏 ； 浸膏处理后 上大孔树脂柱， 6-12 倍量的水冲柱， 弃去洗脱液， 再用 6-12 倍量的 20％ -60％的乙醇冲柱， 收集洗脱液， 减压浓缩即得有效部位， 干燥， 加入蔗糖粉、 淀粉， 混合均匀， 用乙醇作为润湿 剂制成软材， 过筛制粒， 置烘箱干燥， 加入硬脂酸镁， 混匀， 整粒， 压成， 分装， 即得片剂。
以下从药理实施例来进一步说明本发明的有益效果， 在下列实施例中， 所用的制 剂为实施例 1 处方制备得到的胶囊剂， 在药品名称上我们称取为 JGC。
1.JGC 对 HBV-GN 形态的影响
实验动物 ： BALB/c 小鼠， 体重 80 ～ 20g， 质量合格， 购于北京军事医学科学院动物 中心。合格证号 ： SCXK-( 军 )2007-004。
动物模型的制备 ： 动物自由饮食分笼饲养。 观察 1 周查尿常规无异常后， 经腹腔注 射加佐剂的含 HBV-DNA 复制的人血清 0.2ml/ 次， 每周 2 次， 连续 4 周。
动物随机分为 3 组， 每组 10 只。实验期间大鼠均自由摄食和饮水。
(1). 空白对照组 ： 不予处理 ；
(2). 模型组 ： 灌胃等体积的生理盐水 ；
(3). 筋骨草剂量组 ： 灌胃 0.02g/kg·d ；
实验方法 ： 于注射血清前 1 周及注射后 2、 4、 6、 8 周各查尿常规和 4、 6、 8 周查血清 乙肝病毒标志物各 1 次。以反射排尿法取尿 . 用尿纸条进行尿蛋白半定量 (+ ≥ 0.1g/L， ++ ≥ 0.39g/L， +++ ≥ 0.9/L， ++++ ≥ 1.0g/L) 检测。酶标法测定乙肝病毒标志物。于第 6、 8 周末， 两组各处死 5 只动物取肾组织以 10％福尔马林固定， 常规脱水， 透明包埋， 制 2mm 厚 切片， 染色， 光镜下观察肾小球和肾小管的改变， 用 HMIAS 图文分析系统， 每片选 10 个小球， 计算总增殖面积 (ECM) 与肾小球总面积之比。
实验结果 ： 注射加佐剂的含 HBV-DNA 复制的人血清后的第 1 周， 模型组部分小鼠 即出现蛋白尿， 定性 ( ≥ ++) ； 第 4 周时 10 只小鼠均出现尿蛋白， 定性在 (++ ～ +++)， 一直 持续至笫 8 周实验结束。经过检验， 第 4 与笫 2 周、 笫 6 与第 4 周相比较， 均有统计学意义 (P ＜ 0.05) ； 而正常对照组小鼠尿蛋白始终呈 ( 一 )。酶标法检测乙肝病毒标志物， 血清 HBsAg、 HBcAg 等呈阳性。
光镜可见， 模型组可见肾小球明显增大， 球内细胞数增多， 系膜区面积增宽， 部分 肾小球毛细血管腔受压变狭， 肾间质有炎性细胞浸润。 筋骨草组肾小球肿胀较轻， 肾小球大 小变化较模型组减轻， 系膜细胞轻度增生， 部分系膜区增宽， 血管腔有轻度挤压现象， 但毛 细血管基底膜无明显变化， 肾小管及肾间质无明显变化。说明筋骨草组肾脏病理损伤明显 比模型组轻。
2.JGC 对系膜增生性肾炎大鼠肝肾功能的影响
实验动物 ： SD 大鼠， 体重 180 ～ 200g， 质量合格， 购于北京军事医学科学院动物中 心。合格证号 ： SCXK-( 军 )2007-004。
动物模型的制备 ： 除正常对照组外， 其余各组均腹腔注射戊巴比妥钠 (30mg/kg) 麻醉， 常规消毒后， 通过背侧切除左侧肾脏， 休养 1 周。 预免疫 ： 实验组大鼠足垫皮下注射弗 氏完全佐剂 0.1mg 加 3mg 小牛血清白蛋白 (BSA)， 在 1 周末、 2 周末时分别加强 1 次 ； 3 周末时腹腔注射 BSA 4 次， 剂量分别为每只 0.5、 1.0、 1.5、 3.0mg， 每次间隔 1h ； 注射次日晨再加 强 1 次 (2.0mg/ 只 )。免疫 ： 预免疫后每日腹腔注射 BSA， 从每只 1mg 剂量开始， 以每日 1mg 量增加至 5mg 为止， 继续每周加量 1mg， 至 10mg 为止。存活大鼠于造模第 5 周末进行尿蛋白 检测， 出现明显蛋白尿者进入实验， 于造模第 6 周开始给药， 每日 1 次， 连续 6 周。
动物随机分为 4 组， 每组 10 只。实验期间大鼠均自由摄食和饮水。
(1). 空白对照组 ： 不予处理 ；
(2). 模型组 ： 灌胃等体积的生理盐水 ；
(3). 雷公藤组 ： 灌胃 0.018g/kg·d， 作阳性对照 ；
(4). 筋骨草剂量组 ： 灌胃 1.08g/kg·d ；
实验方法 ： 于末次给药后将大鼠置清洁代谢笼中， 留取 24h 尿液， 用考马斯亮蓝法 进行 24h 蛋白尿定量检测， 于次日从心脏取血测定血肌酐 (Scr)、 尿素氮 (BUN)、 谷氨酸氨基 转移酶 (ALT) 含量。
数据处理各组测定的实验数据以 表 1JGC 对大鼠 24h 蛋白尿的影响表示， 组间差异用 t 检验进行显著性分析。
与正常对照组相比 *P ＜ 0.05， **P ＜ 0.01 ； 与模型组比较， △ P ＜ 0.05， △△ P ＜ 0.01。 表 2JGC 对大鼠肝肾功能的影响
与正常对照组相比 *P ＜ 0.05， **P ＜ 0.01 ； 与模型组比较， △ P ＜ 0.05， △△ P ＜ 0.01。
由表 1 可知， 与正常对照组相比， 模型组尿蛋白显著增高 (P ＜ 0.01)， 表明造模成 功。筋骨草组和雷公藤组尿蛋白明显低于模型组 (P ＜ 0.01)。虽然筋骨草组尿蛋白略高于
雷公藤组， 但无显著差异 (P ＞ 0.05)。而由表 2 可知， 与正常对照组相比， 模型组 BUN、 Scr 明显升高 (P ＜ 0.05)， 而 ALT 两者之间无明显差异 (P ＞ 0.05)。与模型组相比， 筋骨草组 显著降低 BUN、 Scr(P ＜ 0.05)， 与 雷公藤组相比无明显差异 (P ＞ 0.05)， 而 ALT 明显低于 雷公藤组 (P ＜ 0.01)。 因此， 实验表明， 经筋骨草治疗后的模型大鼠， 可显著降低尿蛋白、 血 BUN、 Scr， 且与雷公藤组相比， 均无显著差异， 说明筋骨草有降尿蛋白、 保护肾功能方面的作 用； 而筋骨草组较雷公藤组的 ALT 显著降低， 说明筋骨草在治疗过程中无明显肝损害作用。
3.JGC 对免疫复合物性肾炎大鼠血脂的影响
实验动物 ： SD 大鼠， 体重 180 ～ 200g， 质量合格， 购于北京军事医学科学院动物中 心。合格证号 ： SCXK-( 军 )2007-004。
动物模型的制备 ： 预免疫 ： 取离子化的牛血清白蛋白 (C-BSA)1mg， 加入 0.5ml PBS 中， 与等量的弗氏不完全佐剂混匀成乳白色悬液， 在大鼠双侧腋下， 腹股沟作多点皮下注 射。免疫 ： 预免疫 1 周后， 每只大鼠尾静脉注射 C-BSA 2.5mg( 溶于 1ml pH 7.4PBS)， 3次/ 周， 共 3 周。
动物随机分为 4 组， 每组 10 只。实验期间大鼠均自由摄食和饮水。
(1). 空白对照组 ： 不予处理 ； (2). 模型组 ： 灌胃等体积的生理盐水 ；
(3). 雷公藤组 ： 灌胃 0.018g/kg·d， 作阳性对照 ；
(4). 筋骨草剂量组 ： 灌胃 1.08g/kg·d ；
实验方法 ： 在实验第 3， 4， 8 周末将大鼠放人代谢笼中收集 24h 尿液， 以双缩脲法测 定尿蛋白含量。于实验 8 周末处死大鼠前采血测定白蛋白、 甘油三酯及胆固醇。
数据处理各组测定的实验数据以 表 3 大鼠尿蛋白的检测结果表示， 组间差异用 t 检验进行显著性分析。
与正常对照组相比 P ＜ 0.05 表 4 大鼠血脂的检查结果与正常对照组相比 **P ＜ 0.01， *P ＜ 0.05 ； 与模型组比较， △△ P ＜ 0.01， △P ＜ 0.05。
从表 3 可以看出， 与正常对照组相比， 模型组大鼠尿蛋白明显增加， 而筋骨草剂量 组尿蛋白比模型组显著降低 (P ＜ 0.05)。表 4 可知， 模型组大鼠较正常组大鼠血清白蛋白 水平降低， 甘油三酯及胆固醇水平增高 (P ＜ 0.05)。 本实验说明， 筋骨草剂量组具有降脂作 用。
4.JGC 对免疫复合物性肾炎 IgG 和 IV 胶原的影响
实验动物 ： SD 大鼠， 体重 180 ～ 200g， 质量合格， 购于北京军事医学科学院动物中 心。合格证号 ： SCXK-( 军 )2007-004。
动物模型的制备 ： 预免疫 ： 取离子化的牛血清白蛋白 (C-BSA)1mg， 加入 0.5ml PBS 中， 与等量的弗氏不完全佐剂混匀成乳白色悬液， 在大鼠双侧腋下， 腹股沟作多点皮下注 射。免疫 ： 预免疫 1 周后， 每只大鼠尾静脉注射 C-BSA 2.5mg( 溶于 1ml pH 7.4PBS)， 3次/ 周， 共 3 周。
动物随机分为 3 组。实验期间大鼠均自由摄食和饮水。
(1). 空白对照组 ： 不予处理 ；
(2). 模型组 ： 灌胃等体积的生理盐水 ；
(3). 筋骨草剂量组 ： 灌胃 1.08g/kg·d ；
实验方法 ： 采用 SABC 法检测肾组织中的 IV 型胶原 (colIV)、 IgG 的表达。将石蜡 包埋的肾组织标本切成 4um 厚的切片， 具体步骤按说明进行， 根据肾小球基底膜上或系膜 区有棕黄色及棕黄色的深浅和分布定为 0 ～ 4 级 ： 0 级， 阴性 ； +， 极少 ； 2+， 少量、 散在， 低倍 镜下阳性 ； 3+， 大量、 呈片状分布。 由两个观察者对每个样本的免疫组化切片进行盲法评分， 每个样本观察 40 个肾小球， 然后两者取平均值。两观察者之间结果一致的符合率高， Kappa 值为 0.88。
数据处理各组测定的实验数据以 表 5JGC 对大鼠 IgG 和 IV 胶原影响表示， 组间差异用 t 检验进行显著性分析。与模型组比较， *P ＜ 0.05
与正常组比较， 模型组 IgG 和 IV 胶原在肾小球的沉积显著增强， 而筋骨草剂量组 较模型组明显减少 ( 见表 5)。 可说明筋骨草对免疫复合物性肾炎肾脏病变有一定的保护作 用。
5.JGC 对 IgA 肾病大鼠肾组织 IL-6， TNF-α 表达的影响
白介素 2-6(IL-6) 是一个重要的炎症介质， 除了 T、 B 淋巴细胞、 单核细胞和成纤维 细胞能产生 IL-6 外， 肾脏系膜细胞 (MC)、 上皮细胞和肾小管上皮细胞也可产生。而且 IL-6 在肾脏局部又能刺激 MC 增殖并分泌其他细胞因子和胶原等进而影响疾病的进展。
实验动物 ： SD 雄性大鼠， 体重 180 ～ 200g， 质量合格， 购于北京军事医学科学院动 物中心。合格证号 ： SCXK-( 军 )2007-004。
动物模型的制备 ： 口服免疫原牛血清白蛋白 (BSA) 剂量 400mg/kg 隔天灌胃， 持续 6周； 四氯化碳 (CCl4) 皮下注射， ( 皮下注射蓖麻油 0.5ml ； CCl40.10ml， 每周 1 次， 持续 9 周 )， 并联合运用脂多糖 (LPS)( 分别于第 6， 8 周以 LPS 0.05mg 尾静脉注射 )。
动物随机分为 4 组， 每组 10 只。实验期间大鼠均自由摄食和饮水。
(1). 空白对照组 ： 不予处理 ；
(2). 模型组 ： 灌胃等体积的生理盐水 ；
(3). 雷公藤组 ： 灌胃 0.018g/kg·d， 作阳性对照 ；
(4). 筋骨草剂量组 ： 灌胃 1.08g/kg·d ；
实验方法 ： 造模共 8 周后随机取造模组大鼠肾组织做肾组织活检。取肾组织以 10％福尔马林固定， 常规脱水， 透明包埋， 制成 2mm 厚切片， 染色， 光镜下观察。
造模成功后第 10d 检测各组血清 IL-6， TNF-α。给药后 90d 用眼底静脉取血的方 法， 全部大鼠每只取血 1.0-1.5mL 置于子弹头容器中， 使用碘 I125 白细胞介素 -6 放射免疫 分析盒及碘 I125 肿瘤坏死因子放射免疫分析药盒进行检测。
实验结果 ： 肾组织活检提示为 IgA 肾病。 光镜可见， 肾小球系膜细胞和基质弥漫性 中度增生。肾小管轻度颗粒变性， 有中量蛋白管型， 间质小灶性慢性炎症细胞浸润。纤维组 织免疫酶标显示 IgG-， IgA+， IgM-， C3-， C4-。
表 6JGC 对大鼠血清 IL-6， TNF-α 变化的影响由表 6 可知， 与正常对照组相比， 模型组大鼠血清 IL-6， TNF-α 含量明显升高 (P ＜ 0.05)， 而筋骨草剂量组与模型组比较血清 IL-6， TNF-α 含量明显降低 (P ＜ 0.05)， 且 与雷公藤组相似。因此， 可以推测 JGC 可直接抑制 IgA 肾病发病过程中的重要介质 IL-6， TNF-α 的分泌， 从而调整免疫系统减轻炎症细胞在肾内的聚集， 清除肾内沉淀的免疫复合 物， 减轻其对肾小球系膜细胞的刺激， 直接抑制 IL-6， TNF-α 的分泌， 达到减轻肾病的目 的。
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