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1、10申请公布号CN101942011A43申请公布日20110112CN101942011ACN101942011A21申请号201010019445622申请日20100119C07K7/08200601C07K14/075200601C07K16/08200601C12N15/34200601A61K39/235200601A61K39/395200601A61P31/20200601G01N33/56920060171申请人呼吸疾病国家重点实验室地址510230广东省广州市沿江路151号72发明人周荣邱红玲周志超李潇苏晓波高文娟钟南山54发明名称人3型、7型腺病毒的中和抗原表位及其应用5。
2、7摘要本发明公开了一种人腺病毒的三个中和抗原表位及其相关应用。本发明的人3型、7型腺病毒的中和抗原表位的氨基酸序列选自如SEQIDNO1、2、3所示的氨基酸序列，其核苷酸序列选自如SEQIDNO4、5、6所示的核苷酸序列。利用该三种人3型、7型腺病毒的中和抗原表位可制备预防3型或/和7型腺病毒感染的疫苗或抗体、抗原结合片段，进而该抗体或抗原结合片段可以制备用于预防或治疗腺病毒感染的药物，该药物含有上述抗体或抗原结合片段。本发明还提供了预防治疗腺病毒感染的方法，即施用免疫有效量的上述疫苗或药物。还可将该三种人3型、7型腺病毒的中和抗原表位做为靶蛋白，用于开发诊断试剂盒。51INTCL19中华人民。
3、共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页附图1页CN101942016A1/1页21人3型、7型腺病毒的中和抗原表位，其特征在于，所述中和抗原表位的氨基酸序列如SEQIDNO1、2、3所示的氨基酸序列，以及含有一个或多个氨基酸插入、缺失、替代或添加并保持其结构和活性的氨基酸序列。2根据权利要求1所述的人3型、7型腺病毒的中和抗原表位，其特征在于，所述中和抗原表位的核苷酸序列如SEQIDNO4、5、6所示的核苷酸序列，以及含有一个或多个核苷酸插入、缺失、替代或添加的核苷酸序列。3权利要求1或2所述的人3型、7型腺病毒的中和抗原表位的应用，其特征在于，用于制备预防3型或/和7型。
4、腺病毒感染的疫苗或药物。4一种疫苗，其特征在于，包含权利要求1或2所述的人3型、7型腺病毒的中和抗原表位的多肽。5一种抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段特异地与权利要求1或2所述的人3型、7型腺病毒的中和抗原表位结合。6一种药物，其特征在于，所述药物含有权利要求5所述的抗体或抗原结合片段。7预防治疗腺病毒感染的方法，其特征在于，施用免疫有效量的权利要求4所述的疫苗或有效量的权利要求6所述的药物。8权利要求1或2所述的人3型、7型腺病毒的中和抗原表位的应用，其特征在于，做为靶蛋白用于开发诊断试剂盒。9检测腺病毒感染的方法，其特征在于，使用了权利要求8所述的诊断试剂盒。权利要求。
5、书CN101942011ACN101942016A1/7页3人3型、7型腺病毒的中和抗原表位及其应用技术领域0001本发明属于生物医药工程技术领域，具体涉及人3型、7型腺病毒的中和抗原表位及其应用。背景技术0002腺病毒颗粒是一个二十面体的对称结构，壳体由252个壳体亚单位组成，其中位于二十面体的12个预角的是五邻体蛋白及一条长度为1030NM的纤维突起；另外240个非顶角颗粒是由六邻体三聚体构成，能刺激机体产生中和抗体以及组和型特异性抗体。不同型别腺病毒的六邻体蛋白的氨基酸序列有高达7895的同源性，其变化主要集中在暴露于病毒壳体表面的高变区HYPERVARIABLEREGIONS，HVRS。
6、；而型特异性中和抗体的识别位点就集中在这些高变区上。0003人腺病毒ADENOVIRUS是1953年从急性呼吸道疾病病人身上分离、鉴定出来的，是一类主要感染人呼吸道和消化道的病原体。截目前为止，人类已经发现了6个种属52种不同血清型的腺病毒；其中约有1/3能引起如急性呼吸道感染、流行性角膜炎、急性出血性结膜炎、咽结膜炎、急性咽炎、膀胱炎、婴幼儿致死性肺炎等疾病；患者主要是婴幼儿及体弱人群。在我国，5岁以下儿童急性呼吸道疾病中约有5是由腺病毒引起的；其中，腺病毒引起的肺炎尤为严重，是婴幼儿肺炎发病率中仅次于呼吸道合胞病毒肺炎的一种病毒性肺炎；严重的腺病毒肺炎不仅可以引起心力衰竭、呼吸衰竭，还可以。
7、引起肺外受累，如脑炎、肝损害、心肌炎或心肌损害等，甚至导致死亡。腺病毒流行范围广，传播速度快，近年来在多个国家和地区爆发和流行，给人们的公共卫生安全带来了极大的威胁。在我国，引起严重呼吸道感染的腺病毒亚型主要是3型、4型、7型。0004腺病毒致病的广泛性和危害的严重性使得腺病毒的防治显得十分重要，接种腺病毒疫苗是预防腺病毒感染最有效的方法之一。但由于腺病毒产生的中和抗体只能抵抗同型腺病毒的感染，不能预防其他型别腺病毒感染，故4、7型腺病毒疫苗产生的抗体不能够有效地抵抗3型腺病毒感染。此外，国外使用的4、7型腺病毒疫苗是口服的活病毒疫苗，疫苗可以在肠道产生无症状感染而达到免疫接种的效果，但经粪便。
8、排出的腺病毒疫苗株仍具有传染的可能性。而且由于不同亚型腺病毒间基因存在同源性，同时服用两种或多种不同亚型的腺病毒疫苗间可能进行同源重组，而产生新的、有感染性的腺病毒颗粒，带来新的感染风险。在我国，腺病毒疫苗的临床使用还是一片空白。从我国近年来多次爆发腺病毒疫情来看，自主研发腺病毒疫苗十分必要。若研制出一种能同时预防多型的腺病毒感染的复制缺陷型疫苗则可以有效的解决上述问题。发明内容0005为克服上述技术缺陷，本发明的目的是提供人腺病毒的三个中和抗原表位及其相关应用。0006具体来说，本发明的目的之一是提供人3型、7型腺病毒的中和抗原表位。说明书CN101942011ACN101942016A2/。
9、7页40007本发明的人3型、7型腺病毒的中和抗原表位的氨基酸序列选自如下序列SEQIDNO1、2、3所示的氨基酸序列；同时，允许一个或多个氨基酸的插入、缺失、替代或添加，但需要保持其结构和活性。0008上述人3型、7型腺病毒的中和抗原表位的核苷酸序列选自如下序列SEQIDNO4、5、6所示的核苷酸序列；同时，允许一个或多个核苷酸的插入、缺失、替代或添加，但需要保证该核苷酸序列表达的多肽的结构和活性与上述人3型、7型腺病毒的中和抗原表位的氨基酸序列表达的多肽的结构和活性一致。0009上述氨基酸序列为SEQIDNO1或核苷酸序列为SEQIDNO4所示的中和抗原表位是人3型腺病毒的中和抗原表位，简。
10、称为ADV3抗原表位。上述氨基酸序列为SEQIDNO2和3或核苷酸序列为SEQIDNO5和6所示的中和抗原表位是人7型腺病毒的中和抗原表位，分别简称为ADV71抗原表位和ADV72抗原表位。0010本发明的目的之二是提供该三种人3型、7型腺病毒的中和抗原表位的相关应用。应用之一是可以利用该三种人3型、7型腺病毒的中和抗原表位制备预防3型或/和7型腺病毒感染的疫苗。0011上述疫苗包含该三种人3型、7型腺病毒的中和抗原表位的多肽。如果该疫苗只含有ADV3抗原多肽，则该疫苗只能用于预防3型人腺病毒的感染。如果该疫苗由ADV71抗原多肽或/和ADV72抗原多肽组成，则该疫苗只能用于预防7型人腺病毒的。
11、感染。如果疫苗包含ADV3抗原多肽和ADV71抗原多肽，或者ADV3抗原多肽和ADV72抗原多肽，或者ADV3抗原多肽、ADV71抗原多肽和ADV72抗原多肽，则该疫苗可以用于同时预防3型和7型人腺病毒的感染。0012应用之二是可以利用该三种人3型、7型腺病毒的中和抗原表位制备抗体或抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段能特异地与相应的人3型、7型腺病毒的中和抗原表位结合。0013进一步，利用该抗体或抗原结合片段可以制备用于预防或治疗腺病毒感染的药物，该药物含有上述抗体或抗原结合片段。0014进一步，本发明还提供了预防治疗腺病毒感染的方法，即施用免疫有效量的上述疫苗或药物。0015应用之三是将该三。
12、种人3型、7型腺病毒的中和抗原表位做为靶蛋白，用于开发诊断试剂盒。0016进一步，本发明提供了一种检测腺病毒感染的方法，即使用上述诊断试剂盒。0017本发明提供了三种人3型、7型腺病毒的中和抗原表位，利用该中和抗原表位可以制备同时预防3型和7型腺病毒感染的二价疫苗，该重组疫苗有如下优点由于腺病毒分子量大，因而能有效地刺激机体产生免疫反应；在六邻体蛋白中插入一个外源抗原表位，则每个腺病毒就可以表达720个抗原表位，抗原表位得以充分表达；目的抗原肽插在六邻体的高变区，易于暴露于病毒壳体的表面，能有效地刺激机体产生免疫反应；为研究基于3型腺病毒载体的腺病毒抗原表位展示重组载体系统打下基础。同时本发明。
13、提供的三种人3型、7型腺病毒的中和抗原表位还能制备药抗体物和检测试剂盒。附图说明0018图1是本发明利用生物信息学分析预测人3型、7型腺病毒的高变区的三维立体说明书CN101942011ACN101942016A3/7页5图。具体实施方式0019为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。0020实施例1生物信息学分析预测人腺病毒的高变区HYPERVARIABLEREGIONS，HVRS0021生物信息学分析的具体步骤如下首先进行人腺病毒六邻体蛋白氨基酸序列。
14、比对，然后利用EMBOSS中的“ANTIGENIC”工具对可能的中和抗原表位进行预测。进而对人3，7型腺病毒六邻体的3D立体结构进行建模和对3D结构上的潜在中和表位进行绘图。最后找到暴露于六邻体“环”表面的位点并定位于序列上的非恒定区高变区。0022图1是上述分析结果的三维立体图，A排为俯视图，B排为侧视图。通过对图1的结果进行分析，可以对人3，7型腺病毒六邻体上的潜在中和抗原表位进行定位，并获得其氨基酸序列。氨基酸序列具体如下所示，其中HVR1，2，5，7分别表示高变区1，2，5，700233型腺病毒ADV30024HVR1IVTTNRDNAVTTTTNT0025HVR2KEGLQIGKDI。
15、TTTEGEEKPIYADK0026HVR5DGRDAVAGALAPEIVLYTEN0027HVR7IKVKTDDANGWEKDAN00287型腺病毒ADV70029HVR1IVTTGEDNATTYT0030HVR2KEGLEIGKDITADNKPIYADK0031HVR5DGREAADAFSPEIVLYTEN0032HVR7IKPRDTAWEKDT0033实施例2构建重组病毒0034为了通过血清中和试验和攻毒实验分析预测得到的3型和7型人腺病毒的高变区HVR的中和抗原表位，发明人用重叠PCROVERLAPPINGPCR方法构建重组病毒。0035用重叠PCROVERLAPPINGPCR方法将7。
16、型腺病毒的HVR1、2、5和7序列替换至PBR322LR质粒上，再与PBRADV3EGFP质粒同源重组。具体得到的重组质粒为PBRADV3ADV71EGFP、PBRADV3ADV72EGFP、PBRADV3ADV75EGFP、PBRADV3ADV77EGFP，其中，PBRADV3ADV71EGFP表示ADV3的高变区1被ADV7的高变区1所替换，其他以此类推。0036将上述重组得到的阳性质粒转染细胞，得到重组病毒MH1、MH2、MH5和MH7；其中重组病毒MH1由重组质粒PBRADV3ADV71EGFP转染细胞得到，以此类推。0037实施例3血清中和试验0038为了制备抗血清，进行血清中和试验。
17、。将纯化的重组病毒MH1、MH2、MH5和MH7以及带增强型绿色荧光蛋白EGFP的野生3型ADV病毒ADV3E和野生7型ADV病毒ADV7分别注射BALB/C小鼠腹腔。分别得到MH1、MH2、MH5和MH7以及ADV3E和ADV7的多克隆说明书CN101942011ACN101942016A4/7页6抗体，然后进行中和试验。分两组进行中和试验第一组是检测抗ADV3E和ADV7血清与重组病毒MH1、MH2、MH5和MH7之间的中和反应，以检测重组病毒中是否包括ADV3和ADV7的中和抗原表位；第二组是检测MH1、MH2、MH5、MH7、ADV3E、ADV7和正常对照小鼠的抗血清与ADV3之间的中。
18、和反应，以检测重组病毒产生的抗体是否具有中和ADV3E病毒的能力。0039具体实验步骤如下00401、细胞准备HEP2细胞长满之后，用胰酶消化，加含10新生牛血清DMEM培养基稀释至96孔细胞培养板，细胞密度为每孔2104个，于375CO2培养箱培养。00412、病毒准备先将各种病毒进行TCID50滴定，所有病毒MH1、MH2、MH5、MH7、ADV7、ADV3E全部稀释至浓度100TCID50。00423、血清准备用含2新生牛血清的无酚红DMEM将抗MH1、MH2、MH5、MH7、ADV7、ADV3E以及正常小鼠血清梯度稀释成25、27、29、211、213、215、217。其中正常小鼠血清。
19、用作阴性对照。00434、不同病毒与不同血清相互做中和试验将稀释好的病毒与每个血清梯度各加50L，混合均匀，放至37温箱孵育1小时，待细胞在细胞板中生长24小时，大约均匀铺满60时，吸尽细胞板中的培养基，用PBS洗两遍，加入孵育好的血清病毒。每个血清梯度做3个平行孔，同时每块细胞板预留5孔正常细胞及5孔病毒感染细胞做对照。加好后，放375CO2培养箱培养。00445、结果读取培养72小时后，1由于病毒MH1，MH2，MH5，MH7，ADV3E表达荧光蛋白，先用荧光显微镜观察并拍照保存结果。小心将细胞板里的培养基吸出，用胰酶消化每孔细胞，再用PBS重悬细胞，转入专用测荧光值96孔板中，485NM。
20、/518NM波长处读数，将测完荧光值的细胞反复冻融3次之后，每孔取50L抽提核酸做定量PCR。2ADV7病毒的中和试验平行做2份，一份用于中性红染色，一份用于荧光定量PCR。ADV7病毒由于不带荧光标记，用中性红染色结果显示。先去除培养板中的培养基，加入50L05中性红溶解于PBS中，37培养箱中孵育1小时，150LPBS洗2次，加染色液染色，于550NM波长读数。0045第一组的中和反应的实验结果见表1，表1为抗ADV3E血清、抗ADV7血清、正常对照小鼠血清和抗重组病毒血清对MH1、MH2、MH5和MH7病毒的中和实验结果。0046表100470048表1中数据显示将ADV3的HVR7改造。
21、为ADV7的HVR7后，抗ADV3E血清对MH7的说明书CN101942011ACN101942016A5/7页7抑制作用出现下降，因而HVR7是ADV3的抗原中和表位。抗ADV7病毒血清对MH2和MH5病毒感染具有抑制能力，因而HVR2和HVR5是ADV7的抗原中和表位。同时，抗ADV3E血清对MH1、MH2、MH5病毒依然具有中和能力，表明对ADV3E的HVR1、HVR2和HVR5进行改造并未改变ADV3E的中和位点，改造后的病毒仍然保有ADV3病毒中和表位。0049第二组的中和反应的实验结果见表2，表2为抗MH1病毒血清，抗MH2病毒血清，抗MH5病毒血清，抗MH7病毒血清，抗ADV3E。
22、病毒血清，抗ADV7病毒血清，正常对照小鼠血清对ADV3E病毒中和能力实验0050表200510052由表2的结果可以看到，用MH7免疫小鼠得到的抗MH7血清由于ADV3的HVR7已经被改造为ADV7的HVR7，因此产生的血清对ADV3病毒的中和能力减弱，进而说明HVR7是ADV3的中和抗原表位。0053实施例4攻毒实验0054为了进一步确证中和表位及该中和表位在疫苗应用方面的研究，进行了攻毒实验，该实验的具体步骤如下00551、按常规免疫程序将小鼠腹腔免疫MH1、MH2、MH5、MH7、ADV3E和ADV7。00562、用滴鼻的方式给小鼠感染ADV7病毒，病毒含量为109拷贝数，滴鼻量为50。
23、L/鼠。00573、于滴鼻后的第三、第五和第七天取小鼠肺页研磨匀浆，取匀浆液做荧光定量PCR，以测定ADV7病毒的含量。00584、同时设立未攻毒小鼠对照，空白未免疫任何病毒小鼠攻毒对照及正常小鼠对照未免疫未攻毒0059实验结果见表30060表30061说明书CN101942011ACN101942016A6/7页80062表3中的数据是应用荧光定量PCR所测定的鼠肺中的ADV7病毒含量。结果表明，免疫过ADV7的小鼠和免疫过MH5的小鼠由于体内有针对ADV7的中和抗体，因此在感染ADV7病毒后，病毒迅速被中和，因此测不出有病毒，证明HVR5是ADV7的中和抗体表位。MH2的结果表明HVR2具。
24、有弱的保护能力。空白是没有免疫过任何病毒的小鼠被ADV7滴鼻感染后肺部的病毒含量，其含量为最高，可作为对照。0063由上述结果可以得出，同时具有ADV3HVR7和ADV7HVR5中和表位的腺病毒3、7型重组体，在免疫小鼠后能够产生体液免疫，使小鼠免受ADV7病毒感染。该实验结果表明可以进一步利用该中和抗原表位制备多价疫苗和药物。0064最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。0065序列表0066人3型。
25、、7型腺病毒的中和抗原表位及其应用00676006810069160070ADV3HVR7PRT007110072ILELYSVALLYSTHRASPASPALAASNGLYTRPGLULYSASPALAASN0073151015007410075210076ADV7HVR2PRT007720078LYSGLUGLYLEUGLUILEGLYLYSASPILETHRALAASPASNLYSPRO00791510150080ILETYRALAASPLYS008120008210083190084ADV7HVR5PRT008530086ASPGLYARGGLUALAALAASPALAPHESERPR。
26、OGLUILEVALLEUTYRTHRGLUASN0087151015008810089480090ADV3HVR7DNA00914说明书CN101942011ACN101942016A7/7页90092ATTAAAGTTAAAACCGATGACGCTAATGGATGGGAAAAAGATGCTAAT48009310094600095ADV7HVR2DNA009650097AAGGAAGGTTTAGAAATTGGGAAAGACATTACTGCAGACAACAAGCCCATTTATGCCGAT60009810099570100ADV7HVR5DNA010160102GATGGTAGAGAAGCTGCTGACGCTTTTTCGCCTGAAATTGTGCTTTACACGGAAAAT57说明书CN101942011ACN101942016A1/1页10图1说明书附图CN101942011A。