抗咪唑啉酮类除草剂的甘蓝型油菜突变基因及其应用 技术领域 本发明涉及植物分子育种领域， 具体地说， 涉及甘蓝型油菜编码乙酰乳酸合成酶 且可以建立咪唑啉酮类除草剂抗性的突变基因核酸序列及其应用。
背景技术 咪唑啉酮类除草剂是美国氰胺公司在 20 世纪 80 年代初开发成功的一类广谱、 用量低、 对哺乳动物低毒和对环境友好的高效除草剂， 通过抑制植物体内支链氨基酸生 物合成关键酶乙酰乳酸合成酶 (acetolactate synthase， ALS)， 也叫乙酰羟基酸合成酶 (acetohydroxyacid synthase， AHAS)， 造成异亮氨酸、 缬氨酸和亮氨酸生物合成受阻， 破坏 植物体内蛋白质合成， 使植物黄化， 生长受抑， 最后逐渐死亡。ALS 负责催化两个平行反应， 催化两分子丙酮酸缩合形成 2- 乙酰乳酸放出 CO2， 最终生成缬氨酸和亮氨酸， 催化一分子丙 酮酸和一分子 2- 氧丁酸缩合形成乙酰羟基丁酸， 最终生成异亮氨酸。以 ALS 为靶酶开发的 除草剂， 已经成为新型高效除草剂的主流产品， 1961 年美国 Du Pont 公司首先报道了嘧啶 类化合物的活性及对植物体内 ALS 的抑制作用， 1982 年该公司成功研发了第一个磺酰脲类 除草剂氯磺隆 (Chlorsulfuron)。 继氯磺隆研发成功以来， 众多国际化学公司相继成功开发 了咪唑啉酮类、 磺酰胺类、 嘧啶水杨酸类和三唑嘧啶磺酰胺类除草剂， 具体的除草剂品种和 商品名更是不计其数。以 ALS 为靶酶的除草剂具有选择性强、 杀草谱广， 活性高、 使用剂量 低， 对哺乳动物毒性小等优点， 既可作土壤处理剂也可茎叶喷施， 除草效率高、 使用方便深 得广大用户欢迎。
国外通过对抗咪唑啉酮类除草剂 ( 包括拟南芥、 水稻、 小麦、 玉米、 油菜、 向日葵 ) 植物的 ALS 基因克隆表明， 抗性作物的产生是由于突变株 ALS 基因 DNA 序列产生了若干碱 基位点的突变， 造成编码蛋白氨基酸残基位点变异， 从而引起除草剂与 ALS 结合方式的变 化。有意思的是， 这些残基位点变异多数都由 5 个必需氨基酸中一个氨基酸被取代所致， 以拟南芥的密码子和氨基酸位置计算 ( 以下同 )， 即 122 位丙氨酸被苏氨酸所取代， 如玉米 的 Mutant1、 中国甜菜的 Sir-13、 向日葵的 CLHA-Plus ； 197 位脯氨酸被组氨酸或丝氨酸所取 代， 如中国甜菜的 sur 和莴苣的 1 个突变体 ； 205 位丙氨酸被缬氨酸所取代， 如向日葵的 Two 突变体 ； 574 位色氨酸被亮氨酸所取代， 如玉米的 XA17、 油菜的 PM2 ； 653 位丝氨酸被天冬酰 胺酸所取代， 如水稻的 PWC16、 小麦的 TeallMl、 玉米的 X112 和 QJ22、 油菜的 PM1。这 5 个必 需氨基酸中有 3 个氨基酸 (122 位丙氨酸、 197 位脯氨酸、 和 205 位丙氨酸 ) 位于 ALS 的氨 基端， 另 2 个 (574 位色氨酸和 653 位丝氨酸 ) 位于酶的羧基端， 这 5 个氨基酸在绝大多数 已知植物的 ALS 序列中的位置相当保守， 只是在苍耳 (Xanthium sp.) 和豚草中 653 位是丙 氨酸， 而不是丝氨酸。另外， 在玉米中还发现 155 位的丙氨酸被苏氨酸和水稻中 654 位的甘 氨酸被谷氨酸取代产生的抗性突变。Whaley 等最近又发现了一个 新突变位点， 即抗咪草 烟 ( 咪唑啉酮类除草剂的一种 ) 的绿穗苋 (Amaranthus hybridus)ALS 酶 376 位天门冬氨 酸被谷氨酸所取代。
甘蓝型油菜 (Brassica napus) 为具有两套基因组 A 和 C 的异源四倍体物种 (2n
＝ 38)。其中基因组 A 有 10 条染色体， 起源于不结球白菜 (Brassica rapa)， 而基因组 C 有 9 条染色体， 起源于花椰菜 (Brassicaoleracea)。Rutledge 等发现在甘蓝型油菜基因组内 存在 5 个 ALS 基因 (ALS1 ～ 5)， 以多基因家族的形式存在， 其多样性超过烟草和拟南芥。甚 至有人提出， 以 ALS 基因作为遗传标记来区分甘蓝型油菜的品种。而作物对咪唑啉酮类抗 性是由于 ALS 基因产生若干碱基位点突变的结果， 但在甘蓝型油菜中仅发现 2 个 ALS 位点 突变产生的抗性油菜， 且都是通过小孢子化学诱变获得， 自然突变产生的抗咪唑啉酮类除 草剂油菜在国内外未见报道。
在已有的国内专利中报道了有关抗咪唑啉酮类除草剂作物有小麦、 玉米、 中国甜 菜、 向日葵， 都是国外公司或研究机构发明。同时， 国内关于抗除草剂油菜的研究材料基本 都来自国外， 抗性基因受国际知识产权保护， 一旦商业化种植， 要向专利拥有者交纳昂贵的 专利费， 大幅度提高油菜生产成本。开发具有自主知识产权的抗 ( 耐 ) 除草剂基因， 是我国 抗除草剂油菜早日进入商业化生产的当务之急。但迄今为止， 国内还没有公开或发表过甘 蓝型油菜抗咪唑啉酮类除草剂的基因及其应用。 发明内容 技术问题
本发明的目的就在于弥补已有专利或技术的不足， 以我们发现的自然突变产生的 抗咪唑啉酮类除草剂甘蓝型油菜品系 M9 为材料， 提供一种抗咪唑啉酮类除草剂的甘蓝型 油菜突变基因的核酸序列， 其编码植物体内乙酰乳酸合成酶， 该酶是植物体内支链氨基酸 生物合成关键酶。
本发明的另一个目的在于提供一种甘蓝型油菜乙酰乳酸合成酶基因突变型的核 酸序列在油菜抗咪唑啉酮类除草剂中的应用。
技术方案 本发明通过以下方案实现 ：
一种抗咪唑啉酮类除草剂的甘蓝型油菜突变基因的核酸序列， 其特征是 ： 该序列 为 SEQ IDNO.1， 由 2006 个碱基组成， 命名为 BnALS1R 基因， 即抗咪唑啉酮类除草剂基因， 编 码乙酰羟基酸合成酶， 又叫乙酰乳酸合成酶， 与其它来源的甘蓝型油菜乙酰乳酸合成酶基 因相比， BnALS1R 基因在 1933 处 G 突变成了 A。
上述的核酸序列编码的蛋白质， 其特征在于 ： 该序列为 SEQ ID NO.2， 由 655 个氨 基酸残基组成， 编码蛋白序列第 638 或等同位置处的氨基酸残基为天冬酰氨酸。
上述的核酸序列用于抗咪唑啉酮类除草剂的甘蓝型油菜的育种方法， 其特征是 ：
(1) 用 M9 单株分别与 MICMS 双低恢复系 3075R 和 3018R 配制 4 个正反交组合， 秋 播对 4 个组合杂种 F1 及亲本在菜苗 3-5 叶期用山东先达化工有限公司生产的咪唑啉酮类 除草剂 5.0％ “豆施乐” 水剂处理， 处理浓度为 90ga.i./hm2， 15d 后调查成活苗与死苗数， 进 行抗性鉴定， 抗性亲本及杂种 F1 均生长正常， 其中 M9 抗性亲本后代株系鉴定， 未发现死苗 和药害现象 ；
(2) 对组合 3075R/M9 和 3018R/M9 的 F1 植株进行小孢子培养， 步骤如下 ：
油菜开花早期于每日上午 7 时左右摘取刚开放第一朵花的花序， 用吸水纸湿润处 理后置于 4℃恒温冰箱 24h ； 次日挑选长度为 4.5mm 左右的花蕾用 70％酒精浸泡 30s， 1％升 汞表面消毒 10min， 无菌水冲洗 3 次， 每次冲洗 2min ； 将消毒花蕾置于无菌玻璃管中， 加 B5
提取液 1ml， 用玻璃棒沿管壁将花蕾捣碎挤出小孢子， 并用 0.22μm 孔径滤膜过滤， 滤液经 1000r/min 的离心机离心 5min， 去除上清液后再加入 B5 提取液悬浮小孢子， 复重 1 次， 去除 上清液， 加入 NLN-13％蔗糖培养液转入三角瓶中 ； 32℃热激培养 24h， 25℃黑暗静止培养， 直至出现可见的小白点胚状体时， 转至 25℃恒温摇床 50r/min 振荡培养， 待胚状体长度达 5mm 左右时转到 B5 固体培养基上， 25℃光照培养， 每天光照时间 16 小时， 直至成苗 ； 将单倍 体小孢子苗用 2％的秋水仙碱溶液浸泡根部 3min 后栽入盆钵， 成株后移入大田 ；
(3) 对活棵苗植株在菜苗 3-5 叶期用有效浓度为 90ga.i./hm2 的咪唑啉酮类除草 剂 “豆施乐” 进行抗性鉴定， 对成活的可育单株套袋自交收获种子 ； 由于 3075R 和 3018R 为 带有不育细胞质的恢复系， 以 3075R 和 3018R 为母本的杂交后代即为获得的转乙酰乳酸合 成酶基因的抗咪唑啉酮 MICMS 恢复系。
有益效果
本发明的甘蓝型油菜乙酰乳酸合成酶基因的突变核酸序列， 可以应用杂交、 回交 等植物常规育种方法将突变核酸序列导入其它对咪唑啉酮类除草剂无抗性的油菜品种或 品系， 提高导入 ALS 基因突变核酸序列目标品种或品系对咪唑啉酮类除草剂的耐受性。同 时， 本发明提供了控制导入 ALS 基因突变核酸序列目标品种或品系附近杂草的方法。该方 法包含， 向杂草和导入 ALS 基因突变核酸序列目标品种或品系使用有效量的咪唑啉酮类除 草剂， 其中与未导入的油菜品种或品系相比， 导入的 ALS 基因突变核酸序列目标品种或品 系具有增加的对咪唑啉酮类除草剂的抗性。
本发明的甘蓝型油菜乙酰乳酸合成酶基因的突变核酸序列的应用研究包括， 但不 限于， 根据本发明发现的序列特征， 设计分子标记， 检测甘蓝型油菜抗咪唑啉酮类除草剂基 因的存在 ； 以该基因突变核酸序列构建载体， 通过转基因方法培育抗咪唑啉酮类除草剂的 油菜品种。
与现有技术相比， 本发明具有下列优点和效果 ：
1、 本发明是在我国油菜中首次发现的甘蓝型油菜抗咪唑啉酮类除草剂的基因。
2、 利用本发明的甘蓝型油菜乙酰乳酸合成酶基因的突变核酸序列， 可以提高其它 对咪唑啉酮类除草剂无抗性的油菜品种或品系对咪唑啉酮类除草剂的耐受性。
3、 本发明的甘蓝型油菜抗咪唑啉酮类除草剂的基因， 打破了我国目前应用的抗除 草剂基因被国外垄断的局面。
本发明还适用于基于该基因的分子标记和基因功能研究、 油菜抗除草剂育种和转 基因研究等方面。 附图说明 图 1—甘蓝型油菜乙酰乳酸合成酶基因的突变核酸序列的 PCR 克隆电泳图
M， DNA 分子量标准， 片段从大到小一次为 200bp、 500bp、 800bp、 1200bp、 2000bp、 3000bp、 4500bp ； 1， 对 照 H 2O 为 模 板 ； 2， 宁 油 16 号 (NY16) 基 因 组 为 模 板 ； 3， 宁 油 18 号 (NY18) 基因组为模极 ； 4， 抗咪唑啉酮类除草剂甘蓝型油菜品系 M9 基因组为模板。
图 2- 与不同来源的油菜乙酰乳酸合成酶基因核酸序列比较图
NY16.seq， 宁油 16 号的乙酰乳酸合成酶基因核酸部分序列 ；
NY18.seq， 宁油 18 号的乙酰乳酸合成酶基因核酸部分序列 ；
Z11524.seq， Genbank 下载序列 ( 登录号 ： Z11524) ； BnALS1R.seq， 甘蓝型油菜品系 M9 乙酰乳酸合成酶基因核酸部分序列， 星号示突变碱基。 图 3- 与不同来源的油菜乙酰乳酸合成酶基因氨基酸序列比较图
NY16.pro， 宁油 16 号的乙酰乳酸合成酶基因氨基酸部分序列 ；
NY18.pro， 宁油 18 号的乙酰乳酸合成酶基因氨基酸部分序列 ；
Z11524.pro， Genbank 下载序列 ( 登录号 ： Z11524) ；
BnALS1R.pro， 甘蓝型油菜品系 M9 乙酰乳酸合成酶基因氨基酸部分序列， 星号示 突变氨基酸。
图 4- 抗咪唑啉酮的 DH 株系抗性基因 BnALS1R 的 PCR 鉴定电泳图
M， DNA 分子量标准， 片段从大到小一次为 200bp、 500bp、 800bp、 1200bp、 2000bp、 3000bp、 4500bp ； 1， 对照宁油 18 号基因组为模板 ； 2-8， 抗咪唑啉酮的 DH 株系基因组为模 极。
图 5- 抗咪唑啉酮的 DH 株系抗性基因 BnALS1R 的测序结果图
1， 对照宁油 18 号基因组为模板的 PCR 产物测序得到的核酸部分序列 ； 2-8， 抗咪唑 啉酮的 DH 株系基因组为模板的 PCR 产物测序得到的核酸部分序列。阴影示 BnALS1R 突变 碱基。
具体实施方式 下列实施中所有方法如无特别说明均为常规方法。
( 一 ) 甘蓝型油菜乙酰乳酸合成酶基因的突变核酸序列的 PCR 克隆及测序
苗期取突变体 M9， 即抗咪唑啉酮类除草剂的自生油菜突变株 ( 公知公用， 见高建 芹等， 植物遗传资源学报， 2010， 11(3) ： 369-373) 鲜嫩叶片， -70℃保存备用。油菜基因组总 DNA 提取方法参照 Murray 等 (1980) 提出的 CTAB 方法并作改良。步骤如下 ：
(1) 取 0.2g 左 右 叶 片 放 在 研 钵 中， 加 入 液 氮 磨 碎， 转 入 1.5ml 离 心 管 中 ； (2) 加 700μl 提 取 缓 冲 液 (2 ％ CTAB， 100mM Tris pH8.0， 20mM EDTA pH8.0， 1.4M NaCl， 临 用 时 加 1 ％ β-Me)， 混 匀， 65 ℃ 水 浴 1.5h ； (3) 冰 上 冷 却， 离 心 12000rpm， 5min ； (4) 吸 上 清， 加 RNase( 终 浓 度 20μg/ml)， 37 ℃ 保 温 0.5h ； (5) 加 苯 酚 ∶ 氯 仿 ∶ 异 戊 醇 (25 ∶ 24 ∶ 1)600μl， 上下混匀 ； (6) 离心， 12000rpm， 15min ； (7) 取上清液， 加氯仿∶异戊 醇 (24 ∶ 1)600μl， 上下混匀 ； (8) 离心， 12000rpm， 15min ； (9) 取上清液， 加入 300μl-20℃ 预冷的异丙醇， 上下混匀， -20 ℃ 0.5h ； (10) 离心， 10000rpm， 10min ； (11) 沉淀用 600μl 70％乙醇悬浮清洗两次 ； (12) 弃乙醇， 真空抽干， DNA 用 200μl 1×TE 缓冲液溶解， (13) 用 1％琼脂糖凝胶电泳检测所提 DNA 质量， 样品 -20℃冷冻保存备用。
利 用 NCBI 数 据 库 中 已 知 的 ALS 基 因 序 列， 在基因编码区段两侧设计能够扩 增 出 全 长 的 PCR 引 物。 其 正 向 引 物 F ： 5’ CATCTCTCTCTCCTCTAACCA3’和 反 向 引 物 R ： 5′ GATCACCAGCTTCATCTCTC3′。
以提取的油菜基因组 DNA 为模板， 利用设计的正向引物 F 和反向引物 R， 在 MJ Research PTC-200 型 PCR 仪上进行扩增。PCR 反应体系为 ： 共 50μl， 其中， 1μl 基因组 2+ DNA， 5μl 正向引物 F(100nM)， 5μl 反向引物 R(100nM)， 5μl 10×buffer(Mg free)， 4μl
dNTPs( 各 2.5mM)， 3μl MgCl2(25mM)， 0.25μl TaKaRa Taq(5U/μl)， 加 ddH2O 至 50μl。 PCR 反应程序 ： 94.0℃变性 5min ； 94.0℃变性 30s、 55℃退火 30s、 72℃延伸 2min， 共循环 35 次； 72℃延伸 5min ； 10℃保存。
电泳结果见图 1， 按北京 Tiangen 公司生产的普通琼脂糖凝胶 DNA 同收试剂盒 ( 目 录号 ： DP209) 步骤进行 PCR 产物纯化回收， PCR 产物大小为 2006bp。纯化的 PCR 产物送南 京金斯瑞生物有限公司测序。测序结果表明该基因编码油菜乙酰乳酸合成酶， 具有序列表 SEQ ID NO.1 的核酸序列， 由 2006 个碱基组成， 将其命名为 BnALS1R， 即抗咪唑啉酮类除草 剂基因， BnALS1R 具有编码序列表 SEQ IDNO.2 的氨基酸残基序列的蛋白质。
( 二 ) 向传统油菜品种或品系导入抗性基因 BnALS1R
用 M9 单株分别与 MICMS 双低恢复系 3075R( 浦惠明等， 2002， 江苏农业科学， 4： 33-34) 和 3018R( 浦惠明等， 1999， 江苏农业科学， 6： 32-33) 配制 4 个正反交组合， 秋播对 4 个杂种 F1 及亲本在菜苗 3-5 叶期用山东先达化工有限公司生产的咪唑啉酮类除草剂 5.0％ “豆施乐” 水剂处理， 处理浓度为 90ga.i./hm2， 15d 后调查成活苗与死苗数， 进行抗性鉴定， 2 个敏感型亲本共鉴定 211 株， 喷药后 15d 内全部死亡， 而抗性亲本及杂种 F1 均生长正常， 其 中 M9 抗性亲本后代 2 个株系共鉴定 429 株， 未发现死苗和药害现象。 对组合 (3075R/M9) 和 (3018R/M9) 的 F1 植株进行小孢子培养。步骤如下 ：
1) 油菜开花早期于每日上午 7 时左右摘取刚开放第一朵花的花序， 用吸水纸湿润 处理后置于 4℃ 恒温冰箱 24h。
2) 次日挑选长度为 4.5mm 左右的花蕾用 70 ％酒精浸泡 30s， 1 ％升汞表面消毒 10min， 无菌水冲洗 3 次， 每次冲洗 2min。
3) 将消毒花蕾置于无菌玻璃管中， 加 B5 提取液 1ml， 用玻璃棒沿管壁将花蕾捣碎 挤出小孢子， 并用 0.22μm 孔径滤膜过滤， 滤液经 1000r/min 的离心机离心 5min， 去除上清 液后再加入 B5 提取液悬浮小孢子， 复重 1 次， 去除上清液， 加入 NLN-13(13％蔗糖 ) 培养液 转入三角瓶中。
4)32℃热激培养 24h， 25℃黑暗静止培养， 直至出现可见的小白点胚状体时， 转至 25℃恒温摇床 50r/min 振荡培养， 待胚状体长度达 5mm 左右时转到 B5 固体培养基上， 25℃ 光照培养， 每天光照时间 16 小时， 直至成苗。
5) 将单倍体小孢子苗用 2％的秋水仙碱溶液浸泡根部 3min 后栽入盆钵， 成株后移 入大田。
对活棵苗植株在菜苗 3-5 叶期用有效浓度为 90ga.i./hm2 的咪唑啉酮类除草剂 “豆施乐” 进行抗性鉴定， 对成活的可育单株套袋自交收获种子。由于 3075R 和 3018R 为带 有不育细胞质的恢复系， 以 3075R 和 3018R 为母本的杂交后代命名为 DH 株系， 只要是可育 的单株均为抗咪唑啉酮的 M1CMS 恢复系。
( 三 ) 抗咪唑啉酮的 DH 株系抗性基因 BnALS1R 的 PCR 鉴定
苗 期 取 上 述 得 到 的 抗 咪 唑 啉 酮 DH 株 系 的 鲜 嫩 叶 片 提 取 DNA， 进行抗性基因 BnALS1R 的 PCR 鉴定。
电泳结果见图 4， 按北京 Tiangen 公司生产的普通琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒 ( 目 录号 ： DP209) 步骤进行 PCR 产物纯化回收， PCR 产物大小为 2006bp。送南京金斯瑞生物有 限公司测序。测序结果见图 5， 表明抗咪唑啉酮 DH 株系的乙酰乳酸合成酶基因具有序列表
SEQ ID NO.1 的核酸序列， BnALS1R 具有编码序列表 SEQ ID NO.2 的氨基酸残基序列的蛋白 质。