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1、10申请公布号CN101940786A43申请公布日20110112CN101940786ACN101940786A21申请号200910273436722申请日20091228CTCCNOM20930320091216A61K39/102200601A61K48/00200601A61P31/04200601G01N33/56920060171申请人华中农业大学地址430070湖北省武汉市洪山区狮子山街1号72发明人周锐金卉郭志伟严琦陈焕春74专利代理机构武汉宇晨专利事务所42001代理人王敏锋54发明名称副猪嗜血杆菌免疫原性蛋白基因PILA的应用57摘要本发明属于兽医微生物学和动物传染病技。
2、术领域。具体涉及副猪嗜血杆菌的一个具有免疫原性蛋白基因的分离、克隆以及它编码的蛋白在疫苗和诊断中的应用。本发明从副猪嗜血杆菌的强毒株SH0165菌株中分离得到一个新的具有免疫原性的蛋白基因PILA；它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所示，编码150个氨基酸。该基因的编码产物为一种新的具有免疫原性蛋白PILA；该蛋白PILA对仔猪感染副猪嗜血杆菌0165能提供有效的免疫保护力。本发明还包括表达免疫原性蛋白基因PILA的大肠杆菌重组菌DH5/HPSPILA的制备，该重组大肠杆菌菌已保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，其保藏编号为CCTCCNOM209303。83生物保藏信息51INTCL1。
3、9中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页附图3页CN101940790A1/1页21PILA基因作为副猪嗜血杆菌的免疫原性蛋白的应用，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所示，编码150个氨基酸。2一株表达副猪嗜血杆菌的免疫原性蛋白基因的重组大肠杆菌ESCHERICHIACOLIDH5/HPSPILA，保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCCNOM209303。3权利要求1所述的应用，其中的应用包括在制备副猪嗜血杆菌病亚单位疫苗中的应用。4权利要求1所述的的应用，其中的应用包括在制备副猪嗜血杆菌病诊断试剂中的应用。5权利要求2所述的保藏编号为。
4、CCTCCNOM209303的重组大肠杆菌在制备副猪嗜血杆菌病亚单位疫苗中的应用。6权利要求2所述的保藏编号为CCTCCNOM209303的重组大肠杆菌在制备副猪嗜血杆菌病诊断试剂中的应用。权利要求书CN101940786ACN101940790A1/7页3副猪嗜血杆菌免疫原性蛋白基因PILA的应用技术领域0001本发明属于兽医微生物学和动物传染病技术领域。具体涉及副猪嗜血杆菌的一个具有免疫原性蛋白基因的分离、克隆以及它编码的蛋白在疫苗和诊断中的应用。背景技术0002副猪嗜血杆菌HAEMOPHILUSPARASUIS，HPS是巴斯德菌科的一种革兰氏阴性小杆菌，是副猪嗜血杆菌病DISEASE的病。
5、原体。作为当前危害世界养猪业最为严重的细菌性传染病之一，副猪嗜血杆菌病可以影响2周龄到4月龄的猪，仔猪主要在断奶前后和保育阶段发病，通常见于58周龄的猪，发病率一般在1015，严重时死亡率高达50。主要临床症状表现为咳嗽、呼吸困难、消瘦、跋行和死亡；剖检的主要病变表现为多发性浆膜炎纤维素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎等。副猪嗜血杆菌还可引起败血症，并且在急性感染后可能留下后遗症，即母猪流产、公猪慢性跛行，增加了种猪的淘汰率。此外，由于猪群中副猪嗜血杆菌的带菌率很高，在猪群发生猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病等病毒性传染病时，副猪嗜血杆菌病的发病率会急剧升高，危害更为严重，造成大批猪死。
6、亡。0003近年来，副猪嗜血杆菌病在规模化猪场的高健康猪群的发病率和死亡率都显著升高CAIX，CHENH，BLACKALLPJ，YIN，Z，WANG，L，LIUZANDJINMSEROLOGICALCHARACTERIZATIONOFHAEMOPHILUSPARASUISISOLATESFROMCHINAVETMICROBIOL，2005，111231236。由于该病在多数情况下爆发突然，抗生素等抗微生物药物的治疗作用非常有限，而且耐药性的产生迅速，因此，药物和免疫预防是防控该病的主要途径。目前，常规灭活菌苗是世界上唯一可以用于该病免疫防治的一类疫苗，在包括中国在内的多个国家实现了商业化。这些。
7、灭活疫苗一般由2个或3个血清型的地方流行菌株制备而成BAUMANNG，BILKEIGEFFECTOFVACCINATINGSOWSANDTHEIRPIGLETSONTHEDEVELOPMENTOFDISEASEINDUCEDBYAVIRULENTSTRAINOFHAEMOPHILUSPARASUISSEROVAR5VETREC，2002，1511821；BAKH，RIISINGHJPROTECTIONOFVACCINATEDPIGSAGAINSTEXPERIMENTALINFECTIONWITHHOMOLOGOUSANDHETEROLOGOUSHAEMOPHILUSPARASUISVETREC。
8、，2002，151502505，但是，目前已经鉴定的副猪嗜血杆菌至少有15种血清型，还有约12的分离株尚不能分型，而且不同国家和地区流行的优势血清型不尽相同，不同血清型菌株之间缺乏或仅能提供有限的交叉免疫保护，常规多价灭活疫苗的交叉免疫保护率有限，只有在流行菌株血清型相符的地区的猪群中才能提供较好的免疫保护OLIVEIRAS，PIJOANCHAEMOPHILUSPARASUISNEWTRENDSONDIAGNOSIS，EPIDEMIOLOGYANDCONTROLVETMICROBIOL，2004B，99112。因此，副猪嗜血杆菌保守的保护性抗原的鉴定是该病新型疫苗研制的技术关键。到目前为止，国。
9、际上关于副猪嗜血杆菌保护性抗原的报道还较少，周明光等2009年发表于VACCINE上的一篇论文首次做了对四个蛋白外膜蛋白PALA，OMP2，D15和假设蛋白HPS06257的免疫原性做了初步的研究ZHOUM，GUOY，ZHAOJ，HUQ，HUY，ZHANGA，CHENH，JINMIDENTIFICATIONANDCHARACTERIZATIONOFNOVEL说明书CN101940786ACN101940790A2/7页4IMMUNOGENICOUTERMEMBRANEPROTEINSOFHAEMOPHILUSPARASUISSEROVAR5VACCINE，2009，273852717。0004。
10、PILA蛋白属于蛋白质二型分泌系统IV型菌毛TYPEIVPILI；PILA蛋白与DNA的摄取相关；致病过程中介导细菌吸附于黏膜上皮细胞完成入侵的第一步，在流感嗜血杆菌中PILA基因对其菌毛及生物被膜的产生以及对该病原菌在哺乳动物上呼吸道上皮细胞的定植起着重要的作用。程安春等2007将鸭源和鸡源致病性大肠杆菌的PILA重组蛋白疫苗，分别在雏鸭和雏鸡进行免疫，能得到很高的ELIAS抗体效价，通过攻毒实验观察，该重组蛋白对宿主有着有效地保护效果程安春，于小娜，汪铭书，朱德康，李玲，孙磊，陈孝跃鸭源致病性大肠杆菌I型菌毛PILA基因的原核表达及重组蛋白对强毒攻击的免疫保护作用生物工程学报，2007，2。
11、3440445；于珊，张倩，水小溪，于宙亮，赵宝华致病性鸡大肠杆菌PILA基因和外膜蛋白C基因的克隆生物工程学报，2008，2415611567。发明内容0005本研究的目的在于克隆一个具有免疫原性的副猪嗜血杆菌的蛋白基因，利用其编码的蛋白应用于研制对副猪嗜血杆菌感染具有保护力的亚单位疫苗和诊断试剂中。0006本发明是这样实现的0007申请人从副猪嗜血杆菌的地方分离株SH0165菌株菌株来源参见实施例1中克隆到IV型菌毛蛋白基因PILA。经过测序发现本发明的蛋白基因PILA其编码区由453个碱基组成，具有序列表SEQIDNO1所示的核苷酸序列。经过序列分析发现的PILA基因编码的蛋白PILA是。
12、由150个经过序列分析发现本发明的PIL4基因编码的蛋白PILA是由286个氨基酸残基组成，具有序列表SEQIDNO1所示的氨基酸序列，去掉信号肽部分之后表达蛋白预计分子量大小为15KDA。通过原核表达和室内生物测定证实本发明的基因PILA在微生物中表达的PILA蛋白，能够对副猪嗜血感染有保护作用，这就预示着该蛋白可以用于研制副猪嗜血杆菌的亚单位疫苗。0008本发明提供的上述基因序列是副猪嗜血杆菌的具有免疫原性的蛋白基因，该蛋白还可以应用于对于副猪嗜血杆菌的诊断和疫苗的研制中。0009更详细的技术方案参考实施例部分的描述。附图说明0010序列表SEQIDNO1是本发明分离克隆的副猪嗜血杆菌免疫。
13、原性蛋白基因的核苷酸序列及其编码的蛋白质序列；0011图1是本发明实施例中副猪嗜血杆菌免疫原性蛋白基因PILA所在的原核表达载体PET28A/HPSPILA的构建图和物理图谱；0012图2是本发明实施例中副猪嗜血杆菌免疫原性蛋白基因PILA在重组菌BL21中表达纯化的SDSPAGE电泳分析；图中M蛋白质分子量标准；0013图3评估免疫原性蛋白免疫仔猪后的抗体水平；0014图4蛋白对仔猪免疫的致死保护率；说明书CN101940786ACN101940790A3/7页5具体实施方案0015以下叙述是根据本发明实施方案的实施例。应该说明的是，本发明的实施例对于本发明只有说明作用，而没有限制作用。有关。
14、DNA的标准操作方法和所使用的药品均参考分子克隆实验指南所描述的内容参见萨姆布鲁克和拉塞尔，2001，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等译，科学出版社，北京。本发明中所涉及的其他各种实验操作，均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。0016实施例1副猪嗜血杆菌SH0165菌株免疫原性蛋白基因PILA的克隆0017本发明以副猪嗜血杆菌SH0165作为免疫原性蛋白基因PILA的来源菌株该菌株的来源见文献YUEM，YANGF，YANGJ，BEIW，CAIX，CHENL，DONGJ，ZHOUR，。
15、JINM，JINQ，CHENHCOMPLETEGENOMESEQUENCEOFHAEMOPHILUSPARASUISSH0165JBACTERIOL2009，19141359600018该菌株为地方分离株，血清型5型，感染了一定剂量的该菌株的仔猪或青年猪会在4日内发病或死亡，为高毒力菌株00191副猪嗜血杆菌SH0165中免疫原性蛋白基因PILA的克隆0020利用副猪嗜血杆菌SH0165的基因组为模板，申请人依据该基因的特异序列并在两端引入酶切位点BAMHI和XHOI设计上游引物P1引物序列为5ATAGGATCCTCTTACACCAGTTACAC3和下游引物P2引物序列为5ATACTCGAGT。
16、TATTGCCTACAGAAATTC3，进行PCR扩增以获得目标基因，PCR反应的体系和程序如下002125L反应体系包含25L10PCR反应缓冲液，1LDNTP各25MM，05L特异性上游引物P120MM，05L特异性下游引物P220MM，1L模板副猪嗜血杆菌SH0165，025LEXTAQ酶，加灭菌去离子水至25L。PCR反应参数和程序为94，5MIN，1个循环；94，30S，60，30S，72，1MIN，30个循环；72，10MIN，1个循环。0022将扩增到的目标片段通过PCR产物回收试剂盒【购自生工生物工程上海有限公司】纯化回收后通过T/A克隆连接到T载体PMD18TSIMPLEVE。
17、CTOR上购自TAKARA公司，将目标片段连接到PET28A【购自默克公司上海】得到含有PILA全长序列的重组质粒PET28A/HPSPILA见图1。之后将该重组质粒转化大肠杆菌ECOLIDH5，并涂布卡那霉素抗性平板KANR，终浓度为50G/ML。将抗性平板置于37培养箱中培养1216H，待转化子长到一定大小以后，筛选转化子。将筛选到的转化子用5ML的液体LB培养基活化培养，然后抽提质粒进行酶切验证，酶切片段大小与预期大小一致。最后将筛选到的阳性转化子用5ML的液体LB培养基活化培养，取1ML的过夜培养物送样测序由北京三博远志生物技术有限责任公司完成。测序结果显示该基因具有如序列表SEQID。
18、NO1中所示的核苷酸序列，申请人将该基因命名为PILA在本发明中，被命名的基因以斜体小写表示。通过软件分析预测此段编码序列可编码一个如序列表SEQIDNO1中所示的由116个氨基酸组成的多肽片段，预测其分子量为15KDA，申请人将其命名为PILA在本发明中，被命名的蛋白以正体大写表示。0023申请人将上述转化了重组质粒PET28A/HPSPILA的重组大肠杆菌命名为大肠杆菌ESCHERICHIACOLIDH5/HPSPILA，于2009年12月16日将该重组大肠杆菌送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心CCTCC保藏，其保藏编号为CCTCCNO说明书CN101940786ACN10。
19、1940790A4/7页6M209303。0024实施例2副猪嗜血杆菌免疫原性蛋白基因PILA在大肠杆菌BL21中的表达纯化及对副猪嗜血感染保护力的检测00251副猪嗜血杆菌免疫原性蛋白基因PILA在大肠杆菌BL21中的表达和纯化0026为了大量表达PILA蛋白，申请人将上述携带有其编码序列的重组表达质粒PET28A/HPSPILA转化到大肠杆菌BL21大肠杆菌购自TIANGEN公司中，得到了重组菌BL21/PET28A/HPSPILA。将该重组菌株BL21/PET28A/HPSPILA接种于5MLLB液体培养基中附加终浓度为50G/ML卡那霉素，过夜活化。以1100V/V转接至50MLLB液。
20、体培养基中，置于37摇床培养至OD600为0508左右以后，加入10MMOL/L的异丙基BD硫代半乳糖苷即IPTG，购自SIGMA公司于37诱导培养3H。将上述50ML重组菌BL21/PET28A/HPSPILA的3H诱导培养物经过12000RPM离心30S收集菌体，利用超声波技术参数功率400W，破碎30S，间歇30S将细胞破碎后12000RPM离心15MIN取上清。然后将上清液过NIIDA亲和层析柱HIS镍柱购自NOVAGEN公司提纯该特异蛋白PILA具体的纯化步骤按照试剂盒操作说明书进行。对最终的纯化产物进行SDSPAGE电泳检测，结果如图2所示，提纯的蛋白与蛋白分子量标准比对，估算分子。
21、量为15KDA，与预计的PILA蛋白分子量大小基本吻合，证明本发明的副猪嗜血杆菌免疫原性蛋白PILA在大肠杆菌BL21中得到了成功的表达。00272对副猪嗜血杆菌免疫原性蛋白进行免疫后仔猪抗体水平评价0028为了对PILA蛋白进行免疫后抗体水平评价，申请人将PILA及其他4个副猪嗜血杆菌的蛋白，灭活苗及佐剂对照进行免疫后仔猪抗体水平评价。将仔猪随机分成7组，每组3头猪。第1组每只肌肉注射副猪嗜血杆菌灭活苗25G与等体积氢氧化铝佐剂混合。第26组注射各个副猪嗜血杆菌的重组蛋白加入等体积氢氧化铝佐剂；第7组为对照组，注射氢氧化铝佐剂。第1次，每只200G蛋白，总剂量3ML/只，约2周后颈静脉采血大。
22、约1ML，进行ELIAS检测。第2次，剂量为500G/3ML/只，1周后进行ELIAS检测。第3次，剂量为500G/3ML/只。0周为第一次免疫，2周为第二次免疫，4周为第三次免疫；第0，1，3，5周进行了采血检测图3。结果显示PILA蛋白在二免后，抗体水平就已经达到较好的水平。00293副猪嗜血杆菌免疫原性蛋白对副猪嗜血感染保护力的检测0030申请人将PILA及其他4个副猪嗜血杆菌的蛋白，灭活苗及佐剂对照进行三免7天后用副猪嗜血杆菌分离菌株进行感染试验，副猪嗜血杆菌SH0165株经气管内注射21头猪，每头猪注射3ML菌液21010/只。注射后连续观察6天。将纯化的蛋白DNAK，GIDA，PI。
23、LA，RFFA和SIAB免疫仔猪，攻毒评价重组表达蛋白的免疫保护力。致死保护力率如图4所示，灭活苗和PILA蛋白免疫组的致死保护率为100，GIDA蛋白和佐剂免疫组的致死保护率为0。0031通过评分评价，结果如表1所示。其中PILA蛋白免疫对阴性对照差异显著P001，而PILA蛋白免疫对灭活苗免疫差异不显著P005。0032表1副猪嗜血杆菌免疫原性蛋白对副猪嗜血感染保护力的评测0033说明书CN101940786ACN101940790A5/7页700340035序列表0036华中农业大学0037副猪嗜血杆菌免疫原性蛋白基因PILA的应用0038130003920091225说明书CN1019。
24、40786ACN101940790A6/7页8004020041PATENTINVERSION310042100434530044DNA0045副猪嗜血杆菌HAEMOPHILUSPARASUIS00460047GENE00481453004900500051CDS005214530053005410055ATGAAAAAAATCAGGTTAATTCGACCGCTTGCAAAAGCCTTTACCTTA480056METLYSLYSILEARGLEUILEARGPROLEUALALYSALAPHETHRLEU00571510150058ATTGAGTTAATGATCGTGATCGCCATCATTG。
25、CCATTTTAGCAACAATA960059ILEGLULEUMETILEVALILEALAILEILEALAILELEUALATHRILE00602025300061GCAATCCCGTCTTACACCAGTTACACCCAAAAGGCAGCTCTCTCTGAG1440062ALAILEPROSERTYRTHRSERTYRTHRGLNLYSALAALALEUSERGLU00633540450064TTATTAAGTGCTTCCGCATCTTATAAATCCGATGTGGAAATTTGTATT1920065LEULEUSERALASERALASERTYRLYSSERASPVALGLUILEC。
26、YSILE00665055600067TATAACGTAGGGGATAAAAAAATCTCGGAATGTAGTTCAGGTAAAAAT2400068TYRASNVALGLYASPLYSLYSILESERGLUCYSSERSERGLYLYSASN0069657075800070GGCGTTCGAGCAGATAAATCCGATGTCCCTGACGCGAAATACCTTAAA2880071GLYVALARGALAASPLYSSERASPVALPROASPALALYSTYRLEULYS00728590950073TCTATTTCCGTCGCTTCGGGGGTAATCACCGTGGCAGGTAAAGGC。
27、AAT3360074SERILESERVALALASERGLYVALILETHRVALALAGLYLYSGLYASN00751001051100076ATTGATGGCTACGGCTACACAATGACTCCGAAATTCGCTAATAACAAC3840077ILEASPGLYTYRGLYTYRTHRMETTHRPROLYSPHEALAASNASNASN0078115120125说明书CN101940786ACN101940790A7/7页90079ATCACTTGGGCAACAAGCTGTCAAGGGGCTGACATTAGTTTGTTCCCT4320080ILETHRTRPALATHRSER。
28、CYSGLNGLYALAASPILESERLEUPHEPRO00811301351400082GAGAATTTCTGTAGGCAATAA4530083GLUASNPHECYSARGGLN00841451500085200861500087PRT0088副猪嗜血杆菌HAEMOPHILUSPARASUIS008920090METLYSLYSILEARGLEUILEARGPROLEUALALYSALAPHETHRLEU00911510150092ILEGLULEUMETILEVALILEALAILEILEALAILELEUALATHRILE00932025300094ALAILEPROSERTYRT。
29、HRSERTYRTHRGLNLYSALAALALEUSERGLU00953540450096LEULEUSERALASERALASERTYRLYSSERASPVALGLUILECYSILE00975055600098TYRASNVALGLYASPLYSLYSILESERGLUCYSSERSERGLYLYSASN0099657075800100GLYVALARGALAASPLYSSERASPVALPROASPALALYSTYRLEULYS01018590950102SERILESERVALALASERGLYVALILETHRVALALAGLYLYSGLYASN01031001051100104ILEASPGLYTYRGLYTYRTHRMETTHRPROLYSPHEALAASNASNASN01051151201250106ILETHRTRPALATHRSERCYSGLNGLYALAASPILESERLEUPHEPRO01071301351400108GLUASNPHECYSARGGLN0109145150说明书CN101940786ACN101940790A1/3页10图1说明书附图CN101940786ACN101940790A2/3页11图2图3说明书附图CN101940786ACN101940790A3/3页12图4说明书附图CN101940786A。