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罗尔斯通氏菌株及其在石油污染盐碱土壤生物修复中的应 用
    技术领域 本发明属于微生物及微生物应用领域， 具体涉及一种罗尔斯通氏菌株 （Ralstonia sp.） 及其在石油污染盐碱土壤生物修复中的应用。
     背景技术 在石油及其产品的生产和使用过程中不可避免地会带来土壤污染问题， 如我国石 油企业每年产生的落地原油约 700 kt， 经回收处理后， 仍有 70 kt 进入土壤环境。 石油及石 油产品中普遍含有多环芳烃 (polycyclic aromatic hydrocarbons， PAHs)、 苯、 甲苯、 乙苯、 二甲苯和酚类等有毒有害物质， 这些有毒有害物质中的大多被认为是具有 “三致” （致癌、 致 畸、 致突变） 危害的物质， 如何治理石油污染， 特别是修复由多环芳烃造成的环境污染， 已成 为世界各国学者共同关注的课题。PAHs 是一类持久性有机污染物， 具有较强的致癌、 致畸、 致突变性， 它给生态环境安全和人类健康带来了很大的威胁， 世界上大多数国家都已将其 列为优先控制污染物。 环境中 PAHs 绝大多数积累于土壤中， 在适宜的情况下它们可能迁移 到其他环境介质中， 扩大污染范围并改变暴露途径， 同时也可以通过生物链传递作用积累 于人体内， 直接危害人类的健康。所以说修复 PAHs 污染， 尤其是修复被 PAHs 长期污染的土 壤显得十分重要和迫切。
     经过其他技术 （如物理清除） 处理后， 总会留下大量不能完全清除的污染物。生物 修复技术作用长期彻底， 而且还具有价格低廉、 无毒环保等诸多优势， 所以采用生物技术促 进有机物降解， 是恢复生态环境的最佳途径。发展和推广有机物污染生物治理技术有着很 广阔的应用前景。
     土壤环境中持久性有机污染物的生物修复技术是国际污染环境修复领域研究的 热点。其中， 石油导致的土壤污染问题中 PAHs 的生物修复技术是国际上研究的重点之一。 PAHs 在环境中的降解或消除途径主要包括挥发、 光氧化、 化学氧化、 生物富集、 土壤吸附及 微生物降解等一些方式， 微生物是自然环境中影响 PAHs 环境化学行为的关键因素之一， 决 定着 PAHs 的最终归宿。通常， PAHs 污染土壤中存在大量可降解 PAHs 的微生物， 微生物降 解已成为 PAHs 污染土壤生物修复的重要技术手段。
     PAHs 污染土壤微生物修复技术的核心是选育 PAHs 高效降解微生物和充分发挥降 解微生物的降解作用。被 PAHs 长期污染的土壤中存在 PAHs 高效降解菌， 但由于土壤中残 留 PAHs 浓度逐渐降低， 且难以为生物所利用， 高效降解菌数量少且活性低。因此， 对于低浓 度 PAHs 污染的土壤， 可通过以下两种方法加强微生物对 PAHs 的降解 ： （1) 改善微生物生存 环境， 保持微生物的长期活性 ； （2) 提高污染物的生物可利用性。2004 年， Xu 和 Obbard 对 新加坡石油污染的海岸带进行了生物修复， 发现 45 天以后在处理后的土壤中仅有 9.3% 的 在该区域中 Alcanivorax borkumensis 和 Pseudomonas stutzeri 两株解烃菌 PHAs 残留， 始终是优势菌株。 Robert 等使用白腐真菌 (phanerochate chrysosporium) 处理受多环芳 烃污染的土壤。起始土壤中多环芳烃为 41g/kg。36 天后， 低分子量多环芳烃的降解率为
     70％～ 100％， 高分子量多环芳烃的降解率为 50％～ 60％， 土壤中多环芳烃降为 18g/kg。
     黄河三角洲地区拥有丰富的油气资源， 这里油井分布广泛的同时污染也十分严 2 重， 一般井场污染范围在 1000-2000 m 之间。另外， 近年来黄河断流影响了黄河三角洲湿 地生态系统淡水水源的补给， 破坏了湿地土壤中水盐的平衡， 致使土壤的含盐量上升， 土壤 盐碱化现象日益严重。在高盐条件下， 微生物既要忍受长期的高渗透压胁迫， 又要承受短 期的渗透冲击。当盐度 >3% 时， 非嗜盐微生物的代谢会受到抑制， 使其生物修复效率明显降 低， 甚至丧失修复能力。当盐度从 0.5% 升高至 2% 时， 也会严重扰乱非嗜盐微生物的代谢活 动。因此， 传统的非嗜盐微生物并不适合对污染的高盐环境进行生物修复。盐碱地石油污 染土壤治理给微生物修复技术带来了新的挑战。 因此亟待找到一种耐盐碱菌对由石油污染 的盐碱土壤进行生物修复。
     嗜盐菌属于极端微生物中的一种， 其结构与理化性质的研究受到国内外生物领域 界的广泛关注。 关于嗜盐菌的研究工作相对集中在自然环境嗜盐微生物方面， 如崔恒林、 潘 海莲、 柴丽红等人分别从新疆、 内蒙古、 青海等地的盐湖中， 分离和研究了不同类群的嗜盐 菌株。然而对人工环境中的嗜盐微生物， 特别是嗜盐细菌的研究很少。
     随着石油工业的发展， 黄河三角洲地区石油污染日趋严重， 该地盐渍化土地面积 大， 土壤含盐量高， 迫切的需要通过生物技术来修复该地的土壤。因此有必要进一步研究， 找到一种适合在高盐碱浓度下降解石油和多环芳烃等有毒有害物质的菌株， 这对于生物修 复技术具有很重要的理论价值和实际应用价值。 发明内容 本发明所要解决的技术问题在于， 提供一种罗尔斯通氏菌株 （Ralstonia sp.） 及 其在高盐碱浓度下降解石油中多环芳烃的应用， 该菌株可在高盐碱浓度下有效的治理由石 油及其产品所带来的土壤污染。
     本发明提供的罗尔斯通氏 （Ralstonia sp.） 菌株， 是烃降解菌株， 于 2009 年 11 月 04 日保藏于 “中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心” ， 其保藏号为 CGMCC No.3389。
     在微生物修复技术中经常用到的烃降解菌株， 它们以自己的方式摄取烃类， 然后 参与自身代谢， 最终生成小分子有机酸。目前所知的微生物细胞对于烷烃的摄取机制之一 就是细胞与烃液滴直接作用 ： 微生物细胞可吸附到比自己大得多的烃液滴表面， 物质的运 输主要靠被动扩散和主动运输。烃类物质的这种摄取方式， 菌体细胞表面疏水性起到关键 作用。
     罗尔斯通氏菌 （Ralstonia sp.） XB CGMCC No.3389 的菌落特征 ： 在 LB 平板上培养 一天的菌落大小直径 1-2mm， 菌落较小， 圆形、 边缘规则、 表面干燥、 不透明， 白色。
     罗尔斯通氏菌 （Ralstonia sp.） XB CGMCC No.3389 的细胞形态特征 ： 菌体呈圆杆 状， 较小， 不产芽孢， 革兰氏染色阴性。
     罗尔斯通氏菌 （Ralstonia sp.） XB CGMCC No.3389 的生理生化特征 ： 生长温度最 高 50℃， NaCl 耐受性 0 ～ 5％； 触酶， 柠檬酸盐利用， V-P 实验， 吲哚实验， MR 实验均为阳性， 脲酶实验， 淀粉水解， 明胶液化， 纤维素水解皆为阴性。能够利用果糖、 葡萄糖产酸， 不能利 用山梨醇、 乳糖、 蔗糖、 木糖醇、 麦芽糖发酵产酸。能够降解原油和多环芳烃。
     罗尔斯通氏菌 （Ralstonia sp.） XB CGMCC No.3389 的 16S rDNA 基 因 序 列 特征 ： CGMCC No.3389 接 种 于 LB 培 养 基， 30 ℃ 摇 床 培 养 （130rpm） 16h， 离 心 收 集 菌 体， 重新悬浮， 加溶菌酶和 SDS 破壁， 由酚 - 氯仿法提取基因组 DNA， 并采用正相引物 27F （5’ -GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ） 和反向引物 1541R（5’ -AAGGAGGTGATCCA GCC-3’ ） ， 用这 对引物对其 16S rDNA 基因进行 PCR 扩增， 将扩增引物送北京三博公司进行测序。PCR 条 件为 ： 94℃， 10min ； 94℃， 45s， 55℃， 45s， 72℃ 90s， 30 个循环 ； 72℃ 10min， 4℃保存。16S rDNA 基因序列长度为 1488bp， 与 Ralstonia pickettii strain ATCC 27511（登录号为 AY741342）序列相似性为 99%。其 16S r DNA 的序列如序列表所示。
     参照 《Bergey’ s Mannual of Systematic Bacteriology》 Vol.VIII 的内容， 根据 其形态特征和生理生化特征， 以及根据其 16S rDNA 基因序列在 GenBank 中的搜索结果， 经 多项分类鉴定 XB 为一新菌， 属于罗尔斯通氏菌属 （Ralstonia sp.XB） 。
     罗尔斯通氏菌 （Ralstonia sp.） XB CGMCC No.3389 可以在营养培养基， 如： 普通 牛肉汁、 LB、 营养琼脂中生长， 也可以以多环芳烃或烷烃或原油为碳源生长。菌株在 0 ～ 5%NaCl 浓度之间的适宜浓度下兼性厌氧生长。
     该菌具有在高盐条件下降解多环芳烃 （PHAs） 和石油烃的能力， 在 0 ～ 5% 的 NaCl 浓度范围内可降解萘、 蒽、 菲、 芘及 C12 ～ C32 的正构烷烃和原油。用 XB 生长细胞进行降解 实验结果表明， 在 30℃下， 往复摇床 130rpm 转速培养 5 ～ 7d， 对萘、 蒽、 菲、 芘 （50 mg/L） 均 有降解， 其中对萘、 菲的降解率较高， 可达 80% 以上 ； 降解 5g/L 的原油， 降解率均可达 60.0% 以上， 对不同碳数的烷烃降解率都在 60.0% 以上。
     本发明提供的 CGMCC No.3389 菌对烃类物质有很强的表面疏水性， 解烃菌摄取烃 类物质首先得将烃运输进细胞中， 通过三种方式 ： 一是烃溶解在水相中， 高可溶烃和气态烃 的主要摄取机制 ； 二是大的烃滴直接接触细胞， 在接触位点通过扩散和主动运输摄取 ； 三 是溶解和提供较细胞小的多的烃。烃的摄取首先需要解烃菌与烃的接触， 解烃菌疏水性越 大与烃越容易接触， XB 菌体细胞对烃的疏性很高。
     本发明提供的 CGMCC No.3389 菌能够明显的促使石油污染盐碱土壤中石油烃和多 环芳烃的降解。
     本发明的有益效果在于 ： 本发明提供的 CGMCC No.3389 菌株能够在高盐环境中降 解多种多环芳烃、 正构烷烃和原油， 对原油的降解率可达 60.0% 以上， 可以应用在由多环芳 烃和石油带来的土壤污染生物治理技术中。 附图说明
     图 1 Ralstonia sp. XB CGMCC No.3389 在不同 NaCl 浓度下对萘、 蒽、 菲、 芘的降 Ralstonia sp. XB CGMCC No.3389 在不同 NaCl 浓度下对原油的降解率 ； Ralstonia sp. XB CGMCC No.3389 对不同碳数正构烷烃的降解率 ； 室内模拟菌株 Ralstonia sp. XB 对供试土壤中 PAHs 的总降解率 ； Ralstonia sp. XB CGMCC No.3389 菌对 1# 试验田生物修复效果。解； 图2 图3 图4 图5具体实施方式
     下面通过附图和具体实施例对本发明作更进一步的说明， 但并不以此限制本发明。
     实施例 1 ： 本发明提供的罗尔斯通氏菌 （Ralstonia sp.） XB 菌株的分离筛选。
     取黄河三角洲石油污染盐碱土壤土样 1g， 无菌接种至 100ml 无机盐液蜡培养基 中。培养基组成 ： Na2HPO4 1.5g ； KH2PO4 3.48g ； MgSO4 0.7g ；(NH4)2SO4 4g ； 酵母粉 0.01g ； 液体石蜡 2％（v/w） ， 蒸馏水 1000ml ； 自然条件下的 pH ； 121℃灭菌 30min， 30℃摇床往复 振荡培养 5d。 将富集培养液充分混匀， 取 100μl 涂布在 1.5％ LB 固体平板上， 30℃恒温 培养箱中培养 2-3d， 观察生长出的菌落。挑取单菌落并用显微镜检验其纯度。将生长的各 个菌落， 接种至 LB 培养基中， 培养至 OD630 为 0.8 左右， 作为种子液以 10％（v/v） 比例接入 100ml 无机盐液蜡培养基中， 30℃摇床往复振荡培养 5d。然后以此发酵液作为种子液， 接种 至新鲜的无机盐液蜡培养基， 反复驯化菌种 3 ～ 4 次。
     选取对液蜡乳化良好的菌种进行原油和多环芳烃降解试验。 将菌落接种至液蜡培 养基培养 3d 左右， 作为种子以 10％（v/v） 的比例接入液接入到 100ml 原油培养基中， 培 养基组成 ： Na2HPO4 1.5g ； KH2PO4 3.48g ； MgSO4 0.7g ； (NH4)2SO4 4g ； 酵母粉 0.01g ； 原油 0.5%（w/w） 或 10mg/L 的多环芳烃 （PHAs） ， 蒸馏水 1000ml ； pH 自然 ； 121 ℃灭菌 30min， 30 ℃震荡培养 5d 后测定原油降解率和 PHAs 降解率。油类测定方法采用红外法， 即发酵液用 100ml 四氯化碳萃取， 用红外测油仪测定剩余原油的量， 降解率 （％） ＝ 1 －剩余原油的量 / 加入原油的量 ×100％。PHAs 降解率采用紫外分光光度法， 最终得到一株能够降解原油烃 及 PHAs 的菌株 Ralstonia sp.XB。
     实施例 2 罗尔斯通氏菌 （Ralstonia sp.） XB 菌株的 16SrDNA 基因的 PCR 扩增和序列测定 CGMCC No.3389 接种于 LB 培养基， 30℃摇床培养 （130rpm） 16h， 离心收集菌体， 重新 悬浮， 加溶菌酶和 SDS 破壁， 由酚 - 氯仿法提取基因组 DNA， 并采用正相引物 27F（5’ -GAG AGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ） 和反向引物 1541R （5’ -AAG GAG GTG ATC CAG CC-3’ ） ， 用这对引物 对其 16SrDNA 基因进行 PCR 扩增， 将扩增引物送北京三博公司进行测序。 PCR 条件为 ： 94℃， 10min ； 94℃， 45s， 55℃， 45s， 72℃ 90s， 30 个循环 ； 72℃ 10min， 4℃保存。 16S rDNA 基因序 列长度为 1488bp， 与 Ralstonia pickettii strain ATCC 27511（登录号为 AY741342）序 列相似性为 99%。其 16S r DNA 的序列如序列表所示。
     实施例 3 罗尔斯通氏菌 （Ralstonia sp.） XB 菌株在不同 NaCl 浓度下对多环芳烃 （PHAs） 降解 取该菌株的新鲜斜面菌种， 接种一接种环于装有 100ml 含有萘、 蒽、 菲、 芘各 50mg/L 的 无机盐的培养基 （培养基成分同实施例 1） 的三角瓶中， 培养基中分别添加 0-5% 的 NaCl， 30℃摇床培养 （130rpm） 7d， 采用气相色谱法 （GC 法） 测定多环芳烃 （PHAs） 的降解率， 结果如 图 1 所示， 菌株 XB 对萘的降解率最高可达到 92.1%， 在 5%NaCl 存在时， 降解率仍有 14.2% ； 对蒽的降解率可达 57.8%， 在 5%NaCl 存在时， 降解率降至 9.1% ； 对菲的降解率可达 87.4%， 随着 NaCl 浓度的升高， 降解率无明显降低， NaCl 浓度 5% 时， 降解率为 38.8% ； 对芘的降解率 最高为 17.3%。
     实施例 4罗尔斯通氏菌 （Ralstonia sp.） XB 菌株在不同 NaCl 浓度下对原油的降解 将菌株在 LB 平板上进行活化， 取单菌落接入 5ml LB 液体培养基中过夜培养， 以 1% 接 种量接种至 100 LB 液体培养基中， 30℃振荡培养 8h 至对数生长期， 以 10% 接种量接种至 装有 100ml 含有原油为碳源的无机盐培养基 （培养基组成同实施例 1） 的三角瓶中， 培养基 中分别添加 0 ～ 5% 的 NaCl， 30℃振荡培养 5d， 用红外测油仪测定原油的降解率， 结果如图 2 所示。菌株对不同碳数直链烷烃的降解， 采用气相色谱法 （GC 法） 测量， 结果如图 3 所示。 该菌株在 0 ～ 5% NaCl 浓度范围内对原油的降解率都在 60.0% 以上， 对 C12 到 C32 的烷烃， 降解率均在 60.0% 以上。
     实施例 5 罗尔斯通氏菌 （Ralstonia sp.） XB 菌株的细胞表面疏水性——对烃的粘附性测定 NaCl 洗涤 4 次， 将洗涤的菌体细胞悬浮于重蒸水中， 将洗涤后的菌体细胞悬于重蒸水 中。利用 BATH 方法对 XB 菌体细胞表面的疏水性进行测定， 具体方法为 ： 1mL 菌悬液 （测 定 OD600 定量） 中加入 200μl 正十二烷或十六烷， 混匀 （不要剧烈） 2min， 静置 15min， 测定 600nm 的 OD 值计算出下层水相中的菌浓。CSH(cell surface hydrophobicity)= [(a-b)/ a] ×100%（其中， a： 初始菌液细胞浓度的 OD 值 ； b： 终止时菌液细胞浓度的 OD 值。 ）根据文 献报道 BATH 的测定结果， 菌体表面疏水性范围大约为 1.0 ～ 97.0％， 大于 80％即为强疏水 性。实验结果如表 1， 菌株 XB 菌体表面对十二烷和十六烷的疏水性分别为 88.5% 和 90.2%， 这说明 XB 对正构烷烃有很强的疏水性。
     表1菌株 XB 对数生长期细胞对不同烷烃的疏水性测定实施例 6 罗尔斯通氏菌 （Ralstonia sp.） XB 菌株在室内模拟高盐度下多环芳烃 （PHAs） 污染土 壤的修复作用 供试土壤样品是未受石油污染的农田盐碱土， 掺杂萘、 蒽、 菲、 芘等多环芳烃。 供试土样 去除石块、 杂草研磨后过 2 mm 筛， 置入烧杯中向其中添加购自上海生工的萘、 蒽、 菲、 芘充分 搅拌， 浓度分别为 （单位 ： mg/kg 土样） ： 萘 50 ； 蒽 50 ； 菲 50 ； 芘 50。于阴暗处晾干后进一 步研磨过 2 mm 筛， 使土壤和 PHAs 混合均匀。采用超声提取法和 GC 法监测供试土壤中各种 PHAs 的含量， 由于提取和测试误差的存在， 实际测得供试土样中各种多环芳烃的量分别是 （单位 ： mg/kg 土样） ： 萘 46.8 ； 蒽 40.1 ； 菲 43.5 ； 芘 42.6。
     将 Ralstonia sp. XB 菌株在添加 2% 液蜡的无机盐培养基中培养 （培养基成分同 8 实施例 1） ， 菌浓达到 10 个 /ml。 称取 200 g 供试土壤装于 500 ml 烧杯中， 烧杯中加入 200ml 菌液， 搅拌均匀， 室温放置 ； 设置对照组， 对照组添加 200ml 无菌的培养基。实验组和对照 组都保持土壤水分含量为 25% ～ 30%， 每天翻耕 1 次， 所有处理均设置 3 个重复。 间隔一 段时间采样。土壤中的 PAHs 采用超声法和 GC 法测定， 计算不同时期土壤样品中 PAHs 总含量， 进而计算出 PAHs 的降解率， 结果如图 4 所示。
     在监测的 30d 内， 土壤样品中 PAHs 总的降解率达到了 77.9%， 说明菌株 XB 可用于 多环芳烃污染土壤的现场治理 ； 对照组中由于土样中少量本源菌的激活也使得 PAHs 的量 减少， 但是不明显。
     实施例 7 本发明提供的 Ralstonia sp. XB 菌株对 1# 试验田石油污染土壤的生物修复能力将 Ralstonia sp. XB 菌株在添加 2% 液蜡的无机盐培养基中培养 （培养基成分同实施例 1） ， 8 -1 # 菌浓达到 10 个 /ml。将发酵液以 250ml ﹒ kg 干土的投加量喷洒到石油污染的 1 试验 田中， 时间为 6-8 月份 （平均温度约 28 ℃， 雨水充足） 。设置对照田， 即喷洒菌液。试验田 和对照田均每周翻耕 1 次， 间隔一段时间采样， 采用 GC 法测定土壤中原油含量， 气质联用 （GC-MS） 法分析多环芳烃 （PHAs） 含量， 计算原油降解率和 PHAs 去除率。结果如图 5 所示， 利用 Ralstonia sp. XB 菌株发酵液处理石油污染盐碱地， 60d 后土壤中原油去除率可达 67.6%， PHAs 总降解率达到 76.8%， PHAs 污染得到了有效的修复， 而在不添加任何菌剂的对 照田中， 由于土壤微生物的降解作用， PHAs 也有一定的减少 （最高 13.4%） ， 但是远远低于 1# 试验田。 实施例 8 本发明提供的 （Ralstonia sp.） XB 菌株对 2# 试验田石油污染土壤的生物修复能力。 将 Ralstonia sp. XB 菌株在添加 2% 液蜡的无机盐培养基中培养 （培养基成分同实施例 1） ， 8 -1 # 菌浓达到 10 个 /ml。将发酵液以 250ml ﹒ kg 干土的投加量喷洒到石油污染的 1 试验田 中， 时间为 6-8 月份 （平均温度约 28℃， 雨水充足） 。设置对照田， 即喷洒菌液。试验田和对 照田均每周翻耕 1 次， 间隔一段时间采样， 土壤中原油含量和 PHAs 测定同实施例 7。利用 Ralstonia sp. XB 菌株发酵液处理石油污染的盐碱地 60d 后原油去除率为 60.6%， 芳香烃 总降解率达到 67.8%， 多环芳烃污染得到了有效的修复。
     以上列举的仅是本发明的一些具体实施例， 显然本发明不限于以上实施例， 还可 以有许多变形。本领域的技术人员能够从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变 形， 均认为是本发明的保护范围。
     罗尔斯通氏菌 （Ralstonia sp.） 菌株 XB CGMCC No.3389 序列表 1488bp Ralstonia sp.XB CGMCC No.3389 16s rDNA gene sequence 1 agattgaacg ctggcggcat gccttacaca tgcaagtcga acggcagcat gatctagctt 61 gctagattga tggcgagtgg cgaacgggtg agtaatacat cggaacgtgc cctgtagtgg 121 gggataacta gtcgaaagat tagctaatac cgcatacgac ctgagggtga aagtggggga 181 ccgcaaggcctcatgctata ggagcggccg atgtctgatt agctagttgg tgaggtaaag 241 gctcaccaag gcgacgatca gtagctggtc tgagaggacg atcagccaca ctgggactga 301 gacacggccc agactcctac cggaggcagc agtggggaat tttggacaat gggcgaaagc 361 ctgatccagc aatgccgcgt gtgtgaagaa ggccttcggg ttgtaaagca catttgtccg 421 gaaagaaatg gctctggtta atacctgggg tcgatgacgg taccggaaga ataaggaccg 481 gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggtcc aagcgttaat cggaattact541 gggcgtaaag cgtgcgcagg cggttgtgca agaccgatgt gaaatccccg agcttaactt 601 gggaattgca ttggtgactg cacggctaga gtgtgtcaga cgggggtaga attccacgtg 661 tagcagtgaa atgcgtagag atgtggagga ataccgatgg cgaaggcagc cccctgggat 721 aacactgacg ctcatgcacg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc 781 cacgccctaa acgatgtcaa ctagttgttg cggattcatt tccttagtaa cgtagctaac 841 gcgtgaagtt gaccgcctgg ggagtacggt cgcaagatta aaactcaaag gaattgacgg 901 ggacccgcac aagcggtgga tgatgtggat taattcgatg caacgcgaaa aaccttacct 961 acccttgaca tgccactaac gaagcagaga tgcattaggt gctcgtaaga gaaagtggac 1021 acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac 1081 gagcgcaacc cttgtctcta gttgctacga aagggcactc tagagagact gccggtgaca 1141 aaccggagga aggtggggat gacgtcaagt cctcatggcc cttatgggta gggcttcaca 1201 cgtcatacaa tggtgcatac agagggttgc caagccgcga ggtggagcta atcccagaaa 1261 atgcatcgta gtccggatcg tagtctgcaa ctcgactacg tgaagctgga atcgctagta 1321 atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggtc ttgtacacac cgcccgtcac 1381 accatgggag tgggctttac cagaagtagt tagcctaacc gcaaggaggg cgattaccac 1441 ggtagggttc atgactgggg tgaagtcgta acaaggtagc cgtatcgg