乙肝病毒核心抗原和 e 抗原的 HLA-DR9 限制性调节性 T 细 胞表位及其应用 技术领域 本发明涉及一种调节性 T 细胞 (Treg) 表位， 特别涉及乙肝病毒核心抗原 (HBcAg) 和乙肝病毒 e 抗原 (HBeAg) 的 HLA-DR9 限制性 Treg 表位， 还涉及该 Treg 表位的应用。
背景技术 乙型肝炎病毒 (HBV) 感染呈全球范围广泛流行， 严重威胁人类健康。抗 HBV 特异 性免疫应答对于机体清除 HBV 起着决定性作用。多项研究报道 ： 在急性 HBV 感染的恢复者 + + 体内检测到活跃的病毒特异性 CD4 和 CD8 T 细胞应答， 而在慢性 HBV 感染 (CHB) 患者中仅 + + + 观察到微弱的病毒特异性 T 细胞应答。CD4 CD25 Foxp3 Treg 被证实能抑制其它 CD4+T 细胞 和 CD8+T 细胞的活化和增殖， 在维持正常的外周免疫耐受中发挥重要作用。目前研究显示， CHB 患者体内 Treg 频率显著增高并能够通过抑制抗 HBV 特异性 T 细胞免疫应答影响病毒的 清除， 且病毒复制活跃的 CHB 患者体内有着更高比例的 Treg。HBeAg 阳性患者的外周血中 Treg 的比例显著高于 HBeAg 阴性患者。但导致 CHB 患者体内 Treg 频率异常改变的原因， 目 前尚不明确。
抗原对于诱导和维持 Treg 是至关重要的。因此， Treg 抗原特异性研究备受 关注。文献报道， 从新鲜黑色素瘤组织浸润淋巴细胞中分离出的 Treg 具有肿瘤抗原特 异性， 并从相关肿瘤抗原中鉴定出若干优势性 Treg 表位。用源于丙型肝炎病毒 (HCV) 核心蛋白的交叠 11 肽库刺激 HCV 感染患者外周血单个核细胞 (PBMC)， 可以迅速诱导 + high high CD4 CD25 Foxp3 IFN-γ Treg 上调， 而用相同肽库刺激健康者 PBMC 后， 不能观察到 CD25 和 Foxp3 的表达上调。这些研究结果均提示疾病相关性 Treg 可由疾病相关抗原诱导产生。 因此， 明确疾病相关抗原 中潜在的 Treg 表位， 无论对于疾病的发病机制研究还是制定更 为有效的特异性免疫干预策略均有重要意义。但来源于 HBV 的蛋白抗原如 HBcAg、 HBeAg 等 是否参与了 CHB 相关性 Treg 的诱导和维持及其相关的 Treg 表位， 目前尚未见报道。
发明内容
有鉴于此， 本发明的目的之一在于明确 HBV 的蛋白抗原 HBcAg 和 HBeAg 中是否存 在 Treg 表位及其氨基酸序列 ； 目的之二在于提供该 Treg 表位的应用。
为达到上述目的， 本发明采用如下技术方案 ：
由于 HBeAg 和 HBcAg 具有 70％的共同序列， 血清中的 HBeAg 可以看作是 HBcAg 的 分泌型， 因此， 本发明先采用生物信息学方法对 HBcAg 和 HBeAg 共同序列中潜在的主要组 织相容性复合体 (MHC) Ⅱ类分子限制性 T 细胞表位热区进行预测， 并合成系列候选表位 最后通过对 肽， 再用各候选表位肽分别刺激 CHB 患者 PBMC， 建立系列肽特异性 T 细胞系， 肽特异性 T 细胞系进行表型和功能检测， 判断其是否具有 Treg 特性， 以此来推断相应候 选表位肽是否为 Treg 表位。研究结果显示， HBcAg81-105/HBeAg110-134( 氨基酸序列为 SRDLVVNY-VNTNMGLKIRQLLWFHI， SEQ ID No.3) 能够特异性上调 HLA-DR9+CHB 患者 PBMC 中CD4+CD25+Foxp3+IL-10+Treg 频率， 且该群细胞具有典型的 Treg 细胞表型和抑制性功能， 因 此， HBcAg81-105、 HBeAg110-134 分别为 HBcAg、 HBeAg 的 HLA-DR9 限制性 Treg 表位。
上述研究结果提示， HBV 的蛋白抗原 HBcAg 和 HBeAg 中的确存在能够特异性诱导 Treg 的表位而导致 HBV 免疫抑制。该 Treg 表位在制备包含 HBcAg 和 / 或 HBeAg 的乙肝治 疗性疫苗时有重要应用， 即在制备包含 HBcAg 和 / 或 HBeAg 的乙肝治疗性疫苗时， 应该摒弃 HBcAg 和 / 或 HBeAg 中具有免疫抑制作用的 Treg 表位， 仅保留对免疫保护有利的表位， 从而 打破 HBV 免疫耐受， 重建细胞免疫功能， 高效抑制和清除 HBV。
本发明的有益效果在于 ： 本发明鉴定了 HBV 的蛋白抗原 HBcAg 和 HBeAg 中的 Treg 表位， 首次明确了 HBV 感染患者体内上调的 Treg 具有 HBV 特异性， 为进一步阐明 Treg 参与 HBV 感染慢性化过程的效应机制提供了必要的理论和实验依据， 同时也为高效乙肝治疗性 疫苗的研制提供了新的策略和方法， 有望打破 HBV 免疫耐受， 重建细胞免疫功能， 高效抑制 和清除 HBV。 附图说明
为了使本发明的目的、 技术方案和优点更加清楚， 下面将结合附图对本发明作进 一步的详细描述， 其中 ： 图 1 为流式细胞仪检测各候选表位肽诱导 CHB 患者 PBMC 10 天后 CD4+CD25+Foxp3+T 细胞频率 ；
图 2 为 CHB 患者的 HLA-DR 分型电泳图 ；
图 3 为流式细胞仪检测候选表位肽 P3 特异性诱导 DR9 纯合型 PBMC 20 天后 + CD4 Foxp3+T 细胞和 CD4+Foxp3-T 细胞各表型的表达 ( 以 CD4+T 细胞设门 ) ；
图 4 为不同刺激下 CD4+T 细胞系中 CD4+Foxp3+IL10+T 和 CD4+Foxp3+IFN-γ+T 细胞 频率 ； 其中，
A 为 10μg/ml 候选表位肽 P3、 500U/ml 白介素 2(IL-2) 和 1μg/ml 抗 CD28 抗体 + (anti-CD28) 刺激下 CD4 T 细胞系中 CD4+Foxp3+IL10+T 细胞频率 ；
B 为 10μg/ml 候选表位肽 P3、 10μg/ml 抗 HLA-DR 抗体 (anti-HLA-DR)、 500U/ml + + + + IL-2 和 1μg/ml anti-CD28 刺激下 CD4 T 细胞系中 CD4 Foxp3 IL 10 T 细胞频率 ；
C 为 10μg/ml 无关对照肽 TT、 500U/ml IL-2 和 1μg/ml anti-CD28 刺激下 CD4+T 细胞系中 CD4+Foxp3+IL10+T 细胞频率 ；
D 为 10μg/ml 候选表位肽 P3、 500U/ml IL-2 和 1μg/ml anti-CD28 刺激下 CD4+T 细胞系中 CD4+Foxp3+IFN-γ+T 细胞频率 ；
E 为 10μg/ml 候 选 表 位 肽 P3、 10μg/ml anti-HLA-DR、 500U/ml IL-2 和 1μg/ + + + + mlanti-CD28 刺激下 CD4 T 细胞系中 CD4 Foxp3 IFN-γ T 细胞频率 ；
F 为 10μg/ml 无关对照肽 TT、 500U/ml IL-2 和 1μg/ml anti-CD28 刺激下 CD4+T 细胞系中 CD4+Foxp3+IFN-γ+T 细胞频率 ；
图 5 为 3H-TdR 法检测 P3 肽特异性 DR9 限制性 CD4+Treg 的抑制功能。
具体实施方式
以下将参照附图， 对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中所述侯选表位肽或无关对照肽、 IL-2、 anti-CD28、 anti-HLA-DR 和抗 CD3 抗体 (anti-CD3) 的浓度均指 其在混合液中的终浓度。
1、 泛限制性 CD4+T 细胞表位热区的分析及候选表位肽的合成
从 表 位 数 据 库 (http://www.immuneepitope.org/) 中 得 到 已 有 的 CD4+T 细 胞 表位， 根据相关文献报道以及网上软件 MHCPred(http://research.i2r.a-star.edu.sg/ multipre/) 和 SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/) 预 测 HBcAg 的 Treg 表 位。 由 于 HBeAg 和 HBcAg 具有 70 ％的共同序列， 血清中的 HBeAg 可以看作是 HBcAg 的分泌型， 因 此， 本发明以 HBeAg 和 HBcAg 共同序列中的三条肽段作为候选表位肽， 并以卵白蛋白片段 (OVA323-339) 和破伤风毒素片段 (TT947-967) 作为无关对照肽。 候选表位肽和无关对照肽 均委托上海生工生物工程技术服务有限公司采用标准 9- 芴甲氧羰基 (Fmoc) 固相合成法合 成， 所得多肽经高效液相色谱法测定纯度大于 90％， 经质谱测定分子量与理论分子量一致。
表 1 候选表位肽和无关对照肽的序列
2、 临床 CHB 患者 PBMC 肽诱导实验及 HLA- Ⅱ类等位基因分型
(1)PBMC 肽诱导实验 ： 选取血清 HBV DNA 载量大于 105、 HBeAg 阳性且近期无治疗的 CHB 确诊患者 ( 编号为 HBV053、 HBV054、 HBV057、 HBV059、 HBV060 和 HBV061)， 分离 PBMC， 加 入 10μg/ml 侯选表位肽或无关对照肽、 500U/ml IL-2 和 1μg/ml anti-CD28 刺激 10 天， 用 + + + 流式细胞仪检测 CD4 CD25 Foxp3 T 细胞频率。
结果如图 1 所示， HBV061、 HBV059 和 HBV053 患者 PBMC 用候选表位肽 P3 刺激后， + + + CD4 CD25 Foxp3 T 细胞频率上调最为显著， 其他 CHB 患者无明显上调。
(2)HLA- Ⅱ类等位基因分型 ： 采用 Invitrogen 全基因组提取试剂盒提取待分型 CHB 患者的基因组 DNA， 再采用 HLA- Ⅱ类 DRB 分型板 Micro SSPTMGeneric HLA Class II(DRB only) 进行引物特异性聚合酶链反应 (SSP-PCR) 获得 HLA-DR 型别特异的扩增产物， 最后通 过电泳直接分析带型判断 HLA-DR 型别。
结果如表 1 和图 2 所示， HBV061、 HBV059 和 HBV053 患者均含有 DR9 等位基因， 且 + + + 其各自的 PBMC 用候选表位肽 P3 刺激后均表现出 CD4 CD25 Foxp3 T 细胞频率明显上调， 初 步提示 P3 肽是 HLA-DR9 限制性的能够特异性诱导 Treg 的抗原肽。
表 1 CHB 患者 HLA-DR 型别的检测结果
3、 P3 肽特异性 DR9 纯合型 CD4+T 细胞系的表型及功能检测
(1) 表型检测
在 1×106 个经丝裂霉素处理的 DR9 纯合型 PBMC 中加入 10μg/ml 候选表位肽 P3 或 无关对照肽 TT( 文献 Eur.J Immunol.1989， 19 ： 2237-2242 报道该 TT 肽为 DR9 限制性 CD4+T 细胞表位 )、 500U/ml IL-2 和 1μg/ml anti-CD28 诱导 20 天， 经丝裂霉素处理的 DR9 纯合型 PBMC、 P3 肽或 TT 肽、 anti-CD28 分别在第 1、 7 和 14 天补加 1 次， IL-2 每隔 3 天补加 1 次， + + + CD45RO、 CD62L、 第 20 天采用流式细胞仪检测 CD4 Foxp3 T 细胞和 CD4 Foxp3 T 细胞上 CD25、 CTLA-4、 HLA-DR 和 GITR 表型的表达。
结果如图 3 所示， 与 CD4+Foxp3-T 细胞相比， CD4+Foxp3+T 细胞高表达 CD25、 CD45RO、 + + CD62L、 CTLA-4、 HLA-DR 和 GITR 表型， 与文献报道一致， 符合 CD4 CD25 Treg 的表型。
(2)anti-HLA-DR 阻断实验
在 1×106 个经丝裂霉素处理的 DR9 纯合型 PBMC 中加入 10μg/ml 候选表位肽 P3 或无关对照肽 TT、 500U/ml IL-2 和 1μg/ml anti-CD28 诱导 20 天， 经丝裂霉素处理的 DR9 纯合型 PBMC、 P3 肽或 TT 肽、 anti-CD28 分别在第 1、 7 和 14 天补加 1 次， IL-2 每隔 3 天补加 1 次， 第 20 天再次补加经丝裂霉素处理的 DR9 纯合型 PBMC、 P3 肽或 TT 肽， 另外 P3 肽组加 TM + 入 10μg/ml anti-HLA-DR 和 0.65μlGolgiStop ， 刺激 5 小时后检测 CD4 Foxp3+IFN-γ+T 细胞频率， 刺激 24 小时后检测 CD4+Foxp3+IL-10+T 细胞频率。
结果如图 4 所示， 10μg/ml P3、 500U/ml IL-2 和 1μg/ml anti-CD28 刺激 DR9 纯 + + + 合型 PBMC20 天后， CD4 Foxp3 IL10 T 细胞占 CD4+T 细胞的频率为 1.26 ％ ( 图 4A)， 同样条 + + 件下这群 CD4 Foxp3 T 细胞几乎不分泌 IFN-γ( 图 4D)， 加入 10μg/ml anti-HLA-DR 共培 + + + + 养， CD4 Foxp3 IL10 T 细胞占 CD4 T 细胞的频率下降至 0.36 ％ ( 图 4B)， 说明 P3 肽的递呈 + + 被阻断， 抑制了 CD4 Foxp3 T 细胞的活化， 从而降低了 IL-10 的分泌 ； 而 10μg/ml TT、 500U/ + + ml IL-2 和 1μg/mlanti-CD28 刺激 DR9 纯合型 PBMC 20 天后， CD4 Foxp3 T 细胞几乎不分 + + + 泌 IL-10， 而 CD4 Foxp3 IL-10 T 细胞占 CD4 T 细胞的频率为 2.84％， 另 CD4+Foxp3+T 细胞和 CD4+Foxp3-T 细胞均分泌少量 IFN-γ， 这个结果与文献报道该 TT 肽为 DR9 限制性 CD4+T 细 胞表位相吻合。同时， 这些结果也进一步说明了 DR9 限制性 CD4+T 细胞表位与 DR9 限制性 CD4+Treg 表位在细胞因子分泌上的不同， 从另一角度说明了 P3 肽为 DR9 限制性 CD4+Treg 表 位。
4、 P3 肽特异性 CD4+CD25+Foxp3+T 细胞的抑制功能检测
在 1×106 个经丝裂霉素处理的 DR9 纯合型 PBMC 中加入 10μg/ml 候选表位肽 P3 或无关对照肽 TT、 500U/ml IL-2 和 1μg/ml anti-CD28 诱导 20 天， 磁珠分选出 CD4+CD25+T 细胞 ； 取 5×104 个同一患者新鲜分离的 CD4+CD25-T 细胞， 用磷酸盐缓冲液 (PH 7.4) 包被 的 1μg/ml anti-CD3 刺激 14 小时， 中断刺激， 再按数量比为 1 ∶ 0、 1 ∶ 1、 0 ∶ 1 加入前述 + + 5 CD4 CD25 T 细胞， 同时加入 2.5×10 个经候选表位肽 P3 或无关对照肽 TT 以及丝裂霉素处 理的自体 PBMC， 混合培养 3 天， 检测前 16 小时加入 H- 胸腺嘧啶核苷 (3H-TdR)1μCi， 在液 闪计数仪上测定每分钟放射活性 (cpm 值 )。
结果如图 5 所示， 携带 HLA-DR9 等位基因的 CHB 患者 PBMC 中的确存在 P3 特异性 + + 的 CD4 CD25 Treg， 该群细胞能被 P3 肽特异性活化并发挥显著的抑制其他细胞增殖的功能， 而同样是 HLA-DR9 限制性的 TT 肽则不能活化这一群 CD4+CD25+Treg。
背景技术 乙型肝炎病毒 (HBV) 感染呈全球范围广泛流行， 严重威胁人类健康。抗 HBV 特异 性免疫应答对于机体清除 HBV 起着决定性作用。多项研究报道 ： 在急性 HBV 感染的恢复者 + + 体内检测到活跃的病毒特异性 CD4 和 CD8 T 细胞应答， 而在慢性 HBV 感染 (CHB) 患者中仅 + + + 观察到微弱的病毒特异性 T 细胞应答。CD4 CD25 Foxp3 Treg 被证实能抑制其它 CD4+T 细胞 和 CD8+T 细胞的活化和增殖， 在维持正常的外周免疫耐受中发挥重要作用。目前研究显示， CHB 患者体内 Treg 频率显著增高并能够通过抑制抗 HBV 特异性 T 细胞免疫应答影响病毒的 清除， 且病毒复制活跃的 CHB 患者体内有着更高比例的 Treg。HBeAg 阳性患者的外周血中 Treg 的比例显著高于 HBeAg 阴性患者。但导致 CHB 患者体内 Treg 频率异常改变的原因， 目 前尚不明确。
抗原对于诱导和维持 Treg 是至关重要的。因此， Treg 抗原特异性研究备受 关注。文献报道， 从新鲜黑色素瘤组织浸润淋巴细胞中分离出的 Treg 具有肿瘤抗原特 异性， 并从相关肿瘤抗原中鉴定出若干优势性 Treg 表位。用源于丙型肝炎病毒 (HCV) 核心蛋白的交叠 11 肽库刺激 HCV 感染患者外周血单个核细胞 (PBMC)， 可以迅速诱导 + high high CD4 CD25 Foxp3 IFN-γ Treg 上调， 而用相同肽库刺激健康者 PBMC 后， 不能观察到 CD25 和 Foxp3 的表达上调。这些研究结果均提示疾病相关性 Treg 可由疾病相关抗原诱导产生。 因此， 明确疾病相关抗原 中潜在的 Treg 表位， 无论对于疾病的发病机制研究还是制定更 为有效的特异性免疫干预策略均有重要意义。但来源于 HBV 的蛋白抗原如 HBcAg、 HBeAg 等 是否参与了 CHB 相关性 Treg 的诱导和维持及其相关的 Treg 表位， 目前尚未见报道。
发明内容
有鉴于此， 本发明的目的之一在于明确 HBV 的蛋白抗原 HBcAg 和 HBeAg 中是否存 在 Treg 表位及其氨基酸序列 ； 目的之二在于提供该 Treg 表位的应用。
为达到上述目的， 本发明采用如下技术方案 ：
由于 HBeAg 和 HBcAg 具有 70％的共同序列， 血清中的 HBeAg 可以看作是 HBcAg 的 分泌型， 因此， 本发明先采用生物信息学方法对 HBcAg 和 HBeAg 共同序列中潜在的主要组 织相容性复合体 (MHC) Ⅱ类分子限制性 T 细胞表位热区进行预测， 并合成系列候选表位 最后通过对 肽， 再用各候选表位肽分别刺激 CHB 患者 PBMC， 建立系列肽特异性 T 细胞系， 肽特异性 T 细胞系进行表型和功能检测， 判断其是否具有 Treg 特性， 以此来推断相应候 选表位肽是否为 Treg 表位。研究结果显示， HBcAg81-105/HBeAg110-134( 氨基酸序列为 SRDLVVNY-VNTNMGLKIRQLLWFHI， SEQ ID No.3) 能够特异性上调 HLA-DR9+CHB 患者 PBMC 中CD4+CD25+Foxp3+IL-10+Treg 频率， 且该群细胞具有典型的 Treg 细胞表型和抑制性功能， 因 此， HBcAg81-105、 HBeAg110-134 分别为 HBcAg、 HBeAg 的 HLA-DR9 限制性 Treg 表位。
上述研究结果提示， HBV 的蛋白抗原 HBcAg 和 HBeAg 中的确存在能够特异性诱导 Treg 的表位而导致 HBV 免疫抑制。该 Treg 表位在制备包含 HBcAg 和 / 或 HBeAg 的乙肝治 疗性疫苗时有重要应用， 即在制备包含 HBcAg 和 / 或 HBeAg 的乙肝治疗性疫苗时， 应该摒弃 HBcAg 和 / 或 HBeAg 中具有免疫抑制作用的 Treg 表位， 仅保留对免疫保护有利的表位， 从而 打破 HBV 免疫耐受， 重建细胞免疫功能， 高效抑制和清除 HBV。
本发明的有益效果在于 ： 本发明鉴定了 HBV 的蛋白抗原 HBcAg 和 HBeAg 中的 Treg 表位， 首次明确了 HBV 感染患者体内上调的 Treg 具有 HBV 特异性， 为进一步阐明 Treg 参与 HBV 感染慢性化过程的效应机制提供了必要的理论和实验依据， 同时也为高效乙肝治疗性 疫苗的研制提供了新的策略和方法， 有望打破 HBV 免疫耐受， 重建细胞免疫功能， 高效抑制 和清除 HBV。 附图说明
为了使本发明的目的、 技术方案和优点更加清楚， 下面将结合附图对本发明作进 一步的详细描述， 其中 ： 图 1 为流式细胞仪检测各候选表位肽诱导 CHB 患者 PBMC 10 天后 CD4+CD25+Foxp3+T 细胞频率 ；
图 2 为 CHB 患者的 HLA-DR 分型电泳图 ；
图 3 为流式细胞仪检测候选表位肽 P3 特异性诱导 DR9 纯合型 PBMC 20 天后 + CD4 Foxp3+T 细胞和 CD4+Foxp3-T 细胞各表型的表达 ( 以 CD4+T 细胞设门 ) ；
图 4 为不同刺激下 CD4+T 细胞系中 CD4+Foxp3+IL10+T 和 CD4+Foxp3+IFN-γ+T 细胞 频率 ； 其中，
A 为 10μg/ml 候选表位肽 P3、 500U/ml 白介素 2(IL-2) 和 1μg/ml 抗 CD28 抗体 + (anti-CD28) 刺激下 CD4 T 细胞系中 CD4+Foxp3+IL10+T 细胞频率 ；
B 为 10μg/ml 候选表位肽 P3、 10μg/ml 抗 HLA-DR 抗体 (anti-HLA-DR)、 500U/ml + + + + IL-2 和 1μg/ml anti-CD28 刺激下 CD4 T 细胞系中 CD4 Foxp3 IL 10 T 细胞频率 ；
C 为 10μg/ml 无关对照肽 TT、 500U/ml IL-2 和 1μg/ml anti-CD28 刺激下 CD4+T 细胞系中 CD4+Foxp3+IL10+T 细胞频率 ；
D 为 10μg/ml 候选表位肽 P3、 500U/ml IL-2 和 1μg/ml anti-CD28 刺激下 CD4+T 细胞系中 CD4+Foxp3+IFN-γ+T 细胞频率 ；
E 为 10μg/ml 候 选 表 位 肽 P3、 10μg/ml anti-HLA-DR、 500U/ml IL-2 和 1μg/ + + + + mlanti-CD28 刺激下 CD4 T 细胞系中 CD4 Foxp3 IFN-γ T 细胞频率 ；
F 为 10μg/ml 无关对照肽 TT、 500U/ml IL-2 和 1μg/ml anti-CD28 刺激下 CD4+T 细胞系中 CD4+Foxp3+IFN-γ+T 细胞频率 ；
图 5 为 3H-TdR 法检测 P3 肽特异性 DR9 限制性 CD4+Treg 的抑制功能。
具体实施方式
以下将参照附图， 对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中所述侯选表位肽或无关对照肽、 IL-2、 anti-CD28、 anti-HLA-DR 和抗 CD3 抗体 (anti-CD3) 的浓度均指 其在混合液中的终浓度。
1、 泛限制性 CD4+T 细胞表位热区的分析及候选表位肽的合成
从 表 位 数 据 库 (http://www.immuneepitope.org/) 中 得 到 已 有 的 CD4+T 细 胞 表位， 根据相关文献报道以及网上软件 MHCPred(http://research.i2r.a-star.edu.sg/ multipre/) 和 SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/) 预 测 HBcAg 的 Treg 表 位。 由 于 HBeAg 和 HBcAg 具有 70 ％的共同序列， 血清中的 HBeAg 可以看作是 HBcAg 的分泌型， 因 此， 本发明以 HBeAg 和 HBcAg 共同序列中的三条肽段作为候选表位肽， 并以卵白蛋白片段 (OVA323-339) 和破伤风毒素片段 (TT947-967) 作为无关对照肽。 候选表位肽和无关对照肽 均委托上海生工生物工程技术服务有限公司采用标准 9- 芴甲氧羰基 (Fmoc) 固相合成法合 成， 所得多肽经高效液相色谱法测定纯度大于 90％， 经质谱测定分子量与理论分子量一致。
表 1 候选表位肽和无关对照肽的序列
2、 临床 CHB 患者 PBMC 肽诱导实验及 HLA- Ⅱ类等位基因分型
(1)PBMC 肽诱导实验 ： 选取血清 HBV DNA 载量大于 105、 HBeAg 阳性且近期无治疗的 CHB 确诊患者 ( 编号为 HBV053、 HBV054、 HBV057、 HBV059、 HBV060 和 HBV061)， 分离 PBMC， 加 入 10μg/ml 侯选表位肽或无关对照肽、 500U/ml IL-2 和 1μg/ml anti-CD28 刺激 10 天， 用 + + + 流式细胞仪检测 CD4 CD25 Foxp3 T 细胞频率。
结果如图 1 所示， HBV061、 HBV059 和 HBV053 患者 PBMC 用候选表位肽 P3 刺激后， + + + CD4 CD25 Foxp3 T 细胞频率上调最为显著， 其他 CHB 患者无明显上调。
(2)HLA- Ⅱ类等位基因分型 ： 采用 Invitrogen 全基因组提取试剂盒提取待分型 CHB 患者的基因组 DNA， 再采用 HLA- Ⅱ类 DRB 分型板 Micro SSPTMGeneric HLA Class II(DRB only) 进行引物特异性聚合酶链反应 (SSP-PCR) 获得 HLA-DR 型别特异的扩增产物， 最后通 过电泳直接分析带型判断 HLA-DR 型别。
结果如表 1 和图 2 所示， HBV061、 HBV059 和 HBV053 患者均含有 DR9 等位基因， 且 + + + 其各自的 PBMC 用候选表位肽 P3 刺激后均表现出 CD4 CD25 Foxp3 T 细胞频率明显上调， 初 步提示 P3 肽是 HLA-DR9 限制性的能够特异性诱导 Treg 的抗原肽。
表 1 CHB 患者 HLA-DR 型别的检测结果
3、 P3 肽特异性 DR9 纯合型 CD4+T 细胞系的表型及功能检测
(1) 表型检测
在 1×106 个经丝裂霉素处理的 DR9 纯合型 PBMC 中加入 10μg/ml 候选表位肽 P3 或 无关对照肽 TT( 文献 Eur.J Immunol.1989， 19 ： 2237-2242 报道该 TT 肽为 DR9 限制性 CD4+T 细胞表位 )、 500U/ml IL-2 和 1μg/ml anti-CD28 诱导 20 天， 经丝裂霉素处理的 DR9 纯合型 PBMC、 P3 肽或 TT 肽、 anti-CD28 分别在第 1、 7 和 14 天补加 1 次， IL-2 每隔 3 天补加 1 次， + + + CD45RO、 CD62L、 第 20 天采用流式细胞仪检测 CD4 Foxp3 T 细胞和 CD4 Foxp3 T 细胞上 CD25、 CTLA-4、 HLA-DR 和 GITR 表型的表达。
结果如图 3 所示， 与 CD4+Foxp3-T 细胞相比， CD4+Foxp3+T 细胞高表达 CD25、 CD45RO、 + + CD62L、 CTLA-4、 HLA-DR 和 GITR 表型， 与文献报道一致， 符合 CD4 CD25 Treg 的表型。
(2)anti-HLA-DR 阻断实验
在 1×106 个经丝裂霉素处理的 DR9 纯合型 PBMC 中加入 10μg/ml 候选表位肽 P3 或无关对照肽 TT、 500U/ml IL-2 和 1μg/ml anti-CD28 诱导 20 天， 经丝裂霉素处理的 DR9 纯合型 PBMC、 P3 肽或 TT 肽、 anti-CD28 分别在第 1、 7 和 14 天补加 1 次， IL-2 每隔 3 天补加 1 次， 第 20 天再次补加经丝裂霉素处理的 DR9 纯合型 PBMC、 P3 肽或 TT 肽， 另外 P3 肽组加 TM + 入 10μg/ml anti-HLA-DR 和 0.65μlGolgiStop ， 刺激 5 小时后检测 CD4 Foxp3+IFN-γ+T 细胞频率， 刺激 24 小时后检测 CD4+Foxp3+IL-10+T 细胞频率。
结果如图 4 所示， 10μg/ml P3、 500U/ml IL-2 和 1μg/ml anti-CD28 刺激 DR9 纯 + + + 合型 PBMC20 天后， CD4 Foxp3 IL10 T 细胞占 CD4+T 细胞的频率为 1.26 ％ ( 图 4A)， 同样条 + + 件下这群 CD4 Foxp3 T 细胞几乎不分泌 IFN-γ( 图 4D)， 加入 10μg/ml anti-HLA-DR 共培 + + + + 养， CD4 Foxp3 IL10 T 细胞占 CD4 T 细胞的频率下降至 0.36 ％ ( 图 4B)， 说明 P3 肽的递呈 + + 被阻断， 抑制了 CD4 Foxp3 T 细胞的活化， 从而降低了 IL-10 的分泌 ； 而 10μg/ml TT、 500U/ + + ml IL-2 和 1μg/mlanti-CD28 刺激 DR9 纯合型 PBMC 20 天后， CD4 Foxp3 T 细胞几乎不分 + + + 泌 IL-10， 而 CD4 Foxp3 IL-10 T 细胞占 CD4 T 细胞的频率为 2.84％， 另 CD4+Foxp3+T 细胞和 CD4+Foxp3-T 细胞均分泌少量 IFN-γ， 这个结果与文献报道该 TT 肽为 DR9 限制性 CD4+T 细 胞表位相吻合。同时， 这些结果也进一步说明了 DR9 限制性 CD4+T 细胞表位与 DR9 限制性 CD4+Treg 表位在细胞因子分泌上的不同， 从另一角度说明了 P3 肽为 DR9 限制性 CD4+Treg 表 位。
4、 P3 肽特异性 CD4+CD25+Foxp3+T 细胞的抑制功能检测
在 1×106 个经丝裂霉素处理的 DR9 纯合型 PBMC 中加入 10μg/ml 候选表位肽 P3 或无关对照肽 TT、 500U/ml IL-2 和 1μg/ml anti-CD28 诱导 20 天， 磁珠分选出 CD4+CD25+T 细胞 ； 取 5×104 个同一患者新鲜分离的 CD4+CD25-T 细胞， 用磷酸盐缓冲液 (PH 7.4) 包被 的 1μg/ml anti-CD3 刺激 14 小时， 中断刺激， 再按数量比为 1 ∶ 0、 1 ∶ 1、 0 ∶ 1 加入前述 + + 5 CD4 CD25 T 细胞， 同时加入 2.5×10 个经候选表位肽 P3 或无关对照肽 TT 以及丝裂霉素处 理的自体 PBMC， 混合培养 3 天， 检测前 16 小时加入 H- 胸腺嘧啶核苷 (3H-TdR)1μCi， 在液 闪计数仪上测定每分钟放射活性 (cpm 值 )。
结果如图 5 所示， 携带 HLA-DR9 等位基因的 CHB 患者 PBMC 中的确存在 P3 特异性 + + 的 CD4 CD25 Treg， 该群细胞能被 P3 肽特异性活化并发挥显著的抑制其他细胞增殖的功能， 而同样是 HLA-DR9 限制性的 TT 肽则不能活化这一群 CD4+CD25+Treg。
最后说明的是， 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制， 尽管通过参 照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述， 但本领域的普通技术人员应当理解， 可 以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变， 而不偏离所附权利要求书所限定的本发明 的精神和范围。7101942013 A CN 101942018
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