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一种利用 RNA 干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法
    【技术领域】
     本发明属于转基因植物的培育技术领域， 特别涉及一种利用 RNA 干扰技术培育抗 粗缩病玉米的方法。背景技术
     玉米粗缩病是由玉米粗缩病毒 (MRDV) 所引起的一种病毒病。国内学者研究表明， 此病是由灰飞虱传播的一种病毒性病害， 其病原是一种具有双层衣壳的双链 RNA 球形病 毒， 主要由灰飞虱传播， 只侵染单子叶植物。 其寄主范围较广， 有玉米、 小麦、 水稻、 谷子和黑 麦等。另外， 还有一年生禾本科杂草， 如狗尾、 马塘、 画眉、 蟋蟀和白茅草等。田间冬小麦 “绿 矮型病株” 及与丛矮病毒 (WRSV) 混生的矮缩病株， 即是玉米粗缩病的初侵染源。研究资料 表明， 在玉米上传毒并造成危害的主要是灰飞虱第 1 代成虫， 而灰飞虱则又是玉米粗缩病 的主要传毒介体。研究结果表明， 麦套夏玉米一般 3 ～ 5 片叶即可感病， 而且感病越早， 发 病越重， 经济产量损失也越大！
     近年来， 山东、 山西、 河北、 北京、 天津、 陕西、 云南等地都有发病严重甚至绝产的报 道。玉米粗缩病已成为我国乃至世界玉米生产中的主要病害。发展到了不可忽视的地步。 针对玉米粗缩病的发生与环境条件、 播种日期、 品种抗病性等因素有关， 目前也采取了调整 播期、 加强田间管理、 药物防治等措施来控制其发生， 但是由于病毒繁殖快， 易于变异， 用传 统的防治方法不能从根本上解决这一问题。
     解决这一问题的有效策略是选育并推广抗病毒玉米品种。近年来逐渐兴起的 RNA 干扰技术 (RNA interference， RNAi)， 为各种作物的抗病毒育种研究开辟了一条新的途径。 利用基因工程的方法可以将病毒基因导入优良玉米品种， 获得对病毒的抗性。
     RNA 干 扰 (RNA interference， RNAi) 是 指 在 进 化 过 程 中 高 度 保 守 的、 由双链 RNA(double-stranded RNA， dsRNA) 诱发的、 同源 mRNA 高效特异性降解的现象。
     作为一种古老的生物体自我监督机制， RNAi 是植物抵御外来核酸入侵， 保持自身 基因组结构完整性的一种有效策略。由双链 RNA(dsRNA) 介导的干扰现象作为细胞的一种 防御机制可针对性地降解细胞内与之具有同源性的核酸 ( 如病毒的核酸 )， 达到对病毒的 抵抗， 同时还调节细胞内编码基因的表达， 为利用 RNA 介导的病毒抗性进行抗病毒基因工 程的研究奠定了基础。
     目前有分析玉米粗缩病基因序列以及寻找和筛选一些与玉米粗缩病抗性相关的 分子标记的报道。如 ： Bai 等分离鉴定了引起中国禾本科作物矮化症状的水稻黑条纹矮 化病毒 (Identification of rice black streaked dwarf virus in different cereal crops withdwarfing symptoms in China.Acta Virol.2001 ； 45(5-6) ： 335-9.)。Azuhata 等研究表明水稻黑条纹矮化病毒与玉米粗缩病病毒基因同源性很高 (Close similarity betweengenome structures of rice black-streaked dwarf and maize rough dwarf viruses.JGen Virol.1993， 74(7) ： 1227-32.)。李常保等人利用 RAPD 标记方法寻找与玉 米粗缩病 (MRDV) 基因紧密连锁的分子标记 ( 李常保等， 玉米抗粗缩病病毒 (MRDV) 基因的RAPD 标记及其辅助选择效果研究， 作物学报， 2002 年 7 月， 28(4) ： 564 ～ 568) ； 何龙等人利 用 SSR 标记方法， 寻找与玉米粗缩病抗性基因连锁的 SSR 分子标记 ( 何龙等， 玉米粗缩病抗 性基因 SSR 标记初步研究， 广东农业科学， 2008 年， 8： 5 ～ 8) ； 陈艳萍等人利用 SSR-BSA 技 术筛选玉米粗缩病抗性基因分子标记 ( 陈艳萍等， 利用 SSR-BSA 技术筛选玉米粗缩病抗性 基因分子标记， 江苏农业学报， 2008， 24(5) ： 590 ～ 594)。
     通过上述方法找到了一些可能与玉米粗缩病抗性有关的分子标记， 张举仁等也利 用分子标记进行了抗粗缩病玉米选育 ( 利用分子标记选育抗粗缩病的玉米， 发明专利公开 号： CN 101138313A)。但目前还未见利用 RNA 干扰技术培育抗粗缩病玉米成功的报道。 发明内容
     本发明的主要目的就是针对上述抗粗缩病玉米的研究现状， 提供一种利用 RNA 干 扰技术培育抗粗缩病玉米的方法。
     为了实现上述发明目的， 本发明采用的技术方案如下 ：
     一种利用 RNA 干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法 ：
     以 SEQ ID NO.1 所述的核苷酸序列作为抗玉米粗缩病的目的基因序列， 以 SEQ ID NO.2 所述的 F0 核苷酸序列作为初始模板， 分别以下述四对引物 f1/r1、 f2/r2、 f3/r3、 f4/r4 依次进行 PCR 扩增， 下一对引物上下游的 3’ 端分别与上一对引物上下游的 5’ 端有部分碱基 重叠， 第一对引物以 F0 为模板， 以后每一对引物以上一对引物的产物为模板， 这样每次 PCR 之后都在 5’ 和 3’ 端将目的序列延伸， 最终扩增得到目的基因序列 ； 四对引物分别如下 ： f1 ： TCCCGCAAGTACTACAGACGTTACTCACTACGGTGGATATGATCAATTTTCAC，
     r1 ： GCTGAAACGGGTATTATGCTAAGACTAATATTGTAAAAGAGATTCAAACG ；
     f2 ： TTAAGAATTGACGGTGGTTATGATTTCAATTGTCCCGCAAGTACTACAGAC，
     r2 ： AACACTTAATTCCTTTTCAAATAGATGAACGGTTTTTAAAGCTGAAACGGGTATTATG ；
     f3 ： GTTAGACTGTTAATGCGAACTGGTAAATTAAGAATTGACGGTGGTT，
     r3 ： TTGTTCAAGCAAAGATTTGTCTGCATCCAAAACACTTAATTCCTTTTCAA ；
     f4 ： CCTGCTCAAATGGGAATACTTACTGATGAAGTTAGACTGTTAATGCGAACT，
     r4 ： AACGAATGACGCTACTGCGCTCCAAGTTTGTTCAAGCAAAGATTTGT ；
     将得到的目的基因序列经不同限制性内切酶酶切形成粘性末端， 再用与其相同 的限制性内切酶酶切中间载体 pSK-int， 于 0.8 ％琼脂糖凝胶电泳分离后回收酶切的目 的条带， 连接克隆入 pSK-int 载体中， 形成含正反向重复目的片段的中间载体， 命名为 pSK-int-FR303 ；
     用不同的两种限制性内切酶分别酶切中间载体 pSK-int-FR303 和植物表达载 体 pJIM19(BARR)， 将含正反向重复序列的目的片段连接到 pJIM19(BARR) 载体中， 即为构 建成功的植物表达载体 ； 新构建的载体能转录出发夹结构 RNA(hairpin RNA)， 命名为 pJIM19-MRDV303 ；
     将植物表达载体 pJIM19-MRDV303 利用农杆菌介导法分别转入优良玉米的胚性愈 伤组织， 通过除草剂筛选、 分化、 生根壮苗， 即获得再生转基因植株。
     上述利用 RNA 干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法， 更具体的可包括下述主要步 骤：
     (1)、 玉米粗缩病病毒的 RNAi 载体的构建
     A. 重叠 PCR 法扩增获得如 SEQ ID NO.1 所述的目的基因序列
     通过 NCBI 数据库的 Blast 序列比对， 选择 MRDV 的保守序列共 303bp 作为抗玉米 粗缩病的目的基因序列， 在本发明中命名为 MRDV-303， 其核苷酸序列从左至右从 5’ 端至 3’ 端碱基组成如 SEQ ID NO.1 所述。
     具体步骤如下 ：
     1)PCR 扩增获得第一段序列 ：
     首先合成目的基因片段的中间部分片段 F0(123bp-179bp)， 即具有如 SEQ ID NO.2 所述的核苷酸序列， 再以 F0 为初始模板、 以下述上游引物 f1 和下游引物 r1 进行 PCR 扩增 ：
     f1 ： TCCCGCAAGTACTACAGACGTTACTCACTACGGTGGATATGATCAATTTTCAC，
     r1 ： GCTGAAACGGGTATTATGCTAAGACTAATATTGTAAAAGAGATTCAAACG ；
     扩增体系为， 每 20μL 中含有 ：
     10×PCR buffer 2μL，
     dNTPs 1.6μL， 2+
     Mg 1.2μL， DNA 模板 1μL，
     上游引物 f1 0.5μL，
     下游引物 r1 0.5μL，
     rTaq 酶 0.2μL，
     ddH2O 13.0μL ；
     扩增程序为 ：
     94℃， 5min ；
     94℃， 30s， 59℃， 30s， 72℃， 30s(30 个循环 ) ；
     72℃， 5min ； 10℃保温 ；
     扩增得到第一段序列。
     2)PCR 扩增获得第二段序列 ：
     以步骤 1) 的产物 ( 第一段序列 ) 为模板， 以下述上游引物 f2 和下游引物 r2 进行 PCR 扩增 ：
     f2 ： TTAAGAATTGACGGTGGTTATGATTTCAATTGTCCCGCAAGTACTACAGAC，
     r2 ： AACACTTAATTCCTTTTCAAATAGATGAACGGTTTTTAAAGCTGAAACGGGTATTATG ；
     扩增体系为， 每 20μL 中含有 ：
     10×PCR buffer 2μL，
     dNTPs 1.6μL， 2+
     Mg 1.2μL，
     DNA 模板 1μL，
     上游引物 f2 0.5μL，
     下游引物 r2 0.5μL，
     rTaq 酶 0.2μL，
     ddH2O 13.0μL ；
     扩增程序为 ：
     94℃， 5min ；
     94℃， 30s， 58℃， 30s， 72℃， 30s(30 个循环 ) ；
     72℃， 5min ； 10℃保温 ；
     扩增得到第二段序列。
     3)PCR 扩增获得第三段序列 ：
     以步骤 2) 的产物 ( 第二段序列 ) 为模板， 以下述上游引物 f3 和下游引物 r3 进行 PCR 扩增 ：
     f3 ： GTTAGACTGTTAATGCGAACTGGTAAATTAAGAATTGACGGTGGTT，
     r3 ： TTGTTCAAGCAAAGATTTGTCTGCATCCAAAACACTTAATTCCTTTTCAA ；
     扩增体系为， 每 20μL 中含有 ：
     10×PCR buffer 2.0μL，
     dNTPs 1.6μL， 2+
     Mg 1.2μL，
     DNA 模板 1μL， 上游引物 f3 0.5μL，
     下游引物 r3 0.5μL，
     rTaq 酶 0.2μL，
     ddH2O 13.0μL。
     扩增程序为 ：
     94℃， 5min ；
     94℃， 30s， 58℃， 30s， 72℃， 30s(30 个循环 ) ；
     72℃， 5min ； 10℃保温 ；
     扩增得到第三段序列。
     4)PCR 扩增获得目的基因序列 ：
     以步骤 3) 的产物 ( 第三段序列 ) 为模板， 以下述上游引物 f4 和下游引物 r4 进行 PCR 扩增 ：
     f4 ： CCTGCTCAAATGGGAATACTTACTGATGAAGTTAGACTGTTAATGCGAACT，
     r4 ： AACGAATGACGCTACTGCGCTCCAAGTTTGTTCAAGCAAAGATTTGT ；
     扩增体系为， 每 20μL 中含有 ：
     10×PCR buffer 2.0μL，
     dNTPs 1.6μL， 2+
     Mg 1.2μL，
     DNA 模板 1μL，
     上游引物 f4 0.5μL，
     下游引物 r4 0.5μL，
     rTaq 酶 0.2μL，
     ddH2O 13.0μL。
     扩增程序为 ：
     94℃， 5min ； 94℃， 30s， 59℃， 30s， 72℃， 30s(30 个循环 ) ； 72℃， 5min ； 10℃保温。 扩增得到目的基因序列。 将扩增产物目的基因序列在 1％琼脂糖凝胶上分离、 回收和纯化， 得到纯化的回收产物。 5) 连接和转化 ：
     ①回收产物连接到 pMD-18T
     反应体系如下 ： pMD-18T 载体 1μL( 约 50ng)， 10× 连接酶缓冲液 1μL， T4DNA 连 接酶 350U， 回收 PCR 产物加至终反应体积 10μL。
     16℃连接 12h， 得到连接产物。
     ②转化大肠杆菌 DH5α
     感受态细胞的制备 ：
     a. 取在无抗生素平板上生长良好的单个 DH5α 菌落， 接种于 1mL LB 液体培养基 中， 37℃振荡培养 (225r/min) 过夜 ；
     b. 取 500μL 活化过夜的菌液于 50mL LB 液体培养基中， 37℃振荡培养至 OD600 ＝ 0.4 ；
     c. 将菌液倒入 50mL 离心管中， 冰浴 10min ；
     d. 在预冷至 4℃的离心机中， 4000r/min 离心 10min 后去掉上清液， 收集菌体 ；
     e. 加入 20mL 冰冷的 0.1mol/L CaCl2 于离心管中， 均匀悬浮菌体后， 冰浴中 30min ；
     f.4 ℃ 下， 4000r/min 离 心 10min 后 去 掉 上 清 液， 收 集 菌 体， 加 入 2mL 冰 冷 的 0.1mol/LCaCl2 溶液均匀悬浮菌体后， 放入冰中待用。
     转化步骤如下 ：
     a. 将连接产物加入 200μL 感受态细胞中， 充分混匀置于冰上 30min ；
     b.42℃热击 1min 30s， 冰浴 2min 后加入预热至 37℃的 LB 液体培养基 600μL ；
     c.37℃低速 (100r/min) 振荡培养 50min ；
     d. 在每个含有氨苄青霉素 (50μg/mL) 的 LB 固体培养基平板上加 100μL 菌液， 均 匀涂于平板上 ；
     e.37℃培养箱中培养 16 小时。
     6) 阳性克隆的筛选 ：
     以前述步骤 A4) 的目的基因序列为模板， 以下述引物 f5 和 r5 扩增全长目的基因 序列 ：
     f5 ： CCTGCTCAAATGGGAATA
     r5 ： AACGAATGACGCTACTGC
     ①挑取培养基平板上生长良好的单菌落， 在含有氨苄青霉素 (50μg/mL) 的 LB 液 体培养基中 37℃、 225r/min 振荡培养 12 小时。
     ②以菌液为模板进行 PCR 扩增， 反应体系如下 ：
     扩增体系为， 每 20μL 中含有 ：
     10×PCR buffer 2.0μL，
     dNTPs 1.6μL， 2+
     Mg 1.2μL，
     DNA 模板 1μL，
     上游引物 f5 0.5μL，
     下游引物 r5 0.5μL，
     rTaq 酶 0.2μL，
     ddH2O 13.0μL ；
     ③ PCR 反应扩增程序为 ：
     94℃， 5min ；
     94℃， 30s， 58℃， 30s， 72℃， 30s(30 个循环 ) ；
     72℃， 5min ； 10℃保温 ；
     将得到的扩增产物在 1％琼脂糖凝胶上分离。
     ④测序 ： 通过测序确定扩增得到的序列与目的基因序列是否一致。
     B. 构建含正向序列的中间载体 pSK-int-F303
     1)PCR 扩增获得正向片段 ：
     以上述步骤 A6) 得到的目的基因序列为模板， 设计上下游引物 F1 和 R1， 其 5’ 端分 别引入限制性内切酶位点 XhoI 和 HindIII， 酶切位点外侧添加三个保护碱基以保证酶切完 全。引物序列如下 ：
     F1 ： 5’ ATCCTCGAGCCTGCTCAAATGGGAAT 3’ (Xho I)，
     R1 ： 5’ CTCAAGCTTAACGAATGACGCTACTGC 3’ (HindIII) ；
     PCR 扩 增 体 系 为， 每 20μL 中 含 有 ： 10×PCR 缓 冲 液 2.0μL， DNA1-10ng， dNTPs 2+ 100μmol/L， 上游引物 F1 5pmol， 下游引物 R1 5pmol， Taq DNA 聚合酶 1U， Mg 1.5mmol/L， ddH2O 加至终体积 20μL ；
     PCR 反应程序为 ： 先 94℃ 4min ； 再 94℃ 30s， 58℃ 30s， 72℃ 30s， 循环 30 次 ； 最 后 72℃延伸 5min ；
     将扩增得到的产物在 1％琼脂糖凝胶上分离， 得到正向片段 PCR 产物。
     2)PCR 产物与中间载体的酶切、 回收和纯化 ：
     ① PCR 产 物 30μL 酶 切 体 系 为 ： 10×H 缓 冲 液 3.0μL， 正 向 片 段 PCR 产 物 10.0μL( 约 2μg)， XhoI 5U， HindIII 5U， ddH2O 加至终体积 30μL
     ② 中 间 载 体 20μL 酶 切 体 系 为 ： 10×H 缓 冲 液 2.0μL， pSK-int 中 间 载 体 5.0μL( 约 1μg)， XhoI 5U， HindIII 5U， ddH2O 加至终体积 20μL。
     37℃温育 4 小时， 将得到的酶切产物在 0.8％琼脂糖凝胶上分离， 再回收和纯化， 得到纯化的回收产物。
     3) 正向片段连入中间载体 ：
     ①回收产物连接到中间载体 pSK-int
     10μL 反应体系为 ： pSK-int 中间载体 2μL( 约 300ng)， 10×T4DNA 连接酶缓冲液 1μL， T4DNA 连接酶 350U， 回收正向片段酶切产物 5μL( 约 800ng)， ddH2O 加至终反应体积 10μL ；
     16℃连接 10 小时 ；②连接产物转化大肠杆菌 DH5α， 方法同上述步骤 A5) ；
     4) 正向片段阳性克隆的筛选 ：
     ①挑取培养平板上生长良好的单菌落， 在含有氨苄青霉素 (50μg/mL) 的 LB 液体 培养基中 37℃、 225r/min 振荡培养 12 小时。
     ② 取 培 养 后 的 菌 液 进 行 PCR 扩 增，反 应 体 系 如 下 ： 10×PCR 缓 冲 液 2.0μL， DNA1.0μL 菌液， dNTPs100μmol/L， 引物 F1 5pmol， 引物 R15pmol， Taq DNA 聚合酶 2+ 1U， Mg 1.5mmol/L， ddH2O 加至终体积 20μL。
     PCR 扩增程序同上述步骤 B1)。
     ③对 PCR 呈阳性的克隆， 取 500μL 菌液进行测序， 完全正确的样品用于下一步载 体构建， 命名为 pSK-int-F303。
     C. 构建含反向重复序列的中间载体 pSK-int-FR303
     1)PCR 扩增获得反向片段 ：
     以上述步骤 A6) 得到的目的基因序列为模板， 设计引物上下游引物 F2 和 R2， 其 5’ 端分别引入限制性内切酶位点 SpeI 和 PstI， 酶切位点外侧添加三个保护碱基以保证酶切 完全。 引物序列如下 ：
     F2 ： 5’ AAAACTAGTCCTGCTCAAATGGGAAT 3’ (SpeI)
     R2 ： 5’ AAACTGCAGAACGAATGACGCTACTGC 3’ (PstI)
     PCR 扩 增 体 系 为，每 20μL 中 含 有 ： 10×PCR 缓 冲 液 2.0μL， DNA1-10ng， 2+ dNTPs100μmol/L， 引物 F2 5pmol， 引物 R2 5pmol， Taq DNA 聚合 1U， Mg 1.5mmol/L， ddH2O 加 至终体积 20μL。
     PCR 扩增程序同上述步骤 B1) ；
     2) 反向片段 PCR 产物与载体 pSK-int-F303 的酶切 ：
     ① PCR 产物 30μL 酶切体系 ： 10×H 缓冲液 3.0μL， 反向片段 PCR 产物 10.0μL( 约 2μg)， SpeI 5U， PstI 5U， ddH2O 加至终体积 30μL。
     ② 中 间 载 体 20μL 酶 切 体 系 ： 10×H 缓 冲 液 2.0μL， pSK-int-F303 中 间 载 体 5.0μL( 约 1μg)， SpeI 5U， PstI 5U， ddH2O 加至终体积 20μL。
     37℃温育 2 小时。
     ③酶切产物的回收、 纯化、 连接和转化等操作与正向片段的相同。
     10μl 连接体系为 ： pSK-int-F303 中间载体 2μL( 约 300ng)， 10×T4DNA 连接酶缓 冲液 1μL， T4DNA 连接酶 350U， 回收反向片段酶切产物 5μL( 约 800ng)， ddH2O 加至终反应 体积 10μL。
     16℃连接 12 小时。
     3) 反向片段阳性克隆的筛选 ：
     ①挑取培养平板上生长良好的单菌落， 在含有氨苄青霉素 (50μg/mL) 的 LB 液体 培养基中 37℃、 225r/min 振荡培养 12h。
     ②取培养后的菌液进行 PCR 扩增， 20μL 反应体系如下 ： 10×PCR 缓冲液 2.0μL， DNA1.0μL 菌 液， dNTPs100μmol/L， 引 物 F2 5pmol， 引 物 R2 5pmol， Taq DNA 聚 合 1U， 2+ Mg 1.5mmol/L， ddH2O 加至终体积 20μL。
     PCR 扩增程序同上述步骤 B1) ；
     ③对 PCR 呈阳性的克隆， 取 500μL 菌液进行测序， 完全正确的即为含反向重复目 的片段的中间载体， 命名为 pSK-int-FR303。
     D. 构建含反向重复序列的表达载体 pJIM19-MRDV303
     1)XhoI 和 SpeI 双酶切含反向重复目的片段的中间载体 pSK-int-FR303
     30 μ L 酶 切 体 系 为 ： 10×K 缓 冲 液 1.5 μ L( 终 浓 度 0.5K) ， pSK-int-FR30315.0μL( 约 3μg)， XhoI 5U， SpeI 5U， ddH2O 加至终体积 30μL。
     37℃温育 30 分钟。
     2)XhoI 和 SpeI 双酶切植物表达载体 pJIM19
     30μL 酶切体系如下 ： 10×K 缓冲液 3.0μL， pJIM19 10.0μL( 约 2μg)， XhoI 5U， SpeI 5U， ddH2O 加至终体积 30μL。
     37℃温育 2 小时。
     3) 酶切产物经 0.8％琼脂糖凝胶电泳后分别回收反向重复序列和植物表达载体 的大片段， 所有操作按说明书进行。T4DNA 连接酶连接。
     10μL 连 接 体 系 为 ： 10×T4DNA 连 接 酶 缓 冲 液 1μL， 正 反 向 重 复 序 列 5μL( 约 1μg)， 植物表达载体的大片段 2μL( 约 200ng)， T4DNA 连接酶 350U， ddH2O 加至终反应体积 10μL。16℃连接 10 小时。
     4) 阳性克隆的筛选
     ①挑取培养平板上生长良好的单菌落， 在含有卡那霉素 (50μg/mL) 的 LB 液体培 养基中 37℃、 225r/min 振荡培养 12 小时。
     ②取培养后的菌液进行 PCR 扩增， 20μL 反应体系为 ： 10×PCR 缓冲液 2.0μL， DNA1.0μL 菌 液， dNTPs100μmol/L， 引 物 F2 5pmol， 引 物 R25pmol， Taq DNA 聚 合 酶 1U， 2+ Mg 1.5mmol/L， ddH2O 加至终体积 20μL。
     PCR 反应体系及扩增程序同上述步骤 B1)。
     ③ PCR 呈阳性的克隆在 20mL 含有卡那霉素 (50μg/mL) 的 LB 液体培养基中扩大 培养， 提取质粒 ； XhoI 和 SpeI 双酶切鉴定， 0.8％琼脂糖凝胶电泳检测含有目的片段大小的 条带， 即为构建好的植物表达载体， 在本发明中命名为 pJIM19-MRDV303。
     (2). 农杆菌介导法转化优良玉米的胚性愈伤组织及植株的再生
     A. 植物表达载体 pJIM19-MRDV303 转化农杆菌 ：
     ①农杆菌感受态细胞的制备
     取 -70℃保存的 EHA105 于含有 50μg/mL 利福霉素平板划线， 28℃培养 2 天。挑取 单菌落接种于 5mL YEP 液体培养基中， 225r/min， 28℃振荡培养 12 小时左右。将 5mL 菌液 转接于 100mL YEP 液体培养基中， 28℃， 225r/min， 振荡培养至 OD600 ＝ 0.5 ； 转入无菌 50mL 的离心管， 5000g 离心 5min， 去上清液。加入 1mL 预冷的 0.1mol/L 的 CaCl2 溶液， 轻轻悬浮 细胞， 冰上放置 20min， 4 ℃下， 5000g 离心 5min， 去上清。加入 200L 预冷的含 15 ％甘油的 0.1mol/L 的 CaCl2 溶液， 轻轻悬浮。混匀后立即冻存于 -70℃， 备用。
     ②表达载体 pJIM19-MRDV303 转化农杆菌
     取 0.5g 左右的 pJIM19-MRDV303 质粒 DNA 加入到 200l EHA105 感受态细胞中， 混 匀后， 冰浴 30min ； 液氮中速冻 1min ； 取出后 37℃水浴 5min ； 冰浴 2min ； 加入 800L YEP 液体培养基， 28℃， 150r/min 振荡培养 4h ； 然后取 200L 涂布在含 50μg/mL 卡那霉素和 50μg/ mL 利福霉素的 YEP 平板上， 28℃培养到形成单菌落。
     ③阳性克隆的鉴定
     挑取转化的农杆菌单菌落接种于含 50g/mL 卡那霉素和 50μg/mL 利福霉素的 YEP 液体培养基中， 28℃， 225r/min 振荡培养 12h， 直接用菌液做 PCR。PCR 反应体系及扩增程序 同上述步骤 (1)D4)。
     B. 农杆菌浸染 ：
     将含有目标载体 pJIM19-MRDV303 的农杆菌接种到含 50mg/L 利福霉素和 50mg/L 卡那霉素的 YEP 培养基， 于 28℃培养 2 天 ； 挑取单个菌落于含相应抗生素的 1mL YEP 培养 基中， 28℃、 225r/min 振荡培养 12h， 再将其加入含相应抗生素的 50mL 培养基扩大培养至 OD600 ＝ 0.5 ； 4℃、 4000r/min 离心 5min 收集菌体， 用等体积的液体浸染培养基悬浮。将待 转化优良玉米自交系的愈伤组织分别浸入含 AS 的浸染培养基， 浸染 5-10min。
     C. 共培养 ：
     浸染了农杆菌的愈伤组织置于灭菌纸上， 吸干多余水分后接种到共培养基。用保 鲜膜封好平板， 22℃暗培养 3d。
     D. 清洗及恢复培养 ：
     共培养 3 天后的愈伤组织用 5mL 含 250mg/L 噻孢霉素钠的灭菌蒸馏水清洗 3 次， 置 于灭菌滤纸上吸干多余水分后， 接种到恢复培养基上。用保鲜膜封好平板， 25℃暗培养 5d。
     E. 筛选转化子 ：
     恢复培养后的愈伤组织转接到含 1.5mg/L 除草剂草丁膦的选择培养基上。每两 周后将抗性愈伤组织转接到新鲜的选择培养基上 ； 连续筛选 3 代， 草丁膦浓度按 1.5mg/L、 3.0mg/L、 5.0mg/L 递增 ； 每次转接都淘汰褐色的愈伤组织。
     F. 转基因植株的再生 ：
     选取抗性愈伤组织， 转接到分化培养基 (N6 盐和维生素 + 蔗糖 30g/L+ 琼脂 6g/L+ 水解酪蛋白 100mg/L+KT 1mg/L， pH 5.8) 上， 25℃光照培养 16 小时 /d ； 2-3 周后， 将分化出 的幼苗转接到生根壮苗培养基 (MS 盐和维生素 + 肌醇 100mg/L+ 生根粉 ABT 0.25g/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 6g/L， pH 5.8) 上， 25℃光照培养 16 小时 /d， 即得到 T0 转基因植株， 经过自交 繁育、 分子检测、 接毒鉴定等， 表明该株系是一种对玉米粗缩病具有较好抗病性的转基因作 物。
     与现有技术相比， 本发明的有益效果是 ：
     本发明方法利用 RNA 干扰技术， 可培育出具有优良抗粗缩病的玉米转基因植株， 从根本上解决玉米粗缩病问题， 显著提高玉米产量， 提高其经济价值。 附图说明 图 1 为中间载体 pBluescript SK+， 构建正反向重复序列的中载体 pSK-int 在 pBluescript SK+ 的 MCS 区插入了一段内含子 ；
     图 2 为植物表达载体 pJIM19(BARR)。MCS 为多克隆位点区， 酶切位点依次为 XbaI， XhoI， Stul， Spel， Sacl ；
     图 3 为重叠 PCR 扩增目的基因电泳检测结果图 ；
     图 4 为含正向序列中间载体 pSK-int-F303 用 XhoI/HindIII 双酶切鉴定电泳检测 结果图 ；
     图 5 为含反向重复序列中间载体 pSK-int-FR303 用 XhoI/SpeI 双酶切鉴定电泳检 测结果图 ；
     图 6 为转基因 18-599 白再生植株 ；
     图 7 为再生植株目的基因 PCR 检测电泳结果图 ；
     图 8 为田间接种病毒 15 天后的 18-599 红植株 ；
     图 9 为实施例 2 中， 部分转化植株 Bar 基因检测结果 ： 1： 阳性对照 ； 2： 阴性对照 ； 3-15 ： 转化植株 ；
     图 10 为实施例 2 中， 部分转化植株目的基因片段检测结果 ： 5， 8， 15 为转化植株 ；
     图 11 为实施例 2 中， 转基因植株 PCR 扩增产物测序结果
     图 12 为实施例 2 中， 部分转基因植株 Southern 杂交检测电泳图， TW2、 TW6 和 TW4 为不同的转基因株系 ；
     图 13、 图 14 分别为实施例 4 中， MRDV 目的基因标准曲线图及熔解曲线分析图 ；
     图 15、 图 16 分别为实施例 4 中， 18S 内参基因标准曲线及熔解曲线分析图 ；
     图 17 为实施例 4 中， qRT-PCR 检测接毒鉴定的转基因植株及对照中 MRDV 基因表 达量。 具体实施方式
     下面结合具体实施方式对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述。
     但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。 在不脱离本发明上 述技术思想情况下， 根据本领域普通技术知识和惯用手段， 做出各种替换和变更， 均应包括 在本发明的范围内。
     实施例 1
     本实施例利用 RNA 干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法， 包括下述主要步骤 ：
     (1)、 玉米粗缩病病毒的 RNAi 载体的构建
     A. 重叠 PCR 法扩增获得如 SEQ ID NO.1 所述的目的基因序列
     通过 NCBI 数据库的 Blast 序列比对， 选择 MRDV 的保守序列共 303bp 作为抗玉米 粗缩病的目的基因序列， 在本发明中命名为 MRDV-303， 其核苷酸序列从左至右从 5’ 端至 3’ 端碱基组成如 SEQ ID NO.1 所述。
     具体步骤如下 ：
     1)PCR 扩增获得第一段序列 ：
     首先合成目的基因片段的中间部分片段 F0(123bp-179bp)， 即具有如 SEQ ID NO.2 所述的核苷酸序列， 再以 F0 为初始模板、 以下述上游引物 f1 和下游引物 r1 进行 PCR 扩增 ：
     f1 ： TCCCGCAAGTACTACAGACGTTACTCACTACGGTGGATATGATCAATTTTCAC，
     r1 ： GCTGAAACGGGTATTATGCTAAGACTAATATTGTAAAAGAGATTCAAACG ；
     扩增体系为， 每 20μL 中含有 ：
     10×PCR buffer 2.0μL，
     dNTPs 1.6μL，Mg2+ 1.2μL，
     DNA 模板 1μL，
     上游引物 f1 0.5μL，
     下游引物 r1 0.5μL，
     rTaq 酶 0.2μL，
     ddH2O 13.0μL ；
     扩增程序为 ：
     94℃， 5min ；
     94℃， 30s， 59℃， 30s， 72℃， 30s(30 个循环 ) ；
     72℃， 5min ； 10℃保温 ；
     扩增得到第一段序列。
     2)PCR 扩增获得第二段序列 ：
     以步骤 1) 的产物 ( 第一段序列 ) 为模板， 设计上游引物 f2 和下游引物 r2， 分别与 步骤 1) 产物的 5’ 和 3’ 端部分碱基重叠， 进行 PCR 扩增 ：
     f2 ： TTAAGAATTGACGGTGGTTATGATTTCAATTGTCCCGCAAGTACTACAGAC，
     r2 ： AACACTTAATTCCTTTTCAAATAGATGAACGGTTTTTAAAGCTGAAACGGGTATTATG ；
     扩增体系为， 每 20μL 中含有 ：
     10×PCR buffer 2.0μL，
     dNTPs 1.6μL， 2+
     Mg 1.2μL，
     DNA 模板 1μL，
     上游引物 f2 0.5μL，
     下游引物 r2 0.5μL，
     rTaq 酶 0.2μL，
     ddH2O 13.0μL ；
     扩增程序为 ：
     94℃， 5min ；
     94℃， 30s， 58℃， 30s， 72℃， 30s(30 个循环 ) ；
     72℃， 5min ； 10℃保温 ；
     扩增得到第二段序列。
     3)PCR 扩增获得第三段序列 ：
     以步骤 2) 的产物 ( 第二段序列 ) 为模板， 设计上游引物 f3 和下游引物 r 3， 分别 与步骤 2) 产物的 5’ 和 3’ 端部分碱基重叠， 进行 PCR 扩增 ：
     f3 ： GTTAGACTGTTAATGCGAACTGGTAAATTAAGAATTGACGGTGGTT，
     r3 ： TTGTTCAAGCAAAGATTTGTCTGCATCCAAAACACTTAATTCCTTTTCAA ；
     扩增体系为， 每 20μL 中含有 ：
     10×PCR buffer 2.0μL，
     dNTPs 1.6μL， 2+
     Mg 1.2μL，DNA 模板 1.0μL，
     上游引物 f3 0.5μL，
     下游引物 r3 0.5μL，
     rTaq 酶 0.2μL，
     ddH2O 13.0μL。
     扩增程序为 ：
     94℃， 5min ；
     94℃， 30s， 58℃， 30s， 72℃， 30s(30 个循环 ) ；
     72℃， 5min ； 10℃保温 ；
     扩增得到第三段序列。
     4)PCR 扩增获得目的序列 ：
     以步骤 3) 的产物 ( 第三段序列 ) 为模板， 设计上游引物 f4 和下游引物 r4， 分别与 步骤 3) 产物的 5’ 和 3’ 端部分碱基重叠， 进行 PCR 扩增 ：
     f4 ： CCTGCTCAAATGGGAATACTTACTGATGAAGTTAGACTGTTAATGCGAACT，
     r4 ： AACGAATGACGCTACTGCGCTCCAAGTTTGTTCAAGCAAAGATTTGT ；
     扩增体系为， 每 20μL 中含有 ：
     10×PCR buffer 2.0μL，
     dNTPs 1.6μL， 2+
     Mg 1.2μL，
     DNA 模板 1.0μL，
     上游引物 f4 0.5μL，
     下游引物 r4 0.5μL，
     rTaq 酶 0.2μL，
     ddH2O 13.0μL。
     扩增程序为 ：
     94℃， 5min ；
     94℃， 30s， 59℃， 30s， 72℃， 30s(30 个循环 ) ；
     72℃， 5min ； 10℃保温。
     PCR 反应在 PTC-220 型 PCR 仪 (MJ Research， U.S.A.) 中进行， 扩增产物即为目的 基因序列。
     将扩增产物在 1％琼脂糖凝胶上分离， 80V 恒定电压电泳 45min。
     在步骤 4) 引物扩增电泳分离后， 使用 TIANGEN 公司琼脂糖凝胶回收和纯化试剂 盒， 所有操作均按说明书进行， 得到纯化的回收产物。
     5) 连接和转化 ：
     ①回收产物连接到 pMD-18T
     反应体系如下 ： pMD-18T 载体 1μL( 约 50ng)， 10× 连接酶缓冲液 1μL， T4DNA 连 接酶 350U， 回收 PCR 产物加至终反应体积 10μL。
     16℃连接 12h。
     ②转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞的制备 ：
     a. 取在无抗生素平板上生长良好的单个 DH5α 菌落， 接种于 1mL LB 液体培养基 中， 37℃振荡培养 (225r/min) 过夜 ；
     b. 取 500μL 活化过夜的菌液于 50mL LB 液体培养基中， 37℃振荡培养至 OD600 ＝ 0.4 ；
     c. 将菌液倒入 50mL 离心管中， 冰浴 10min ；
     d. 在预冷至 4℃的离心机中， 4000r/min 离心 10min 后去掉上清液， 收集菌体 ；
     e. 加入 20mL 冰冷的 0.1mol/L CaCl2 于离心管中， 均匀悬浮菌体后， 冰浴中 30min ；
     f.4 ℃ 下， 4000r/min 离 心 10min 后 去 掉 上 清 液， 收 集 菌 体， 加 入 2mL 冰 冷 的 0.1mol/LCaCl2 溶液均匀悬浮菌体后， 放入冰中待用。
     转化步骤如下 ：
     a. 将连接产物加入 200μL 感受态细胞中， 充分混匀置于冰上 30min ；
     b.42℃热击 1min 30s， 冰浴 2min 后加入预热至 37℃的 LB 液体培养基 600μL ；
     c.37℃低速 (100r/min) 振荡培养 50min ；
     d. 在每个含有氨苄青霉素 (50μg/mL) 的 LB 固体培养基平板上加 100μL 菌液， 均 匀涂于平板上 ；
     e.37℃培养箱中培养 16h。
     6) 阳性克隆的筛选 ：
     以前述步骤 A4) 的目的基因序列为模板， 以下述引物 f5 和 r5 扩增全长目的基因 序列 ：
     f5 ： CCTGCTCAAATGGGAATA
     r5 ： AACGAATGACGCTACTGC
     ①挑取培养平板上生长良好的单菌落， 在含有氨苄青霉素 (50μg/mL) 的 LB 液体 培养基中 37℃、 225r/min 振荡培养 12h。
     ②以菌液为模板进行 PCR 扩增， 反应体系如下 ： DNA1μL 菌液， dNTPs 100μmol/ L， 引物 f45pmol， 引物 r45pmol， Taq DNA 聚合酶 1U， 10×PCR 缓冲液 2.0μL， Mg2+1.5mmol/L， ddH2O 加至终体积 20μL。
     扩增体系为， 每 20μL 中含有 ：
     10×PCR buffer 2.0μL，
     dNTPs 1.6μL， 2+
     Mg 1.2μL，
     DNA 模板 1.0μL，
     上游引物 f5 0.5μL，
     下游引物 r5 0.5μL，
     rTaq 酶 0.2μL，
     ddH2O 13.0μL ；
     ③ PCR 反应扩增程序为 ：
     94℃， 5min ；
     94℃， 30s， 58℃， 30s， 72℃， 30s(30 个循环 ) ；72℃， 5min ； 10℃保温 ；
     将得到的扩增产物在 1％琼脂糖凝胶上分离， 80V 恒定电压电泳 45min， 检测有无 目的片段。
     ④测序 ： 将目的片段送 Invitrogen 公司测序， 测序结果表明扩增序列与设计的目 的片段完全一致。
     B. 构建含正向序列的中间载体 pSK-int-F303
     1)PCR 扩增获得正向片段 ：
     以上述步骤 A 6) 得到的目的基因序列为模板， 设计上下游引物 F1 和 R1， 其 5’ 端 分别引入限制性内切酶位点 XhoI 和 HindIII， 酶切位点外侧添加三个保护碱基以保证酶切 完全。引物序列如下 ：
     F1 ： 5’ ATCCTCGAGCCTGCTCAAATGGGAAT 3’ (Xho I)，
     R1 ： 5’ CTCAAGCTTAACGAATGACGCTACTGC 3’ (HindIII) ；
     PCR 扩增体系为， 每 20μL 中含有 ： 10×PCR 缓冲液 2.0μL， DNA 1-10ng， dNTPs 2+ 100μmol/L， 上游引物 F1 5pmol， 下游引物 R1 5pmol， Taq DNA 聚合酶 1U， Mg 1.5mmol/L， ddH2O 加至终体积 20μL ； PCR 反应程序为 ： 先 94℃ 4min ； 再 94℃ 30s， 58℃ 30s， 72℃ 30s， 循环 30 次 ； 最后 72℃延伸 5min ；
     PCR 反应在 PTC-220 型 PCR 仪 (MJ Research， U.S.A.) 中进行。扩增产物在 1％琼 脂糖凝胶上分离， 80V 恒定电压电泳 45min， 得到正向片段 PCR 产物。
     2)PCR 产物与中间载体的酶切、 回收和纯化 ：
     ① PCR 产 物 30μL 酶 切 体 系 为 ： 10×H 缓 冲 液 3.0μL， 正 向 片 段 PCR 产 物 10.0μL( 约 2μg)， XhoI 5U， HindIII 5U， ddH2O 加至终体积 30μL。
     ② 中 间 载 体 20μL 酶 切 体 系 为 ： 10×H 缓 冲 液 2.0μL， pSK-int 中 间 载 体 5.0μL( 约 1μg)， XhoI 5U， HindIII 5U， ddH2O 加至终体积 20μL。
     37℃温育 2 小时， 酶切产物在 0.8 ％琼脂糖凝胶上分离， 80V 恒定电压电泳 50 分 钟。
     ③使用 TIANGEN 公司琼脂糖凝胶回收和纯化试剂盒， 所有操作均按说明书进行， 得到纯化的回收产物。
     3) 正向片段连入中间载体 ：
     ①回收产物连接到中间载体 pSK-int 的 10μL 反应体系为 ： 酶切的 pSK-int 中间 载体 2μL( 约 300ng)， 10×T4DNA 连接酶缓冲液 1μL， T4DNA 连接酶 350U， 回收正向片段酶 切产物 5μL( 约 800ng)， ddH2O 加至终反应体积 10μL。
     16℃连接 10 小时。
     ②转化大肠杆菌 DH5α， 方法同上述步骤 A 5)。
     4) 正向片段阳性克隆的筛选 ：
     ①挑取培养平板上生长良好的单菌落， 在含有氨苄青霉素 (50μg/mL) 的 LB 液体 培养基中 37℃、 225r/min 振荡培养 12h。
     ②取培养后的菌液进行 PCR 扩增， 反应体系如下 ： 10×PCR 缓冲液 2.0μL， DNA1.0μL 菌 液， dNTPs 100μmol/L， 引 物 F1 5pmol， 引 物 R1 5pmol， TaqDNA 聚 合 酶 1U，
     Mg2+1.5mmol/L， ddH2O 加至终体积 20μL。
     PCR 扩增程序同上述步骤 B1) ；
     ③ PCR 呈阳性的克隆取 500μL 菌液送 Invitrogen 公司测序， 完全正确的样品用 于下一步载体构建， 命名为 pSK-int-F303。
     C. 构建含反向重复序列的中间载体 pSK-int-FR303
     1)PCR 扩增获得反向片段 ：
     以上述步骤 A 6) 得到的目的基因序列为模板， 上下游引物 F2 和 R2， 其 5’ 端分别 引入限制性内切酶位点 SpeI 和 PstI( 下划线 )， 酶切位点外侧添加三个保护碱基以保证酶 切完全。引物序列如下 ：
     F2.5’ AAAACTAGTCCTGCTCAAATGGGAAT 3’ (SpeI)
     R2 ： 5’ AAACTGCAGAACGAATGACGCTACTGC 3’ (PstI)
     PCR 扩 增 体 系 为， 每 20μL 中 含 有 ： 10×PCR 缓 冲 液 2.0μL， DNA1-10ng， dNTPs 2+ 100μmol/L， 引物 F25pmol， 引物 R2 5pmol， Taq DNA 聚合 1U， Mg 1.5mmol/L， ddH2O 加至终体 积 20μL。
     PCR 扩增程序同上述步骤 B1) ；
     2) 反向片段 PCR 产物与载体 pSK-int-F303 的酶切 ：
     ① PCR 产物 30μL 酶切体系 ： 10×H 缓冲液 3.0μL， 反向片段 PCR 产物 10.0μL( 约 2μg)， SpeI 5U， PstI 5U， ddH2O 加至终体积 30μL。
     ② 中 间 载 体 20μL 酶 切 体 系 ： 10×H 缓 冲 液 2.0μL， pSK-int-F303 中 间 载 体 5.0μL( 约 1μg)， SpeI 5U， PstI 5U， ddH2O 加至终体积 20μL。
     37℃温育 2h。
     ③酶切产物的回收、 纯化、 连接和转化等操作与正向片段的相同。
     10μL 连接体系为 ： pSK-int-F303 中间载体 2μL( 约 300ng)， 10×T4DNA 连接酶缓 冲液 1μL， T4DNA 连接酶 350U， 回收反向片段酶切产物 5μL( 约 800ng)， ddH2O 加至终反应 体积 10μL。
     16℃连接 12h。
     3) 反向片段阳性克隆的筛选 ：
     ①挑取培养平板上生长良好的单菌落， 在含有氨苄青霉素 (50μg/mL) 的 LB 液体 培养基中 37℃、 225r/min 振荡培养 12h。
     ②取培养后的菌液进行 PCR 扩增， 20μL 反应体系如下 ： 10×PCR 缓冲液 2.0μL， DNA1.0μL 菌液， dNTPs 100μmol/L， 引物 F2 5pmol， 引物 R2 5pmol， Taq DNA 聚合酶 1U， 2+ Mg 1.5mmol/L， ddH2O 加至终体积 20μL。
     PCR 扩增程序同上述步骤 B1) ；
     ③ PCR 呈阳性的克隆取 500μL 菌液送 Invitrogen 公司测序， 完全正确的即为含 反向重复目的片段的中间载体， 命名为 pSK-int-FR303。
     D. 构建含反向重复序列的表达载体 pJIM19-MRDV303
     1)XhoI 和 SpeI 双酶切含反向重复目的片段的中间载体 pSK-int-FR303
     30μL 酶 切 体 系 为 ： 10×K 缓 冲 液 1.5μL( 终 浓 度 0.5K)， pSK-int-FR303 15.0μL( 约 3μg)， XhoI 5U， SpeI 5U， ddH2O 加至终体积 30μL。37℃温育 30min。
     2)XhoI 和 SpeI 双酶切植物表达载体 pJIM19
     30μL 酶切体系如下 ： 10×K 缓冲液 3.0μL， pJIM19 10.0μL( 约 2μg)， XhoI 5U， SpeI 5U， ddH2O 加至终体积 30μL。
     37℃温育 2h。
     3) 酶切产物经 0.8％琼脂糖凝胶电泳后分别回收反向重复序列和植物表达载体 的大片段， 所有操作按说明书进行。T4DNA 连接酶连接。
     10μL 连 接 体 系 为 ： 10×T4DNA 连 接 酶 缓 冲 液 1μL， 正 反 向 重 复 序 列 5μL( 约 1μg)， 植物表达载体的大片段 2μL( 约 200ng)， T4DNA 连接酶 350U， ddH2O 加至终反应体积 10μL。16℃连接 10h。
     4) 阳性克隆的筛选
     ①挑取培养平板上生长良好的单菌落， 在含有卡那霉素 (50μg/mL) 的 LB 液体培 养基中 37℃、 225r/min 振荡培养 12h。
     ②取培养后的菌液进行 PCR 扩增， 20μL 反应体系为 ： 10×PCR 缓冲液 2.0μL， DNA1.0μL 菌 液， dNTPs 100μmol/L， 引 物 F2 5pmol， 引 物 R2 5pmol， Taq DNA 聚 合 1U， 2+ Mg 1.5mmol/L， ddH2O 加至终体积 20μL。
     PCR 扩增程序同上述步骤 B1) ；
     ③ PCR 呈阳性的克隆在 20ml 含有卡那霉素 (50μg/mL) 的 LB 液体培养基中扩大培 养， 提取质粒， 使用 TIANGEN 公司的质粒小提试剂盒， 所有操作按说明书进行。XhoI 和 SpeI 双酶切鉴定， 0.8％琼脂糖凝胶电泳检测含有目的片段大小的条带， 即为构建好的植物表达 载体， 命名为 pJIM19-MRDV303。
     (2). 农杆菌介导法转化优良玉米自交系的胚性愈伤组织及植株的再生
     1) 植物表达载体 pJIM19-MRDV303 转化农杆菌 ：
     ①农杆菌感受态细胞的制备
     取 -70℃保存的 EHA105 于含有 50μg/mL 利福霉素平板划线， 28℃培养 2 天。挑取 单菌落接种于 5mL YEP 液体培养基中， 225r/min， 28℃振荡培养 12 小时左右。将 5mL 菌液 转接于 100mL YEP 液体培养基中， 28℃， 225r/min， 振荡培养至 OD600 ＝ 0.5 ； 转入无菌 50mL 的离心管， 5000g 离心 5min， 去上清液。加入 1mL 预冷的 0.1mol/L 的 CaCl2 溶液， 轻轻悬浮 细胞， 冰上放置 20min， 4 ℃下， 5000g 离心 5min， 去上清。加入 200L 预冷的含 15 ％甘油的 0.1mol/L 的 CaCl2 溶液， 轻轻悬浮。混匀后立即冻存于 -70℃。
     ②表达载体 p JIM19-MRDV303 转化农杆菌
     取 0.5g 左右的 pJIM19-MRDV303 质粒 DNA 加入到 200L EHA105 感受态细胞中， 混 匀后， 冰浴 30min ； 液氮中速冻 1min ； 取出后 37℃水浴 5min ； 冰浴 2min ； 加入 800LYEP 液体 培养基， 28℃， 150r/min 振荡培养 4h ； 取 200L 菌液涂布在含 50μg/mL 卡那霉素和 50μg/ mL 利福霉素的 YEP 平板上， 28℃培养形成单菌落。
     ③阳性克隆的鉴定
     挑取转化的农杆菌单菌落接种于含 50g/mL 卡那霉素和 100μg/mL 利福霉素的 YEP 液体培养基中， 28℃， 225r/min 振荡培养 12h， 直接用菌液做 PCR。
     PCR 反应体系及扩增程序同上述步骤 (1)D4)。2) 农杆菌浸染 ：
     将含有目标载体 pJIM19-MRDV303 的农杆菌接种到含 50mg/L 利福霉素和 50mg/ L 卡那霉素的 YEP 培养基， 于 28 ℃培养 2 天。挑取单个菌落于含相应抗生素的 1mL YEP 培养基中， 28 ℃、 225r/min 振荡培养 12h， 再将其加入含相应抗生素的 50mL 培养基扩大培 养至 OD600 ＝ 0.5 ； 4 ℃、 4000r/min 离心 5min 收集菌体， 用等体积的液体浸染培养基 ( 含 100μmol/L 乙酰丁香酮即 AS) 悬浮。将 18-599 红、 18-599 白的愈伤组织分别浸入含 AS 的 浸染培养基， 浸侵染 5-10min。
     3) 共培养 ：
     浸染了农杆菌的愈伤组织置于灭菌纸上， 吸干多余水分后接种到共培养基。用保 鲜膜封好平板， 22℃暗培养 3d。
     4) 清洗及恢复培养 ：
     共培养 3 天后的愈伤组织用 5mL 含 250mg/L 噻孢霉素钠的灭菌蒸馏水清洗 3 次， 置 于灭菌滤纸上吸干多余水分后， 接种到恢复培养基上。用保鲜膜封好平板， 25℃暗培养 5d。
     5) 筛选转化子 ：
     恢复培养后的愈伤组织转接到含 1.5mg/L 除草剂草丁膦的选择培养基上。每两周 后将愈伤组织转接到新鲜的选择培养基上 ； 连续筛选 3 代， 草丁膦浓度按 1.5mg/L、 3mg/L、 5mg/L 递增 ； 每次转接都淘汰褐色的愈伤组织。
     6) 转基因植株的再生 ：
     选取抗性愈伤组织， 转接到分化培养基 (N6 盐和维生素 + 蔗糖 30g/L+ 琼脂 6g/L+ 水解酪蛋白 100mg/L+KT 1mg/L， pH 5.8) 上， 25℃光照培养 16 小时 /d ； 2-3 周后， 将分化出 的幼苗转接到生根壮苗培养基 (MS 盐和维生素 + 肌醇 100mg/L+ 生根粉 ABT 0.25g/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 6g/L， pH 5.8) 上， 25℃光照培养 16 小时 /d， 即得到 T0 转基因植株。
     经分子检测和田间接种鉴定， 确定将 MRDV 基因转入到玉米自交系 18-599 红、 18-599 白中。
     实施例 2 本实施例为转基因植株的分子检测
     A. 玉米基因组 DNA 提取
     取 T0 代转化植株幼嫩叶片， 用 CTAB 法提取总 DNA， 试剂及配方见表 1。
     表 1CTAB 提取液的配置 (500mL)
     将 5g 左右新鲜叶片放入研钵中， 加入液氮快速研磨成粉末状， 转入 5mL 离心管， 加 入 2mL 65℃预热的 CTAB 提取液充分混匀， 65℃保温 45 ～ 60min， 在此期间轻轻颠倒离心管 几次， 使植株组织与 CTAB 充分接触。加入等体积的氯仿 / 异戊醇 (24/1) 混合液轻轻摇动
     15min。10,000r/min 离心 10min。
     取上清液， 再用等体积的氯仿 / 异戊醇抽提一次， 10,000r/min 离心 10min。
     小心吸出上清液于另一支 5mL 离心管中， 加入 0.6 倍体积的异丙醇， 轻轻混匀， 置 于 -20℃冰箱中沉淀 DNA。
     挑出成团的 DNA， 用 70％乙醇洗 2-3 次， 无水乙醇洗 1-2 次， 烘干， 加 200L TE 溶解， 再加入 RNase 于 37℃保温 30min。0.8％琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 合格后， 保存于 -20℃备 用。
     B. 选择标记基因 Bar 和目的基因片段的 PCR 检测
     利用 primer premier5.0 软件设计一对筛选标记 Bar 基因和目的基因片段的特异 引物， 对 T0 代植株 DNA 进行 PCR 扩增。引物序列分别如下 ：
     Bar-s ： ATGAGCCCAGAACGACGC//Bar-x ： CTAAATCTCGGTGACGGGC
     f1 ： CCTGCTCAAATGGGAATA//r1 ： AACGAATGACGCTACTGC
     PCR 扩增体系 (20μL) ： DNA 1L， dNTP 1.6L， Mg2+2L， 10×buffer 2L， 正向引物和反 向引物各 0.3L， Taq 酶 0.3L， ddH2O 12.5L。PCR 程序 ： 94℃变性 5min， 58℃退火 30S， 72℃ 延伸 45S， 30 个循环， 最后 72℃再延伸 5min。1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果， 见图 9、 图 10， 并送博迈德公司测序。PCR 扩增和测序结果表明 ( 见图 11)， 外源目的基因片段已成功 导入玉米中。
     C.Southern 杂交检测结果
     T0 代阳性植株套袋自交结实， 并于云南南繁加代， 用上述 PCR 方法继续检测后代植 株的阳性情况。 PCR 阳性的株系进一步用 Southern 杂交检测外源基因是否整合到玉米基因 组上及其在玉米基因组中的拷贝数。
     以 MRDV 目的基因片断作为探针， 质粒 pJIM19-MRDV303 作为阳性对照， 用 Roche 公 司 DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II 试剂盒进行基因组 DNA Southern 杂交， 检测目的基因拷贝数， 步骤如下 ：
     A.SpeI 酶切基因组 DNA
     用限制性内切酶 SpeI 酶切转基因植株基因组 DNA， 酶切体系见表 2， 反应条件为 37℃， 过夜。
     表 2SpeI 酶切反应体系
     消化后的 DNA 加入 1/10 体积的 10×Loading 缓冲液， 以终止反应。取 5μL 电泳 检测消化效果。
     B. 酶切产物电泳及变性
     制备 0.8％的琼脂糖凝胶， 酶切产物全部点样电泳， 电压 ： 1-2V/cm， 电泳过夜。将
     电泳后的凝胶去除胶孔， 切成适当大小并切去左上角用做标记， 于变性液中轻微振荡变性 40min。
     将凝胶转移到中和液中， 振荡中和 30min。
     C. 毛细管法转膜及固定
     取一方盘， 在放盘内加入适量的 20×SSR 溶液， 在方盘上架一玻璃板， 在玻璃板上 铺上一张 Whatman 3mm 滤纸作为盐桥， 两端浸没在 20×SSR 溶液中， 滤纸与玻璃板之间无气 泡。
     将凝胶倒扣 ( 点样孔向下 ) 在 Whatman 3mm 滤纸上， 凝胶与滤纸之间无气泡。按 凝胶的大小剪裁尼龙膜并剪去一角作为标记， 水浸湿后， 浸入 20×SSR 溶液中浸泡 5min。 将 膜准确覆盖在凝胶上， 接触后不再移动。
     将两张与膜大小相同的 Whatman 3mm 滤纸置于 2×SSR 溶液中湿润， 覆盖在膜上， 去除气泡。滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸， 吸水纸上再置一玻璃板， 玻板上压 0.5 ～ 1Kg 的重物， 水平转膜过夜。
     取下尼龙膜， 置于 2×SSC 中漂洗 5min， 放于滤纸上凉干， 将膜放在浸有 10×SSR 的 厚滤纸上， DNA 面向上， 置于紫外交联仪中， 紫外光下自动交联。 D. 标记探针
     取阳性质粒 pJIM19-MRDV303 经 PCR 扩增， 得到目的基因序列产物。将 1μg 此产 物溶于 16μL ddH2O， 100℃水浴 10min， 迅速冰浴冷却， 加入 4μL DIG-High Prime 的探针 标记液 (vial1)， 37℃标记 20h， 加入 0.2mol/L EDTA(pH 8.0)2μL 终止标记。
     E. 预杂交
     42℃预热 10mL 的杂交液 DIG Easy Hyb Granules(bottle 7)， 将尼龙膜放入装有 预杂交液的杂交管中， 置于杂交炉中， 42℃预杂交 2h。
     F. 杂交
     将标记的探针 (25ng/mL DIG High Hyb) 于 100℃水浴变性 5min， 使其变性， 迅速置 2 于冰上冷却。加变性的标记探针于预热的杂交液中 (3.5mL/100cm 膜 )， 置于杂交炉， 42℃ 杂交过夜。
     G. 洗膜及显色
     取出尼龙膜， 按试剂盒说明书步骤及要求进行洗膜和显色。部分阳性植株的分子 杂交结果见图 12。
     由于 Spe I 在 RNAi 载体上是单一的酶切位点， 因此 Southern 杂交的条带数即为 外源基因的拷贝数。Southern 杂交结果表明， 外源目的基因片段均以低拷贝形式插入玉米 基因组。
     实施例 3 本实施例为阳性株系抗病性接种鉴定
     具体步骤为 ：
     A. 传毒介体昆虫灰飞虱的饲养
     沙土与蛭石按 1 ∶ 1 混合灭菌， 用于培养水稻幼苗。待幼苗长至 5cm 左右， 转入灰 飞虱若虫饲养， 视幼苗生长情况及时更换新鲜幼苗用于灰飞虱取食 ( 饲养条件 ： 温度 24℃， 相对湿度 60％， 光照 14 小时 )， 经过多代繁殖可获得大量灰飞虱。
     B. 带毒灰飞虱的获得
     因为我国玉米粗缩病病原主要是水稻黑条矮缩病病毒， 遗传转化玉米的外源基因 也是此病毒衣壳蛋白基因的保守序列。所以， 将饲养 1-2 龄的无毒灰飞虱转入水稻黑条矮 缩病病株上饲喂一周， 而后转入健康的水稻苗继续饲养 10 天， 待灰飞虱度过病毒循回期 后， 此灰飞虱即为带毒灰飞虱， 可用于转基因株系病毒接种的介体毒源。
     C. 转基因株系接种传毒介体
     将阳性转基因株系 (TW1、 TW2、 TW3、 TW4、 TW5、 TW6、 TW7、 TW8、 TW9) 与未转基因对照 “18 白” 及抗病自交系 “87-1” ( 是否是已知的？ ) 种植于温室内， 随机区组设计， 单行区， 每 行 14 株， 双株种植， 株行距 30cm×70cm， 两次重复。 三叶一心时， 接入带毒灰飞虱， 接虫量约 每株 5 头， 接种植株用纱网隔离， 同时设不接虫对照。温室温度约 25-30℃， 自然光照。
     D. 转基因株系发病情况调查
     接虫一周后， 用杀虫剂杀灭灰飞虱， 10 天后观察病情发展情况， 开花期调查病情指 数， 记录发病率。表 3 中发病率和病情指数为两次重复的平均值。不同平均数后的相同字 母表示 0.0.5 水平差异不显著， 不同字母表示 0.0.5 水平差异显著。R 抗病 ； MR 中抗 ； S感 病。
     表 3 转基因株系田间对 MRDV 抗性鉴定
     实施例 4 本实施例为荧光定量 PCR 检测接毒转基因株系及对照 MRDV CP 基因表达 (1) 引物设计 以转化 303bp MRDV 目的基因为模板， 18S rRNA 为内参基因设计引物， 引物序列见 表 4 定量 PCR 用引物28量
     表 4。
     101979562 A CN 101979567说明书21/26 页
     (2) 荧光定量 PCR 引物的特异性检测
     以感病对照 18 白 cDNA 样品 5 倍稀释后用作荧光定量 PCR(qRT-PCR) 反应的模板， 采用 50 ～ 65℃的退火温度梯度进行 qRT-PCR 反应来确定最佳的退火温度， 采用 25μL 反应 体系， 见表 5。
     表 5qRT-PCR 反应体系
     qRT-PCR 在 iQTM 5thermal cycler(Bio-Rad USA) 进行。反应程序为 ： 95℃预变 性 10s ； 然后按 95℃变性 10s， 50 ～ 65℃退火 20s， 72℃延伸 20s， 并在此温度收集荧光， 读 板 (Plateread) 的程序进行 40 个循环。之后从 50℃开始， 以每步 0.5℃的温度梯度升高至 95℃， 每步温度保持 5s， 绘制熔解曲线。
     (3)qRT-PCR 标准品的制备
     将含有目的基因和看家基因的克隆载体质粒 DNA 按如下梯度 ： 1×10-1、 1×10-2、 1×10-3、 1×10-4、 1×10-5、 1×10-6、 1×10-7、 1×10-8、 1×10-9 进行稀释制备定量标准品。用 1×10-2 ～ 1×10-8 梯度稀释的标准品来制作目的基因和内参基因的标准曲线。
     (4)qRT-PCR 反应
     将逆转录的 cDNA 样品 5 倍稀释后用作 qRT-PCR 扩增的模板， 采用 25μL 反应体系 ( 表 6)， 并设立以 ddH2O 为模板的阴性对照。单个逆转录的 cDNA 样品设三次重复。
     qRT-PCR 反应程序为 ： 95℃预变性 10s， 然后按 95℃变性 10s， 56℃退火 20s， 72℃ 延伸 20s， 并在此温度收集荧光， 读板 (Plate read) 的程序进行 40 个循环。之后最后从 50℃开始， 以每步 0.5℃的速度升高至 95℃， 每个温度保持 5s， 绘制熔解曲线。 TM
     数据分析采用 iQ 5thermal cycler(Bio-Rad USA) 自带的分析软件中的 ddCt 模 式。
     (5)MRDV 目的基因和 18S 内参基因标准曲线
     MRDV 目的基因定量 PCR 扩增效率为 91.5， R2 值为 0.999 ； 18S PCR 扩增效率为 2 95.8， R 值为 0.999， 表明标准曲线的制作满足定量 PCR 的要求 ( 可见图 13、 14、 15、 16)。
     (6) 接毒鉴定的转基因植株及对照 MRDV 目的基因表达量
     qRT-PCR 检测接毒鉴定的转基因植株及对照 MRDV 目的基因表达量的结果见图 17。
     结果表明， 感病对照即非转基因 18 白叶片中 MRDV 的基因表达量最高。在田间抗病性表现 最好的转基因株系 TW2 其叶片中 MRDV 的基因表达量最低。TW5、 TW7 叶片中 MRDV 的基因表 达量均低于抗病对照自交系 87-1。 说明转基因株系能够通过 RNA 干扰的作用抵抗病毒的入 侵， 从而减轻粗缩病病毒对玉米的危害。荧光定量 PCR 检测结果与田间抗病性鉴定的结果 一致。
     序列表
     <110> 四川农业大学
     <120> 一种利用 RNA 干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法
     <150>CN2009102164170
     <151>2009-11-27
     <160>23
     <210>1
     <211>303
     <212>DNA
     <213> 抗玉米粗缩病的 MRDV-303 基因的核苷酸序列
     <400>1
     cctgctcaaa tgggaatact tactgatgaa gttagactgt taatgcgaac tggtaaatta 60
     agaattgacg gtggttatga tttcaattgt cccgcaagta ctacagacgt tactcactac 120
     ggtggatatg atcaattttc acgtcaaatg tttgaacgtt tgaatctctt ttacaatatt 180
     agtcttagca taatacccgt ttcagcttta aaaaccgttc atctatttga aaaggaatta 240
     agtgttttgg atgcagacaa atctttgctt gaacaaactt ggagcgcagt agcgtcattc 300
     gtt 303
     <210>2
     <211>57
     <212>DNA
     <213> 抗玉米粗缩病的 MRDV-303 基因中间片段 FO 的核苷酸序列
     <400>2
     tggatatgatcaattttcac gtcaaatgtttgaacgtttgaatctcttttacaatat 57
     <210>3
     <211>53
     <212>DNA
     <213> 抗玉米粗缩病的 MRDV-303 基因扩增引物 f1 的核苷酸序列
     <400>3
     tcccgcaagtactacagacg ttactcacta cggtggatatgatcaattttcac 53
     <210>4
     <211>50
     <212>DNA
     <213> 抗玉米粗缩病的 MRDV-303 基因扩增引物 r1 的核苷酸序列
     <400>4gctgaaacgg gtattatgctaagactaata ttgtaaaaga gattcaaacg <210>5 <211>51 <212>DNA <213> 抗玉米粗缩病的 MRDV-303 基因扩增引物 f2 的核苷酸序列 <400>5 ttaagaattg acggtggtta tgatttcaattgtcccgcaa gtactacaga c <210>6 <211>58 <212>DNA <213> 抗玉米粗缩病的 MRDV-303 基因扩增引物 r2 的核苷酸序列 <400>6 aacacttaattccttttcaa atagatgaac ggttttaaa gctgaaacgg gtattatg <210>7 <211>46 <212>DNA <213> 抗玉米粗缩病的 MRDV-303 基因扩增引物 f3 的核苷酸序列 <400>7 gttagactgt taatgcgaac tggtaaatta agaattgacg gtggtt <210>8 <211>50 <212>DNA <213> 抗玉米粗缩病的 MRDV-303 基因扩增引物 r3 的核苷酸序列 <400>8 ttgttcaagc aaagatttgtctgcatccaa aacacttaattccttttcaa <210>9 <211>51 <212>DNA <213> 抗玉米粗缩病的 MRDV-303 基因扩增引物 f4 的核苷酸序列 <400>9 cctgctcaaa tgggaatacttactgatgaa gttagactgttaatgcgaact <210>10 <211>47 <212>DNA <213> 抗玉米粗缩病的 MRDV-303 基因扩增引物 r4 的核苷酸序列 <400>10 aacgaatgac gctactgcgc tccaagttg ttcaagcaaa gatttgt <210>11 <211>1831505158465051<212>DNA <213> 抗玉米粗缩病的 MRDV-303 基因扩增引物 f5 的核苷酸序列 <400>11 cctgctcaaa tgggaata <210>12 <211>18 <212>DNA <213> 抗玉米粗缩病的 MRDV-303 基因扩增引物 r5 的核苷酸序列 <400>12 aacgaatgacgctactgc <210>13 <211>26 <212>DNA <213> 抗玉米粗缩病的 MRDV-303 基因正向片段扩增引物 F1 的核苷酸序列 <400>13 atcctcgagc ctgctcaaatgggaat <210>14 <211>27 <212>DNA <213> 抗玉米粗缩病的 MRDV-303 基因正向片段扩增引物 R1 的核苷酸序列 <400>14 ctcaagctta acgaatgacg ctactgc <210>15 <211>26 <212>DNA <213> 抗玉米粗缩病的 MRDV-303 基因反向片段扩增引物 F2 的核苷酸序列 <400>15 aaaactagtc ctgctcaaatgggaat <210>16 <211>27 <212>DNA <213> 抗玉米粗缩病的 MRDV-303 基因反向片段扩增引物 R2 的核苷酸序列 <400>16 aaactgcaga acgaatgacg ctactgc <210>17 <211>18 <212>DNA <213> 转基因植株筛选标记 Bar 基因扩增引物 Bar-s 的核苷酸序列 <400>17321818262726atgagcccag aacgacgc <210>18 <211>19 <212>DNA <213> 转基因植株筛选标记 Bar 基因扩增引物 Bar-x 的核苷酸序列 <400>18 ctaaatctcg gtgacgggc <210>19 <211>22 <212>DNA <213> 荧光定量 PCR 检测 MRDV 目的基因扩增上游引物的核苷酸序列 <400>19 ttaattgtcc tgcaagcactac <210>20 <211>19 <212>DNA <213> 荧光定量 PCR 检测 MRDV 目的基因扩增下游引物的核苷酸序列 <400>20 ctgcgctcca agtttgttc <210>21 <211>19 <212>DNA <213> 荧光定量 PCR 18S 内参基因扩增上游引物的核苷酸序列 <400>21 ctgagaaacg gctaccaca <210>22 <211>19 <212>DNA <213> 荧光定量 PCR 18S 内参基因扩增下游引物的核苷酸序列 <400>22 cccaaggtcc aactacgag <210> <211>303 <212>DNA <213>PCR 检测转基因植株中 MRDV 目的基因的核苷酸序列测序结果 <400>23181922191919cctgctcaaa tgggaatact tactgatgaa gttagactgt taatgcgaac tggtaaatta 60 agaattgacg gtggttatga tttcaattgtc ccgcaagta ctacagacgt tactcactac 120 ggtggatatg atcaattttc acgtcaaatg tttgaacgtt tgaatctctt ttacaatatt 180agtcttagca taatacccgt ttcagcttta aaaaccgttc atctatttga aaaggaatta 240 agtgttttgg atgcagacaa atctttgctt gaacaaactt ggagcgcagt agcgtcattc 300 gtt 303