依达拉奉注射液及其制备工艺 【技术领域】
本发明属于药物制剂技术领域， 具体涉及一种稳定的依达拉奉注射液制剂及制备工艺。 背景技术 依达拉奉注射液 (Edaravone Injection) 是由日本三菱东京制药株式会社研制用 于治疗急性脑梗塞病人的脑神经保护剂。南京先声东元制药有限公司于 2003 年 12 月在我 国首先研发上市， 商品名为必存 该药用于治疗缺血性脑血管疾病的新型自由基清除剂和 神经保护药物， 在治疗心脑血管疾病尤其是急性缺血性中风方面具有明确的临床疗效。
依达拉奉是强效自由基清除剂， 在脑缺血、 缺氧后可抑制再灌注引起的大量自由 基和脂质过氧化物的产生， 从而保护脑组织， 减轻脑神经症状， 促进神经功能的恢复。
依达拉奉是一种新发展的羟基自由基清除作用的抗氧剂， 表现出了对由羟基自由 基和离子产生的脂质过氧化物的显著抗氧化作用。其化学名称为 ： 3- 甲基 -1 苯基 -2- 吡 唑啉 -5- 酮 (3-Methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one)， 其结构式为 ：
分子式 ： C10H10N2O 分子量 ： 174.20
由于依达拉奉主环是五元环的酮， 羰基与 N 相邻， 2 号位的 N 连着不饱和键， 很容易 氧化， 因此这个分子结构很不稳定， 遇到氧就会氧化成没有活性的物质， 且易产生高分子杂 质， 对人体造成伤害。此外， 因为结构中没有羟基、 羧基等亲水基团， ， 而甲基与苯基难溶于 水， 长时间的溶解过程会加剧其氧化造成不稳定性。目前国内外对依达拉奉注射液的抗氧 化方面的研究不是很多， 有研究采用亚硫酸氢钠作抗氧剂的， 但通过我们的试验发现仅用 亚硫酸氢钠较难解决本品的易氧化、 不稳定的难题， 制备的样品有效期仅为 1.5 年。
发明内容
本发明的目的是为了解决依达拉奉在水溶液中稳定性差、 容易氧化的问题， 通过 在溶液中增加适当的抗氧剂和助溶剂， 调节 pH， 并排除药液及环境中的游离氧， 从而提供一 种依达拉奉注射液制剂， 该制剂保证了药品在生产过程及储存期间的稳定性。
本发明的另一目的是提供一种上述依达拉奉注射液的制备方法。
本发明的目的可以通过以下措施达到 ：
一种依达拉奉注射液， 该注射液含有活性成分依达拉奉和抗氧剂竹叶黄酮。
本发明所述的依达拉奉注射液的辅料中的抗氧剂为竹叶黄酮。 竹叶黄酮是一种新 型抗氧剂， 易溶于水和低浓度醇， 有高度的水、 热稳定性， 分子量小， 能被迅速吸收， 具有优良的抗活性自由基能力、 确凿的 SOD 活性和显著的抗氧化能力， 同时竹叶黄酮能阻断亚硝 胺的合成， 能抗应激、 抗疲劳， 降血脂、 防治心脑血管疾病， 对增强免疫力、 抗肿瘤、 抗菌、 抗 病毒均有良好的效果， 和依达拉奉亦能起到协同作用。临床实验还表明， 竹叶黄酮安全有 效、 适用于多种类型血脂异常代谢， 对动脉粥样硬化、 心脑血管疾病的防治具有较好的临床 应用前景。竹叶黄酮按 LD50 的分级标准为实际无毒， 可以参与人体代谢， 无体内蓄积， 安全 性好。竹叶黄酮在日本科技界被认为其结构与人体的血红蛋白相似， 可以制成针剂直接注 入静脉。抗氧剂竹叶黄酮在注射液中的含量优选为 0.1 ～ 10mg/ml， 进一步优选为 0.5 ～ 5mg/ml， 最优选为 0.5 ～ 2mg/ml。
注射液中还可含有助溶剂， 可以使用 1 种或 1 种以上选自羟丙基倍他环糊精、 乙 醇、 丙二醇、 甘油、 聚乙二醇、 聚维酮的助溶剂， 助溶剂在注射液中的含量优选为 1 ～ 200mg/ ml， 进一步优选为 1 ～ 80mg/ml。选用以上助溶剂溶解依达拉奉制成注射液， 经过血管刺激 性实验以及样品检验、 稳定性实验， 优选羟丙基倍他环糊精和 / 或丙二醇。羟丙基倍他环糊 精是一种新型助溶剂， 是一类倍他环糊精的羟烷基化衍生物， 极易溶于水， 是目前研究最充 分的新型辅料， 被广泛用于难溶性药物的增溶和提高药物的稳定性， 并且刺激性小、 溶血活 性低、 毒副作用小、 安全性高。 该注射液的 pH 为 2.0 ～ 5.0。本发明所述的酸碱调节 pH 至依达拉奉水溶液最稳 定的酸度， 可用 0.1mol/L 盐酸和 / 或氢氧化钠溶液进行调节 pH， 经实验结果表明， 样品的 pH 稳定在至 2.0 ～ 5.0 时， 有利于依达拉奉在水中的稳定性。
本发明的注射液采用充氮灌封， 封装后的注射液中含氧量低于 3％。在药液灌封 前后向安瓿瓶中填充高纯氮气， 使药瓶中含氧量低于 3％， 从而更好的防止依达拉奉在水溶 液中氧化分解。分别制备不同含氧量的样品， 经过低温加速试验， 说明充氮使含氧量低于 4.5％后有助于提高依达拉奉注射液的稳定性， 且尤以充氮后含氧量低于 3％有助于提高依 达拉奉注射液的稳定性， 故优选充氮至含氧量低于 3％。
注射液中依达拉奉的含量可以根据具体制剂的需求以及国家规定进行调整， 其含 量一般为 0.4 ～ 10mg/ml。
本发明依达拉奉注射液的一种制备工艺 ： 取依达拉奉和辅料溶于注射用水中， 搅 拌至完全溶解后加入针用活性炭， 除炭后用盐酸或氢氧化钠溶液调节 pH， 充氮灌封于安瓿 中， 最后在 110 ～ 120℃下热压灭菌。 其中所述的辅料包括但不一定仅限于上述抗氧剂和助 溶剂。另一种具体的方法为 ： 取依达拉奉和助溶剂、 抗氧剂溶于注射用水中， 搅拌至完全溶 解后加入针用活性炭， 除炭后用 0.1mol/L 盐酸和 / 或氢氧化钠溶液调节 pH， 充氮灌封于安 瓿中， 115℃热压灭菌 30 分钟， 即得。
选用不同抗氧剂如 ： 竹叶黄酮、 亚硫酸氢钠、 维生素 C 和盐酸半胱氨酸分别制备样 品， 进行对比实验 ： 对样品的性状、 pH、 含量、 有关物质以及澄明度合格率进行检验， 同时经 高温 (60℃ ) 条件下放置 10 天、 40℃加速条件下放置 6 个月以及 25℃长期条件下放置 36 个 月， 检验性状、 pH、 可见异物、 含量、 有关物质、 无菌、 热原等， 进行稳定性考察以确定有效期。
表 1 不同抗氧剂制备样品
表 2R1、 R2、 R4 样品的长期稳定性考察数据结论 ： 使用亚硫酸氢钠 (R2)、 维生素 C(R3) 为抗氧剂的样品分别在 24 个月、 18 月 时有关物质超标， 不符合规定， 有效期分别为 1.5 年、 1 年。使用竹叶黄酮 (R1)、 盐酸半胱氨 酸 (R4) 为抗氧剂的样品有效期均为 3 年， 而 R1 的有关物质量也小于 R4 的有关物质量， 且 在长期试验中有关物质增加的很少， 体现出更好的质量 ； 同时在中国不提倡使用生物制品 的盐酸半胱氨酸用作注射液的辅料， 故本发明使用竹叶黄酮作为抗氧剂对提高依达拉奉注 射液的质量和稳定性有很大优势。
使用竹叶黄酮为抗氧剂的样品 R1 通过血管刺激性试验、 过敏试验和溶血试验， 也 充分说明本发明制备的依达拉奉注射液的安全性和稳定性。
(1) 血管刺激性试验
试验选用健康新西兰白兔 3 只， 兔自右耳耳缘静脉注射 R1， 左耳耳缘静脉注射等 量生理盐水作对照。每天 1 次， 连续 3 天， 每天观察静脉注射部位的血管及周围组织有无红 斑、 水肿等现象。末次给药 24 小时后， 从耳静脉处向近心端取血管 4cm 进行病理学检查， 观 察血管及周围组织有无充血、 水肿、 变形、 坏死等刺激性反应。
试验结果为 ： 兔右耳给 R1 后， 注射部位肉眼观察末发现明显的充血、 水肿及坏死 等异常现象， 左侧对照注射部位也末见明显刺激性。从耳静脉注射处向近心端取血管 4cm
进行病理学检查， 光镜检查发现 ： 给 R1 和生理盐水末发现明显炎细胞浸润、 坏死、 血管内凝 血、 血管周围渗出及坏死等刺激性反应。
表 3 依达拉奉注射液静脉注射后血管刺激性试验的肉眼观察
注： 左耳为阴性对照品组， 右耳为试制药品组 ； “-” 表示无明显变化。
结论 ： 给兔每天耳缘静脉注射 R1 连续 3 天， 兔耳注射部位血管及周围组织无明显 的刺激性反应。
(2) 过敏试验
试验选用健康豚鼠 18 只， 随机分为三组， 每组 6 只， 雌雄各半， 3 组分别为阴性对 照组 ( 生理盐水组 )、 阳性对照组 ( 鸡蛋清组 )、 试制药品组 (R1 组 )， 隔日分别肌肉注射生 理盐水、 鸡蛋清和 R1， 连续 3 次。在首次注射后的第 14 天和 21 天， 每组各取 3 只分别腹腔 注射生理盐水、 鸡蛋清和 R1 进行攻击， 观察注射后动物有无抓鼻、 坚毛、 呼吸困难、 痉挛、 休 克甚至死亡等过敏反应。按表 4 中的评判标准判定其反应级数， 凡反应级数达到 2 级以上 ( 包括 2 级 ) 时， 可认为该受试药过敏试验不合格。如受试药物动物有过敏反应， 应取健康 未致敏豚鼠 2 只， 静脉注射受试药 2ml， 观察有无药物作用引起的类似过敏反应症状， 以供 结果判断。
表 4 豚鼠过敏反应级数
反应级数 0 1 2 3 4
反应症状 无明显反应 只有轻微抓鼻、 颤抖或竖毛 有几声咳嗽， 有抓鼻、 颤抖或竖毛 多次或连续咳嗽， 伴有呼吸困难或痉挛、 抽搐 痉挛、 抽搐、 大小便失禁， 休克死亡试验结果为 ： 鸡蛋清组在第 14 天和 21 天的攻击中， 均出现明显痉挛、 抽搐、 大小便 失禁等过敏症状， 动物一般在攻击后 30min 内休克死亡， R1 组和生理盐水组均未出现明显 的过敏反应。表 5R1 的全身过敏性试验结论 ： 注射给予 R1 后， 豚鼠未见有全身过敏反应。
(3) 体外溶血试验
试验用兔心脏取血 20ml， 置三角瓶中， 用玻璃棒搅拌去除纤维蛋白， 然后将血移入 刻度离心管中， 加入生理盐水混匀后离心 (2500r/min)5 分钟， 去除上清液， 再加生理盐水 混匀后离心， 反复洗涤 3 ～ 4 次， 至上清液呈无色透明方可用于试验。 将所得红细胞按容积， 用生理盐水稀释成 2％的混悬液。取干净试管 7 支， 按表 6 加入各种溶液， 第 6 管不加供试 品溶液， 作为空白对照管 ； 第 7 管仍不加供试品溶液， 并用蒸馏水代替生理盐水， 作为溶血 的阳性对照。将各管轻轻摇匀， 在 37℃恒温箱中保温。开始每 15min 观察一次， 1h 后每小 时观察一次， 连续观察 4h。
结果判断标准 ： 全溶血 ： 溶液澄明， 红色， 管底无红细胞残存。
部分溶血 ： 溶液澄明， 红色或棕色， 底部有少量红细胞残存。
不溶血 ： 红细胞全部沉， 上层液体无色澄明。
凝聚 ： 虽不溶血， 但出现红细胞凝集， 振荡后不能分散。
试验结果为 ： 加入不同体积 R1 的各管和第 6 管空白对照管均未出现溶血现象， 第 7 管阳性对照管出现明显的溶血现象。
表 6 R1 的体外溶血试验
试管号 R1 生理盐水 (ml) 2％红细胞混悬液 (ml) 结果
1 0.1 2.4 2.5 -2 0.2 2.3 2.5 -3 0.3 2.2 2.5 -4 0.4 2.1 2.5 -5 0.5 2.0 2.5 -6 2.5 2.5 -7 2.5( 蒸馏水 ) 2.5 +注： 表中 “+” 表示溶血和 / 或凝聚反应 ； “-” 表示无溶血和凝聚反应。
结论 ： R1 无溶血和凝聚现象。
本发明提高了依达拉奉注射液的稳定性， 延长其有效期， 确保依达拉奉注射液在 临床上使用的安全有效。本发明的特点在于采用新型抗氧剂竹叶黄酮， 并通过加入适宜的 助溶剂促进依达拉奉溶解， 用酸碱调节 pH 至依达拉奉水溶液最稳定的酸度， 并在药液灌封 时向安瓿瓶中填充高纯氮气， 从而保证依达拉奉始终处于一个低氧的环境中。竹叶黄酮除了作为抗氧剂外， 亦能抗应激、 抗疲劳， 降血脂、 防治心脑血管疾病， 对增强免疫力、 抗肿瘤、 抗菌、 抗病毒均有良好的效果， 和依达拉奉能起到协同作用。 使用竹叶黄酮为抗氧剂的依达 拉奉注射液的血管刺激性试验、 过敏试验和溶血试验， 也充分说明本发明制备的依达拉奉 注射液的安全性和稳定性。 具体实施方式
下面采用一些具体实施例进一步描述了本发明， 但本发明的范围并不仅限于以下 实施例。
实施例 1 ：
配方 ( 规格 ： 5ml:10mg)
原辅料 依达拉奉 羟丙基倍他环糊精 竹叶黄酮 注射用水加至 灌封充氮
用量 10g 40g 5g 5000ml 残存氧 1.8％作用 主药 助溶剂 抗氧剂 溶剂 防止氧化规格 药用 药用 药用 注射用 高纯氮取配方量的依达拉奉、 羟丙基倍他环糊精、 竹叶黄酮加入注射用水中， 搅拌至完全 溶解， 加入针用活性炭， 除炭后用 0.1mol/L 盐酸和 / 或氢氧化钠溶液调节 pH， 充氮灌封于安 瓿中， 115℃热压灭菌 30 分钟， 即得。
样品 3 年后检验， 形状、 pH、 可见异物、 有效成分含量以及有关物质等各项检查均 符合标准， 说明有效期可以达到 3 年。
实施例 2 ：
配方 ( 规格 ： 5ml:10mg)
原辅料 依达拉奉 丙二醇 竹叶黄酮用量 10g 400g 4g作用 主药 助溶剂 抗氧剂规格 药用 药用 药用9CN 101934037 A说5000ml明书溶剂 防止氧化 注射用 高纯氮8/9 页注射用水加至 灌封充氮
残存氧 1.6％取配方量的依达拉奉溶于丙二醇中， 搅拌至完全溶解后， 加入维生素 C 的水溶液 搅拌， 加入针用活性炭， 除炭后用 0.1mol/L 盐酸和 / 或氢氧化钠溶液调节 pH， 充氮灌封于安 瓿中， 115℃热压灭菌 30 分钟， 即得。
样品 3 年后检验， 形状、 pH、 可见异物、 有效成分含量以及有关物质等各项检查均 符合标准， 说明有效期可以达到 3 年。
实施例 3 ：
配方 ( 规格 ： 20ml:30mg)
原辅料 依达拉奉 羟丙基倍他环糊精 竹叶黄酮 注射用水加至 灌封充氮
用量 30g 160g 24g 20000ml 残存氧 1.5％作用 主药 助溶剂 抗氧剂 溶剂 防止氧化规格 药用 药用 药用 注射用 高纯氮取配方量的依达拉奉、 羟丙基倍他环糊精、 竹叶黄酮加入注射用水中， 搅拌至完全 溶解， 加入针用活性炭， 除炭后用 0.1mol/L 盐酸和 / 或氢氧化钠溶液调节 pH， 充氮灌封于安 瓿中， 115℃热压灭菌 30 分钟， 即得。
样品 3 年后检验， 形状、 pH、 可见异物、 有效成分含量以及有关物质等各项检查均 符合标准， 说明有效期可以达到 3 年。
实施例 4 ：
配方 ( 规格 ： 20ml:30mg)
原辅料 依达拉奉 丙二醇 竹叶黄酮 注射用水加至用量 30g 1200g 20g 20000ml10作用 主药 助溶剂 抗氧剂 溶剂规格 药用 药用 药用 注射用CN 101934037 A说明书防止氧化 高纯氮9/9 页灌封充氮
残存氧 2.5％取配方量的依达拉奉溶于丙二醇中， 搅拌至完全溶解后， 加入维生素 C 的水溶液 搅拌， 加入针用活性炭， 除炭后用 0.1mol/L 盐酸和 / 或氢氧化钠溶液调节 pH， 充氮灌封于安 瓿中， 115℃热压灭菌 30 分钟， 即得。
样品 3 年后检验， 形状、 pH、 可见异物、 有效成分含量以及有关物质等各项检查均 符合标准， 说明有效期可以达到 3 年。11