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一种靶向丙型肝炎病毒 F 基因的结构及其应用
    技术领域 本 发 明 涉 及 生 物 医 药 领 域， 具 体 涉 及 一 种 靶 向 丙 型 肝 炎 病 毒 (hepatitis C virus， HCV)F 基因的广谱的小分子干扰 RNA， 更具体的涉及具有抑制 1b 亚型 HCV F 基因表 达的小分子干扰核糖核酸及其应用。
     背景技术 丙型肝炎病毒 (hepatitis C virus， HCV) 是丙型肝炎的病原体。在欧美发达国 家， HCV 感染是肝硬化和原发性肝癌的首要原因， 非洲等欠发达国家的 HCV 感染率高达 10％ 以上， 我国 HCV 感染率近 3％， 其中约 75％发展为 HCV 慢性肝炎， 约 20％最终发展为肝硬化、 肝癌等终末期肝病 ( 中华肝脏病杂志， 2004， 12 ： 194-198)。国家卫生部 2009 年 1 月公布的 全国法定报告传染病疫情显示， HCV 感染发病数与死亡数均居前 5 位。
     HCV 基因型分为 6 个基因型与不同的亚型， 日本国立传染性疾病研究院通过对亚 洲多个国家 HCV 感染患者进行基因组分析发现， 基因型为 1b 的患者较其他患者更易发生较 为严重的肝脏疾病如肝细胞癌 (hepatocellular carcinoma， HCC)， 并且对干扰素的治疗不 敏感 (Pediatr Int， 2004， 46(2) ： 223-230)。我国大部分地区主要流行的 HCV 型为基因型 1b， 在南方城市基因型 1b 感染率达 90％以上， 且基因型 1b 在慢性肝炎、 肝硬化和肝癌中占 80％以上。
     HCV 属黄病毒属， 全长约 9.6kb， 为一单股正链 RNA， 分为 5’ 非翻译区 (UTR)、 一个 开放阅读框 (ORF) 和 3’ 非翻译区， 编码一个由 3000 多个氨基酸组成的复合蛋白前体， 在宿 主信号肽酶和病毒蛋白酶的作用下裂解产生至少 10 种基因产物 ： 四种结构蛋白 (Core、 E1、 E2、 p7) 和六种非结构蛋白 (NS2、 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A、 NS5B)。
     研究表明， HCV Core 蛋白 (C 蛋白 ) 与肝炎慢性化感染及肝癌的发生发展有 关。近年来， 研究者在感染 HCV 的患者血清中发现了一种新的蛋白， 现称为 F 蛋白， 它是 HCV C 基因编码的另一个产物， 由 C 基因密码子核苷酸移位而产生 (EMBO J， 2001， 20(14) ： 3840-3848)。已有的研究表明， HCV 自然感染过程中可同时产生 C 与 F 蛋白， 且 F 蛋白的变 异高于 C 蛋白 (Hepatology， 2007， 46(6) ： 1704-1712)。在 HCV 所致 HCC 患者体内， F 蛋白的 数量、 抗体阳性率以及基因序列的突变率均显著升高， 提示 F 蛋白可能与肝癌的发生发展 有关。
     用 35S 标记技术研究了 F 蛋白在无细胞翻译体系以及 Huh7 细胞内的半衰期， 发 现 F 蛋白是一个短寿命蛋白， 半衰期小于 10 分钟 (J Gen Virol， 2003， 84(7) ： 1751-1759)。 短寿命意味着 F 蛋白很可能是一种调节性蛋白。C 蛋白、 NS5A 蛋白等 7 种 HCV 蛋白质以 复合体形式分布在内质网上， 该复合体是 HCV 病毒复制的场所 (Hepatology， 2003， 38 ： 468A-469A)。现已证实 F 蛋白分布在内质网上， 推测 F 蛋白也许是内质网上 HCV 蛋白复合 体的成员之一， 可能参与调节 HCV RNA 的复制以及病毒颗粒的形成 (J Virol， 2003， 77(2) ： 1578-1583)。
     F 蛋白既有很高的保守性又有很大的变异性。 不同基因型 HCV 均能编码 F 蛋白， 相
     同基因型 HCV 产生的 F 蛋白高度保守。对 102 株 HCV 1b 基因型的 F 蛋白、 C 蛋白、 NS2 蛋 白进行分析， 发现 F 蛋白的 125 个 aa 中有 116 个 aa 相同， 保守性为 85％， C 蛋白保守性为 97％ (185/191)， NS2 蛋白保守性为 78％ (167/214)(RNA， 2002， 8(5) ： 557-571)。F 蛋白的 高保守性意味着其可能肩负有重要功能。有研究结果显示， 不同基因型 HCV 所编码的 F 蛋 白在一级结构上存在很大变异性， 型间的同源性较低。 F 蛋白的这些特性提示其在 HCV 病毒 的生命周期中可能具有重要作用， 同时又对于 HCV 病毒的变异逃逸以及对抗干扰素疗效发 生影响。
     F 基因与 C 基因重叠， 这使得 F 基因对 HCV 其它基因的表达有着重要的顺式 (cis) 调节作用。另外， F 基因指导合成的 F 蛋白可以反式 (trans) 调节 HCV 其他基因的表达。F 蛋白的合成受到 HCV RNA 内部二级结构的调节， 这些部位可能是抗病毒药物的新靶点。在 抗病毒药物或宿主免疫应答压力作用下， 这些调节性 RNA 元件可能发生突变， 当突变积累 到一定程度时就可能改变 C 蛋白与野生型 F 蛋白之间的比例， 或者是出现突变型 F 蛋白， 受 其调节的 HCV 基因的表达也将发生改变 (Annals of Surgical Oncology， 2004， 11 ： S50 ； J Virol， 2008， 82(23) ： 11503-11515)。当肝细胞损伤或衰老时， 带有突变型 F 基因的 HCV 可 以维持肝细胞存活， 从而支持 HCV 复制， 野生型 F 基因没有这种功能。这样看来， F 基因也 许具有原癌基因的某些功能 (Proc Natl Acad Sci USA， 2002， 99(5) ： 2830-2835)。 F 与 C 蛋白均能够引起细胞内 NF-κB 的持续激活， 从而增强细胞抵抗 TNF-α 诱 导 凋 亡 的 能 力 (Hepatol Res， 2009， 39(3) ： 282-289 ； J Biol Chem， 2001， 276(19) ： 16399-16405)。 阻断细胞凋亡有利于 HCV 在细胞内建立持久感染， 是 HCV 慢性化并导致肝癌 发生的机制之一。 F 与 C 蛋白可激活原癌基因 c-myc， 使其基因产物表达异常增加 (J Biomed Sci， 2008， 15(4) ： 417-425 ； Int J Cancer， 2008， 122(1) ： 124-131)。 F 蛋白还能够抵制抑癌 基因 p21 转录与 DNA 的合成， 扰乱细胞周期， 进而参与致癌过程 (Hepatol Res， 2008， 38(1) ： 1-26)。
     现在 HCV F 蛋白多用于体外诊断、 检测生物学样本， 其中主要是通过设计一系列 的多肽或多肽表位， 进行酶联免疫吸附实验 (ELISA) 或微阵列实验检测生物学样本。近年 来， RNA 干扰 (RNAi) 的研究成为热点， 被 《Science》 评选为 2002 年度最重要科技突破的首 位。RNAi 是细胞本身固有的对抗外源基因及其侵害的一种自我保护现象， 是双链 RNA 分子 在 mRNA 水平关闭相应序列及基因的表达使其沉默的过程。RNAi 技术的应用领域已经从基 因组学研究逐步扩展到医学领域并作为基因治疗手段。利用 RNAi 提供一种经济、 快捷、 高 效的抑制基因表达的技术手段， 在包括医药学在内的诸多领域的应用有非常广阔的前景。
     在病毒性疾病治疗方面， 在利用 RNAi 技术对 HIV-1、 乙型肝炎、 丙型肝炎等进行基 因治疗研究中发现， 选择病毒基因组中与人类基因组无同源性的序列作为抑制序列可在抑 制病毒复制的同时避免对正常组织的毒副作用。siRNA 在感染的早期阶段能有效地抑制 病毒的复制， 病毒感染能被针对病毒基因和相关宿主基因的 siRNA 所阻断， 这些结果提示 RNAi 能胜任许多病毒的基因治疗， RNAi 将成为一种有效的抗病毒治疗手段。
     在肿瘤治疗方面， 肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结果， 传统技术诱 发的单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长， 而 RNAi 可以利用同一基因家 族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性， 设计针对这一区段序列的 siRNA 分子， 只注射一种 siRNA 即可以产生多个基因同时剔除的表现， 也可以同时注射多种 siRNA
     而将多个序列不相关的基因同时剔除 ( 动物医学进展， 2004， 25(2) ： 18-20)。 发明内容 本发明以 RNA 干扰技术为基础， 设计靶向 HCV F 基因的 F-siRNA 药物， 阐明了 F-siRNA 表达载体及化学合成 F-siRNA 对稳定表达 F 蛋白的 NIH3T3-F 细胞的生长抑制作用 和细胞转化抑制作用， 及其对体内移植肿瘤的生长抑制作用， 为 F-siRNA 在 1b 亚型 HCV 治 疗中的应用提供了一定的理论依据。
     本发明设计并制备了一种双链小分子干扰 RNA(F-siRNA)， 由下述核苷酸序列的正 义链和反义链组成 ：
     正义链 5′ -CCUCGUGGAAGGCGACAACX-3′
     反义链 5′ -XGUUGUCGCCUUCCACGAGG-3′
     其中 X 代表 TT 或 UU。T 代表脱氧胸腺嘧啶 dT。
     上述正义 RNA 片段和反义 RNA 片段与已知人类基因和基因表达片段无显著的同一 性。
     本发明的 F-siRNA 可以用化学合成法直接合成或者用质粒载体在细胞或体内表 达的方法获得。
     本发明的双链小分子干扰 RNA 是一种高效针对 HCV 1b 型 F 基因的广谱的 F-siRNA 抗肿瘤药物。
     下面结合实施例对本发明的双链小分子干扰 RNA 的药理活性作进一步的研究。
     附图说明 图 1. 带有 H1 启动子和 U6 启动子 pRNAi-U6H1/Neo 的质粒图谱。
     图 2.F-siRNA 特异性鉴定。纵坐标表示以转录活性为对照的 β- 半乳糖苷酶活 性为标准化的萤火虫萤光素酶活性。( 其中 ： 1- 转染 F-siRNA 表达载体的 NIH3T3-F 细胞， 2- 转染 F-siRNA 表达载体的 NIH3T3-C 细胞， 空白 - 未转染任何 siRNA 的 NIH3T3-F 细胞， 阴 性 - 转染阴性对照 siRNA 的 NIH3T3-F 细胞 )
     图 3. 细胞中转染 F-siRNA 表达质粒对 F 基因稳定转染细胞 (NIH3T3-F 细胞 ) 生 长曲线的影响。纵坐标表示 A490。( 其中 ： ◆ - 转染 F-siRNA 表达载体的 NIH3T3-F 细胞， △ - 未转染任何 siRNA 的 NIH3T3-F 细胞， ○ - 转染空载体对照的 NIH3T3-F 细胞 )
     图 4. 细胞中转染化学合成的 F-siRNA 对 F 基因稳定转染细胞 (NIH3T3-F 细胞 ) 生 长曲线的影响。纵坐标表示 A490。( 其中 ： ◆ - 转染化学合成 F-siRNA 的 NIH3T3-F 细胞， △ - 未转染任何 siRNA 的 NIH3T3-F 细胞， ○ - 转染阴性对照 siRNA 的 NIH3T3-F 细胞 )
     图 5. 细胞中转染 F-siRNA 表达质粒对 F 基因稳定转染细胞 (NIH3T3-F 细胞 ) 的 转化作用的影响。纵坐标表示细胞克隆数。( 其中 ： F-siRNA vector- 转染 F-siRNA 表达载 体的 NIH3T3-F 细胞， 空白 - 未转染任何 siRNA 的 NIH3T3-F 细胞， 载体 - 转染空载体对照的 NIH3T3-F 细胞 )
     图 6. 细胞中转染化学合成的 F-siRNA 对 F 基因稳定转染细胞 (NIH3T3-F 细胞 ) 的 转化作用的影响。纵坐标表示细胞克隆数。( 其中 ： chem F-siRNA- 转染化学合成 F-siRNA 的 NIH3T3-F 细胞， 空白 - 未转染任何 siRNA 的 NIH3T3-F 细胞， 阴性 - 转染阴性对照 siRNA
     的 NIH3T3-F 细胞 )
     图 7.F-siRNA 表达质粒的体内抗肿瘤作用。纵坐标表示肿瘤体积。( 其中 ： ◆-瘤 内注射 F-siRNA 表达载体组， △ - 瘤内注射生理盐水组， ○ - 瘤内注射空载体组 )
     图 8. 化学合成 F-siRNA 的体内抗肿瘤作用。 纵坐标表示肿瘤体积。 ( 其中 ： ◆-瘤 内注射化学合成 F-siRNA 组， △ - 瘤内注射生理盐水组， ○ - 瘤内注射阴性 siRNA 对照组 ) 具体实施方式
     材料与方法
     带有 H1 启动子和 U6 启动子的载体 pRNAi-U6H1/Neo 购自 Biomics 公司， 萤光素 酶表达载体 pGL3、 大肠杆菌 DH5α、 NIH3T3 细胞以及 BALB/c 裸鼠， 由南京军区军事医学 研究所疾病控制研究所所有。质粒提取试剂盒 QIAGEN plasmid kit 购自德国 QIAGEN 公 司。常用的限制性内切酶和 T4DNA 连接酶购自大连宝生物工程有限公司。脂质体转染试剂 Lipofectamine 2000 购自美国 Invitrogen 公司， 无血清培养基 Opti-MEM 购自美国 Gibico 公司。软琼脂购自美国 Cambrex 公司。
     本发明所涉及的分子生物学相关技术如核酸操作技术在科学文献中都已有充分 的描述 ( 如参见 J 萨姆布鲁克 E· F· 弗里奇 T· 曼尼要蒂斯， 分子克隆实验指南 ( 第二版 ))。 涉及到各种试剂 ( 或试剂盒 ) 的具体操作， 按照各试剂 ( 或试剂盒 ) 的使用说明书进行。 实施例 1
     siRNA 的化学合成
     F-siRNA 设计后送上海吉玛制药技术有限公司合成。其采用的合成方法为通用的 方法， siRNA 分子经过 2 位上脱保护、 脱盐、 纯化和退火形成双链， 然后溶于 DEPC 处理的蒸 馏水中。
     1. 分别合成 siRNA 的正义 RNA 片段与反义 RNA 片段
     2. 退火形成双链 siRNAs
     1) 将合成的 siRNA 正义、 反义 RNA 片段溶于焦磷酸二乙酸 (DEPC) 处理过的水中。
     2) 制备退火缓冲液 (2×) ： 200mM 乙酸钾， 4mM 乙酸镁， 60mM Hepes-KOH(pH7.4)
     3) 制备 20μM 的 siRNA 贮存液 ：
     2× 退火缓冲液 100μl
     siRNA 正义 RNA 片段 Aμl
     siRNA 反义 RNA 片段 Bμl
     DEPC 处理水 (100-A-B)μl
     上述成份混匀， 于 90℃放置 1min， 再于 37℃放置 1h。贮存于 -20℃。
     得到 F-siRNA 序列 ： 正义链 5′ -CCUCGUGGAAGGCGACAACX-3′
     反义链 5′ -XGUUGUCGCCUUCCACGAGG-3′
     其中 X 代表 TT 或 UU。
     设计阴性对照， 设计阴性对照遵循的原则是与 F-siRNA 序列有相同的组成， 但与 mRNA 和人类基因和基因表达片段没有明显的同源性。
     得到阴性对照 (N-siRNA) 序列 ： 正义链 ： 5′ -UCAAGGAGCAGAGAACGACdTdT-3′，
     反义链 ： 5′ -GUCGUUCUCUGCUCCUUGAdTdT-3′。
     实施例 2
     siRNA 表达载体的构建
     用带有 H1 启动子和 U6 启动子的载体 pRNAi-U6H1/Neo(Biomics 公司 )( 质粒图谱 见图 1)， 分别连接上述设计的 F-siRNA 靶位点序列 (21 个碱基 ) 的 DNA 寡核苷酸链， 形成能 表达 F-siRNA 的质粒载体。
     DNA 寡核苷酸链为 ：
     正义 DNA 片段 ( 对应于 siRNA 正义 RNA 片段 ) ：
     5′ -AAACCUCGUGGAAGGCGACAACdTdT-3′
     反义 DNA 片段 ( 对应于 siRNA 反义 RNA 片段 )
     5′ -AAAGUUGUCGCCUUCCACGAGGdTdT-3′
     这两条 DNA 寡核苷酸链经退火形成双链 DNA oligos。
     1)DNA 单链合成
     多家 DNA 合成公司均可合成。
     2)DNA 单链退火形成双链
     退火反应体系如下 ： 正义 DNA 片段寡核苷酸 (100μM) 2μl 反义 DNA 片段寡核苷酸 (100μM) 2μl
     10× 任何一种限制性内切酶缓冲液 2μl
     去离子水 14μl
     总量 20μl
     退火程序为 ： 于 95℃加热 5min 后， 移至室温 10min， 即完成退火反应， 然后用 1× 相同限制酶缓冲液稀释 50 倍， 至终浓度为 0.2M。
     3) 连接
     将退火后的双链 DNA oligos 连接入 pRNAi-U6H1/Neo 载体， 连接体系如下 ：
     pRNAi-U6H1/Neo 载体 (1ng/μl) 1μl
     双链 DNA oligos(0.2M) 1μl
     5× 连接酶缓冲液 4μl
     T4DNA 连接酶 1μl
     去离子水 13μl
     总量 20μl
     4) 转化、 鉴定
     连接产物转化 DH5α 大肠杆菌， 经新霉素 (Neo+) 抗性筛选， 挑取单克隆菌落进行 PCR 扩增， 筛选出含目的基因的阳性克隆， 并进行 DNA 序列分析加以确定。
     实施例 3
     萤光素酶表达载体的构建及稳定转染细胞系的构建
     用生物软件分析 GenBank 中已公布的 HCV 1b 亚型病毒序列， 在 HCV C 基因片段设 计引物， 先扩增出 +1 框的 42 ～ 144aa 的序列， 再利用两对引物， 加上 0 框的前 41 个 aa 的 序列， 则得到如下 HCV 1b 亚型 F 基因序列 (F 基因在 42 位密码子 +1 移框及 144 位密码子 TAG 终止 ) ：
     ATG AGC ACG AAT CCT AAA CCT CAA AGA AAA ACC AAA CGT AAC ACC AAC CGC
     CGC CCA CAG GAC GTC AAG TTC CCG GGC GGT GGT CAG ATC GTT GGT GGA GTT
     TAC CTG TTG CCG CGC AGG GGC CCC AGG TTG GGT GTG CGC GCG ACT AGG AAG
     ACT TCC GAG CGG TCG CAA CCT CGT GGA AGG CGA CAA CCT ATC CCA AAG GCT
     CGC CAA CCC GAG GGC AGG GCC TGG GCT CAG CCC GGG TAC CCT TGG CCC CTC
     TAT GGC AAT GAG GGC TTG GGG TGG GCA GGA TGG CTC CTG TCA CCC CGC GGC
     TCC CGG CCT AGT TGG GGC CCC ACG GAC CCC CGG CGT AGG TCG CGT AAC TTG
     GGT AAG GTC ATC GAT ACC CTT ACA TGC GGC TTC GCC GAT CTC ATG GGG TAC ATT
     CCG CTC GTC GGC GCC CCC TA G
     为了分析 F-siRNA 对 HCV F 基因的干扰效果， 本发明构建了如下报告质粒 ：
     将 HCV 1b 亚型 F 基因克隆到一个萤火虫荧光素酶 (firefly luciferase， FL) 表 达载体 (pGL3)， 构建融合蛋白表达质粒 pGL-F。由于 HCV 1b 亚型 F 基因与 C 基因在 3′端 拥有相同的基因序列， 则为了验证本发明的 F-siRNA 的特异性， 我们还将 HCV 1b 亚型 C 基 因克隆到 pGL3 载体中， 构建 pGL-C 质粒作为对照。若靶基因被 F-siRNA 干扰则荧光素酶表 达量降低， 据此可以判断 F-siRNA 是否为特异性干扰靶基因。
     构建稳定转染细胞系， 使用阳性脂质体 Lipofectamine 2000(Invitrogen 公司 ) 转染试剂， 按其说明书进行转染实验。 ①转染前 24h， 胰酶消化细胞并计数， 1-2×105 个细胞铺板， 使其在转染日密度为 80-90％。细胞铺板在 0.5ml 含血清， 不含抗生素的正常生长的培养基中 ；
     ②每孔细胞使用 50μl 无血清培养基稀释 0.8μg-1.0μgDNA(pGL-F 或 pGL-C 质 粒)；
     ③每孔细胞使用 50μl 无血清培养基稀释 1μl-3μl Lipofectmine 2000 试剂， 在 30min 内同稀释的 DNA 混合， 在室温保温 20min ；
     ④在加入复合物前移去生长培养基， 替换为 0.5ml 无血清培养基， 然后， 直接将复 合物加入到每孔中， 摇动培养板， 轻轻混匀， 在 37℃， 5％的 CO2 培养箱中中保温 24h ；
     ⑤转染后第 2d， 将细胞按 1 ∶ 10 传代 ；
     ⑥转染 48h 后， 用 800μg/mL G418(Promega 公司 ) 进行压力筛选， 每周更换 2 次 含 G418 的培养液， 10 到 14d 后， 可以观察到抗性克隆， 未转染的对照没有细胞生长 ；
     ⑦采用萤光素酶和 β- 半乳糖苷酶分析系统， 荧光素酶活性用 GloMax 发光检测仪 进行检测， 以发光值表示 ； β- 半乳糖苷酶活性用酶标仪检测， 以波长 420nm 的吸光度值表 示。对阳性转染孔用有限稀释法亚克隆 3 次后， 得到稳定表达 pGL-F 或 pGL-C 的 NIH3T3 细 胞， 分别命名为 NIH3T3-F 细胞和 NIH3T3-C 细胞。
     实施例 4
     F-siRNA 表达质粒在 NIH3T3-F 细胞中抑制 F 蛋白表达的鉴定
     1. 方法
     (1) 细胞转染
     用 24 孔细胞培养板进行细胞转染实验。
     ①转染前 24h， 在 500μL 无抗完全培养基中接种 1-2×105 个细胞， 转染时细胞融 合度为 80-90％。
     ② F-siRNA 表达载体的转染用阳性脂质体 Lipofectamine 2000 转染试剂， 具体转
     染方法同实施例 3。其中， F-siRNA 表达载体 0.8μg， Lipofectamine 20002μL。
     ③于 37℃、 5％ CO2 培养箱中培养， 转染 4-6h 后换新鲜培养基， 72h 后检测。
     (2) 萤光检测
     萤光检测方法同实施例 3。相对荧光素酶活性＝荧光素酶发光值 - 本底发光值 / β- 半乳糖苷酶吸光度值。
     2. 结果
     如图 2 所示， 应用针对 1b 亚型的丙型肝炎病毒 F 基因上特异 F-siRNA 表达载体， 能有效抑制 NIH3T3-F 细胞中 pGL-F 融合基因的萤火虫萤光素酶表达， 有效抑制率为 75％， 而且 F-siRNA 不影响稳定转染 HCV C 基因在 NIH3T3-C 细胞中的萤光素酶活性。
     实施例 5
     细胞中转染 F-siRNA 表达质粒对 NIH3T3-F 细胞生长曲线的影响
     培养在 24 孔板的 NIH3T3-F 细胞中转染 ( 如实施例 3 中用脂质体转染 )0.8μg 特 异性靶向 F 基因的 F-siRNA 表达质粒， 观察对 NIH3T3-F 细胞生长曲线的影响。采用四甲基 偶氮唑蓝 (MTT) 法， 将转染后的干扰组、 载体对照组细胞和空白对照组分别接种于 6 块 96 4 孔板， 接种密度为 1×10 / 孔， 每天取 1 板进行 MTT 检测， 测定 490nm 吸光度值， 取平均值。 连续测定 6d， 绘制细胞生长曲线， 比较 F-siRNA 干扰组与载体对照组和空白对照组细胞的 生长增殖速度。
     结果如图 3 所示， 以时间为横坐标， A 值 ( 波长为 490nm， 代表活细胞的数量 ) 为纵 坐标， 分别绘制 F-siRNA、 载体对照组和空白对照组细胞的生长曲线。载体对照组与空白对 照组细胞相比， 生长速度基本一致， 而干扰组 F-siRNA 细胞生长速度减缓。
     实施例 6
     细胞中转染化学合成 F-siRNA 对 NIH3T3-F 细胞生长曲线的影响
     方法同实施例 5。
     培养在 24 孔板的 NIH3T3-F 细胞中转染化学合成 F-siRNA， 转染细胞的终浓度为 33nM( 其余步骤同实施例 3 中用脂质体转染 )， 用 MTT 法分析对 NIH3T3-F 细胞生长曲线的 影响。
     结果如图 4 所示， 阴性对照组与空白对照组细胞相比， 生长速度基本一致， 而干扰 组 F-siRNA 细胞生长速度减缓。
     实施例 7
     细胞中转染 F-siRNA 表达质粒对 NIH3T3-F 细胞转化的影响
     采用软琼脂集落形成实验研究 F-siRNA 表达质粒对 NIH3T3-F 细胞转化的影响。 用 六孔板进行软琼脂集落形成实验， 转染质粒的用量为 4μg/ 孔， Lipofectamine 2000 的用 量为 10μL。 收集转染 4μg F-siRNA 表达质粒的 NIH3T3-F 细胞 ( 如实施例 3 中用脂质体转 染 )， 未转染 F-siRNA 表达质粒的 NIH3T3-F 细胞 ( 空白对照组 ) 和转染空质粒的 NIH3T3-F 细胞 ( 载体对照组 )， 于含有 20％小牛血清的 2×DMEM 培养基中， 调整细胞浓度为 2×104/ mL， 于等量的 40℃水浴的 0.6％琼脂混匀， 快速加入六孔板中， 1mL/ 孔， 每种细胞设三个复 孔， 常温下自然凝固后置于 37℃、 5％ CO2 孵箱中培养， 每 3 天向琼脂表面滴加 3 ～ 5 滴培养 液， 21 天后计算软琼脂中细胞集落形成数目。
     结果如图 5 所示， 空白对照组和载体对照组均可以在软琼脂上形成 50 个以上的细胞克隆， 说明 NIH3T3-F 细胞具有在软琼脂上形成克隆的能力， 表现出恶性转化的性质。 转染 F-siRNA 表达质粒的 NIH3T3-F 细胞不能在软琼脂中形成 3 个以上的细胞克隆， 说明 F-siRNA 表达质粒可以使 NIH3T3-F 细胞失去转化活性， 消除了其潜在的致癌性。
     实施例 8
     细胞中转染化学合成 F-siRNA 对 NIH3T3-F 细胞转化的影响
     方法同实施例 7。
     培养在 6 孔板的 NIH3T3-F 细胞中转染化学合成 F-siRNA， 转染细胞的终浓度为 33nM， Lipofectamine 2000 的用量为 10μL( 其余步骤同实施例 3 中用脂质体转染 )， 采用 软琼脂集落形成实验分析对稳定表达 F 基因细胞转化的影响。
     结果如图 6 所示， 转染化学合成 F-siRNA 的 NIH3T3-F 细胞不能在软琼脂中形成 3 个以上的细胞克隆， 而空白对照组与 N-siRNA 阴性对照组均可以在软琼脂上形成 50 个以上 的细胞克隆， 说明化学合成 F-siRNA 可以使 NIH3T3-F 细胞失去转化活性。
     实施例 9
     F-siRNA 表达质粒体内抗肿瘤作用检测
     采用 NIH3T3-F 细胞裸鼠体内移植模型来检测 F-siRNA 表达质粒在体内的抗肿瘤 作用。选择 5-6 周龄 SPF 级雌性 BALB/c 裸鼠， 将细胞用胰酶消化成单细胞悬液后， 进行细 6 胞计数， 用 0.4mL 的培养液悬浮 3×10 细胞， 用一次性注射器将细胞悬液注射至裸鼠右腋 皮下。待皮下肿瘤长至足够大时， 将其无菌取出， 在生理盐水中剪成 2×2mm 大小的肿瘤块。 和套管针将瘤块移植到裸鼠右侧腋下， 待瘤块直径约 4mm 时， 将裸鼠随机分组， 每组 3 只。 分组后进行给药， F-siRNA 表达质粒采用瘤内注射， 剂量为 40μg/ 只， F-siRNA 表达质粒 与 Lipofectamine 2000 脂质体的比例为 1 ∶ 5， 将 F-siRNA 表达质粒与脂质体混合后静置 20min， 再加入 30μL 的 Opti-MEM 培养液， 采用微量注射器注射， 每隔 3d 注射 1 次， 共给药 7 次。并设空载体对照及用 PBS 注射的空白对照。用游标卡尺测量瘤块的大小， 根据公式 2 ab /2 计算瘤块体积， a 为长径， b 为短径。第 28d 脱颈椎处死动物， 剪开局部皮肤， 钝性剥离 出瘤体组织， 电子天平称重， 以组为单位计算平均瘤重和肿瘤抑制率。 肿瘤抑制率＝ (C-T)/ C×100％。C ＝对照组平均瘤重 ； T ＝给药组平均瘤重。
     结果如图 7 所示， F-siRNA 表达质粒对肿瘤的抑制率为 37.6％， 与荷瘤鼠载体对照 组和空白对照组比较， 差异有统计学意义。 且实验中对照组和给药组裸鼠的体重接近， 各组 均无动物死亡。
     实施例 10
     化学合成 F-siRNA 体内抗肿瘤作用检测
     方法同实施例 9。
     待裸鼠瘤块直径约 4mm 时， 将其随机分组。分组后进行给药， 化学合成 F-siRNA 采 用瘤内注射， 裸鼠注射时用 Lipofectamine 2000 转染， F-siRNA 与脂质体的比例为 1 ∶ 5， 注射剂量为 2mg/kg， 每隔 1d 给药 1 次， 共给药 7 次， 第 28d 处死动物， 分离瘤体组织， 根据公 式计算裸鼠肿瘤体积及肿瘤抑制率。并设 N-siRNA 阴性对照组与 PBS 空白对照组。
     背景技术 丙型肝炎病毒 (hepatitis C virus， HCV) 是丙型肝炎的病原体。在欧美发达国 家， HCV 感染是肝硬化和原发性肝癌的首要原因， 非洲等欠发达国家的 HCV 感染率高达 10％ 以上， 我国 HCV 感染率近 3％， 其中约 75％发展为 HCV 慢性肝炎， 约 20％最终发展为肝硬化、 肝癌等终末期肝病 ( 中华肝脏病杂志， 2004， 12 ： 194-198)。国家卫生部 2009 年 1 月公布的 全国法定报告传染病疫情显示， HCV 感染发病数与死亡数均居前 5 位。
     HCV 基因型分为 6 个基因型与不同的亚型， 日本国立传染性疾病研究院通过对亚 洲多个国家 HCV 感染患者进行基因组分析发现， 基因型为 1b 的患者较其他患者更易发生较 为严重的肝脏疾病如肝细胞癌 (hepatocellular carcinoma， HCC)， 并且对干扰素的治疗不 敏感 (Pediatr Int， 2004， 46(2) ： 223-230)。我国大部分地区主要流行的 HCV 型为基因型 1b， 在南方城市基因型 1b 感染率达 90％以上， 且基因型 1b 在慢性肝炎、 肝硬化和肝癌中占 80％以上。
     HCV 属黄病毒属， 全长约 9.6kb， 为一单股正链 RNA， 分为 5’ 非翻译区 (UTR)、 一个 开放阅读框 (ORF) 和 3’ 非翻译区， 编码一个由 3000 多个氨基酸组成的复合蛋白前体， 在宿 主信号肽酶和病毒蛋白酶的作用下裂解产生至少 10 种基因产物 ： 四种结构蛋白 (Core、 E1、 E2、 p7) 和六种非结构蛋白 (NS2、 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A、 NS5B)。
     研究表明， HCV Core 蛋白 (C 蛋白 ) 与肝炎慢性化感染及肝癌的发生发展有 关。近年来， 研究者在感染 HCV 的患者血清中发现了一种新的蛋白， 现称为 F 蛋白， 它是 HCV C 基因编码的另一个产物， 由 C 基因密码子核苷酸移位而产生 (EMBO J， 2001， 20(14) ： 3840-3848)。已有的研究表明， HCV 自然感染过程中可同时产生 C 与 F 蛋白， 且 F 蛋白的变 异高于 C 蛋白 (Hepatology， 2007， 46(6) ： 1704-1712)。在 HCV 所致 HCC 患者体内， F 蛋白的 数量、 抗体阳性率以及基因序列的突变率均显著升高， 提示 F 蛋白可能与肝癌的发生发展 有关。
     用 35S 标记技术研究了 F 蛋白在无细胞翻译体系以及 Huh7 细胞内的半衰期， 发 现 F 蛋白是一个短寿命蛋白， 半衰期小于 10 分钟 (J Gen Virol， 2003， 84(7) ： 1751-1759)。 短寿命意味着 F 蛋白很可能是一种调节性蛋白。C 蛋白、 NS5A 蛋白等 7 种 HCV 蛋白质以 复合体形式分布在内质网上， 该复合体是 HCV 病毒复制的场所 (Hepatology， 2003， 38 ： 468A-469A)。现已证实 F 蛋白分布在内质网上， 推测 F 蛋白也许是内质网上 HCV 蛋白复合 体的成员之一， 可能参与调节 HCV RNA 的复制以及病毒颗粒的形成 (J Virol， 2003， 77(2) ： 1578-1583)。
     F 蛋白既有很高的保守性又有很大的变异性。 不同基因型 HCV 均能编码 F 蛋白， 相
     同基因型 HCV 产生的 F 蛋白高度保守。对 102 株 HCV 1b 基因型的 F 蛋白、 C 蛋白、 NS2 蛋 白进行分析， 发现 F 蛋白的 125 个 aa 中有 116 个 aa 相同， 保守性为 85％， C 蛋白保守性为 97％ (185/191)， NS2 蛋白保守性为 78％ (167/214)(RNA， 2002， 8(5) ： 557-571)。F 蛋白的 高保守性意味着其可能肩负有重要功能。有研究结果显示， 不同基因型 HCV 所编码的 F 蛋 白在一级结构上存在很大变异性， 型间的同源性较低。 F 蛋白的这些特性提示其在 HCV 病毒 的生命周期中可能具有重要作用， 同时又对于 HCV 病毒的变异逃逸以及对抗干扰素疗效发 生影响。
     F 基因与 C 基因重叠， 这使得 F 基因对 HCV 其它基因的表达有着重要的顺式 (cis) 调节作用。另外， F 基因指导合成的 F 蛋白可以反式 (trans) 调节 HCV 其他基因的表达。F 蛋白的合成受到 HCV RNA 内部二级结构的调节， 这些部位可能是抗病毒药物的新靶点。在 抗病毒药物或宿主免疫应答压力作用下， 这些调节性 RNA 元件可能发生突变， 当突变积累 到一定程度时就可能改变 C 蛋白与野生型 F 蛋白之间的比例， 或者是出现突变型 F 蛋白， 受 其调节的 HCV 基因的表达也将发生改变 (Annals of Surgical Oncology， 2004， 11 ： S50 ； J Virol， 2008， 82(23) ： 11503-11515)。当肝细胞损伤或衰老时， 带有突变型 F 基因的 HCV 可 以维持肝细胞存活， 从而支持 HCV 复制， 野生型 F 基因没有这种功能。这样看来， F 基因也 许具有原癌基因的某些功能 (Proc Natl Acad Sci USA， 2002， 99(5) ： 2830-2835)。 F 与 C 蛋白均能够引起细胞内 NF-κB 的持续激活， 从而增强细胞抵抗 TNF-α 诱 导 凋 亡 的 能 力 (Hepatol Res， 2009， 39(3) ： 282-289 ； J Biol Chem， 2001， 276(19) ： 16399-16405)。 阻断细胞凋亡有利于 HCV 在细胞内建立持久感染， 是 HCV 慢性化并导致肝癌 发生的机制之一。 F 与 C 蛋白可激活原癌基因 c-myc， 使其基因产物表达异常增加 (J Biomed Sci， 2008， 15(4) ： 417-425 ； Int J Cancer， 2008， 122(1) ： 124-131)。 F 蛋白还能够抵制抑癌 基因 p21 转录与 DNA 的合成， 扰乱细胞周期， 进而参与致癌过程 (Hepatol Res， 2008， 38(1) ： 1-26)。
     现在 HCV F 蛋白多用于体外诊断、 检测生物学样本， 其中主要是通过设计一系列 的多肽或多肽表位， 进行酶联免疫吸附实验 (ELISA) 或微阵列实验检测生物学样本。近年 来， RNA 干扰 (RNAi) 的研究成为热点， 被 《Science》 评选为 2002 年度最重要科技突破的首 位。RNAi 是细胞本身固有的对抗外源基因及其侵害的一种自我保护现象， 是双链 RNA 分子 在 mRNA 水平关闭相应序列及基因的表达使其沉默的过程。RNAi 技术的应用领域已经从基 因组学研究逐步扩展到医学领域并作为基因治疗手段。利用 RNAi 提供一种经济、 快捷、 高 效的抑制基因表达的技术手段， 在包括医药学在内的诸多领域的应用有非常广阔的前景。
     在病毒性疾病治疗方面， 在利用 RNAi 技术对 HIV-1、 乙型肝炎、 丙型肝炎等进行基 因治疗研究中发现， 选择病毒基因组中与人类基因组无同源性的序列作为抑制序列可在抑 制病毒复制的同时避免对正常组织的毒副作用。siRNA 在感染的早期阶段能有效地抑制 病毒的复制， 病毒感染能被针对病毒基因和相关宿主基因的 siRNA 所阻断， 这些结果提示 RNAi 能胜任许多病毒的基因治疗， RNAi 将成为一种有效的抗病毒治疗手段。
     在肿瘤治疗方面， 肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结果， 传统技术诱 发的单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长， 而 RNAi 可以利用同一基因家 族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性， 设计针对这一区段序列的 siRNA 分子， 只注射一种 siRNA 即可以产生多个基因同时剔除的表现， 也可以同时注射多种 siRNA
     而将多个序列不相关的基因同时剔除 ( 动物医学进展， 2004， 25(2) ： 18-20)。 发明内容 本发明以 RNA 干扰技术为基础， 设计靶向 HCV F 基因的 F-siRNA 药物， 阐明了 F-siRNA 表达载体及化学合成 F-siRNA 对稳定表达 F 蛋白的 NIH3T3-F 细胞的生长抑制作用 和细胞转化抑制作用， 及其对体内移植肿瘤的生长抑制作用， 为 F-siRNA 在 1b 亚型 HCV 治 疗中的应用提供了一定的理论依据。
     本发明设计并制备了一种双链小分子干扰 RNA(F-siRNA)， 由下述核苷酸序列的正 义链和反义链组成 ：
     正义链 5′ -CCUCGUGGAAGGCGACAACX-3′
     反义链 5′ -XGUUGUCGCCUUCCACGAGG-3′
     其中 X 代表 TT 或 UU。T 代表脱氧胸腺嘧啶 dT。
     上述正义 RNA 片段和反义 RNA 片段与已知人类基因和基因表达片段无显著的同一 性。
     本发明的 F-siRNA 可以用化学合成法直接合成或者用质粒载体在细胞或体内表 达的方法获得。
     本发明的双链小分子干扰 RNA 是一种高效针对 HCV 1b 型 F 基因的广谱的 F-siRNA 抗肿瘤药物。
     下面结合实施例对本发明的双链小分子干扰 RNA 的药理活性作进一步的研究。
    附图说明 图 1. 带有 H1 启动子和 U6 启动子 pRNAi-U6H1/Neo 的质粒图谱。
     图 2.F-siRNA 特异性鉴定。纵坐标表示以转录活性为对照的 β- 半乳糖苷酶活 性为标准化的萤火虫萤光素酶活性。( 其中 ： 1- 转染 F-siRNA 表达载体的 NIH3T3-F 细胞， 2- 转染 F-siRNA 表达载体的 NIH3T3-C 细胞， 空白 - 未转染任何 siRNA 的 NIH3T3-F 细胞， 阴 性 - 转染阴性对照 siRNA 的 NIH3T3-F 细胞 )
     图 3. 细胞中转染 F-siRNA 表达质粒对 F 基因稳定转染细胞 (NIH3T3-F 细胞 ) 生 长曲线的影响。纵坐标表示 A490。( 其中 ： ◆ - 转染 F-siRNA 表达载体的 NIH3T3-F 细胞， △ - 未转染任何 siRNA 的 NIH3T3-F 细胞， ○ - 转染空载体对照的 NIH3T3-F 细胞 )
     图 4. 细胞中转染化学合成的 F-siRNA 对 F 基因稳定转染细胞 (NIH3T3-F 细胞 ) 生 长曲线的影响。纵坐标表示 A490。( 其中 ： ◆ - 转染化学合成 F-siRNA 的 NIH3T3-F 细胞， △ - 未转染任何 siRNA 的 NIH3T3-F 细胞， ○ - 转染阴性对照 siRNA 的 NIH3T3-F 细胞 )
     图 5. 细胞中转染 F-siRNA 表达质粒对 F 基因稳定转染细胞 (NIH3T3-F 细胞 ) 的 转化作用的影响。纵坐标表示细胞克隆数。( 其中 ： F-siRNA vector- 转染 F-siRNA 表达载 体的 NIH3T3-F 细胞， 空白 - 未转染任何 siRNA 的 NIH3T3-F 细胞， 载体 - 转染空载体对照的 NIH3T3-F 细胞 )
     图 6. 细胞中转染化学合成的 F-siRNA 对 F 基因稳定转染细胞 (NIH3T3-F 细胞 ) 的 转化作用的影响。纵坐标表示细胞克隆数。( 其中 ： chem F-siRNA- 转染化学合成 F-siRNA 的 NIH3T3-F 细胞， 空白 - 未转染任何 siRNA 的 NIH3T3-F 细胞， 阴性 - 转染阴性对照 siRNA
     的 NIH3T3-F 细胞 )
     图 7.F-siRNA 表达质粒的体内抗肿瘤作用。纵坐标表示肿瘤体积。( 其中 ： ◆-瘤 内注射 F-siRNA 表达载体组， △ - 瘤内注射生理盐水组， ○ - 瘤内注射空载体组 )
     图 8. 化学合成 F-siRNA 的体内抗肿瘤作用。 纵坐标表示肿瘤体积。 ( 其中 ： ◆-瘤 内注射化学合成 F-siRNA 组， △ - 瘤内注射生理盐水组， ○ - 瘤内注射阴性 siRNA 对照组 ) 具体实施方式
     材料与方法
     带有 H1 启动子和 U6 启动子的载体 pRNAi-U6H1/Neo 购自 Biomics 公司， 萤光素 酶表达载体 pGL3、 大肠杆菌 DH5α、 NIH3T3 细胞以及 BALB/c 裸鼠， 由南京军区军事医学 研究所疾病控制研究所所有。质粒提取试剂盒 QIAGEN plasmid kit 购自德国 QIAGEN 公 司。常用的限制性内切酶和 T4DNA 连接酶购自大连宝生物工程有限公司。脂质体转染试剂 Lipofectamine 2000 购自美国 Invitrogen 公司， 无血清培养基 Opti-MEM 购自美国 Gibico 公司。软琼脂购自美国 Cambrex 公司。
     本发明所涉及的分子生物学相关技术如核酸操作技术在科学文献中都已有充分 的描述 ( 如参见 J 萨姆布鲁克 E· F· 弗里奇 T· 曼尼要蒂斯， 分子克隆实验指南 ( 第二版 ))。 涉及到各种试剂 ( 或试剂盒 ) 的具体操作， 按照各试剂 ( 或试剂盒 ) 的使用说明书进行。 实施例 1
     siRNA 的化学合成
     F-siRNA 设计后送上海吉玛制药技术有限公司合成。其采用的合成方法为通用的 方法， siRNA 分子经过 2 位上脱保护、 脱盐、 纯化和退火形成双链， 然后溶于 DEPC 处理的蒸 馏水中。
     1. 分别合成 siRNA 的正义 RNA 片段与反义 RNA 片段
     2. 退火形成双链 siRNAs
     1) 将合成的 siRNA 正义、 反义 RNA 片段溶于焦磷酸二乙酸 (DEPC) 处理过的水中。
     2) 制备退火缓冲液 (2×) ： 200mM 乙酸钾， 4mM 乙酸镁， 60mM Hepes-KOH(pH7.4)
     3) 制备 20μM 的 siRNA 贮存液 ：
     2× 退火缓冲液 100μl
     siRNA 正义 RNA 片段 Aμl
     siRNA 反义 RNA 片段 Bμl
     DEPC 处理水 (100-A-B)μl
     上述成份混匀， 于 90℃放置 1min， 再于 37℃放置 1h。贮存于 -20℃。
     得到 F-siRNA 序列 ： 正义链 5′ -CCUCGUGGAAGGCGACAACX-3′
     反义链 5′ -XGUUGUCGCCUUCCACGAGG-3′
     其中 X 代表 TT 或 UU。
     设计阴性对照， 设计阴性对照遵循的原则是与 F-siRNA 序列有相同的组成， 但与 mRNA 和人类基因和基因表达片段没有明显的同源性。
     得到阴性对照 (N-siRNA) 序列 ： 正义链 ： 5′ -UCAAGGAGCAGAGAACGACdTdT-3′，
     反义链 ： 5′ -GUCGUUCUCUGCUCCUUGAdTdT-3′。
     实施例 2
     siRNA 表达载体的构建
     用带有 H1 启动子和 U6 启动子的载体 pRNAi-U6H1/Neo(Biomics 公司 )( 质粒图谱 见图 1)， 分别连接上述设计的 F-siRNA 靶位点序列 (21 个碱基 ) 的 DNA 寡核苷酸链， 形成能 表达 F-siRNA 的质粒载体。
     DNA 寡核苷酸链为 ：
     正义 DNA 片段 ( 对应于 siRNA 正义 RNA 片段 ) ：
     5′ -AAACCUCGUGGAAGGCGACAACdTdT-3′
     反义 DNA 片段 ( 对应于 siRNA 反义 RNA 片段 )
     5′ -AAAGUUGUCGCCUUCCACGAGGdTdT-3′
     这两条 DNA 寡核苷酸链经退火形成双链 DNA oligos。
     1)DNA 单链合成
     多家 DNA 合成公司均可合成。
     2)DNA 单链退火形成双链
     退火反应体系如下 ： 正义 DNA 片段寡核苷酸 (100μM) 2μl 反义 DNA 片段寡核苷酸 (100μM) 2μl
     10× 任何一种限制性内切酶缓冲液 2μl
     去离子水 14μl
     总量 20μl
     退火程序为 ： 于 95℃加热 5min 后， 移至室温 10min， 即完成退火反应， 然后用 1× 相同限制酶缓冲液稀释 50 倍， 至终浓度为 0.2M。
     3) 连接
     将退火后的双链 DNA oligos 连接入 pRNAi-U6H1/Neo 载体， 连接体系如下 ：
     pRNAi-U6H1/Neo 载体 (1ng/μl) 1μl
     双链 DNA oligos(0.2M) 1μl
     5× 连接酶缓冲液 4μl
     T4DNA 连接酶 1μl
     去离子水 13μl
     总量 20μl
     4) 转化、 鉴定
     连接产物转化 DH5α 大肠杆菌， 经新霉素 (Neo+) 抗性筛选， 挑取单克隆菌落进行 PCR 扩增， 筛选出含目的基因的阳性克隆， 并进行 DNA 序列分析加以确定。
     实施例 3
     萤光素酶表达载体的构建及稳定转染细胞系的构建
     用生物软件分析 GenBank 中已公布的 HCV 1b 亚型病毒序列， 在 HCV C 基因片段设 计引物， 先扩增出 +1 框的 42 ～ 144aa 的序列， 再利用两对引物， 加上 0 框的前 41 个 aa 的 序列， 则得到如下 HCV 1b 亚型 F 基因序列 (F 基因在 42 位密码子 +1 移框及 144 位密码子 TAG 终止 ) ：
     ATG AGC ACG AAT CCT AAA CCT CAA AGA AAA ACC AAA CGT AAC ACC AAC CGC
     CGC CCA CAG GAC GTC AAG TTC CCG GGC GGT GGT CAG ATC GTT GGT GGA GTT
     TAC CTG TTG CCG CGC AGG GGC CCC AGG TTG GGT GTG CGC GCG ACT AGG AAG
     ACT TCC GAG CGG TCG CAA CCT CGT GGA AGG CGA CAA CCT ATC CCA AAG GCT
     CGC CAA CCC GAG GGC AGG GCC TGG GCT CAG CCC GGG TAC CCT TGG CCC CTC
     TAT GGC AAT GAG GGC TTG GGG TGG GCA GGA TGG CTC CTG TCA CCC CGC GGC
     TCC CGG CCT AGT TGG GGC CCC ACG GAC CCC CGG CGT AGG TCG CGT AAC TTG
     GGT AAG GTC ATC GAT ACC CTT ACA TGC GGC TTC GCC GAT CTC ATG GGG TAC ATT
     CCG CTC GTC GGC GCC CCC TA G
     为了分析 F-siRNA 对 HCV F 基因的干扰效果， 本发明构建了如下报告质粒 ：
     将 HCV 1b 亚型 F 基因克隆到一个萤火虫荧光素酶 (firefly luciferase， FL) 表 达载体 (pGL3)， 构建融合蛋白表达质粒 pGL-F。由于 HCV 1b 亚型 F 基因与 C 基因在 3′端 拥有相同的基因序列， 则为了验证本发明的 F-siRNA 的特异性， 我们还将 HCV 1b 亚型 C 基 因克隆到 pGL3 载体中， 构建 pGL-C 质粒作为对照。若靶基因被 F-siRNA 干扰则荧光素酶表 达量降低， 据此可以判断 F-siRNA 是否为特异性干扰靶基因。
     构建稳定转染细胞系， 使用阳性脂质体 Lipofectamine 2000(Invitrogen 公司 ) 转染试剂， 按其说明书进行转染实验。 ①转染前 24h， 胰酶消化细胞并计数， 1-2×105 个细胞铺板， 使其在转染日密度为 80-90％。细胞铺板在 0.5ml 含血清， 不含抗生素的正常生长的培养基中 ；
     ②每孔细胞使用 50μl 无血清培养基稀释 0.8μg-1.0μgDNA(pGL-F 或 pGL-C 质 粒)；
     ③每孔细胞使用 50μl 无血清培养基稀释 1μl-3μl Lipofectmine 2000 试剂， 在 30min 内同稀释的 DNA 混合， 在室温保温 20min ；
     ④在加入复合物前移去生长培养基， 替换为 0.5ml 无血清培养基， 然后， 直接将复 合物加入到每孔中， 摇动培养板， 轻轻混匀， 在 37℃， 5％的 CO2 培养箱中中保温 24h ；
     ⑤转染后第 2d， 将细胞按 1 ∶ 10 传代 ；
     ⑥转染 48h 后， 用 800μg/mL G418(Promega 公司 ) 进行压力筛选， 每周更换 2 次 含 G418 的培养液， 10 到 14d 后， 可以观察到抗性克隆， 未转染的对照没有细胞生长 ；
     ⑦采用萤光素酶和 β- 半乳糖苷酶分析系统， 荧光素酶活性用 GloMax 发光检测仪 进行检测， 以发光值表示 ； β- 半乳糖苷酶活性用酶标仪检测， 以波长 420nm 的吸光度值表 示。对阳性转染孔用有限稀释法亚克隆 3 次后， 得到稳定表达 pGL-F 或 pGL-C 的 NIH3T3 细 胞， 分别命名为 NIH3T3-F 细胞和 NIH3T3-C 细胞。
     实施例 4
     F-siRNA 表达质粒在 NIH3T3-F 细胞中抑制 F 蛋白表达的鉴定
     1. 方法
     (1) 细胞转染
     用 24 孔细胞培养板进行细胞转染实验。
     ①转染前 24h， 在 500μL 无抗完全培养基中接种 1-2×105 个细胞， 转染时细胞融 合度为 80-90％。
     ② F-siRNA 表达载体的转染用阳性脂质体 Lipofectamine 2000 转染试剂， 具体转
     染方法同实施例 3。其中， F-siRNA 表达载体 0.8μg， Lipofectamine 20002μL。
     ③于 37℃、 5％ CO2 培养箱中培养， 转染 4-6h 后换新鲜培养基， 72h 后检测。
     (2) 萤光检测
     萤光检测方法同实施例 3。相对荧光素酶活性＝荧光素酶发光值 - 本底发光值 / β- 半乳糖苷酶吸光度值。
     2. 结果
     如图 2 所示， 应用针对 1b 亚型的丙型肝炎病毒 F 基因上特异 F-siRNA 表达载体， 能有效抑制 NIH3T3-F 细胞中 pGL-F 融合基因的萤火虫萤光素酶表达， 有效抑制率为 75％， 而且 F-siRNA 不影响稳定转染 HCV C 基因在 NIH3T3-C 细胞中的萤光素酶活性。
     实施例 5
     细胞中转染 F-siRNA 表达质粒对 NIH3T3-F 细胞生长曲线的影响
     培养在 24 孔板的 NIH3T3-F 细胞中转染 ( 如实施例 3 中用脂质体转染 )0.8μg 特 异性靶向 F 基因的 F-siRNA 表达质粒， 观察对 NIH3T3-F 细胞生长曲线的影响。采用四甲基 偶氮唑蓝 (MTT) 法， 将转染后的干扰组、 载体对照组细胞和空白对照组分别接种于 6 块 96 4 孔板， 接种密度为 1×10 / 孔， 每天取 1 板进行 MTT 检测， 测定 490nm 吸光度值， 取平均值。 连续测定 6d， 绘制细胞生长曲线， 比较 F-siRNA 干扰组与载体对照组和空白对照组细胞的 生长增殖速度。
     结果如图 3 所示， 以时间为横坐标， A 值 ( 波长为 490nm， 代表活细胞的数量 ) 为纵 坐标， 分别绘制 F-siRNA、 载体对照组和空白对照组细胞的生长曲线。载体对照组与空白对 照组细胞相比， 生长速度基本一致， 而干扰组 F-siRNA 细胞生长速度减缓。
     实施例 6
     细胞中转染化学合成 F-siRNA 对 NIH3T3-F 细胞生长曲线的影响
     方法同实施例 5。
     培养在 24 孔板的 NIH3T3-F 细胞中转染化学合成 F-siRNA， 转染细胞的终浓度为 33nM( 其余步骤同实施例 3 中用脂质体转染 )， 用 MTT 法分析对 NIH3T3-F 细胞生长曲线的 影响。
     结果如图 4 所示， 阴性对照组与空白对照组细胞相比， 生长速度基本一致， 而干扰 组 F-siRNA 细胞生长速度减缓。
     实施例 7
     细胞中转染 F-siRNA 表达质粒对 NIH3T3-F 细胞转化的影响
     采用软琼脂集落形成实验研究 F-siRNA 表达质粒对 NIH3T3-F 细胞转化的影响。 用 六孔板进行软琼脂集落形成实验， 转染质粒的用量为 4μg/ 孔， Lipofectamine 2000 的用 量为 10μL。 收集转染 4μg F-siRNA 表达质粒的 NIH3T3-F 细胞 ( 如实施例 3 中用脂质体转 染 )， 未转染 F-siRNA 表达质粒的 NIH3T3-F 细胞 ( 空白对照组 ) 和转染空质粒的 NIH3T3-F 细胞 ( 载体对照组 )， 于含有 20％小牛血清的 2×DMEM 培养基中， 调整细胞浓度为 2×104/ mL， 于等量的 40℃水浴的 0.6％琼脂混匀， 快速加入六孔板中， 1mL/ 孔， 每种细胞设三个复 孔， 常温下自然凝固后置于 37℃、 5％ CO2 孵箱中培养， 每 3 天向琼脂表面滴加 3 ～ 5 滴培养 液， 21 天后计算软琼脂中细胞集落形成数目。
     结果如图 5 所示， 空白对照组和载体对照组均可以在软琼脂上形成 50 个以上的细胞克隆， 说明 NIH3T3-F 细胞具有在软琼脂上形成克隆的能力， 表现出恶性转化的性质。 转染 F-siRNA 表达质粒的 NIH3T3-F 细胞不能在软琼脂中形成 3 个以上的细胞克隆， 说明 F-siRNA 表达质粒可以使 NIH3T3-F 细胞失去转化活性， 消除了其潜在的致癌性。
     实施例 8
     细胞中转染化学合成 F-siRNA 对 NIH3T3-F 细胞转化的影响
     方法同实施例 7。
     培养在 6 孔板的 NIH3T3-F 细胞中转染化学合成 F-siRNA， 转染细胞的终浓度为 33nM， Lipofectamine 2000 的用量为 10μL( 其余步骤同实施例 3 中用脂质体转染 )， 采用 软琼脂集落形成实验分析对稳定表达 F 基因细胞转化的影响。
     结果如图 6 所示， 转染化学合成 F-siRNA 的 NIH3T3-F 细胞不能在软琼脂中形成 3 个以上的细胞克隆， 而空白对照组与 N-siRNA 阴性对照组均可以在软琼脂上形成 50 个以上 的细胞克隆， 说明化学合成 F-siRNA 可以使 NIH3T3-F 细胞失去转化活性。
     实施例 9
     F-siRNA 表达质粒体内抗肿瘤作用检测
     采用 NIH3T3-F 细胞裸鼠体内移植模型来检测 F-siRNA 表达质粒在体内的抗肿瘤 作用。选择 5-6 周龄 SPF 级雌性 BALB/c 裸鼠， 将细胞用胰酶消化成单细胞悬液后， 进行细 6 胞计数， 用 0.4mL 的培养液悬浮 3×10 细胞， 用一次性注射器将细胞悬液注射至裸鼠右腋 皮下。待皮下肿瘤长至足够大时， 将其无菌取出， 在生理盐水中剪成 2×2mm 大小的肿瘤块。 和套管针将瘤块移植到裸鼠右侧腋下， 待瘤块直径约 4mm 时， 将裸鼠随机分组， 每组 3 只。 分组后进行给药， F-siRNA 表达质粒采用瘤内注射， 剂量为 40μg/ 只， F-siRNA 表达质粒 与 Lipofectamine 2000 脂质体的比例为 1 ∶ 5， 将 F-siRNA 表达质粒与脂质体混合后静置 20min， 再加入 30μL 的 Opti-MEM 培养液， 采用微量注射器注射， 每隔 3d 注射 1 次， 共给药 7 次。并设空载体对照及用 PBS 注射的空白对照。用游标卡尺测量瘤块的大小， 根据公式 2 ab /2 计算瘤块体积， a 为长径， b 为短径。第 28d 脱颈椎处死动物， 剪开局部皮肤， 钝性剥离 出瘤体组织， 电子天平称重， 以组为单位计算平均瘤重和肿瘤抑制率。 肿瘤抑制率＝ (C-T)/ C×100％。C ＝对照组平均瘤重 ； T ＝给药组平均瘤重。
     结果如图 7 所示， F-siRNA 表达质粒对肿瘤的抑制率为 37.6％， 与荷瘤鼠载体对照 组和空白对照组比较， 差异有统计学意义。 且实验中对照组和给药组裸鼠的体重接近， 各组 均无动物死亡。
     实施例 10
     化学合成 F-siRNA 体内抗肿瘤作用检测
     方法同实施例 9。
     待裸鼠瘤块直径约 4mm 时， 将其随机分组。分组后进行给药， 化学合成 F-siRNA 采 用瘤内注射， 裸鼠注射时用 Lipofectamine 2000 转染， F-siRNA 与脂质体的比例为 1 ∶ 5， 注射剂量为 2mg/kg， 每隔 1d 给药 1 次， 共给药 7 次， 第 28d 处死动物， 分离瘤体组织， 根据公 式计算裸鼠肿瘤体积及肿瘤抑制率。并设 N-siRNA 阴性对照组与 PBS 空白对照组。
     结果如图 8 所示， 化学合成 F-siRNA 对肿瘤的抑制率为 35.0％， 与转染 N-siRNA 阴 性对照荷瘤鼠组及 PBS 空白对照组比较， 差异具有统计学意义。且实验中对照组和给药组 裸鼠的体重接近， 各组均无动物死亡。10101979552 A CN 101979557
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