α- 淀粉酶， 其编码基因及其表达 技术领域 本发明属于生物工程领域， 更具体地， 本发明涉及 α- 淀粉酶， 其编码基因， 含有 该基因的重组质粒和菌株， 以及表达方法。
背景技术 淀粉 (Starch) 是一种碳水化合物， 几乎完全是以 α-D- 葡萄糖为单位聚合而 成的， 链平均长度为 500-1000 个葡萄糖残基。淀粉中能溶于热水的一部分叫直链淀粉 (Amylase)， 不能溶解的叫支链淀粉 (Amylopectin)， 曾称为 α- 直链淀粉或红直链淀粉 (Erythroamylose)， 这两种成分是淀粉颗粒的主要成分， 含量可以达到 75％ -80％。
直链淀粉分子量在 10-2000kD 之间， 以 α-1， 4 糖苷键型缩合而成， 卷曲成螺旋形， 遇碘呈紫蓝色， 每个糖链含有几千个葡萄糖残基， 直链淀粉在 620-680nm 呈最大的光吸收。 支链淀粉分子量在 50-400000kD 之间， 主要以 α-1， 4 糖苷键型缩合而成， 少量由 α-1， 6糖 苷键型缩合而成， 平均每 24 个有约 1 个末端葡萄糖残基的 α-1， 6 支链出现， 支链淀粉分子 分支很多， 在热水中膨润成淀粉糊， 遇碘呈紫红色， 在 530-550nm 呈最大光吸收。
淀粉几乎存在于所有的绿色植物多数组织中， 是植物营养物质的一种储存形式， 在显微镜下以颗粒形状存在于植物有机体中。 就目前的情况来看能够作为淀粉原料的作物 主要是玉米， 其次是薯类、 稻谷和小麦， 2004 年我国粮食总产量达到 46947.2 万吨， 而这四 种粮食作物年产量占我国粮食作物总产量 90％以上， 所以在我国淀粉资源是相当丰富的。
淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的通称， 广泛存在于动植物和微生物中。由于淀粉 酶在工农业上的重要价值， 因此很早就有人对淀粉酶进行研究。1833 年 Payen 和 Persoz 已首次从麦芽的水抽提物中用酒精沉淀分离到淀粉酶。1894 年日本人高峰让吉用麸皮培 养米曲霉 (Aspergillus oryzae) 用水提取， 再以酒精沉淀， 得到作为消化剂的酶， 即高峰 淀粉酶。1919 年法国 Boidin 和 Effront 首次用枯草杆菌生产淀粉酶， 为微生物酶的工业 生产奠定基础。1949 年， 日本人成功的进行的 α- 淀粉酶的深层发酵， 从而促进了酶的大 规模生产的发展。淀粉酶按照水解淀粉方式的不同大致可分为四大类 ： (1)α- 淀粉酶 (EC 3.2.1.1)， 它以糖原或淀粉为底物， 从分子内部切开 α-1， 4 糖苷键而使底物水解成糊精和 少量的葡萄糖和麦芽糖。 (2)β- 淀粉酶 (EC 3.2.1.2) ： 从底物的非还原末端依次间隔的切 开 α-1， 4 糖苷键， 因此作用于直链淀粉时所得的产物为麦芽糖， 而作用于支链时只能得到 50％ -65％麦芽糖， 残留下 40％左右的极限糊精。(3) 葡萄糖淀粉酶 (EC 3.2.1.3) ： 习惯上 简称糖化酶， 从底物非还原性末端依次水解 α-1， 4 糖苷键和分支点 α-1， 6 糖苷键， 生成葡 萄糖。(4) 异淀粉酶 (EC 3.2.1.9) ： 只水解糖原或支链淀粉分支点 α-1， 6 糖苷键， 切下整 个侧枝。
从催化专一性上看， 把 α- 淀粉酶归为糖苷水解酶类 (glycosyl hydrases) 的 第 13 家族， 属于 α- 葡萄糖苷水解酶 (α-Glycosyl hydrases， EC 3.2.1)， α- 淀粉酶 (α-amylase) 又称为液化淀粉酶， 其系统名称为 α-1， 4- 葡聚糖 -4- 葡聚糖水解酶 (α-1， 4-glucan-glucanhydrolase EC 3.2.1.1)， 常用名 α- 淀粉酶， 又名 α-1， 4 糊精酶， 是一种
内切酶， 能水解淀粉分子中的 α-1， 4 糖苷键， 将其任意切成长短不一的短链糊精和少量的 低相对分子质量糖类， 直链淀粉和支链淀粉均以无规则的形式进行分解， 从而使淀粉糊的 粘度迅速下降， 即 “液化” 起作用， 故 α- 淀粉酶又称为液化酶。
α- 淀粉酶水解淀粉机制在上个世纪 50 年代后逐渐得到阐述 ： α- 淀粉酶对于直 链淀粉的作用第一步是将直链淀粉任意地迅速地降解成小分子糊精、 麦芽糖和麦芽三糖， 第二步缓慢地将低聚糖水解为葡萄糖和麦芽糖。水解终产物有 α- 极限糊精、 部分低聚糖、 麦芽糖和葡萄糖。在 α-1， 4 糖苷键水解地过程中， 葡萄糖单位间的 C1-O-C4 键地 C1-O 键 间断裂。
α- 淀粉酶液化淀粉导致淀粉部分解聚， 失去粘性和遇碘呈色的性质， 水解物的还 原力增加， 当到达消色点附近时随还原力增加而反应速度降低， 逐渐达到水解极限。 但是不 同来源的 α- 淀粉酶， 不同来源的淀粉、 对淀粉的预处理方式、 处理温度以及溶液 pH 等因素 都会影响这一水解过程， 导致 α- 淀粉酶作用于淀粉的水解极限不同， 生成低寡糖组成存 在差异和结构不同的极限糊精。
不同来源的 α- 淀粉酶， 水解淀粉的极限不同。当 α- 淀粉酶作用于淀粉时， 随 着粘度的下降， 碘反应由蓝变紫， 再变为红色， 直至无色， 反应液的还原力逐渐的加强， 到达 消色点附近时随还原力的增加反应速度逐渐降低， 此时的水解率因酶的来源而异， 细菌、 霉 菌、 麦芽的 α- 淀粉酶为 10-20％ ； 胰液、 唾液和细菌糖化型 α- 淀粉酶约为 40％。 α- 淀粉酶广泛存在于包括人、 动物、 植物、 真菌和细菌等各种生物中， 从 1956 年 首 次 报 道 分 离 α- 淀 粉 酶 开 始， 目 前 已 经 分 离 并 鉴 定 的 超 过 120 种 α- 淀 粉 酶， 从 数 量 上 看 微 生 物 来 源 的 α- 淀 粉 酶 占 大 部 分。 微 生 物 中 能 产 生 α- 淀 粉 酶 的 属 有 ： Bacillus， Thermomonospor， Acinetobacter， Pseudomonas， Streptomyces， Aspergillus， Penicillus 等。目前在工业上大量使用的 α- 淀粉酶主要来源于枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)， 地 衣 芽 孢 杆 菌 (Bacillus licheniformis)， 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 (Bacillus amyloliquefaciens)， 黑曲霉 (Aspergillus niger) 和米曲霉 (Aspergillus oryzae)。
α- 淀粉酶具有相当大的商业价值， 广泛应用于淀粉深加工工业、 酒精工业、 啤酒 工业、 柠檬酸工业、 味精及淀粉糖化工业、 制药工业及纺织业。目前我国 40 多家酶制剂厂 中， 淀粉酶是相当一部分厂家的主要酶制剂产品。国内生产其中适用于不同用途的 α- 淀 粉酶有 10 余种剂型， 但以吸附型居多， 包被型或高纯度剂型较少。在我国 α- 淀粉酶主要 生产菌株是枯草芽孢杆菌和黑曲霉。 但是这些生产菌株几乎都从自然界筛选得到或经过人 工诱变的菌株， 酶的性质并不十分优良， 加之酶的后处理工艺落后， 产品利润普遍不高。在 中国具有自主知识产权的基因工程菌株实现工业化生产的 α- 淀粉酶的报道极少。
因此， 目前本领域还有必要找到性能优越的新的 α- 淀粉酶的编码基因， 开发出 高性能的淀粉酶， 更新和完善淀粉酶的种类， 为淀粉原料的深加工提供更好的条件， 开创新 的酶法工艺， 提高收得率、 降低消耗、 提高产品质量、 增加效益， 从而可以进一步促进淀粉原 料深加工行业的发展， 显著提高经济效益和社会效益。
发明内容
本发明的目的在于提供 α- 淀粉酶， 其编码基因， 含有该基因的重组质粒和菌株， 以及表达方法。在本发明的第一方面， 提供一种分离的 α- 淀粉酶， 所述的 α- 淀粉酶的氨基酸序 列如 SEQ ID NO ： 11 所示， 其中，
第 14 位氨基酸选自 Tyr 或 His ； 第 124 位氨基酸选自 Asp 或 Asn ；
第 133 位氨基酸选自 His 或 Arg ； 第 134 位氨基酸选自 Arg 或 Gln ；
第 164 位氨基酸选自 Asp 或 Gly ； 第 180 位氨基酸选自 Glu 或 Lys ；
第 211 位氨基酸选自 Glu 或 Lys ； 第 264 位氨基酸选自 Gln 或 Pro ；
第 272 位氨基酸选自 Asn 或 Thr ； 第 310 位氨基酸选自 Gly 或 Ser ；
第 373 位氨基酸选自 Pro 或 Ser ； 或第 396 位氨基酸选自 Tyr 或 His。
在一个优选例中， 所述的 α- 淀粉酶的氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 6， SEQ ID NO ： 7， SEQ ID NO ： 8， SEQ ID NO ： 9 或 SEQ ID NO ： 10 所示。
在本发明的另一方面， 提供一种分离的多核苷酸， 所述的多核苷酸包含一核苷酸 序列， 该核苷酸序列选自下组 ：
(a) 编码所述 α- 淀粉酶的多核苷酸 ； 或
(b) 与多核苷酸 (a) 互补的多核苷酸。
在一个优选例中， 所述的多核苷酸的核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 1， SEQ ID NO ： 2， SEQ ID NO ： 3， SEQ ID NO ： 4 或 SEQ ID NO ： 5 所示。
在本发明的另一方面， 提供一种载体， 所述的载体包含所述的多核苷酸。
在一个优选例中， 所述的载体是大肠杆菌质粒。
在 另 一 优 选 例 中，所 述 的 载 体 选 自 pTrcHis2-BSAmy、 pTrcHis2-BCAmy、 pTrcHis2-BL16Amy、 pTrcHis2-BLAmy 或 pTrcHis2-BPAmy。
在本发明的另一方面， 提供一种细胞， 其包含所述的载体， 或其基因组中整合有所 述的多核苷酸。
在一个优选例中， 所述的细胞是大肠杆菌细胞。
在另一优选例中， 所述的细胞是包含所述核酸分子或用所述载体转化的大肠杆菌 BL21。
在本发明的另一方面， 提供一种生产所述的 α- 淀粉酶的方法， 包括 ： 培养所述的 细胞， 从培养物中分离出表达产物。
在本发明的另一方面， 提供一种组合物， 所述组合物中含有所述的 α- 淀粉酶 ； 以 及食品学上可接受的载体。
在本发明的另一方面， 提供所述的 α- 淀粉酶的用途， 用于水解糖原或淀粉。
在本发明的另一方面， 提供一种水解糖原或淀粉的方法， 所述方法包括 ： 用所述的 α- 淀粉酶处理糖原或淀粉。
本发明的其它方面由于本文的公开内容， 对本领域的技术人员而言是显而易见 的。 附图说明
图1： 来自枯草芽孢杆菌的编码 α- 淀粉酶的核酸序列 BS-Amy(SEQ ID NO ： 1) 及 其编码的氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 6)。
图2： 来自蜡状芽孢杆菌的编码 α- 淀粉酶的核酸序列 BC-Amy(SEQ ID NO ： 2) 及其编码的氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 7)。
图3： 来自地衣芽孢杆菌的编码 α- 淀粉酶的核酸序列 BL16-Amy(SEQ ID NO ： 3) 及其编码的氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 8)。
图4： 来自地衣芽孢杆菌的编码 α- 淀粉酶的核酸序列 BL-Amy(SEQ ID NO ： 4) 及 其编码的氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 9)。
图5： 来自短小芽孢杆菌的编码 α- 淀粉酶的核酸序列 BP-Amy(SEQ ID NO ： 5) 及 其编码的氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 10)。
图6： 五种来源的 α- 淀粉酶氨基酸序列的比对。
图7： 大肠杆菌表达 BS-Amy、 BC-Amy、 BL16-Amy、 BL-Amy 和 BP-Amy 序列所编码 α- 淀粉酶的最适反应 pH。
图8： 大肠杆菌表达 BS-Amy、 BC-Amy、 BL16-Amy、 BL-Amy 和 BP-Amy 序列所编码 α- 淀粉酶的最适反应温度。
图9： 大肠杆菌表达 BS-Amy、 BC-Amy、 BL16-Amy、 BL-Amy 和 BP-Amy 序列所编码 α- 淀粉酶的 pH 稳定性。
图 10 ： 大肠杆菌表达 BS-Amy、 BC-Amy、 BL16-Amy、 BL-Amy 和 BP-Amy 序列所编码 α- 淀粉酶的热稳定性。 图 11 ： 大肠杆菌表达 BS-Amy、 BC-Amy、 BL16-Amy、 BL-Amy 和 BP-Amy 序列所编码 α- 淀粉酶发酵过程中样品的 SDS-PAGE。
图 12 ： 大肠杆菌表达 BS-Amy、 BC-Amy、 BL16-Amy、 BL-Amy 和 BP-Amy 序列所编码 α- 淀粉酶的分子量。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究， 首次分离获得一类具有优异的水解糖原或淀粉效果的 α- 淀粉酶， 其具有酶活性高且稳定性 ( 特别是热稳定性 ) 好的特点。 在此基础上完成本发 明。
如本文所用， “分离的” 是指物质从其原始环境中分离出来 ( 如果是天然的物质， 原 始环境即是天然环境 )。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和蛋白是没有分离纯化 的， 但同样的多聚核苷酸或蛋白如从天然状态中同存在的其他物质中分开， 则为分离纯化 的。
如本文所用， “分离的 α- 淀粉酶” 是指 α- 淀粉酶基本上不含天然与其相关的其 它蛋白、 脂类、 糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化 α- 淀 粉酶。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。α- 淀粉酶的纯度 能用氨基酸序列分析。
本发明的 α- 淀粉酶可以是重组蛋白 ( 多肽 )、 天然蛋白、 合成蛋白， 优选重组蛋 白。本发明的 α- 淀粉酶可以是天然纯化的产物， 或是化学合成的产物， 或使用重组技术从 原核或真核宿主 ( 例如， 细菌、 酵母、 高等植物、 昆虫和哺乳动物细胞 ) 中产生。根据重组生 产方案所用的宿主， 本发明的 α- 淀粉酶可以是糖基化的， 或可以是非糖基化的。本发明的 α- 淀粉酶还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括 α- 淀粉酶的片段、 衍生物和类似物。如本文所用， 术语 “片段” “衍 、生物” 和 “类似物” 是指基本上保持本发明的天然 α- 淀粉酶相同的生物学功能或活性的蛋 白。本发明的 α- 淀粉酶片段、 衍生物或类似物可以是 (i) 有一个或多个保守或非保守性 氨基酸残基 ( 优选保守性氨基酸残基 ) 被取代的蛋白， 而这样的取代的氨基酸残基可以是 也可以不是由遗传密码编码的， 或 (ii) 在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白， 或 (iii) 成熟蛋白与另一个化合物 ( 比如延长蛋白半衰期的化合物， 例如聚乙二醇 ) 融合 所形成的蛋白， 或 (iv) 附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白 ( 如前导序列或 分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列， 或与抗原 IgG 片段的形成的融合蛋白 )。 根据本文的教导， 这些片段、 衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中， 术语 “α- 淀粉酶” 指具有 α- 淀粉酶活性的 SEQ ID NO ： 11 序列的 蛋白。该术语还包括具有与 α- 淀粉酶相同功能的、 SEQ ID NO ： 11 序列的变异形式。这些 变异形式包括 ( 但并不限于 ) ： 一个或多个 ( 通常为 1-30 个， 较佳地 1-20 个， 更佳地 1-10 个， 最佳地 1-5 个 ) 氨基酸的缺失、 插入和 / 或取代， 以及在 C 末端和 / 或 N 末端添加一个 或数个 ( 通常为 20 个以内， 较佳地为 10 个以内， 更佳地为 5 个以内 ) 氨基酸。例如， 在本 领域中， 用性能相近或相似的氨基酸进行取代时， 通常不会改变蛋白质的功能。又比如， 在 C 末端和 / 或 N 末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括 α- 淀粉酶的活性片段和活性衍生物。 该 α- 淀粉酶的变异形式包括 ： 同源序列、 保守性变异体、 等位变异体、 天然突变 体、 诱导突变体、 在高或低的严紧度条件下能与 α- 淀粉酶的 DNA 杂交的 DNA 所编码的蛋 白、 以及利用抗 α- 淀粉酶的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他蛋白， 如包含 α- 淀粉酶或其片段的融合蛋白。 除了几乎全长的蛋白外， 本发明还包括了 α- 淀粉酶的可 溶性片段。通常， 该片段具有 α- 淀粉酶序列的至少约 10 个连续氨基酸， 通常至少约 30 个 连续氨基酸， 较佳地至少约 50 个连续氨基酸， 更佳地至少约 80 个连续氨基酸， 最佳地至少 约 100 个连续氨基酸。
发明还提供 α- 淀粉酶的类似物。这些类似物与天然 α- 淀粉酶的差别可以是氨 基酸序列上的差异， 也可以是不影响序列的修饰形式上的差异， 或者兼而有之。 这些蛋白包 括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到， 如通过辐射或暴露于诱 变剂而产生随机诱变， 还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括 具有不同于天然 L- 氨基酸的残基 ( 如 D- 氨基酸 ) 的类似物， 以及具有非天然存在的或合 成的氨基酸 ( 如 β、 γ- 氨基酸 ) 的类似物。应理解， 本发明的 α- 淀粉酶并不限于上述例 举的代表性的蛋白。
修饰 ( 通常不改变一级结构 ) 形式包括 ： 体内或体外的蛋白的化学衍生形式如乙 酰化或羧基化。修饰还包括糖基化， 如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进 行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶 ( 如哺乳动 物的糖基化酶或去糖基化酶 ) 而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基 ( 如磷酸酪 氨酸， 磷酸丝氨酸， 磷酸苏氨酸 ) 的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优 化了溶解性能的蛋白。
在本发明中， “α- 淀粉酶保守性变异蛋白 ( 多肽 )” 指与 SEQ ID NO ： 11 的氨基酸 序列相比， 有至多 10 个， 较佳地至多 8 个， 更佳地至多 5 个， 最佳地至多 3 个氨基酸被性质 相似或相近的氨基酸所替换而形成蛋白。这些保守性变异蛋白最好根据表 1 进行氨基酸替
换而产生。
表1
最初的残基 代表性的取代 Ala(A) Arg(R) Asn(N) Asp(D) Cys(C) Gln(Q) Glu(E) Gly(G) His(H) Ile(I) Leu(L) Lys(K) Met(M) Phe(F) Pro(P) Ser(S) Thr(T) Trp(W) Tyr(Y) Val(V)
优选的取代 Val Lys Gln Glu Ser Asn Asp Ala Arg Leu Ile Arg Leu Leu Ala Thr Ser Tyr Phe LeuVal ； Leu ； Ile Lys ； Gln ； Asn Gln ； His ； Lys ； Arg Glu Ser Asn Asp Pro ； Ala Asn ； Gln ； Lys ； Arg Leu ； Val ； Met ； Ala ； Phe Ile ； Val ； Met ； Ala ； Phe Arg ； Gln ； Asn Leu ； Phe ； Ile Leu ； Val ； Ile ； Ala ； Tyr Ala Thr Ser Tyr ； Phe Trp ； Phe ； Thr ； Ser Ile ； Leu ； Met ； Phe ； Ala作为本发明的优选方式， 所述的 α- 淀粉酶是从枯草芽孢杆菌、 蜡状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌 (2 株 ) 和短小芽孢杆菌中克隆的 α- 淀粉酶， 分别称之为 BS-Amy、 BC-Amy、 BL16-Amy、 BL-Amy、 BP-Amy， 它们分别具有 SEQ ID NO ： 6-10 所示的氨基酸序列。在氨基酸 序列水平上， 它们之间的相同性为 99.5％。
本发明的多核苷酸可以是 DNA 形式或 RNA 形式。DNA 形式包括 cDNA、 基因组 DNA 或人工合成的 DNA。DNA 可以是单链的或是双链的。DNA 可以是编码链或非编码链。编码成 熟蛋白的编码区序列可以与 SEQ ID NO ： 1-5 任一所示的编码区序列相同或者是简并的变异 体。如本文所用， “简并的变异体” 在本发明中是指编码具有 SEQ IDNO ： 11 的蛋白质， 但与 SEQ ID NO ： 1-5 任一所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码 SEQ ID NO ： 11 的成熟蛋白的多核苷酸包括 ： 只编码成熟蛋白的编码序列 ； 成 熟蛋白的编码序列和各种附加编码序列 ； 成熟蛋白的编码序列 ( 和任选的附加编码序列 ) 以及非编码序列。
术语 “编码蛋白的多核苷酸” 可以是包括编码此蛋白的多核苷酸， 也可以是还包括 附加编码和 / 或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体， 其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋 白或蛋白的片段、 类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或 非天然发生的变异体。 这些核苷酸变异体包括取代变异体、 缺失变异体和插入变异体。 如本 领域所知的， 等位变异体是一个多核苷酸的替换形式， 它可能是一个或多个核苷酸的取代、 缺失或插入， 但不会从实质上改变其编码的蛋白的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少 50 ％， 较佳地至少 70％， 更佳地至少 80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多 核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中， “严格条件” 是指 ： (1) 在较低离子强度和较高温度 下的杂交和洗脱， 如 0.2×SSC， .1％ SDS， 0℃ ； 或 (2) 杂交时加有变性剂， 50％ (v/v) 甲酰 胺， 0.1％小牛血清 /0.1％ Ficoll， 42℃等 ； 或 (3) 仅在两条序列之间的相同性至少在 90％ 以上， 更好是 95％以上时才发生杂交。 并且， 可杂交的多核苷酸编码的蛋白与 SEQID NO ： 11 所示的成熟蛋白有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用， “核酸片段” 的长度至 少含 15 个核苷酸， 较好是至少 30 个核苷酸， 更好是至少 50 个核苷酸， 最好是至少 100 个核 苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术 ( 如 PCR) 以确定和 / 或分离编码 α- 淀粉酶 的多聚核苷酸。
作为本发明的优选方式， 编码所述的 α- 淀粉酶的多核苷酸分离自枯草芽孢杆 菌、 蜡状芽孢杆菌、 地衣芽孢杆菌 (2 株 ) 和短小芽孢杆菌， 它们分别具有 SEQ ID NO ： 1-5 所 示的核苷酸序列。
本发明中的蛋白和多核苷酸优选以分离的形式提供， 更佳地被纯化至均质。
本发明的 α- 淀粉酶核苷酸全长序列或其片段通常可以用 PCR 扩增法、 重组法或 人工合成的方法获得。对于 PCR 扩增法， 可根据本发明所公开的有关核苷酸序列， 尤其是开 放阅读框序列来设计引物， 并用市售的 cDNA 库或按本领域技术人员已知的常规方法所制 备的 cDNA 库作为模板， 扩增而得有关序列。当序列较长时， 常常需要进行两次或多次 PCR 扩增， 然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列， 就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体， 再转入细胞， 然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外， 还可用人工合成的方法来合成有关序列， 尤其是片段长度较短时。通常， 通 过先合成多个小片段， 然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前， 已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白 ( 或其片段， 或其衍生 物 ) 的 DNA 序列。然后可将该 DNA 序列引入本领域中已知的各种现有的 DNA 分子 ( 或如载 体 ) 和细胞中。此外， 还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
应 用 PCR 技 术 扩 增 DNA/RNA 的 方 法 (Saiki， et al.Science 1985 ； 230 ： 1350-1354) 被优选用于获得本发明的基因。 特别是很难从文库中得到全长的 cDNA 时， 可优 选使用 RACE 法 (RACE-cDNA 末端快速扩增法 )， 用于 PCR 的引物可根据本文所公开的本发明 的序列信息适当地选择， 并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化 扩增的 DNA/RNA 片段。
作为实施方式之一， 本发明人分别提取枯草芽孢杆菌、 蜡状芽孢杆菌、 地衣芽孢杆 菌 (2 株 ) 和短小芽孢杆菌的基因组 DNA， 通过基因组文库构建好活性筛选的方法克隆到编 码 α- 淀粉酶的全长序列。结果获得如 SEQ ID NO ： 1-5 所示的核酸序列。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体， 以及用本发明的载体或 α- 淀粉酶 编码序列经基因工程产生的宿主细胞， 以及经重组技术产生本发明所述蛋白的方法。 通过常规的重组 DNA 技术 (Science， 1984 ； 224 ： 1431)， 本发明的多聚核苷酸序列 可用来表达或生产重组的 α- 淀粉酶。一般来说有以下步骤 ：
(1). 用本发明的编码 α- 淀粉酶的多核苷酸 ( 或变异体 )， 或用含有该多核苷酸 的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞 ；
(2). 在合适的培养基中培养的宿主细胞 ；
(3). 从培养基或细胞中分离、 纯化蛋白质。
本发明中， α- 淀粉酶多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语 “重组表达载 体” 指本领域熟知的细菌质粒、 噬菌体、 酵母质粒、 植物细胞病毒、 哺乳动物细胞病毒如腺病 毒、 逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于 ： 大肠杆菌质粒。只要能 在宿主体内复制和稳定， 任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有 复制起点、 启动子、 标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含 α- 淀粉酶编码 DNA 序列和合适的转 录 / 翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组 DNA 技术、 DNA 合成技术、 体内重组 技术等。所述的 DNA 序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上， 以指导 mRNA 合成。这 些启动子的代表性例子有 ： 大肠杆菌的 lac 或 trp 启动子 ； λ 噬菌体 PL 启动子 ； 真核启动 子包括 CMV 立即早期启动子、 HSV 胸苷激酶启动子、 早期和晚期 SV40 启动子、 反转录病毒的 LTRs 和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。 表达载体 还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外， 表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因， 以提供用于选择转化的 宿主细胞的表型性状， 如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、 新霉素抗性， 或用于大肠杆菌 的四环素或氨苄青霉素抗性。
在一种实施方式中， 将不带内源性信号肽编码序列的本发明 α- 淀粉酶编码序 列经 NcoI 和 EcoRI 双酶切后与 NcoI 和 EcoRI 双酶切的 pTrcHis2 载体连接， 得到大肠
重 组 表 达 载 pTrcHis2-BSAmy、 pTrcHis2-BCAmy、 pTrcHis2-BL16Amy、 pTrcHis2-BLAmy 和 pTrcHis2-BPAmy。
包含上述的适当 DNA 序列以及适当启动子或者控制序列的载体， 可以用于转化适 当的宿主细胞， 以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞， 如细菌细胞 ； 或是低等真核细胞， 如酵母细胞 ； 或是高 等真核细胞， 如哺乳动物细胞。代表性例子有 ： 大肠杆菌， 链霉菌属 ； 鼠伤寒沙门氏菌的细 菌细胞 ； 真菌细胞如酵母 ； 植物细胞 ； 果蝇 S2 或 Sf9 的昆虫细胞 ； CHO、 COS、 293 细胞、 或 Bowes 黑素瘤细胞的动物细胞等。所述宿主细胞优选各种利于基因产物表达或发酵生产的 细胞， 此类细胞已为本领域熟知并常用， 例如各种大肠杆菌细胞和酵母细胞。 在本发明的实 施方式之一中， 选用大肠杆菌 BL21 构建表达 α- 淀粉酶的重组细胞。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、 启动子、 增强子和宿主细胞。
用重组 DNA 转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原 核生物如大肠杆菌时， 能吸收 DNA 的感受态细胞可在指数生长期后收获， 用 CaCl2 法处理， 所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用 MgCl2。如果需要， 转化也可用电穿孔的 方法进行。当宿主是真核生物， 可选用如下的 DNA 转染方法 ： 磷酸钙共沉淀法， 常规机械方 法如显微注射、 电穿孔、 脂质体包装等。 获得的转化子可以用常规方法培养， 表达本发明的 α- 淀粉酶。根据所用的宿主 细胞， 培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培 养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后， 用合适的方法 ( 如温度转换或化学诱导 ) 诱导 选择的启动子， 将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组蛋白可在细胞内、 或在细胞膜上表达、 或分泌到细胞外。 如 果需要， 可利用其物理的、 化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。 这 些方法是本领域技术人员所熟知的。 这些方法的例子包括但并不限于 ： 常规的复性处理、 用 蛋白沉淀剂处理 ( 盐析方法 )、 离心、 渗透破菌、 超处理、 超离心、 分子筛层析 ( 凝胶过滤 )、 吸附层析、 离子交换层析、 高效液相层析 (HPLC) 和其它各种液相层析技术及这些方法的结 合。
作为实施方式之一， 通过包含本发明 α- 淀粉酶编码序列的大肠杆菌 ( 例如大肠 杆菌 BL21) 发酵来生产 α- 淀粉酶， 并通过硫酸铵沉降， 离子交换层析和凝胶层析纯化得到 了纯酶形式的目的蛋白。
本发明的 α- 淀粉酶的用途包括 ( 但不限于 ) ： 用于水解糖原或淀粉。本发明的 α- 淀粉酶具有优异的水解糖原或淀粉的效果， 且具有良好的热稳定性以及 pH 稳定性， 应 用前景良好。
本发明还提供了一种组合物， 它含有有效量的 α- 淀粉酶以及食品学上或工业上 可接受的载体或赋形剂。这类载体包括 ( 但并不限于 ) ： 缓冲液、 水等。其可被制成溶液或 粉剂等。所述的 “有效量” 是指可发挥 α- 淀粉酶的功能或活性的且可被接受的量。在使 用时， 本领域能够根据所述 α- 淀粉酶的酶活性方便地确定所述的有效量。
本发明利用基因工程手段制备了能够表达 α- 淀粉酶的重组菌株， 并获得了优质 的 α- 淀粉酶。本发明通过酶学性质鉴定进行了酶的最适作用温度、 最适作用 pH 值、 pH 稳 定性、 热稳定性及比活力等理化性质的分析， 证明本发明的 α- 淀粉酶具有很好的 pH 稳定
性， 良好的热稳定性以及抗蛋白酶水解能力。
下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条 件如 Sambrook 等人， 分子克隆 ： 实验室指南 (New York ： Cold Spring HarborLaboratory Press， 1989) ； 赵永芳等， 生物化学技术原理及其应用 ( 第二版 ) ； 朱检等， 生物化学实验 [M] 中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明， 否则百分比和份数按重 量计算。
I. 实验材料和试剂
1. 菌株和载体
大肠杆菌 BL21、 JM109 及表达载体 pTrcHis2 均购自 Invitrogen 公司 (Carlsbad， CA， USA)。
2. 酶类及其他生化试剂
限制性内切酶、 DNAMaker、 蛋白质 Maker 均购自 Fermentas(MBI)， 作用底物可溶性 淀粉购自国药集团化学试剂有限公司 ( 中国， 上海 )， 其他常规试剂购自上海生工。
3. 培养基 使用的培养基 ： LB 培养基， YPD， YPAD， BMDY， BNNY， MM， MD 培养基均参照 Invitrogen 毕氏酵母操作手册。
4. 方法
4.1α- 淀粉酶
本发明各实施例中所有相关的酶活、 酶活力、 酶活性均是指 α- 淀粉酶活力， 可用 可溶性淀粉作为底物进行检测和测定。其中， 酶活力定量测定采用国际通用的 DNS(3， 5- 二 硝基水杨酸 ) 法。
具体的说， 准确移取 250μl 1％ (m/v) 的可溶性淀粉溶液 (pH6.0， 50mM 磷酸氢二 钠 - 磷酸二氢钠 ) 于 2ml 离心管中， 放入 70℃水浴中预热 3min。 用 PBS 缓冲液 (pH6.0， 50mM) 将酶液样品做 10 倍梯度稀释， 选择显色效果令人满意的稀释度。将 250μl 按照选定稀释 度 (N) 稀释好的酶液加入到离心管中， 继续在 70℃水浴中反应 10min， 再加入 1mlDNS 试剂 终止反应， 将离心管在沸水中煮沸 5min， 立即用流水冷却至室温， 室温放置 10min 显色， 然 后于 540nm 处测定吸光度值。
空白对照为现将 250μl 同样稀释度的酶液于 2ml 离心管中， 加入 1ml DNS 试剂， 再加入 250μl 底物， 振荡混合均匀后， 置于 70℃水浴中反应 10min， 将离心管在沸水中煮沸 5min， 立即用流水冷却至室温， 室温放置 10min 显色， 然后于 540nm 处测定吸光度值。
如下绘制酶解产物 ( 葡萄糖 ) 显色的标准曲线 ： 将 500μmol/L 的葡萄糖标准液用 PBS(pH6.0， 50mM 磷酸盐 ) 稀释成 0、 25、 50、 100、 150、 200、 250μmol/L 的溶液， 按上述样品测 定的操作步骤一起反应。以葡萄糖浓度 (C， μmol/L) 为纵坐标， 以吸光值 (A) 为横坐标， 绘 制标准曲线， 列出线性回归方程 (C ＝ KA+b)。
α- 淀粉酶活性单位定义 ： 单位量的淀粉酶每分钟分解淀粉产生 1μmol 葡萄糖为 1 个活力单位 (U)。
样品的 α- 淀粉酶活力 U 按照下面的公式计算 ：
式中 ： U——样品 α- 淀粉酶活力， U/mL ； K——标准曲线的斜率 ； A——样品溶液的吸光值 ； A0——空白对照的吸光值 ； b——标准曲线的截距 ； t——反应时间， min ； V——反应体系中酶液的加入量， ml ； V0——反应体系的总体积， ml ； N——试样稀释倍数 ； 每次测定均取两个平行试验结果的算术平均值， 保留整数。 α- 淀粉酶的比活力按下面的公式计算 ： Uc ＝ U/c其中 ：
Uc——样品 α- 淀粉酶比活性， U/mg ；
U——样品 α- 淀粉酶活力， U/ml ；
c——样品溶液中的蛋白质含量， mg/ml。
纯化倍数 X 按照下面的公式计算 ：
X ＝ UC/UC0
其中 ：
X——纯化倍数 ；
UC——纯化后 α- 淀粉酶样品的比活力， U/mg ；
UC0——纯化前 α- 淀粉酶样品的比活力， U/mg。
II. 实施例
实施例 1、 α- 淀粉酶编码序列的克隆
基因组 DNA 的提取 ： 取 37℃培养 2 天， 菌体浓度 OD600nm 至 0.5 ～ 0.8 的枯草芽孢 杆菌 (Bacillus subtilis， CICC 10090， 购自中国工业微生物菌株保藏管理中心 (CICC)) 菌液 50ml， 10000rpm 离心 10min， 取 50mg 菌体加 500μl 无菌水清洗， 离心取沉淀。沉淀重 新悬浮于 500μl 1mg/ml 的溶菌酶溶液中， 于 37℃温浴 30min， 再补加溶菌酶液 100μl 于 40-50℃继续保温 30min， 至菌液透明后， 加 10％ SDS 至终浓度 2％ (m/v)， 搅拌约 5min 至菌 液粘度显著下降， 15000rpm 离心 10min 去除碎片。 上清依次用等体积酚、 酚∶氯仿 (1 ∶ 1)、 氯仿抽提。取氯仿抽提所得上层溶液加 0.6-1 倍体积的异丙醇常温沉淀 10min。16000rpm 离心 15min。沉淀用 70％ (v/v) 乙醇清洗， 低速离心， 将沉淀晾干后用 30μl 无菌水溶解， 备用。
取提取的基因组 DNA 5μg， 利用 BamHI 酶切， 与同样酶切的 pUC19 载体连接， 用所 得重组质粒转化大肠杆菌 DH5α( 购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司 )， 构建基因文库。 挑取 白色的阳性克隆 (LB 培养基含有 100μg/ml Amp、 0.5％ (m/v)X-gal 和 1.5mMIPTG)， 转移到活性筛选平板 (LB 培养基中含有 3％ (m/v) 的琼脂和 1％ (m/v) 可溶性淀粉 ) 上过夜培养。 洗去平板上的菌体， 用 1％碘液染色， 再用 0.5M NaCl 溶液洗涤脱色。含有 α- 淀粉酶编码 序列的克隆能够产生降解圈。挑取产生降解圈的克隆， 提取该克隆的质粒， 进行测序， 得到 α- 淀粉酶的编码序列 BS-Amy， 该序列包括 1452bp( 图 1， SEQ ID NO ： 1)， 其中第 1450-1452 位为终止密码子 TAG、 第 1-1449 位编码不含信号肽的成熟蛋白 ( 图 1 和图 6)， 该成熟蛋白 含有 483 个氨基酸 (SEQ ID NO ： 6)。
分别用蜡状芽孢杆菌 (Bacillus cereus， CGMCC 1.260， 购自中国普通微生物菌株 保藏管理中心 (CGMCC))、 地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis， ATCC21610， 购自美国典 型培养物保藏中心 (ATCC))、 地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis， ATCC27811， 购自美 国典型培养物保藏中心 (ATCC)) 和短小芽孢杆菌 (Bacillus pumilus， CGMCC1.0271， 购自 中国普通微生物菌株保藏管理中心 (CGMCC)) 重复以上过程， 得到 α- 淀粉酶的全长编码序 列 BC-Amy(SEQ ID NO ： 2)、 BL16-Amy(SEQ ID NO ： 3)、 BL-Amy(SEQ ID NO ： 4) 和 BP-Amy(SEQ ID NO ： 5) 及其编码的成熟蛋白氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 7 至 SEQ ID NO ： 10)( 图 2、 3、 4和 图 5)。
实施例 2、 构建大肠杆菌重组表达载体及在大肠杆菌中表达 α- 淀粉酶
根据实施例 1 所得编码 α- 淀粉酶的核酸序列设计引物 ：
引物 1 ： 5’ -CCATGGGCAAATCTTAATGGGACGC-3’ (SEQ ID NO ： 12) ；
引物 2 ： 5’ -GAATTCCTATCTTTGAACATAAATTGAAACCGAC-3’ (SEQ ID NO ： 13) ；
引物 3 ： 5’ -GAATTCTTATCTTTGAACATAAATTGAAACCGAC-3’ (SEQ ID NO ： 14)。
分别以实施例 1 中选择和分离得到的含有 BS-Amy、 BC-Amy、 BL16-Amy、 BL-Amy 和 BP-Amy 的 pUC19 重 组 质 粒 为 模 板， PCR 扩 增 5 种 α- 淀 粉 酶 的 编 码 序 列。PCR 扩 增 条件为 ： 94 ℃ 5min ； 94 ℃ 1min， 55 ℃ 1min， 72 ℃ 1min， 32 个 循 环 ； 72 ℃ 10min。 用 NcoI 和 EcoRI 进行双酶切， 连接到载体 pTrcHis2 上， 分别获得含有 5 种 α- 淀粉酶编码序列 的 重 组 质 粒 pTrcHis2-BSAmy、 pTrcHis2-BCAmy、 pTrcHis2-BL16Amy、 pTrcHis2-BLAmy 和 pTrcHis2-BPAmy。
取 10μl 构 建 好 的 重 组 质 粒 pTrcHis2-BSAmy、 pTrcHis2-BCAmy、 pTrcHis2-BL16Amy、 pTrcHis2-BLAmy 和 pTrcHis2-BPAmy， 分别加入到 100μl 制备好的感 受态细胞 ( 大肠杆菌 BL21 和 JM109) 中， 摇匀置于冰上， 冰浴 30min ； 置于 42℃水浴中热击 90s ； 将离心管快速移至冰水混合物中冰浴 2min ； 每管加入 400μl SOC 培养基 (2％蛋白胨， 0.5％酵母粉 (m/v)， 10mM NaCl， 2.5mM KCl， 10mM MgCl2， 10mM MgSO4， 20mM 葡萄糖， pH7.0 ～ 7.2)， 用移液器轻吸打散后于 37℃摇床上复苏 1h(80rpm ～ 200rpm) ； 离心， 4000rpm×5min， 除去 400μl 上清， 剩余部分混匀 ； 涂平板 (LB-agar 平板， 含 80μg/ml Amp)， 37℃正置 1h 后， 倒置培养过夜， 在抗性平板上生长的为含有重组质粒的阳性克隆子。
分别取 5 种重组质粒阳性克隆所在的重组大肠杆菌菌株 JM109， 接种于 50ml LB 培 养 液 中 (250ml 三 角 瓶， 含 50μg/ml Amp)， 37 ℃ 250rpm 振 荡 培 养 2-2.5h， 取培养液 10000rpm 离心 10min， 收集菌体， 提取质粒， 酶切回收目的 DNA 片段 ( 质粒提取和胶回收分 别 用 OMEGA 公 司 的 E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit I 和 E.Z.N.A.Gel ExtractionKit 试 剂 盒 )， 进行测序， 经比对， 所测得的序列与实施例 1 中的序列一致， 这说明目的基因在质粒 pTrcHis2 正确插入。分别取 5 种重组质粒阳性克隆的重组大肠杆菌菌株 BL21， 接种于 50ml LB 培养液 中 (250ml 三角瓶， 含 50μg/ml Amp)， 37℃ 250rpm 振荡培养 1-1.5h， 加入 IPTG 诱导 ( 终浓 度为 2μmol/ml)， 37℃ 250rpm 再振荡培养 3-3.5h。取培养液 10000rpm 离心 10min， 收集菌 体， 再加入等体积的无菌水重新悬浮菌体， 12000rpm 离心 10min， 取沉淀用 1/5 体积 pH6.0， 50mM 的 PBS 悬浮菌体， 进行超声波破碎， 破碎条件为 ： 60％功率， 间隔 5s 破碎 10min， 停止 10min， 再破碎 10min。12000rpm 离心， 收集上清液， 测定 α- 淀粉酶活力， 结果表明五种 α- 淀粉酶的编码基因所编码的 α- 淀粉酶均可在大肠杆菌中表达， 且均有 α- 淀粉酶活 性， 测得 BS-Amy、 BC-Amy、 BL16-Amy、 BL-Amy 和 BP-Amy 序列所编码 α- 淀粉酶活力分别可 达到 81U/ml、 115U/ml、 280U/ml、 85U/ml 和 95.7U/ml。
另外， 将上面所收集的细胞破碎上清液进行 SDS-PAGE 目的蛋白质电泳分析 ( 见图 11 所示 )， 并按照实施例中所述方法从上清液中纯化目的蛋白质， 分别将所得到的纯的目 的蛋白进行 N 端氨基酸序列测定， 所得到的 N 端氨基酸序列与 SEQ ID NO ： 6 至 SEQ ID NO ： 10 中相应的氨基酸序列一致， 这表明目标蛋白得到了正确表达。
实施例 3、 重组 α- 淀粉酶发酵制备
分别取实施例 2 中所制备的 5 种 α- 淀粉酶重组质粒阳性克隆的重组大肠杆菌菌 株 BL21， 各接种于 2 瓶 50ml LB 培养液中 (250ml 三角瓶， 含 50μg/ml Amp)， 37℃ 250rpm 振荡培养至 OD600nm ＝ 0.3 ～ 0.5( 约 2-3hr)， 然后分别将 2 瓶种子各自接种于 3L 发酵基 本培养基 (10g/L 蛋白胨， 5g/L 酵母粉， 1g/L NaCl， 6g/L Na2HPO4·12H2O， 3g/L KH2PO4， 6g/ L(NH4)2SO4， 1g/L MgSO4·7H2O， 0.01g/L CaCl2， 15g/L 葡萄糖， 0.05g/L Amp， 0.1g/L FeSO4) 中， 于 5L 发酵罐中进行发酵。
在起始阶段——菌体生长阶段， 发酵过程中用 25％ (v/v) 的氨水调节 pH， 使其维 持在 7.0-7.2， 并且以 2.8ml/hr 的速度流加微量元素溶液 (3.5mM 硫酸铜， 0.06mM 碘化钠， 1.8mM 硫酸锰， 0.08mM 钼酸钠， 0.04mM 硼酸， 0.5mM 氯化钴， 0.02mM 氯化锌， 0.03mM 硫酸亚 铁， 0.17mM 生物素 ) 进行连续流加补料， 直至 OD600 ＝ 15(8-10hr)。
进入诱导阶段， 加入一定量的浓度为 1mol/L 的 IPTG， 使其终浓度为 1mmol/L， 开始 诱导， 并以 15-20ml/hr 的速度流加 TY(500g/L 葡萄糖， 12.5g/L MgSO4·7H2O)， 以 10-15ml/ hr 的速度流加 DY(100g/L 酵母粉， 10g/L(NH4)2SO4)， 使培养基中还原糖和氨基氮的终浓度 在 0.4-0.6％和 0.05-0.15％ (m/v) 之间。发酵过程中， 从诱导开始， 每隔 3hr 取样一次， 按 照实施例 2 中所叙述的方法获取酶液， 并测定 α- 淀粉酶活力， 至酶活力无明显增加时， 停 止发酵 (18-21hr)。发酵结束后 (18hr)， 测得 BS-Amy、 BC-Amy、 BL16-Amy、 BL-Amy 和 BP-Amy 序列所编码 α- 淀粉酶活力分别可达到 202U/ml、 230U/ml、 430U/ml、 175U/ml 和 220U/ml。
大肠杆菌表达 BS-Amy、 BC-Amy、 BL16-Amy、 BL-Amy 和 BP-Amy 序列所编码 α- 淀粉 酶的分子量鉴定见图 12。
实施例 4、 重组 α- 淀粉酶的纯化
分别将实施例 3 所制备的 5 种发酵培养液 (18hr 后回收所得 )10000rpm 离心 10min， 各自收集菌体， 用 4 倍于菌体体积的 pH6.0， 50mM 的 PBS 缓冲液重新悬浮菌体， 充分 混合均匀后， 10000rpm 离心 10min， 收集沉淀物， 再次用 4 倍体积的 pH6.0， 50mM 的 PBS 缓冲 液使其充分悬浮， 10000rpm 离心 10min， 收集沉淀物， 继续用 4 倍体积的 pH6.0， 50mM 的 PBS 缓冲液使其充分悬浮， 然后用高压均质机进行细胞破壁， 破壁条件为 ： 压力 800-1000bar，过程中用 0-4℃冰水进行冷却。将细胞破碎后的混悬液 10000rpm 离心 10min， 收集上清液 4℃保存待用。
取上清液作为粗酶液， 将粗酶液置于冰浴中， 边搅拌边缓慢加入硫酸铵至 70 ％ (w/v)， 13000rpm 离心 15min， 取沉淀， 用 pH6.0， 50mM 的 PBS 缓冲液重新溶解， 置于截留分子 量为 6000Da 的透析袋中， 以 pH6.0， 20mM 的 PBS 缓冲液为透析外液， 透析外液与内液的体积 比大于 50， 4℃透析 12-16h， 中间每隔 4h 更换透析外液一次， 透析完后， 取透析内液用真空 旋转蒸发仪进行浓缩， 再进行冷冻干燥后， 置于 -20℃的低温冰箱中保存待用。
取 50mg 上面所得到的冻干粉末于离心管中， 加入 2ml pH8.0， 50mM 的 PBS 缓冲液， 使其充分溶解后， 上 TOSOH Toyopearl EDAE-650C 阴离子柱。先用 pH8.0， 50mM PBS 缓冲液 平衡柱子， 然后流加样品， 再用相同缓冲液配置的 0-1.0mol/L NaCl 梯度洗脱 5 个柱体积， 流速为 1ml/min， 用部分收集器收集， 每管 3ml。然后对收集管中的溶液测定 α- 淀粉酶活 力及蛋白电泳分析。
收集常压离子交换分离后的活性峰， 浓缩、 脱盐、 冻干后， 再用 pH7.0， 50mM PBS 缓 冲液溶解， 上 Sephadex G-75 凝胶柱 (Φ1.6×100cm)。 先用 pH7.0， 50mM PBS 缓冲液平衡柱 子， 然后上样， 用 pH7.0， 50mM PBS 缓冲液洗脱 1.5 个柱体积， 流速为 0.2ml/min， 用部分收集 器收集， 每管 3ml。然后对收集管中的溶液测定 α- 淀粉酶活力及蛋白电泳分析。 收集常压凝胶过滤分离后的活性峰， 浓缩、 脱盐、 冻干后， 再用 pH7.0， 50mM PBS 缓 冲液溶解， 上 Mono Q HPLC 柱， 先用 pH8.0， 50mM PBS 缓冲液平衡柱子， 然后上样， 洗脱梯 度为 ： 0mol/L NaCl 20min， 0-0.8mol/L NaCl 90min， 0.8-1.0mol/L NaCl20min， 1.0mol/L NaCl 20min。流速 1.0ml/min， 按峰收集， 然后对收集的样品测定 α- 淀粉酶活力及进行蛋 白质电泳分析。
收集离子交换分离后的活性峰， 浓缩、 脱盐、 冻干后， 再用 pH7.0， 20mM PBS 缓冲液 溶解， 上 Superdex 75HPLC 柱。 先用 pH7.0、 20mM PBS 缓冲液平衡柱子， 然后上样， 用 pH7.0、 20mM PBS 缓冲液洗脱 1.5 个柱体积， 流速为 0.25ml/min， 按峰收集， 然后对收集的样品测定 α- 淀粉酶活力及进行蛋白质电泳分析。SDS-PAGE 结果 ( 图 13) 表明， 5 种来源的 α- 淀粉 酶纯化后的 α- 淀粉酶蛋白仅有单一的条带， 分子量均约为 56kDa。
纯化完成后， BS-Amy 编码的 α- 淀粉酶比活性从粗酶液的 326U/mg 提高到纯酶的 20300U/mg， 纯化倍数为 62.3 ； BC-Amy 编码的 α- 淀粉酶比活性从粗酶液的 345U/mg 提高到 纯酶的 17500U/mg， 纯化倍数为 50.7 ； BL16-Amy 编码的 α- 淀粉酶比活性从粗酶液的 640U/ mg 提高到纯酶的 31200U/mg， 纯化倍数为 48.8 ； BL-Amy 编码的 α- 淀粉酶比活性从粗酶液 的 283U/mg 提高到纯酶的 33000U/mg， 纯化倍数为 116.6 ； BP-Amy 编码的 α- 淀粉酶比活性 从粗酶液的 416U/mg 提高到纯酶的 24000U/mg， 纯化倍数为 57.7。
实施例 5、 重组 α- 淀粉酶酶学性质分析
将实施例 4 所制备的 α- 淀粉酶酶液 ( 细胞破碎上清液 ) 在不同的 pH 下进行酶 促反应以测定其最适 pH。所用缓冲液为 pH4.0-10.0 的 Britton-Robinson 缓冲液 ( 柠檬 酸、 磷酸二氢钾、 硼酸、 氢氧化钠、 巴比妥 )。α- 淀粉酶在不同的 pH 的缓冲液中， 70℃下测 定 pH 的适性结果。结果表明， BS-Amy、 BC-Amy、 BL16-Amy、 BL-Amy 和 BP-Amy 编码的 α- 淀 粉酶的最适 pH 均在 6.0-7.0 之间， 见图 7。
将 α- 淀粉酶酶液在不同 pH 值的 Britton-Robinson 缓冲液中于室温下静置
60min， 再测定残余酶活性以研究 α- 淀粉酶的 pH 稳定性。结果见图 9， 表明在 pH5.0-10.0 范围内， BS-Amy 编码的 α- 淀粉酶的残余活性在 80％以上 ； 在 pH5.0-10.0 范围内， BC-Amy 编码的 α- 淀粉酶的残余活性在 80％以上 ； 在 pH6.0-10.0 范围内， BL16-Amy 编码的 α- 淀 粉酶的残余活性在 90％以上 ； 在 pH5.0-10.0 范围内， BL-Amy 编码的 α- 淀粉酶的残余活性 在 85％以上 ； 在 pH5.0-10.0 范围内， BP-Amy 编码的 α- 淀粉酶的残余活性在 80％以上 ； 这 说明 BS-Amy、 BC-Amy、 BL16-Amy、 BL-Amy 和 BP-Amy 编码的 α- 淀粉酶均有很好的 pH 稳定 性。
最适反应温度的测定在 PBS(pH6.0， 50mM) 缓冲体系及不同温度下 (40℃ -90℃ ) 进行。按照前述 DNS 法进行酶促反应和活力测定。结果见图 8， 表明 BC-Amy、 BL16-Amy 和 BP-Amy 编码的 α- 淀粉酶的最适反应温度在 70℃左右， BS-Amy 编码的 α- 淀粉酶的最适 反应温度在 75℃左右， BL-Amy 编码的 α- 淀粉酶的最适反应温度在 85℃左右。
热稳定性研究为在不同温度下处理 10-60min， 再进行酶活性测定。结果见图 10， 表明在 30℃ -60℃的范围内保温 60min， 5 种 α- 淀粉酶的残余酶活力均可维持在 85％以 上； 在 70℃下保温 30min， 5 种 α- 淀粉酶的残余酶活力均可维持在 80％以上 ； 在 80℃下保 温 10min， 5 种 α- 淀粉酶的残余酶活力均可维持在 60％以上。说明 5 种来源 α- 淀粉酶均 有很好的热稳定性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考， 就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
序列表
<110> 福建福大百特科技发展有限公司
<120>α- 淀粉酶， 其编码基因及其表达
<130>093845
<160>14
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1452
<212>DNA
<213> 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)
<400>1
gcaaatctta atgggacgct gatgcagtat tttgaatggt acatgcccaa tgacggccaa 60
cattggaagc gcttgcaaaa cgactcggca tatttggctg aacacggtat tactgccgtc 120
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<210>3 <211>1452 <212>DNA <213> 地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis) <400>3 gcaaatctta atgggacgct gatgcagtat tttgaatggt acatgcccaa tgacggccaa 60 cattggaagc gcttgcaaaa cgactcggca tatttggctg aacacggtat tactgccgtc 120 tggattcccc cggcatataa gggaacgagc caagcggatg tgggctacgg tgcttacgac 180 ctttatgatt taggggagtt tcatcaaaaa gggacggttc ggacaaagta cggcacaaaa 240 ggagagctgc aatctgcgat caaaagtctt cattcccgcg acattaacgt ttacggggat 300 gtggtcatca accacaaagg cggcgctgat gcgaccgaag atgtaaccgc ggttgaagtc 360 gatcccgcta accgcaaccg cgtaatttca ggagaacacc gaattaaagc ctggacacat 420 tttcattttc cggggcgcgg cagcacatac agcgatttta aatggcattg gtaccatttt 480 gacggaaccg attgggacga gtcccgaaag ctgaaccgca tctataagtt tcaaggaaag 540 gcttgggatt gggaagtttc caatgaaaac ggcaactatg attatttgat gtatgccgac 600 atcgattatg accatcctga tgtcgcagca gaaattaaga gatggggcac ttggtatgcc 660 aatgaactgc aattggacgg tttccgtctt gatgctgtca aacacattaa attttctttt 720 ttgcgggatt gggttaatca tgtcagggaa aaaacgggga aggaaatgtt tacggtagct 780 gaatattggc 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说明书90 His Lys Gly Gly Ala 105 Asp Pro Ala Asp Arg 125 Ala Trp Thr His Phe 140 Phe Lys Trp His Trp 155 Arg Lys Leu Asn Arg 170 Glu Val Ser Asn Glu 185 Ile Asp Tyr Asp His 20525/31 页Val Glu Ile Gly 145 Asp Phe Tyr85 Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn 100 Asp Val Thr Ala Val Glu Val 115 120 Ser Gly Glu His Arg Ile Lys 130 135 Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp 150 Gly Thr Gly Trp Asp Glu Ser 165 Gln Gly Lys Ala Trp Asp Trp 180 Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp 195 20095 Asp Ala Thr 110 Asn Arg Val His Phe Pro Tyr His Phe 160 Ile Tyr Lys 175 Asn Gly Asn 190 Pro Asp Val Gln Phe 240 Met Asn Leu Met Ala 320 Glu Leu Gly Ile His 400Ala Ala Lys Ile Lys 210 Leu Asp Gly Phe Arg 225 Leu Arg Asp Trp Val 245 Phe Thr Val Ala Glu 260 Tyr Leu Asn Lys Thr 275 His Tyr Gln Phe His 290 Arg Lys Leu Leu Asn 305 Val Thr Phe Val Asp 325 Ser Thr Val Gln Thr 340 Thr Arg Glu Ser Gly 355 Thr Lys Gly Asp Ser 370 Glu Pro Ile Leu Lys 385Arg Trp Gly Thr Trp 215 Leu Asp Ala Val Lys 230 Asn His Val Arg Glu 250 Tyr Trp Gln Asn Asp 265 Asn Phe Asn His Ser 280 Ala Ala Ser Thr Gln 295 Gly Thr Val Val Ser 310 Asn His Asp Thr Gln 330 Trp Phe Lys Pro Leu 345 Tyr Pro Gln Val Phe 360 Gln Arg Glu Ile Pro 375 Ala Arg Lys Gln Tyr 39027Tyr Ala Asn Glu Leu 220 His Ile Lys Phe Ser 235 Lys Thr Gly Lys Glu 255 Leu Gly Ala Leu Glu 270 Val Phe Asp Val Pro 285 Gly Gly Gly Tyr Asp 300 Lys His Pro Leu Lys 315 Pro Gly Gln Ser Leu 335 Ala Tyr Ala Phe Ile 350 Tyr Gly Asp Met Tyr 365 Ala Leu Lys His Lys 380 Ala Tyr Gly Ala Gln Asp Tyr Phe Asp His His Asp 405 Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly 420 Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr 435 Trp His Asp Ile Thr Gly Asn 450 455 Glu Gly Trp Gly Glu Phe His 465 470 Val Gln Arg <210>10 <211>483 <212>PRT <213> 短小芽孢杆菌 (Bacillus <400>10 Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu 1 5 Asn Asp Gly Gln His Trp Lys 20 Ala Glu His Gly Ile Thr Ala 35 Thr Ser Gln Ala Asp Val Gly 50 55 Gly Glu Phe His Gln Lys Gly 65 70 Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile 85 Val Tyr Gly Asp Val Val Ile 100 Glu Asp Val Thr Ala Val Glu 115 Ile Ser Gly Glu Arg Arg Ile 130 135 Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser 145 150 Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu 165 Phe Gln Gly Lys Ala Trp AspIle Val Gly 410 Leu Ala Ala 425 Val Gly Arg 440 Arg Ser GluTrp Thr Arg Glu Gly 415 Leu Ile Thr Asp Gly 430 Gln Asn Ala Gly Glu 445 Pro Val Val Ile Asn 460 Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile 475Asp Pro Thr Ser Tyr 480pumilus) Met Gln Tyr 10 Arg Leu Gln 25 Val Trp Ile 40 Tyr Gly Ala Thr Val Arg Lys Ser Leu 90 Asn His Lys 105 Val Asp Pro 120 Lys Ala Trp Asp Phe Lys Ser Arg Lys 170 Trp Glu Val28Phe Glu Trp His Met 15 Asn Asp Ser Ala Tyr 30 Pro Pro Ala Tyr Lys 45 Tyr Asp Leu Tyr Asp 60 Thr Lys Tyr Gly Thr 75 His Ser Arg Asp Ile 95 Gly Gly Ala Asp Ala 110 Ala Asp Arg Asn Arg 125 Thr His Phe His Phe 140 Trp His Trp Tyr His 155 Leu Asn Arg Ile Tyr 175 Ser Ash Glu Asn GlyPro Leu Gly Leu Lys 80 Asn Thr Val Pro Phe 160 Lys Asn101962633 A CN 101962634
说明书27/31 页180 Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala 195 Ala Ala Glu Ile Lys Arg Trp 210 215 Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp 225 230 Leu Arg Asp Trp Val Asn His 245 Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp 260 Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe 275 His Tyr Gln Phe His Ala Ala 290 295 Arg Lys Leu Leu Asn Ser Thr 305 310 Val Thr Phe Val Asp Asn His 325 Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe 340 Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro 355 Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg 370 375 Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg 385 390 Asp Tyr Phe Asp His His Asp 405 Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly 420 Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr 435 Trp His Asp Ile Thr Gly Asn 450 455 Glu Gly Trp Gly Glu Phe His 465 470 Val Gln Arg <210>11185 Asp Ile Asp Tyr Asp 200 Gly Thr Trp Tyr Ala 220 Ala Val Lys His Ile 235 Val Arg Glu Lys Thr 250 Pro Asn Asp Leu Gly 265 Asn His Ser Val Phe 280 Ser Thr Gln Gly Gly 300 Val Val Ser Lys His 315 Asp Thr Gln Pro Gly 330 Lys Pro Leu Ala Tyr 345 Gln Val Phe Tyr Gly 360 Glu Ile Pro Ala Leu 380 Lys Gln Tyr Ala His 395 Ile Val Gly Trp Thr 410 Leu Ala Ala Leu Ile 425 Val Gly Arg Gln Asn 440 Arg Ser Glu Pro Val 460 Val Asn Gly Gly Ser 475190 His Pro Asp Val 205 Asn Glu Leu Gln Lys Phe Ser Phe 240 Gly Lys Glu Met 255 Ala Leu Glu Asn 270 Asp Val Pro Leu 285 Gly Tyr Asp Met Pro Leu Lys Ala 320 Gln Ser Leu Glu 335 Ala Phe Ile Leu 350 Asp Met Tyr Gly 365 Lys His Lys Ile Gly Ala Gln His 400 Arg Glu Gly Asp 415 Thr Asp Gly Pro 430 Ala Gly Glu Thr 445 Val Ile Asn Ser Val Ser Ile Tyr 480<211>483 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <221>MISC_FEATURE <222>(14)..(14) <223>Xaa ＝ Tyr 或 His <220> <221>MISC_FEATURE <222>(124)..(124) <223>Xaa ＝ Asp 或 Asn <220> <221>MISC_FEATURE <222>(133)..(133) <223>Xaa ＝ His 或 Arg <220> <221>MISC_FEATURE <222>(134)..(134) <223>Xaa ＝ Arg 或 Gln <220> <221>MISC_FEATURE <222>(164)..(164) <223>Xaa ＝ Asp 或 Gly <220> <221>MISC_FEATURE <222>(180)..(180) <223>Xaa ＝ Glu 或 Lys <220> <221>MISC_FEATURE <222>(211)..(211) <223>Xaa ＝ Glu 或 Lys <220> <221>MISC_FEATURE <222>(264)..(264) <223>Xaa ＝ Gln 或 Pro <220> <221>MISC_FEATURE <222>(272)..(272) <223>Xaa ＝ Asn 或 Thr<220> <221>MISC_FEATURE <222>(310)..(310) <223>Xaa ＝ Gly 或 Ser <220> <221>MISC_FEATURE <222>(373)..(373) <223>Xaa ＝ Pro 或 Ser <220> <221>MISC_FEATURE <222>(396)..(396) <223>Xaa ＝ Tyr 或 His <400>11 Ala Asn Leu Asn Gly Thr 1 5 Asn Asp Gly Gln His Trp 20 Ala Glu His Gly Ile Thr 35 Thr Ser Gln Ala Asp Val 50 Gly Glu Phe His Gln Lys 65 70 Gly Glu Leu Gln Ser Ala 85 Val Tyr Gly Asp Val Val 100 Glu Asp Val Thr Ala Val 115 Ile Ser Gly Glu Xaa Xaa 130 Gly Arg Gly Ser Thr Tyr 145 150 Asp Gly Thr Xaa Trp Asp 165 Phe Gln Gly Xaa Ala Trp 180 Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr 195Leu Met Gln Tyr 10 Lys Arg Leu Gln 25 Ala Val Trp Ile 40 Gly Tyr Gly Ala 55 Gly Thr Val Arg Ile Lys Ser Leu 90 Ile Asn His Lys 105 Glu Val Asp Pro 120 Ile Lys Ala Trp 135 Ser Asp Phe Lys Glu Ser Arg Lys 170 Asp Trp Glu Val 185 Ala Asp Ile Asp 20031Phe Glu Trp Xaa Met 15 Asn Asp Ser Ala Tyr 30 Pro Pro Ala Tyr Lys 45 Tyr Asp Leu Tyr Asp 60 Thr Lys Tyr Gly Thr 75 His Ser Arg Asp Ile 95 Gly Gly Ala Asp Ala 110 Ala Xaa Arg Asn Arg 125 Thr His Phe His Phe 140 Trp His Trp Tyr His 155 Leu Asn Arg Ile Tyr 175 Ser Asn Glu Asn Gly 190 Tyr Asp His Pro Asp 205Pro Leu Gly Leu Lys 80 Asn Thr Val Pro Phe 160 Lys Asn Val101962633 A CN 101962634
说明书Tyr Ala Asn Glu Leu 220 His Ile Lys Phe Ser 235 Lys Thr Gly Lys Glu 255 Leu Gly Ala Leu Glu 270 Val Phe Asp Val Pro 285 Gly Gly Gly Tyr Asp 300 Lys His Pro Leu Lys 315 Pro Gly Gln Ser Leu30/31 页Ala Ala Xaa Ile Lys 210 Leu Asp Gly Phe Arg 225 Leu Arg Asp Trp Val 245 Phe Thr Val Ala Glu 260 Tyr Leu Asn Lys Thr 275 His Tyr Gln Phe His 290 Arg Lys Leu Leu Asn 305 Val Thr Phe Val AspArg Trp Gly Thr Trp 215 Leu Asp Ala Val Lys 230 Asn His Val Arg Glu 250 Tyr Trp Xaa Asn Asp 265 Asn Phe Asn His Ser 280 Ala Ala Ser Thr Gln 295 Xaa Thr Val Val Ser 310 Asn His Asp Thr GlnGln Phe 240 Met Xaa Leu Met Ala 320 Glu325 Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys 340 Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln 355 360 Thr Lys Gly Asp Xaa Gln Arg Glu 370 375 Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys 385 390 Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile 405 Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu 420 Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val 435 440 Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg 450 455 Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val 465 470 Val Gln Arg <210>12 <211>25 <212>DNA <213> 引物32330 Pro Leu Ala Tyr Ala 345 Val Phe Tyr Gly Asp 365 Ile Pro Ala Leu Lys 380 Gln Tyr Ala Xaa Gly 395 Val Gly Trp Thr Arg 410 Ala Ala Leu Ile Thr 425 Gly Arg Gln Asn Ala 445 Ser Glu Pro Val Val 460 Asn Gly Gly Ser Val 475335 Phe Ile Leu 350 Met Tyr Gly His Lys Ile Ala Gln His 400 Glu Gly Asp 415 Asp Gly Pro 430 Gly Glu Thr Ile Asn Ser Ser Ile Tyr 480101962633 A CN 101962634
说明书2531/31 页<400>12 ccatgggcaa atcttaatgg gacgc <210>13 <211>34 <212>DNA <213> 引物 <400>13 gaattcctat ctttgaacat aaattgaaac cgac <210>14 <211>34 <212>DNA <213> 引物 <400>14 gaattcttat ctttgaacat aaattgaaac cgac3434