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微生物感染的治疗
    前言
     本发明涉及改进的微生物抗原疫苗、 药物组合物、 免疫原性组合物和抗体及其在 治疗微生物感染， 特别是细菌来源的， 包括葡萄球菌 (Staphylococcal) 来源的微生物感染 中的用途。
     多重耐药性 (MDR) 是革兰氏阳性细菌尤其是医院中的日益严重的问题。抗生素和 其它治疗细菌感染的试剂的广泛使用已经引起细菌迅速产生针对所述试剂的抗性， 很多细 菌具有多重耐药性。因此， 目前需要提供改进的处理这样的耐药性感染的治疗。
     葡萄球菌是球形的革兰氏阳性细菌， 其通常按照葡萄样不规则成簇排列。有一些 是人类皮肤和粘膜的正常菌丛 (flora) 的成员， 其它的则引起化脓、 脓肿形成、 多种化脓性 感染， 甚至是致命的败血病。 致病性葡萄球菌通常引发溶血、 使血浆凝固并产生多种细胞外 酶类和毒素。
     葡萄球菌属中有至少 30 个种。具有临床重要性的三个主要种是金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、 表皮葡萄球菌 (Staphylococcus epidermidis) 和腐生葡萄球 菌 (Staphylococcus saprophyticus)。金黄色葡萄球菌是凝固酶阳性的， 这将其与其它的 种区分开。金黄色葡萄球菌是对于人类的主要病原体。几乎每个人在其一生中都具有一 些类型的金黄色葡萄球菌感染， 从食物中毒的严重性或轻微皮肤感染到严重的威胁生命的 感染。凝固酶阴性的葡萄球菌是正常的人类菌丛， 其有时引起感染， 通常与移植装置相关， 特别是在非常年幼的、 年老的和免疫缺陷的患者中。大约 75％的由凝固酶阴性的葡萄球 菌引起的感染都是由表皮葡萄球菌引起的。由沃氏葡萄球菌 (Staphylococcus warneri)、 人葡萄球菌 (Staphylococcus hominis) 和其它种引起的感染较不常见。腐生葡萄球菌 是年轻妇女中尿道感染的相对常见的诱因。葡萄球菌产生过氧化氢酶， 这将其与链球菌 (streptococci) 区别开来。路邓葡萄球菌 (S.lugdunensis) 也是临床相关的， 其存在于大 约 5-10％的感染性心内膜炎的病例中。
     在关节空间内， 金黄色葡萄球菌在主要成分为胶原的关节软骨内的定殖似乎是促 成脓毒性关节炎产生的重要因素。造血性获得的细菌性关节炎仍然是严重的医学问题。这 种迅速进展和高度破坏性的关节病难以根除。通常而言， 不产生严重的关节损伤的话， 有 50％以下的感染患者难以恢复。 金黄色葡萄球菌是从具有造血性和继发性骨髓炎的成年患 者中分离而来的主要病原体。
     在住院患者中， 葡萄球菌例如金黄色葡萄球菌是主要的感染诱因。伤口或留置的 医疗器械的最初局部感染能够导致更严重的侵入性感染例如败血病、 骨髓炎、 乳腺炎和心 内膜炎。在与医疗器械有关的感染中， 在移植之后较短时间内塑料和金属表面被宿主血浆 和基质蛋白例如纤维蛋白原和纤连蛋白包被。 金黄色葡萄球菌和其它葡萄球菌粘附到这些 蛋白上的这种能力对于感染的起始是必不可少的。 血管移植物、 静脉内导管、 动脉心瓣膜和 心脏辅助装置是血栓形成性的， 易于细菌的群集。一般而言， 在葡萄球菌中， 金黄色葡萄球 菌是这些感染中最具破坏性的病原体。
     在世界范围内的医院中已经观察到了对目前可用的治疗感染的多数抗生素呈现
     抗性的金黄色葡萄球菌分离体的显著增加。抵抗金黄色葡萄球菌的青霉素的开发是感染 控制和治疗中的一大进步。不幸的是， 青霉素抗性的生物迅速出现， 迫切需要新的抗生 素。随着每种新的抗生素的引进， 金黄色葡萄球菌能够对抗 β- 内酰胺酶——改变的青霉 素结合蛋白， 以及允许细菌存在的突变的细胞膜蛋白。因此， 出现了甲氧苯青霉素抗性的 金黄色葡萄球菌 (MRSA) 和多重耐药的生物并且在全世界的医院和疗养院留下了主要足迹 (Chambers， H.F.， Clin Microbiol Rev， 1： 173， 1988 ； 和 Mulligan， M.E. 等人， AmJ Med， 94 ： 313， 1993)。 目前， 引起医院中的感染的葡萄球菌菌株中几乎有一半对于除了万古霉素以外 的所有抗生素都是抗性的， 似乎万古霉素变得无效也只是时间的问题。
     因此， 迫切且日益需要用于治疗葡萄球菌例如金黄色葡萄球菌感染的治疗剂， 所 述治疗剂有效抵抗那些抗生素抗性的细菌菌株。
     在革兰氏阳性病原体例如葡萄球菌、 链球菌和肠球菌中， 被称为粘附素 (adhesin) 的蛋白通过例如促进群集、 附着至血液凝块和使组织受损而介导这样的感染。这些特异性 微生物表面粘附素被称为 MSCRAMM( 微生物表面成分识别性粘附基质分子 )(Patti， J. 等 人， Ann Rev Microbiol， 48 ： 585-617， 1994 ； Patti， J.and Hook， M.， Cur Opin Cell Biol.， 6： 752-758， 1994)。MSCRAMM 特异性识别并结合至细胞外基质 (ECM) 成分， 例如纤连蛋白、 纤维蛋白原、 胶原和弹性蛋白。在很多革兰氏阳性病原体中发现了这些 MSCRAMM， 其氨基酸 序列是相关的， 它们具有相似的模块 (modular) 设计和共同的结合结构域组构。 细菌细胞表面上的 MSCRAMM 和宿主组织内的配体以锁钥模式相互作用， 从而导致 细菌粘附至宿主。细菌生存通常需要粘附， 其帮助细菌规避宿主的防御机制和抗生素的挑 战。 一旦细菌成功粘附并群集在宿主组织中， 其生理即被显著改变， 并且分泌破坏性成分例 如毒素和酶。此外， 粘附细菌通常产生生物膜并迅速对多数抗生素的杀灭效应产生抗性。
     细菌能够表达识别多种基质蛋白的 MSCRAMM。MSCRAMM 中的配体结合位点似乎是 由氨基酸序列的相对较短的连续区段 ( 基序 ) 决定的。因为在几种不同的细菌物种中可 以发现相似的基序， 所以这些功能性基序似乎会进行种间转移 (Patti and Hook， Cur Opin Cell Biol， 6： 752-758， 1994)。另外， 有时单一的 MSCRAMM 能够结合数个 ECM 配体。
     MSCRAMM 能够通过与包括纤维蛋白原 (Fg) 和 / 或纤连蛋白 (Fn) 等的蛋白结合而 介导感染。纤维蛋白原和纤连蛋白是在血浆中发现的蛋白， 其在止血和凝固中发挥重要作 用。
     纤维蛋白原由 6 条多肽链组成 ： 2 条 Aα、 2 条 Bβ 和 2 条 γ- 链。γ- 链的 C 末端 部分在生物学上是重要的， 并且在血小板吸附和聚集中与血小板整联蛋白相互作用。该区 域也是金黄色葡萄球菌靶定的， 导致纤维蛋白原依赖性的细胞聚集和组织吸附。
     金黄色葡萄球菌具有数个表面表达的蛋白， 其刺激血小板激活和聚集。金黄色葡 萄球菌的 MSCRAMM 蛋白包括但不限于下列蛋白 ：
     - 纤维蛋白原结合蛋白聚集因子 A(ClfA) ；
     - 纤维蛋白原结合蛋白聚集因子 B(ClfB) ；
     - 纤连蛋白 - 纤维蛋白原结合蛋白 A(FnBPA) ；
     - 纤连蛋白 - 纤维蛋白原结合蛋白 B(FnBPB) ； 和
     - 金黄色葡萄球菌表面蛋白 SasA、 SasG、 SasK 等。
     下表 1 列举了各种金黄色葡萄球菌细胞壁锚定表面蛋白的选集
     表1
     aa， 以氨基酸表示的蛋白长度。
     蛋白识别和结合的分子成分。 c
     分选酶识别的且存在于 C 末端细胞壁分选信号中的共有基序。 d
     以细胞壁表面蛋白为底物的分选酶。 e
     TNFR ： 肿瘤坏死因子受体。 f
     也与脱落的上皮细胞中的蛋白结合。促进对杀菌脂质和乳铁蛋白的抗性。 g
     也与脱落的鼻上皮细胞结合。参与生物膜的形成。
     其它的葡萄球菌表达类似于以上所列出的聚集因子或结合蛋白的表面表达的蛋 白 (MSCRAMM)。这些包括但不限于 ：
     - 来自表皮葡萄球菌的 SdrF、 SdrG 和 SdrH， 其中已经表明 SdrG/F 与纤维蛋白原和 胶原结合。
     - 来自路邓葡萄球菌的 Fbl 是与纤维蛋白原结合的蛋白。Fbl 是 Sdr 家族的成员， Sdr 家族是一组含有特征性丝氨酸 - 天冬氨酸重复区的葡萄球菌细胞表面蛋白。已经测绘 出 Fbl 的纤维蛋白原结合结构域为 313 个氨基酸， 并且与来自金黄色葡萄球菌的聚集因子 A(ClfA) 的相应区域具有 62％的同一性。
     其它的与配体结合的蛋白 / 粘附素包括 Isd 蛋白 ( 离子调控的表面决定子 )， 虽然 它们全部都不是 MSCRAMM 本身 ( 例如 IsdB 和 IsdH)， 但是它们促进细菌粘附至细胞外基质 成分， 在本文中将它们称为 “MSCRAMM 样蛋白” 。已经知道 IsdA 促进向鳞状细胞的粘附， 并 且对于纤维蛋白原和纤连蛋白的亲和性弱， 所以在技术上将其定义为 MSCRAMM。
     聚集因子 A(ClfA) 是第一个被鉴定出来的与纤维蛋白原的 γ- 链结合的金黄色葡 萄球菌粘附素。 随后认识到纤连蛋白 - 纤维蛋白原结合蛋白 A(FnBPA) 和纤连蛋白 - 纤维蛋 白原结合蛋白 B(FnBPB) 是与 Fg 的 γ- 链中相同的 C 末端肽区段结合的双功能蛋白。ClfA 和 FnBP 具有在革兰氏阳性菌中表达的所有细胞壁锚定蛋白包括 ClfB 共有的结构特征。
     例如， 聚集因子 A(ClfA) 是金黄色葡萄球菌的位于表面上的蛋白。ClfA 是金黄色 葡萄球菌的重要毒力因子。 其促成脓毒性关节炎和心内膜炎的病理发生。 ClfA 是具有相似 的结构 / 模块组构的表面结合蛋白家族 ( 包括但不限于 ClfB、 SdrD、 SdrE 等 ) 的原始型。
     ClfA 含有 520 个氨基酸的 N 末端 A 结构域 ( 纤维蛋白原结合区域 )， 其包括三个 单独折叠的亚结构域 N1、 N2 和 N3。A 结构域后面是丝氨酸 - 天冬氨酸二肽重复区域以及 细胞壁和膜跨越区域， 其含有用于分选酶促进的向细胞壁锚定的 LPDTG 基序。ClfA 实际上
     ba存在于所有的金黄色葡萄球菌菌株中 (Peacock SJ， Moore CE， Justice A， Kantzanou M， Story L， Mackie K， O′ NeillG， Day NPJ(2002)Virulent combinations of adhesin and toxin genes in natural populations of Staphylococcus aureus.Infect Immun 70 ： 4987-4996)。 其与纤维蛋白原的 γ- 链的 C 末端结合， 因此能够诱导纤维蛋白原溶液中的细 菌聚集 (McDevitt D， Nanavaty T， House-Pompeo K， Bell E， Turner N， McEntire L， Foster T， M(1997)Characterization of the interaction between the Staphylococcus aureus clumping factor(ClfA)and fibrinogen.Eur J Biochem247 ： 416-424 ； 和 McDevitt D， Francois P， Vaudaux P， Foster TJ(1994)Molecular characterization of the clumping factor(fibrinogen receptor)ofStaphylococcus aureus.Mol Microbiol 11 ： 237-248)。
     对 ClfA 和相关的纤维蛋白原结合蛋白 SdrG 和 ClfB 进行的三维结构分析已经 揭示 ： 在所有这些相关蛋白中， 配体结合 A 结构域均由三个亚结构域 N1、 N2 和 N3 组成， 其中对应于区域 N2-N3 的残基 221-559 是最小的保留与纤维蛋白原结合能力的截短物 (truncate)。已经发现氨基酸残基 532 至 538 对应于 ClfA 的锁闭肽 (latching peptide) 区域。每个亚结构域包含 9 个 β 链， 其构成新的 IgG 型折叠。这些蛋白中的纤维蛋白原 γ 链肽结合位点位于 N2 和 N3 之间的节点的疏水槽。已经发现这些蛋白的三维结构存在显著 的结构相似性， 这是由于存在一个或多个相关的氨基酸序列、 相似的模块设计和共同的结 合结构域组构。
     SdrC、 SdrD、 SdrE、 FnBPA-A( 所有 7 个同型 ) 和 FnBPB-B( 所有 7 个同型 ) 具有相 似的模块组构， 因此使用 PHYRE 分子模型， 预期这些蛋白将具有相同的三维结构。
     IsdA 和 IsdB 不具有与 Clf 或 Sdr 蛋白相同类型的结构。 它们具有新的被称为 NEAT 的基序， 该基序参与配体结合。 但是， NEAT 基序由 β 链夹心结构组成 ( 由 2 个 5 条链的反平 行 β 片层组成的 β 夹心折叠 ) 并且是 Ig 超家族成员 (Pilpa 等人 “Solution Structure of the NEAT(NEAr Transported)Domain from IsdH/HarA ： the Human Hemoglobin Receptor in Staplococcus aureus” J.Mol.Biol.(2006)360 ： 435-447)， 从这个意义上来讲， NEAT 基 序与 Clf 或 Sdr 的三维结构是相似的。已经解决了 IsdH 的 NEAT 基序的三维结构并预测了 环 1b-2 中的残基。
     金 黄 色 葡 萄 球 菌 上 ClfA 的 表 达 阻 碍 巨 噬 细 胞 和 嗜 中 性 粒 细 胞 的 吞 噬 作 用 (Palmqvist N ，Patti JM ，Tarkowski A ，Josefsson E(2004)Expression of staphylococcal clumping factor A impedes macrophage phagocytosis.Microb Infect 6： 188-195 ； 和 Higgins J， Loughman A， van Kessel KPM， van Strijp JAG， Foster TJ(2006) Clumping factor A of Staphylococcus aureus inhibits phagocytosis by human polymorphonuclear leukocytes.FEMS Microbiol Lett258 ： 290-296)。在嗜中性粒细胞 中， 这是由纤维蛋白原依赖性机制和纤维蛋白原非依赖性机制共同造成的。相反， 细菌表 达的 ClfA 通过与 GPIIb/IIIa 发生相互作用而激活血小板， 从而导致聚集。当纤维蛋白 原存在时， 这个作用进行得最为有效 ； 但是还存在血小板激活的纤维蛋白原非依赖性途径 (Loughman A， Fitzgerald JR， Brennan MP， Higgins J， Downer R， Cox D， FosterTJ(2005) Roles of fibrinogen， immunoglobulin and complement in platelet activation promoted by Staphylococcus aureus clumping factor A.Mol Microbiol 57 ： 804-818 ；和 O ′ Brien L， Kerrigan SW， Kaw G.， Hogan M.， PenadésJ.， Litt D.， Fitzgerald D.J.， Foster T.J.&Cox D.(2002)Multiple mechanisms for the activation of human platelet aggregation by Staphylococcus aureus ： roles for the clumping factors ClfA and ClfB， the serine-aspartate repeat protein SdrE and protein A.Mol Microbiol 44， 1033-1044)。
     ClfA 是 诱 导 小 鼠 中 的 脓 毒 性 关 节 炎 的 毒 力 因 子 (Josefsson E.， Hartford O.， O ′ Brien L， Patti JM， Foster T(2001)Protection against experimental Staphylococcus aureus arthritis by vaccination with clumping factor A， a novel virulence determinant.J Infect Dis 184 ： 1572-1580)。此外， ClfA 连同另一种纤维蛋 白原结合蛋白 ClfB 的消除引起在感染早期抵抗全身性炎症的保护 (Palmqvist N， Foster T， Fitzgerald R， Josefsson E， Tarkowski A(2005)Fibronectin-binding proteins and fibrinogen-binding clumping factors play distinct roles in staphylococcal arthritis and systemic inflammation.J Inf Dis191 ： 791-798)。
     已经分离并且表征了金黄色葡萄球菌的纤维蛋白原结合蛋白 ClfA， 其为例如美国 专利号 6,008,341 和 6,177,084 的主题。 ClfA 和 ClfB 具有相同的结构 ( 三维 ) 组构和大约 27％的氨基酸同一性。FnBPA 与 ClfA 具有大约 25％的氨基酸同一性。
     目前尚无基于 MSCRAMM 的疫苗被批准并上市。 是一种供体选择的葡 萄球菌静脉内人类免疫球蛋白 (IGIV)， 其靶向 ClfA 和 SdrG， 由于在 III 期临床试验表现较 差， 所以从临床试验被撤销。目前正在重新评估以确定它是不是葡萄球菌感染的可行性治 疗。
     WO 2005/116064 涉及 FnBPA， 其为金黄色葡萄球菌的多功能结合蛋白。FnBPA 的 N 末端 A 结构域类似于 ClFA， 已经发现其与纤维蛋白原结合。但是， FnBPA 的 C 末端 BCD 结构 域与纤连蛋白结合， 因此， FnBPA 是双功能的 MSCRAMM。
     WO 2005/116064 基于以下发现 ： 在存在转谷氨酰胺酶的情况下， 在细菌粘附素 FnBPA 和宿主蛋白纤连蛋白之间形成共价连接， 从而使得结合更加强烈并基本上是不可逆 的。纤维蛋白原是血液中的主要成分 ( ～ 3mg/ml)， 在血液中其作为凝固级联的最终靶标。 纤连蛋白含量较低， ～ 0.3mg/ml 或者对于每 10-15 个纤维蛋白原有一个 Fn 分子。纤维蛋 白原和纤连蛋白被认为与血液无关， 在血液中它们独立地循环。
     重要的是， WO 2005/116064 特别涉及因子 XIIIa 催化的共价交联。 WO2005/116064 分离了重组 FnBPA 中的多个突变体， 其中具有带正电荷侧链的残基 ( 即转谷氨酰胺酶底物 ) 被改变。此外， WO 2005/116064 涉及具有改变的共价纤连蛋白结合特性而非只有纤维蛋白 原结合特性的突变体。 此外， 该文献没有通过实验证明突变蛋白与配体的结合是否减少， 并 且没有提供任何支持性的免疫原性数据。
     因此， 鉴于多重耐药性在革兰氏阳性菌中的流行以及对这些多重耐药性细菌的成 功治疗和疫苗的缺乏， 任何能够不使用抗生素来处理这样的细菌感染的替代性治疗将具有 重要意义。
     此外， 对于任何已知的治疗或疫苗的效力的任何改进将具有重要意义， 特别是在 临床环境中。
     因此， 本发明旨在提供治疗这样的细菌感染的替代性和改进的治疗法。发明内容 根据本发明的第一个一般性方面， 提供了对其宿主配体的结合减少的重组葡萄球 菌 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白或其片段， 用于治疗。
     根据优选的实施方式， 提供了不具有结合纤维蛋白原的能力的重组葡萄球菌纤维 蛋白原结合性 MSCRAMM 蛋白或其包含至少一部分纤维蛋白原结合区域的片段， 用于治疗。
     根据本发明的第二方面， 提供了在个体中诱导免疫反应的方法和 / 或治疗患有微 生物感染的患者的方法， 其包括给予所述个体对其宿主配体的结合减少的重组葡萄球菌 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白或其片段， 或包含所述重组葡萄球菌 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白 或其片段的疫苗。
     根据本发明的第三方面， 提供了包含对其宿主配体的结合减少的重组葡萄球菌 MSCRAMM 蛋白或其片段的疫苗。
     根据本发明的第四方面， 提供了针对对其宿主配体的结合减少的重组葡萄球菌 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白或其片段而产生的抗体， 优选为超免疫血清的形式。
     根据本发明的第五方面， 提供了免疫原性药物组合物， 其包含对其宿主配体的结 合减少的重组葡萄球菌 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白或其片段以及药学上可接受的佐剂。
     详细描述
     在本说明书中， 术语 “粘附素” 、 “MSCRAMM” 和 “细胞壁锚定蛋白” 将被理解为可以 相互替换并且涵盖所有的源自微生物的配体结合蛋白。理想地， 这些蛋白与纤维蛋白原、 血红素或血红蛋白、 触珠蛋白 - 血红蛋白、 氯化血红素、 胶原和其它这样的配体结合。术语 “MSCRAMM 样” 蛋白旨在涵盖与这样的 MSCRAMM 蛋白具有相关的氨基酸序列、 相似的模块设 计和 / 或共同 / 相似的结合结构域组构 (organization) 的蛋白或粘附素， 例如 Isd 蛋白。 理想地， MSCRAMM 样蛋白具有相似的结合结构域组构 / 模块设计。另外， MSCRAMM 样蛋白与 MSCRAMM 蛋白可以具有至少 50％、 优选 60％、 优选 75％、 更优选 85％、 还更优选 95％， 又更 优选 99％或更高的氨基酸序列同一性。
     还应该理解， 本说明书所称的任何百分比同一性或同源性是使用可获得的常规方 法在序列的整个 / 完整长度上确定的。
     术语 “微生物 (micro-organism)” 、 “微生物 (microbe)” 、 “微生物的 (microbial)” 或类似的术语包括但不限于下列生物体， 包括 ： 细菌、 真菌、 病毒、 酵母和 / 或霉菌。
     术语 “免疫有效数量” 包括能够刺激 B 细胞和 / 或 T 细胞反应的那些量。
     根据本发明的第一个一般性方面， 提供了对其宿主配体的结合减少的重组葡萄球 菌 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白， 或其片段， 其包含至少一部分配体结合区域， 用于治疗。这 样的重组蛋白可用于治疗微生物感染， 例如治疗脓毒症、 脓毒性关节炎和 / 或心内膜炎或 其它类似的病状或疾病状态。 这样的微生物感染理想地是由葡萄球菌或其它类似的微生物 引起的。
     根据本发明的这个方面的一个特定实施方式， 所述重组 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋 白或其片段具有减少的或不具备与其宿主配体非共价结合的能力。
     因此， 应该理解， 重组葡萄球菌 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白或其片段可能具有减少
     的与其宿主配体的结合或者与其宿主配体的结合被阻止。
     根据本发明推论 ： MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白通过坞、 锁和锁闭 (Dock， Lock and Latching(DLL)) 与其配体结合过程中发生的非共价结合可能被减少或阻止。已经证明 MSCRAMM 与其配体结合的第一个步骤涉及通过 DLL 模型进行的非共价相互作用。这些是 MSCRAMM 与配体的首要的非共价相互作用。MSCRAMM- 配体结合的最后阶段涉及共价相互作 用。在这个特定实施方式中， 由于改变的坞、 锁和锁闭， 重组 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白或 其片段具有减少的或不具备与其宿主配体非共价结合的能力。一个或多个坞、 锁或锁闭步 骤可以被改变。
     DLL 模型是从 SdrG 与其配体的复合物的三维结构中阐明的。现在已经表明 ClfA 通过 DLL 机制的微小变化发挥作用 (Ganech 等人 (2008)“Astructural model of the Staphylococcus aureus Clfa-fibrinogen interaction opens new avenues for the design of anti-staphylococcal therapeutics” .PloS Pathog4(11) ； e1000226)。DLL 模 型特别涉及参与配体结合的非共价相互作用。对于所有其它的相似结构类型 ( 无论是按照 氨基酸相似性 / 同源性还是按照结构组构同源性 ) 的蛋白均推断具有 DLL 模型， 包括但不 限于 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白。 特别在涉及 MSCRAMM ClfA/ClfB 时， 发现最小配体结合结构域包含区域 A 的亚区 域 N1 至 N3， 特别是包含变体 Dev-IgG Ig 折叠的亚区域 N2 和 N3。变体 Dev-IgG Ig 折叠是 免疫球蛋白基序的新变体， 其也被称为 DE 变体。据推论， 在 ClfA/B 的两个 DEv-IgG 结构域 之间形成的疏水袋是纤维蛋白原 γ- 链的配体结合位点。实质上， 配体与分隔 N2 和 N3 的 疏水槽结合。特别地， 在配体结合过程中， 配体的未折叠肽成分插入位于 N2 和 N3 亚结构域 之间的槽。亚结构域 N3 的 C 末端的锁闭肽发生构象变化并插入亚结构域 N2 的两条 B 链 之间， 因此， 将配体锁定在适当位置。确实， 聚集因子中的残基 Tyr256、 Pro336、 Tyr338 和 408 411 Lys389( 它们被认为是与纤维蛋白原的 γ 链末端残基 AGDV 接触 ) 的突变取代使得该 蛋白丧失或显著降低其对纤维蛋白原的亲和力。下文将详述该具体实施方式的更多细节。
     虽然这些教导涉及聚集因子， 尤其是 ClfA， 但是它们同样适用于其它具有类似模 块结合结构域组构和以相似方式与配体结合的 MSCRAMM 和 / 或 MSCRAMM 样蛋白。
     因此， 为了提供对其宿主配体的结合减少的重组葡萄球菌 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样 蛋白或其片段， 可以改变全长蛋白、 配体结合结构域、 最小配体结合结构域或其片段以减少 或阻止与其宿主配体的结合。理想地， 对于 ClfA/ClfB 或其它类似 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样 蛋白， 可以改变区域 A 的亚区域 N2 和 N3( 其理想地包含变体 Dev-IgG Ig 折叠 ) 以阻止或 减少与其宿主配体的结合。这样的改变被设计为阻止配体与疏水槽的结合， 所述疏水槽分 隔 DLL 所需的最小配体结合结构域。
     可以使用全长蛋白、 配体结合结构域、 最小配体结合结构域或其片段， 通过氨基酸 取代或删除， 使配体结合结构域在氨基酸水平发生这样的改变。 应该理解， 还可以使用与配 体结合蛋白具有足够高的同源性的蛋白或其片段。本文定义的高同源性是指， 在全长 DNA 序列上至少 50％、 优选 60％、 优选 70％、 优选 80％、 更优选 90％、 还更优选 95％、 又更优选 95％至 99％、 又更优选 99％或更多的核苷酸的匹配， 或者， 当用于氨基酸序列时是指， 氨基 酸序列虽不相同但产生具有相同功能性和活性的蛋白。应该理解， 这些关于高同源性的论 述也适用于蛋白质的三维结构， 即模块结合结构域组构。
     应该理解， 可以使用完整的配体结合蛋白、 配体结合结构域、 最小配体结合结构域 或其片段。
     使用配体结合蛋白的截短的蛋白例如配体结合结构域、 最小配体结合结构域或使 用其片段对于操作简易性以及克服诸如不想要的蛋白切割等其它问题是有利的。例如， 存 在于最小配体结合结构域中的锁闭肽可以被删除 / 除去或改变。例如， 锁闭肽在 ClfA 中对 应于区域 A 的氨基酸 532 至 538 ； 在 ClfB 中对应于区域 A 的氨基酸 530 至 540(Walsh 等人 (2004)JBC 279(49) ： 50691-50699)。可以将这些残基改变、 取代或除去 / 删除以阻止配体 通过 DLL 与 MSCRAMM 结合。按照这种方式， MSCRAMM 与其配体的 DLL“锁闭” 被阻止。这种 “锁闭” 通过非共价相互作用的方式发生。在一个实施方式中， 沿着剩余区域 A 的 C 末端氨 基酸残基将全部锁闭肽除掉。根据另一个实施方式， 仅有锁闭肽区域被除掉。根据另外一 个实施方式， 锁闭肽区域发生氨基酸取代以减少或阻止配体结合 / 锁闭。这些论述适用于 所有的通过 DLL 或类似模型与配体结合的 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白。
     通过以这种方式改变 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白， 可以提供不具有与其配体结合 能力的配体结合蛋白， 在免疫之后其会刺激产生比野生型蛋白更大的免疫反应。 有利地， 这 减少了全身性炎症， 从而降低了微生物毒力。 因此， 这种缺少与其配体结合能力的改变的配 体结合性 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白可有利地用于微生物感染的治疗。因此， 这些发现呈 现了抵抗细菌感染的新的且有价值的疫苗 / 免疫治疗剂， 与源自野生型蛋白的疫苗或免疫 治疗剂相比， 其提供了更好的效果。
     根据本发明的一个实施方式， 所述配体是血红素、 血红蛋白或纤维蛋白原。 可以考 虑其它配体， 例如触珠蛋白 - 血红蛋白、 血红蛋白、 氯化血红素、 胶原等。
     根据本发明的另一个实施方式， 重组 MSCRAMM 蛋白选自 ： 纤维蛋白原结合蛋白 ； 或
     SdrD、 SdrE、 SdrG 和 / 或 SdrF。
     上文已经详述了纤维蛋白原结合蛋白， 包括但不限于 ClfA、 ClfB、 FnBPA、 FnBPB、 FbI、 IsdA 等。已经表明 SdrG/F 与胶原结合。其它的 MSCRAMM 包括 SasA、 SasG、 SasK 和 SdrH。
     重组 MSCRAMM 样蛋白可以选自 ： IsdA、 IsdB 和 / 或 IsdH。
     基于来自纤维蛋白原结合性 MSCRAMM ClfA 的发现， 可以在例如包括 IsdH 和 IsdB 的 Isd 蛋白的 NEAT(NEAr 转运子 ) 基序中产生相似的非配体结合性突变体。 如上文所详述， IsdA 和 IsdB 不具有与 Clf 或 Sdr 蛋白相同类型的结构。但是， Isd 中的 NEAT 基序直接参 与配体结合 ( 触珠蛋白 - 血红蛋白、 血红蛋白、 氯化血红素 )， 因此， NEAT 基序中的改变将以 改变 Clf 或 Sdr 的 DLL 或 DLL 样宿主配体相互作用的相同方式阻止宿主配体相互作用。很 多含有 NEAT 结构域的蛋白参与血红素 (haem) 的结合， 包括金黄色葡萄球菌中的 IsdA。据 推论 ： IsdA 与血红素结合的性质包含于 NEAT 结构域中。apo-IsdA NEAT 结构域和与血红素 的复合物中的晶体结构已经揭示出具有大的疏水性血红素结合袋的网格蛋白适配子样 β 夹心折叠。IsdB 具有两个 NEAT 基序 ； IsdA 具有一个 NEAT 基序。可以通过改变预测为配体 结合的残基来分离 Isd 蛋白的非配体结合性突变体， 例如通过改变 β 链和 / 或疏水袋之间 的残基来进行。另外， 可以改变 NEAT 基序来影响非共价的宿主 - 配体相互作用。
     根据本发明的该方面的另一个实施方式， 提供了在个体中诱导免疫反应和 / 或治 疗患有微生物感染的患者的方法， 其包括给予所述个体对其宿主配体的结合减少的重组葡萄球菌 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白或其片段， 或包含对其宿主配体的结合减少的重组葡萄 球菌 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白或其片段的疫苗。
     根据本发明的该方面的另一个实施方式， 提供了包含对其宿主配体的结合减少的 重组葡萄球菌 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白或其片段的疫苗。
     根据本发明的该方面的另一个实施方式， 提供了针对对其宿主配体的结合减少的 重组葡萄球菌 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白或其片段而产生的抗体， 优选为超免疫血清的形 式。
     根据本发明的该方面的另一个实施方式， 提供了免疫原性药物组合物， 其包含对 其宿主配体的结合减少的重组葡萄球菌 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白或其片段。
     根据本发明的优选实施方式， 提供了不具有与纤维蛋白原结合的能力的重组葡萄 球菌纤维蛋白原结合蛋白， 或其包含至少一部分纤维蛋白原结合区域的片段， 用于治疗。
     应该理解， 重组葡萄球菌纤维蛋白原结合蛋白或其片段可用于治疗微生物感染， 优选为葡萄球菌感染， 例如治疗脓毒症、 脓毒性关节炎和 / 或心内膜炎或其它类似的病状 或疾病状态。
     蛋白的纤维蛋白原结合区域被改变从而不再与纤维蛋白原结合。如上所述， 该改 变可以发生在核苷酸或氨基酸水平。应该理解， 还可以使用与纤维蛋白原结合蛋白具有足 够高的同源性的蛋白或其片段。 本文定义的高同源性是指， 在全长 DNA 序列上至少 50％、 优 选 60％、 优选 70％、 优选 80％、 更优选 90％、 还更优选 95％、 又更优选 95％至 99％、 又更优 选 99％的核苷酸的匹配， 或者， 当关于氨基酸序列使用时是指， 氨基酸序列虽不相同但产生 具有相同功能性和活性的蛋白。应该理解， 这些关于高同源性的论述也可以涉及蛋白质的 三维结构。
     应该理解， 可以使用完整的纤维蛋白原结合蛋白、 纤维蛋白原结合区域、 最小纤维 蛋白原结合区域或其片段。 使用截短的蛋白或其片段对于操作简易性以及克服诸如不想要 的蛋白切割等其它问题是有利的。这将在下文详述。
     理想地， 这样的片段应该包含 MSCRAMM 的至少一部分纤维蛋白原结合区域。使用 截短的蛋白或其片段 ( 包含例如仅有配体 - 纤维蛋白原结合区域的一个或多个亚结构域 ) 的好处在于， 能够在不发生降解的情况下以高产率纯化蛋白。ClfA 蛋白的纤维蛋白原结合 区域， 或者称为 A 区域， 包含 3 个亚区域 ： N1、 N2 和 N3。因此， 免疫原性片段可以包含 ClfA A 区域的亚区域 N1、 N2 和 / 或 N3 或其片段。因此， 例如， 涉及到 ClfA 时， 片段可以包含区 域 A 中的一个或多个亚结构域， N1、 N2 或 N3。理想地， 可以使用 N2 和 N3， 因为该截短物较 不容易发生蛋白酶解 ( 已经报道在 ClfA 和 ClfB 中的 N1 和 N2 之间存在蛋白酶切割位点 ) 并且可以在大肠杆菌中以较高水平表达。 N2 和 N3 是 Clf 蛋白的最小纤维蛋白原结合区域。
     应该理解， 虽然以下讨论涉及纤维蛋白原结合蛋白 ClfA， 但是这些论述同样适用 于其它的 MSCRAMM、 MSCRAMM 样蛋白， 特别是其它的在氨基酸或蛋白质结构水平上与 ClfA 在 结构上相似的纤维蛋白原结合蛋白， 例如 ClfB、 FbI 和 SdrF/G( 其也与胶原结合 )。此外， 这些教导适用于 FnBPA 和 FnBPB。因此， 虽然以下论述涉及纤维蛋白原结合蛋白， 但是它们 也同样适用于其它的与纤维蛋白原之外的配体结合的 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白。
     我们出乎意料地发现 ： 在免疫之后， 这种不具有与纤维蛋白原结合能力的改变的 纤维蛋白原结合蛋白、 截短物或其片段刺激产生比那些以正常方式结合至纤维蛋白原的野生型蛋白更大的免疫反应。 有利地， 当由金黄色葡萄球菌表达时， 这种改变的纤维蛋白原结 合蛋白不引起全身性炎症。因此， 微生物毒力降低。因此， 这种缺乏与纤维蛋白原结合能力 的改变的蛋白能够有利地用于治疗微生物感染。 与预期相反， 我们还发现， 改变的纤维蛋白 原结合蛋白的保护效应比野生型蛋白大。 我们发现包含这样的改变的重组蛋白的药物组合 物或疫苗比包含未经改变 ( 野生型 ) 的形式的相同重组蛋白 ( 例如 ClfA、 ClfB、 SdrG 等 ) 的药物组合物或疫苗更加有效。
     因此， 这些发现呈现了抵抗细菌感染的新的且有价值的疫苗 / 免疫治疗剂， 与同 样用作疫苗 / 免疫治疗剂的野生型蛋白相比， 其提供了更好的效果。
     应该理解， 改变的蛋白， 无论是 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样或纤维蛋白原或其它配体结 合， 可用于产生抗体， 包括单克隆、 多克隆、 嵌合、 人源化抗体或其片段， 以用于治疗这样的 微生物感染。然后可以提供包括这样的抗体例如超免疫血清的组合物， 这些组合物可用于 治疗感染了葡萄球菌感染的患者。
     因此， 蛋白或其活性片段可用于抑制葡萄球菌与细胞外基质 (ECM) 的结合并用于 预防 / 治疗患者中的葡萄球菌感染。
     此外， 蛋白或其活性片段以及针对所述蛋白的抗体可用于治疗来自葡萄球菌感染 的感染， 用于开发进行主动或被动疫苗接种的疫苗， 当作为药物组合物向伤口或医疗器械 施用时， 蛋白和抗体均可用作预防微生物感染的阻断剂。 例如， 这些蛋白或其片段可用于主 动疫苗， 针对这些蛋白的抗体可用于被动疫苗。 本文描述的这些疫苗和产品呈现出对于现有技术的显著改进， 现有技术教导了 MSCRAMM 进行免疫的一般性用途， 但是没有教导本文描述的出人意料的和改进的疫苗或产 品。
     蛋白质、 DNA 和抗体的制备在本领域是熟知的， 本文中将不再详细描述。在产生这 些分子的过程中理想地使用常规技术。 还应该理解本发明涵盖包含目标核酸或氨基酸序列 的核酸构建体、 包含这样的核酸构建体以表达目标蛋白的重组宿主细胞以及免疫原性组合 物。
     为了给药， 可以将蛋白组合物分散于无菌的等渗盐溶液或其它药学上可接受的佐 剂中。
     应该理解， 疫苗可以是 DNA 或蛋白质疫苗。
     可以通过注射 DNA、 蛋白质或抗体进行免疫接种。备选地， 可以给予包括并表达 DNA 的减毒的活的生物体。
     可以给予的 DNA、 蛋白质或抗体的量将取决于数个减轻要素， 包括， 对于启动子强 度、 蛋白表达和表达的基因的免疫原性的依赖性。对于每个新的应用可以改变这些因素以 获得想要的需要的免疫有效数量。
     根据本发明的另一个实施方式， 提供了在个体中诱导免疫反应和 / 或治疗患有微 生物感染的患者的方法， 其包括给予所述个体不具备与纤维蛋白原结合能力的重组葡萄球 菌纤维蛋白原结合蛋白或其至少包含纤维蛋白原结合区域的片段。
     根据本发明的另一个优选实施方式， 提供了一种疫苗， 其包含不具备与纤维蛋白 原结合能力的重组葡萄球菌纤维蛋白原结合蛋白或其含有至少一部分纤维蛋白原结合区 域的片段。
     根据本发明的另外一个优选实施方式， 提供了针对重组葡萄球菌纤维蛋白原结合 蛋白或其含有至少一部分纤维蛋白原结合区域的片段产生的抗体， 优选为超免疫血清的形 式， 所述重组葡萄球菌纤维蛋白原结合蛋白或其片段不具备与纤维蛋白原结合的能力。
     根据本发明的另外一个优选实施方式， 提供了一种免疫原性药物组合物， 其包含 不具备与纤维蛋白原结合能力的重组葡萄球菌纤维蛋白原结合蛋白或其含有至少一部分 纤维蛋白原结合区域的片段以及药学上可接受的佐剂。
     理想地， 重组葡萄球菌纤维蛋白原结合蛋白或其片段源自金黄色葡萄球菌、 表皮 葡萄球菌和 / 或路邓葡萄球菌。
     这些实施方式的纤维蛋白原结合蛋白可以选自下列 FbI、 SdrF 和 / 或 SdrG( 其也 与胶原结合 ) 的一种。 备选地， 纤维蛋白原结合蛋白可以选自下列一种 ： 纤维蛋白原结合蛋 白聚集因子 A(ClfA)、 纤维蛋白原结合蛋白聚集因子 B(ClfB)、 纤连蛋白 - 纤维蛋白原结合 蛋白 A(FnBPA)、 纤连蛋白 - 纤维蛋白原结合蛋白 B(FnBPB)。 IsdA 促进粘附， 并且对于纤维蛋 白原和纤连蛋白的亲和性较弱， 所以在技术上可以将其定义为纤维蛋白原结合性 MSCRAMM。
     应该理解， 这样的纤维蛋白原结合蛋白的纤维蛋白原结合区域内的核苷酸或氨基 酸取代或删除将产生不具备与纤维蛋白原结合能力的重组蛋白。 已经推论出 ClfA- 纤维蛋白原的结合是通过类似于 SdrG 的坞、 锁和锁闭 (DLL) 机 制发生的。上文详述了 DLL 模型。ClfA 的区域 A 负责蛋白 - 配体相互作用。如图 11 中所 示， 几个纤维蛋白原结合性 MSCRAMM 的模块结构是相似的， 都含有类似于 ClfA 的区域 A。
     纤维蛋白原 γ- 链肽结合位点位于 ClfA 的 N2 和 N3 之间的节点的疏水槽中。因 此， 以上提及的取代或删除被设计为改变 MSCRAMM 蛋白 - 配体相互作用并阻止 ClfA 与纤维 蛋白原的非共价结合。
     根据本发明的一个具体实施方式， 重组葡萄球菌纤维蛋白原结合蛋白是 ClfA 的 纤维蛋白原结合缺陷型突变体。在该实施方式中， ClfA 的纤维蛋白原结合区域 A 被任何方 式改变 ( 例如取代或删除突变 ) 从而其不再与纤维蛋白原结合。
     理想地， 纤维蛋白原结合蛋白是 ClfA， 但是， ClfA 具有与很多其它纤维蛋白原结 合蛋白相似的三维结构。因此， 应该理解， 这些关于 ClfA 的论述同样适用于其它 MSCRAMM 纤维蛋白原结合蛋白， 包括 ClfB、 FnBPA、 FnBPB、 FbI、 SdrG/F、 IsdA 等。所有这些蛋白都具 有相似的三维结构， 因此， 可以对纤维蛋白原结合区域进行相似的改变 / 突变以达到相同 的结果。
     ClfA 是 993 个氨基酸的蛋白， 其包含 520 个氨基酸的纤维蛋白原结合结构域 ( 从 氨基酸 40 至 559)。该纤维蛋白原结合结构域是包含亚区域 N1、 N2 和 N3 的 N 末端 A 结构 域。跨越 N1 至 N3 的从氨基酸 40 至氨基酸 559 的整个纤维蛋白原区域可用于本发明。备 选地， 可以使用 N1 至 N3 区域的截短物， 例如 221 至 559( 最小纤维蛋白原结合区域 )、 221 至 531( 不含锁闭肽和其后的残基的最小纤维蛋白原区域 ) 等。 理想地， 可以使用亚区域 N2 和 N3， 最小纤维蛋白原结合区域， 其对应于氨基酸残基 221 至 559。备选地， 可以使用这些 亚区域的片段。
     已经研究表明， ClfA 的涵盖了 N2 和 N3 区域的氨基酸残基 221 至 559 在与纤维蛋 白原结合的过程中发挥重要作用， 其为最小纤维蛋白原结合区域。我们还出乎意料地发现 该区域中的氨基酸残基突变产生可以被宿主免疫防御识别但是没有纤维蛋白原结合的表
     达蛋白， 因此， 降低了相关的毒力。ClfA 的这个区域 (339 个氨基酸的纤维蛋白原结合结构 域 ) 具有特异性的三维结构， 即所谓的 DE 变体 IgG 折叠， 其为最小 Fg 结合截短物， 如果被 改变的话 ( 通过取代或删除等 )， 能够提供改进的治疗。
     可以通过在核苷酸或氨基酸水平上进行取代、 添加或插入或删除来进行改变以导 致纤维蛋白原结合活性的丧失。理想地， 取代对蛋白或片段的三维结构 ( 例如， 所谓的 DE 变体 IgG 折叠 ) 造成负面影响， 所以它将不能再与纤维蛋白原结合。
     理想地， 核苷酸或氨基酸取代减少与纤维蛋白原的非共价相互作用， 优选通过阻 止配体与分隔纤维蛋白原结合蛋白的区域 A 的 N2 和 N3 的疏水袋结合。备选地， 对应于氨 基酸 532 至 538 的锁闭肽区域可以通过取代或删除被改变， 以阻止配体结合。另外， 可以使 用没有锁闭肽区域和任选地没有 C 末端蛋白残基的剩余部分即没有氨基酸残基 532 至 559 的截短物 / 片段。
     根据本发明的这个方面的一个具体实施方式， 可以通过分别将氨基酸 P336 替换为 丝氨酸和 / 或将氨基酸 Y338 替换为天冬氨酸来构建 ClfA 的纤维蛋白原结合缺陷的突变体。 残基的选择是基于 ClfA 的 X 射线晶体结构以及 “对脯氨酸或酪氨酸的单个改变降低结合活 性” 的观察。令人惊奇的是， 我们发现该突变体 ClfA 蛋白 (rClfAP336S Y338A) 刺激免疫反应 并且可用于产生更加有效的疫苗或抗体治疗。 所述取代可以发生在全长纤维蛋白原结合蛋 白、 纤维蛋白原结合区域、 最小纤维蛋白原结合区域或其片段中。
     根据本发明的这个方面的另一个具体实施方式， 可以通过分别将氨基酸 P336 替换 为天冬氨酸和 / 或将氨基酸 Y338 替换为丝氨酸来构建 ClfA 的纤维蛋白原结合缺陷的突变 体。 如同上一个实施方式一样， 该突变体 ClfA 蛋白 (rClfAP336A Y338S) 也可用于产生更加有 效的疫苗或抗体治疗。
     或者， 所述改变可以是删除的形式， 包括不含锁闭肽序列 ( 氨基酸 532 至 538) 的 纤维蛋白原结合区域， 以产生不具备与纤维蛋白原非共价结合能力的重组纤维蛋白原结合 蛋白。在该实施方式中， 使用了 ClfA 的区域 A 的氨基酸残基 221 至 531， 其没有锁闭肽和其 后的 C 末端残基。备选地， 可以考虑锁闭肽氨基酸 532 至 538 中的氨基酸取代， 其阻止纤维 蛋白原的 DLL。
     应该理解， Clf-Sdr 家族中的所有蛋白都通过 DLL 模型与配体结合。通过模拟三 维结构可以预测锁闭肽并制备没有锁闭肽的截短物， 不论是全长 (N1 至 N3) 还是最小配体 结合截短物 N2-N3 或其片段。
     我们发现这些取代的 rClfA 蛋白 ( 不论是删除突变体， 取代或截短物 ) 降低了毒 力和疾病后果， 并且令人惊奇地诱导比野生型蛋白少的全身性炎症。
     因此， 基于所测的蛋白， 预期以这些突变体蛋白进行的免疫将增强同时识别突变 体和野生型蛋白的抗体水平并且将提供比野生型蛋白更大的免疫反应。
     因此， 经过改变从而其不再与纤维蛋白原结合的 ClfA 是用于主动或被动免疫的 有用的候选治疗剂。按照这种方式， 经改变的 ClfA 蛋白本身可用作疫苗， 或者可以使用针 对这种改变的 ClfA 蛋白产生的抗体。如上所述， 疫苗可以是 DNA 或蛋白疫苗。
     下表中列出的以下序列可以根据本发明使用。
     另外的 N 残基 (N- 末端延伸 (6×His 标签和另外的残基 ) 包含 6 个 His 残基， 接 着是 Gly 和 Ser。另外的 C 末端残基包含 Lys， 接着是 Leu( 可以使用其它的另外的 N 和 C 末端残基 - 取决于所用的引物或需要的 N/C 末端标签 ) 2
     另外的 N 残基 (6×His 标签和另外的残基 ) 包含 6 个 His 残基， 接着是 Gly 和 Ser。另外的 C 末端残基包含 Arg， 接着是 Ser( 可以使用其它的另外的 N 和 C 末端残基 - 取 决于所用的引物或需要的 N/C 末端标签 ) 3
     不含对应于氨基酸残基 532 至 538 的锁闭肽和剩余的 A 区域 C 末端残基， 即没有 氨基酸残基 532 至 559。
     理想地， 重组葡萄球菌纤维蛋白原结合蛋白包含根据任意 SEQ ID NO ： 1 至 3 的氨 基酸序列或其片段， 其中残基 P336 和 / 或 Y338 被丝氨酸和 / 或丙氨酸取代。
     备选地， 重组葡萄球菌纤维蛋白原结合蛋白的片段包含根据任意 SEQID NO ： 4至 SEQ ID NO ： 14 的氨基酸序列。SEQ ID NO ： 4 和 5 仅对应于 ClfA 结构域 N1、 N2、 N3， 其分别 为 rClfA P336S Y338A 和 rClfA P336A Y338S， 如上表中所示。
     基于在 SdrG 中进行的锁闭中的取代推测 ： 在构象变化或 β 链互补方面存在缺陷 的锁闭中的取代在配体结合上也将是有缺陷的。 因此， 理想地， 取代发生于对应于锁闭肽的 氨基酸残基 532 至 538 并影响肽发生构象变化的能力或与配体的结合或二者皆有。 备选地， 改变可以包含一起除掉氨基酸残基 532 至 538(Δ 锁闭肽 )， 以产生相似的结果。 另外， 没有 氨基酸残基 532 至 559( 包括锁闭肽残基 ) 的 C 末端截短突变体也将影响与配体的结合。
     但是， 应该考虑到， 除了以上特别指明的那些之外， 也可以对其它的氨基酸残基进 行取代。 例如， 可以对 Glu 526、 Val 527、 Tyr 256 和 Lys 389 进行取代以改变蛋白或其片段 的纤维蛋白原结合性质。因此， 任何减少结合能力的取代均可以被考虑到。理想地， 这样的 取代或删除影响疏水袋和与之相关的与疏水沟中的配体结合的机制， 例如 ClfA 中的同源 物 Val527 和 ClfB 中的 N526。在 ClfB 中， 已经研究表明 Q235 和 N526 减少结合。以 FnBPA 进行了相似研究， 其中表明 N304 和 F306 对于 Fg 结合是重要的。因此， 这些氨基酸残基中 的突变将影响配体结合。
     应该理解， 这些论述对于其它纤维蛋白原结合蛋白例如 ClfB、 SdrG、 FnBPA、 FnBPB 同样适用。因此， 治疗 ( 疫苗、 抗体或药物组合物等 ) 可以包含完整的纤维蛋白原结合区域 或其片段。
     在 本 说 明 书 中， 术语 “包 括 (comprise)、 包 括 (comprises)、 包 括 (comprised) 和包括 (comprising)”或其任何变体以及术语 “包括 (include)、 包括 (includes)、 包括 (included) 和包括 (including)” 或其任何变体被认为是完全可以相互替换使用， 它们应 该被赋予最可能宽的解释。
     19本发明不限于以上描述的实施方式， 可以在权利要求的范围内在解释和细节方面变化。 现在将通过参考以下非限制性附图和实施例来描述本发明。
     图 1 至 15 显示了实施例 1 的结果。
     图 1 显示了在接种了金黄色葡萄球菌菌株 Newman， 和 clfAPYI、 clfAPYII 和 clfA 无效突变体的小鼠中以关节炎指数测定的关节炎的严重性 (A) 和体重丧失 (B)。接种 3.2×106-6.0×106cfu 的金黄色葡萄球菌菌株。数据表示为中位数 ( 正方形或中线 )、 四分 位数间距 ( 框 ) 和 80％中间间距 ( 须 )。汇集来自三次实验的数据。NNewman ＝ 27-30， NclfAPYI ＝ 30， NclfAPYII ＝ 10， NclfA ＝ 16-20。
     图 2 显示了以 3.2×106-6.0×106cfu 的金黄色葡萄球菌菌株 Newman， 和 clfAPYI、 clfAPYII 和 clfA 无效突变体接种之后 7-8 天的小鼠肾脏中的细菌生长。数据表示为每对 肾脏中的 cfu。 当检测不到生长时， 将计数设置为根据所用的稀释度的最高可能计数。 汇集 来自三次实验的数据。NNewman ＝ 26， NclfAPYI ＝ 30， NclfAPYII ＝ 10， NclfA ＝ 15。 7
     图 3 显示了分别接种 5.2、 5.1 或 3.3×10 cfu 的金黄色葡萄球菌菌株 Newman、 clfAPYI 突变体或 clfA 无效突变体之后的小鼠生存情况。从开始起每组 N ＝ 10。
     图 4 显示了分别接种 9.4、 7.9、 10.7 或 9.8×106cfu 的金黄色葡萄球菌菌株 LS-1， 和 clfAPYI、 clfAPYII 或 clfA 无效突变体之后的小鼠生存情况。从开始起每组 N ＝ 15。
     图 5 显示了以 BSA、 重组 ClfA 或重组 ClfAPY( 即 ClfAPYI 重组蛋白 A 结构域 ) 免 7 疫并接种了 2.3×10 cfu 的金黄色葡萄球菌 Newman 的小鼠的生存情况。 从开始起每组 N ＝ 15。
     图 6 显示了接种了 3.2×106-6.0×106cfu 的金黄色葡萄球菌菌株 Newman 野生型， 和 clfAPYI、 clfAPYII 和 clfA 无效突变体的关节炎小鼠的频率。汇集来自三次实验的数 据。NNewman ＝ 27-30， NclfAPYI ＝ 30， NclfAPYII ＝ 10， NclfA ＝ 16-20。
     图 7 显示了分别接种了 5.2、 5.1 或 3.3×107cfu 的金黄色葡萄球菌菌株 Newman 野 生型、 clfAPYI 突变体或 clfA 无效突变体的小鼠中以关节炎指数测定的关节炎的严重性。 数据表示为中位数 ( 正方形 )、 四分位数间距 ( 框 ) 和 80％中间间距 ( 须 )。NNewman ＝ 0-10， NclfAPYI ＝ 9-10， NclfA ＝ 0-10。
     图 8 显示了分别接种了 5.2、 5.1 或 3.3×107cfu 的金黄色葡萄球菌菌株 Newman 野生型、 clfAPYI 突变体或 clfA 无效突变体的小鼠中的体重丧失。数据表示为中位数 ( 中 线 )、 四分位数间距 ( 框 ) 和 80％中间间距 ( 须 )。NNewman ＝ 0-10， NclfAPYI ＝ 9-10， NclfA ＝ 0-10。
     图 9 显示了以 BSA、 重组 ClfA 或重组 ClfAPY( 即 ClfAPYI 重组蛋白 A 结构域 ) 免 6 疫并接种了 4.0×10 cfu 的金黄色葡萄球菌 Newman 的小鼠中以关节炎指数测定的关节炎 的严重性。数据表示为中位数 ( 正方形 )、 四分位数间距 ( 框 ) 和 80％中间间距 ( 须 )。从 开始起， 每组 NBSA ＝ 14， NclfAPY ＝ 14， NclfA ＝ 15。
     图 10 给出了野生型 ClfA A 结构域蛋白 (rClfA)、 仅结构域 N123 的核苷酸和氨基 酸序列， 其中以高亮标出了在以下实施例中被改变以产生 rClfAPYI/II(SEQ ID No.3) 的残 基 (P336 和 Y338)。在以下实施例中用于疫苗接种的正是这个重组蛋白 A 结构域。
     图 11 显示了 FnBPA、 ClfB、 ClfA 和 SdrG 蛋白结构的示例性图。区域 A 是纤维蛋白
     原结合区域， S 是信号序列， W 是细胞壁跨越结构域， M 是膜锚定， 其包括 LPXTG 基序， + 表示 带正电的残基， R 是重复区域。在 ClfA 中， 区域 A 包含 N123( 未显示 )。FnBPA 的 BCD 区域 ( 以及 FnBPB 的较短的 CD 区域 - 未显示 ) 与纤连蛋白结合。
     图 12 显 示 了 在 第 二 次 加 强 免 疫 9 天 之 后， 对 于 用 牛 血 清 白 蛋 白 (BSA)、 重组 ClfA40-559(rClfA) 或 重 组 ClfAPY40-559(rClfAPY) 免 疫 的 小 鼠 血 清 样 品 中 的 重 组 ClfAPY40-559 的特异性抗体反应， 1 天之后以 2.3×107cfu/ 小鼠进行金黄色葡萄球菌菌株 Newman 野生型的感染以诱导脓毒症。数据表示为中位数 ( 中线 )、 四分位数间距 ( 框 ) 和 80％中间间距 ( 须 )。NBSA ＝ 13-15， NrClfA ＝ 15， NrClfAPY ＝ 15。
     图 13 显 示 了 在 第 二 次 加 强 免 疫 9 天 之 后， 对 于 用 牛 血 清 白 蛋 白 (BSA)、 重组 ClfA40-559(rClfA) 或 重 组 ClfAPY40-559(rClfAPY) 免 疫 的 小 鼠 血 清 样 品 中 的 重 组 ClfA40-559 的特异性抗体反应， 1 天之后以 2.3×107cfu/ 小鼠进行金黄色葡萄球菌菌株 Newman 野生型的感染以诱导脓毒症。数据表示为中位数 ( 中线 )、 四分位数间距 ( 框 ) 和 80％中间间距 ( 须 )。NBSA ＝ 13-15， NrClfA ＝ 15， NrClfAPY ＝ 15。
     图 14 显 示 了 在 第 二 次 加 强 免 疫 9 天 之 后， 对 于 用 牛 血 清 白 蛋 白 (BSA)、 重组 ClfA40-559(rClfA) 或 重 组 ClfAPY40-559(rClfAPY) 免 疫 的 小 鼠 血 清 样 品 中 的 重 组 ClfAPY40-559 的特异性抗体反应， 1 天之后以 4.0×106cfu/ 小鼠进行金黄色葡萄球菌菌 株 Newman 野生型的感染以诱导脓毒性关节炎。数据表示为中位数 ( 中线 )、 四分位数间距 ( 框 ) 和 80％中间间距 ( 须 )。NBSA ＝ 14-15， NrClfA ＝ 15， NrClfAPY ＝ 15。
     图 15 显 示 了 在 第 二 次 加 强 免 疫 9 天 之 后， 对 于 用 牛 血 清 白 蛋 白 (BSA)、 重组 ClfA40-559(rClfA) 或 重 组 ClfAPY40-559(rClfAPY) 免 疫 的 小 鼠 血 清 样 品 中 的 重 组 ClfA40-559 的特异性抗体反应， 1 天之后以 4.0×106cfu/ 小鼠进行金黄色葡萄球菌菌株 Newman 野生型的感染以诱导脓毒性关节炎。数据表示为中位数 ( 中线 )、 四分位数间距 ( 框 ) 和 80％中间间距 ( 须 )。NBSA ＝ 14-15， NrClfA ＝ 15， NrClfAPY ＝ 15。
     实施例 2 的图 16 显示了在第二次加强免疫 9 天之后， 对于用牛血清白蛋白 (BSA)、 重组 ClfA221-559(rClfA221-559) 或重组 ClfAPY221-559(rClfAPY221-559) 免疫的小鼠血 清样品中的重组 ClfAPY221-559 的特异性抗体反应。 数据表示为中位数 ( 中线 )、 四分位数 间距 ( 框 ) 和 80％中间间距 ( 须 )。NBSA ＝ 15， NrClfA221-559 ＝ 14-15， NrClfAPY221-559 ＝ 14-15。
     实施例 2 的图 17 显示了在第二次加强免疫 9 天之后， 对于用牛血清白蛋白 (BSA)、 重组 ClfA221-559(rClfA221-559) 或重组 ClfAPY221-559(rClfAPY221-559) 免疫的小鼠血 清样品中的重组 ClfA221-559 的特异性抗体反应。 数据表示为中位数 ( 中线 )、 四分位数间 距 ( 框 ) 和 80％中间间距 ( 须 )。NBSA ＝ 15， NrClfA221-559 ＝ 14-15， NrClfAPY221-559 ＝ 14-15。
     实 施 例 3 的 图 18 显 示 了 在 第 二 次 加 强 免 疫 9 天 之 后，对 于 用 重 组 ClfAPY221-531(rClfA221-531) 免疫的小鼠血清样品中的重组 ClfA221-53l 的特异性抗体 反应。数据表示为中位数 ( 中线 )、 四分位数间距 ( 框 ) 和 80％中间间距 ( 须 )。NrClfA221-531 ＝ 14-15。 实施例
     实施例 1 包含 N1、 N2 和 N3( 氨基酸 40-559) 的 rClfA A 区域截短物材料和方法
     在本部分末尾处提供了实施例中给出的括号中的数字参考文献的全部细节。
     小鼠
     NMRI 小鼠获自 Scanbur BK(Sollentuna， 瑞典 )， 维持在瑞典哥德堡大学风湿病学 系的动物厂房中。哥德堡动物实验伦理委员会批准了该实验。每个笼子中饲养 10 只动物， 以 12 小时的光照 - 黑暗进行循环， 以标准实验室食品和水随意饲养。在实验开始时， 动物 为 6 至 16 周龄。
     细菌菌株
     为了感染动物， 使用了金黄色葡萄球菌野生型菌株 Newman(14) 和 LS-1(11) 及其 构建衍生物。 在菌株 Newman 中构建 clfA P336SY338A(clfAPYI) 和 clfAP336AY338S(clfAPYII) 衍 生物并将其转导至菌株 LS-1( 见下文 )。 还使用了删除突变体 Newman clfA2::Tn917 突变体 DU5876(3) 和 LS-1 clfA2::Tn917 突变体 (J.R.Fitzgerald 等人， 未发表 )。细菌在血液琼 脂板上生长 48 小时， 收获并于 -20℃冷冻于含有 5％ ( 重量 / 体积 )BSA(Sigma Chemicals) 和 10％ ( 体积 / 体积 ) 二甲基亚砜的 PBS 中。在注射到动物中之前， 将细菌悬浮液解冻， 在 PBS 中洗涤， 并调整至合适的细胞浓度。在每次刺激时根据血液琼脂板上的培养和计数 菌落测定活细菌的数目。 在金黄色葡萄球菌 Newman 和 LS-1 中构建 clfAPYI 和 clfAPYII 突变
     在本实验中， 使用了包含对应于氨基酸 40-559 的 N1、 N2 和 N3 的全长 ClfAA 区域 截短物。在以下描述和附图中 ：
     -ClfA 也可被称作 rClfA 40-559(SEQ ID NO 3) ；
     -ClfA P336SY338A 也可被称作 clfAPYI、 rclfAPY 或 rclfAPYI( 即 clfAPYI40-559) (SEQ ID NO 4) ； 和
     -ClfA P336AY338S 也可被称作 clfAPYII、 rclfAPYII( 即 clfAPYII 40-559)(SEQ ID NO 5)。
     将 在 clfA 中 含 有 P336S 和 Y338A 突 变 的 1.02kb 的 pCF77PY 的 PstI-BamHI 片 段 (Loughman 等人， 2005) 克隆进入 pBluescriptII SK-(Stratagene)。使用 HindIII 将该质 粒线性化并连接进入 HindIII- 切割的 pTSermC(J.Higgins， 未发表 ) 以产生质粒 pARM， 其 为温度敏感性的大肠杆菌 - 金黄色葡萄球菌穿梭质粒， 其含有 P336S 和 Y338A 取代。
     为了降低由于取代 P336 和 Y338 而产生功能性或免疫反应性表位的未知风险， 我们 产生了 产生了第二个突变体， 其中取代的顺序是反的， 即产生 P336A 和 Y338S。为了产生这个， 类似于 pARM 但是包含 P336A 和 Y338S 取代的质粒 pJH2。使用与用以制备 pCF77PY(6) 相同的 侧翼引物和一对不同的重叠突变引物 ( 突变以黑体和下划线表示 ) 进行重叠引物 PCR 以产 生 pCF77PYII ：
     F3 ： GCAACTTTGACCATGGCCGCTTCTATTGACCCTGAAAATG 和
     R3 ： CATTTTCAGGGTCAATAGAAGCGGCCATGGTCAAAGTTGC
     如上所述， 使用该质粒的 1.02kb PstI-HindIII 片段用于产生 pJH2——一种温度 敏感性大肠杆菌 - 金黄色葡萄球菌穿梭质粒， 其含有 P336A 和 Y338S 取代。
     通过电穿孔将 pARM 和 pJH2 都转移到 RN4220(15) 中， 然后使用噬菌体 85(16) 将 其转导到金黄色葡萄球菌 Newman(14) 和 LS-1(11) 中。在这些菌株中， 诱导该质粒使其
     插入到染色体中， 然后进行切割， 将突变留在一定比例的转化子的染色体中， 产生 Newman clfAPYI、 Newman clfAPYII、 LS-1clfAPYI 和 LS-1clfAPYII。就质粒的损失和纤维蛋白原结 合活性的丧失筛选转化子。 使用 clfA 探针通过 Southern 杂交验证 clfA 基因的完整性 ( 数 据未显示 )。使用抗 -ClfA 区域 A 的多克隆兔子抗血清通过 Westem 免疫印迹验证免疫反应 性蛋白 (ClfAPY) 的表达 ( 数据未显示 )。通过在来自基因组 DNA 的 KpnI-BamHI 片段上进 行 PCR 和产物的商业测序对突变进行验证。所测序的菌株 LS-1 的 clfA 基因的大约 700 个 碱基与菌株 Newman 的 Newman clfA 基因中的对应碱基是相同的。
     重组 ClfA 和 ClfAPY 的产生
     按照以前的描述 (17)， 从 pCF40 产生 His 标记的重组 ClfA 区域 A、 结构域 N123( 氨 基酸 40-559)， 其中增加了另外的通过阴离子交换柱的抛光步骤。使用质粒 pCF77PY(6) 作 为模板， 将 clfAPYI 结构域 N123 克隆进入 pQE30 中以产生 pCF40PY。使用该质粒， 还通过镍 亲和层析和阴离子交换层析产生了重组 ClfAPY， 如同对于 rClfA 的描述一样。在浓缩和冷 冻干燥之前， 以 PBS 将洗脱物透析两次。
     脓毒性关节炎和脓毒症实验
     在实验 1-3 中， 以菌株 Newman 感染所有的小鼠 ( 每组 n ＝ 10) 以引发关节炎， 在 实验 4 和 5 中， 分别以菌株 Newman 和 LS-1 感染小鼠 ( 每组 n ＝ 10) 以引发脓毒症。
     实 验 1 通过静脉 内注射 3.5×106cfu/ 小鼠的金 黄色 葡萄球菌菌株 Newman 或 4.3×106cfu/ 小鼠的 Newman clfAPYI 突变体感染小鼠， 二者均处于 200μl PBS 中。监测 临床关节炎和重量变化直至第 7 天。在第 8 天将小鼠杀死， 测定肾脏中细菌的生长并且测 定血清 IL-6 和总 IgG 水平。在前和后足的关节处进行滑膜炎和骨破坏的组织学研究。
     实验 2 分别以 5.0×106cfu、 6.0×106cfu 或 4.3×106cfu 的金黄色葡萄球菌菌株 Newman、 clfAPYI 突变体或 Newman clfA::ErmR(clfA 无效突变体 ) 感染小鼠。监测临床关 节炎和重量变化直至第 7 天。 在第 7 天将小鼠杀死， 测定肾脏中细菌的生长 ； 测定血清 IL-6 和总 IgG 水平。在前和后足的关节处进行滑膜炎和骨破坏的组织学研究。
     实验 3 分别以 4.7×106cfu、 3.2×106cfu、 3.9×106cfu 或 4.8×106cfu 的金黄色葡 萄球菌菌株 Newman、 clfAPYI 突变体、 Newman clfAPYII 突变体或 NewmanclfA 无效突变体 感染小鼠。监测临床关节炎和重量变化直至第 7 天。在第 8 天将小鼠杀死， 测定肾脏中细 菌的生长 .
     实验 1-3 的结果是非常相似的， 所以将数据汇集并一起呈现。
     在实验 4 中， 将小鼠分别用 5.2×107cfu、 5.1×107cfu 或 3.3×107cfu 的金黄色葡 萄球菌菌株 Newman、 clfAPYI 突变体或 clfA 无效突变体静脉内注射。监测死亡率、 重量变 化和临床关节炎直至第 10 天。
     在 实 验 5 中，将 小 鼠 分 别 用 9.4×106cfu、 7.9×106cfu、 10.7×106cfu 或 9.8×106cfu 的金黄色葡萄球菌菌株 LS-1、 LS-1clfAPYI 突变体、 LS-1 clfAPYII 突变体或 LS-1 clfA 无效突变体感染。监测死亡率、 临床关节炎和重量变化直至第 16 天。
     关节内注射细菌
     分别以 2.4×104cfu、 2.4×104cfu 或 3.4×104cfu 的菌株 Newman 野生型、 clfAPYI 突变体或 clfA 敲除突变体 ( 处于 20μl PBS 中 ) 注射每只小鼠的一个膝关节。每组 N ＝ 10。在 3 天后杀死小鼠， 收集膝关节用于组织病理学检查。以野生型和突变体重组 ClfA 进行疫苗接种
     将纯化的 rClfA40-559、 rClfAPY40-559( 即 rClfAPYI) 或 BSA 溶解于生理盐水中 并与弗氏完全佐剂 (Difco Laboratories) 以 1 ∶ 1 进行乳化。在第 0 天将 200μl 含有 30μg( ＝ 0.53nmol) 蛋白的乳液皮下 (s.c.) 注射。在第 11 天以不完全的弗氏佐剂中的生 理盐水中的 30μg 蛋白进行第一次加强免疫。在第 21 天进行第二次加强免疫。在第 30 天 将小鼠放血， 将血清冷冻用于后续的抗体反应分析。
     在第 31 天， 以 4.0×106cfu/ 小鼠通过静脉内注射感染每组 14-15 只小鼠以诱导 脓毒性关节炎， 或者以 2.3×107cfu/ 小鼠诱导脓毒症。监测临床关节炎、 重量变化和死亡 率分别达 11 和 15 天。在脓毒性关节炎实验中测定肾脏中的细菌生长。
     感染小鼠的临床评价
     以不知情方式进行临床评价。目测检查每个肢体。检查产生 0 至 3 的评分 (0 是 没有肿胀和红斑 ； 1 是轻微肿胀和 / 或红斑 ； 2 是中度肿胀和 / 或红斑 ； 3 是显著肿胀和 / 或 红斑 )。通过将动物的所有四肢的评分相加而获得关节炎指数。还通过测定全身性炎症的 迹象即重量减轻、 警戒性降低和皮毛发皱来检查每只小鼠的总体状况。在严重全身性感染 的情况下， 当判定某小鼠病得太严重以致于活不过 24 小时的时候， 通过断颈法将其杀死并 且认为是由于脓毒症而死亡的。
     组织学检查
     使用以前描述的方法 (18) 的修改 (8) 来进行关节的组织学检查。
     感染的肾脏的细菌学检查
     无菌分离肾脏、 置于冰上、 匀浆、 在 PBS 中连续稀释并涂布于血液琼脂板上。在 37℃温育 24 小时之后， 测定每对肾脏的 cfu 数目。
     血清 IgG 的测定
     通过放射状免疫扩散技术 (19) 测定血清中的总 IgG 水平。山羊抗小鼠 IgG 和小 鼠 IgG 标准物购自 Southern Biotech， Birmingham， AL。
     特异性抗体 -ELISA
     在第二次加强免疫之后 9 天从经免疫的小鼠获取血清样品。通过 ELISA 测定针 对 rClfA 和 rClfAPY 的血清特异性抗体反应。以 PBS 中的 5μg/ml 的重组蛋白包被微板 (96- 孔 ； Nunc)。封闭试剂、 血清样品、 生物素化的抗体和 ExtrAvidin- 过氧化物酶均在 PBS 中稀释。根据以前的描述 (8) 进行该检验。所有的血清样品以 1 ∶ 20000 稀释， 以 405nm 处的吸光度监测抗体反应。
     在第二轮中， 为了获得不同免疫组中特异性抗体反应的更精确的测定， 在数个 血清稀释度中测定反应。因此， 所有的血清样品以 1 ∶ 5000、 1 ∶ 20000、 1 ∶ 80000 和 1 ∶ 320000 稀释， 以 405nm 处的吸光度监测抗体反应。
     IL-6 分析
     根据以前描述的方法 (20) 检测血清 IL-6。
     统计学分析
     使用 Mann-Whitney U 检验进行统计学评价。P ＜ 0.05 被认为是显著性的。除非 另有指明， 否则数据报告为中位数、 四分位数间距和 80％中间间距。
     结果ClfA 与纤维蛋白原结合必需的两个氨基酸的替换阻碍了脓毒性关节炎和脓毒症的发生 通过等位基因交换将已知为 ClfA 与纤维蛋白原结合必需的两个氨基酸 (P336 和 Y338) 改变以产生菌株 Newman 和 LS1 的突变体， 其在细胞表面表达非纤维蛋白原结合性 ClfA 蛋白。通过 Western 印迹检测该蛋白的表达水平和完整性， 证明了该突变蛋白在细菌 表面表达良好并且表达的蛋白是正确的大小。
     研究了 Newman 野生型和 Newman clfA P336S Y338A(clfAPYI) 引发脓毒性关节炎的 能力。通过静脉内分别接种 3.5×106 至 5.0×106 的菌落形成单位 (cfu) 和 3.2×106 至 6.0×106cfu 的 Newman 野生型和 clfAPYI 突变体诱导脓毒性关节炎。对关节炎的发展临床 研究 7 天。在整个实验期间， 相比野生型菌株， clfAPYI 突变体引发的关节炎严重性显著较 低 (P ＞ 0.001， 图 1A)。在多数时间点， 对于 Newman clfAPYI， 关节炎的频率较低 ( 图 6)。
     出乎意料的是， ClfAPYI 分子中的新的氨基酸组成似乎适合与宿主的抗细菌防御 相互作用。 为了检验这个可能性， 制备了一种新的构建体， 其中以不同的氨基酸来取代 P336 6 和 Y338(clfA P336A Y338S ： clfAPYII)。以 3.9×10 cfu 的 NewmanclfAPYII 接种的小鼠产生 的关节炎程度与 clfAPYI 突变体一样低 ( 图 1A)， 并且具有相似的频率 ( 图 6)。这个结果 强烈表明， 纤维蛋白原结合的丧失促成关节炎水平的降低。
     ClfA 可能通过不涉及纤维蛋白原结合的机制参与关节炎的发生。 为测试这个可能 性， 将缺少 ClfA 蛋白的 ClfA 删除突变体与表达修饰的非纤维蛋白原结合性 ClfA 蛋白的突 变体进行比较。但是， 以 4.3×106 至 4.8×106cfu 的 clfA 无效突变体感染的小鼠产生的关 节炎与 clfAPYI 和 clfAPYII 突变体感染的小鼠在方式上没有差异 ( 图 1A)。关节炎的频率 也是不可区分的 ( 图 6)。
     还对感染的关节进行了组织学研究。在实验 1 和 2 中， 相比野生型感染的小鼠， Newman clfAPYI 感染的小鼠中的滑膜炎均显著较轻 ( 分别为 P ＝ 0.02 和 0.001)。 在 Newman clfAPYI 感染的样品中， 几乎不存在骨破坏 ( 骨破坏是人类脓毒性关节炎后遗症的主要诱 因 )( 实验 2， P ＝ 0.001)。与 Newman 野生型感染的小鼠相比， Newman clfA 无效突变体诱 导的滑膜炎和骨破坏均较轻 ( 分别为 P ＝ 0.003 和 0.006)， 但是在某种程度上比 Newman clfAPYI 组严重， 虽然不是很显著。
     接下来分析了 clfA 突变对于感染过程造成的代谢后果。以 Newman 野生型菌株感 染的小鼠在实验过程中体重下降了高达大约 30％。 以纤维蛋白原结合缺陷的突变体 Newman clfAPYI 和 Newman clfAPYII 感染的小鼠重量几乎没有任何减少 (P ＞ 0.0001 相对于野生 型 )。相反， Newman clfA 无效突变体对于重量损失具有中等效应， 导致显著小于野生型菌 株， 但是显著高于 clfAPYI 和 clfAPYII 突变体菌株 ( 在多数情况下 P ≤ 0.02， 图 1B)。
     在感染的第 7-8 天分析了作为全身性炎症反应的度量的血清 IL-6 水平。IL-6 的 表达模式类似于重量变化。Newman 野生型引发高水平的血清 IL-6(4.8(2.8， 5.7)ng/ml)， Newman clfAPYI 突变体引发显著较低的 IL-6(0.2(0.07， 2.4)ng/ml， P ＜ 0.0001) 而 Newman clfA 无效突变体产生中等的反应 (2.5(1.3， 3.2)ng/ml)， 其与野生型和 clfAPYI 突变体组 均有显著差异 ( 分别为 P ＝ 0.009 和 P ＝ 0.008)( 中位数， 四分位数间距 )。
     与 Newman clfAPY 突变体和 Newman clfA 无效突变体这两者相比， 在 Newman 野 生型感染的小鼠中， 肾脏中的细菌生长显著较高 ( 分别为 P ＜ 0.0001， P ＝ 0.011， 和P＝
     0.005 ； 图 2)。相比于 Newman clfAPYI- 感染的小鼠， Newman clfA 无效突变体 - 感染的小 鼠的肾脏中的细菌生长显著较高 (P ＝ 0.0005， 图 2)。
     在感染的第 7-8 天测定了小鼠血清中的总 IgG。Newman clfAPYI- 和 NewmanclfA 无效突变体 - 感染的两个组中的 IgG 水平的增加都显著低于以野生型菌株感染的小鼠 ( 分 别 为 3.1(1.2， 4.9) ； 2.3(1.0， 2.6) ； 和 6.4(5.0， 11.0)( 中 位 数， 四分位数间距 ) ； P ≤ 0.0003)。在两个突变体组之间没有显著性差异。
     在 Newman 野生型感染的小鼠中死亡率是 17％， 在 Newman clfAPYI 和 clfAPYII 突 变体组中是 0％， 在 Newman clfA 无效突变体组中是 30％。在野生型和 clfAPYI 组之间以 及在 clfAPYI 和 clfA 无效突变体组之间的死亡率存在显著性差异 ( 分别为 P ＜ 0.05 和 P ＜ 0.01)。
     在感染了表达纤维蛋白原结合缺陷的 ClfA 的金黄色葡萄球菌的小鼠中， 全身性 炎症的直接和间接迹象似乎较低。出人意料的是， 不表达 ClfA 的菌株都诱导了比表达 ClfAPY 突变体的菌株更强烈的全身性炎症。
     通过增加金黄色葡萄球菌的接种剂量诱导了脓毒症。 以 5.2×107cfu 的 Newman 野 生型、 5.1×107cfu 的 Newman clfAPYI 突变体和 3.3×107cfu 的 Newman clfA 无效突变体 注射小鼠。 在 5 天内， 所有的感染了野生型的小鼠都死亡， 但是在注射 10 天后， 10 只注射了 clfAPYI 突变体的小鼠中仅有 1 只死亡 (P ＜ 0.0001， 图 3)。注射了 clfA 无效突变体的小 鼠的生存时间也显著短于 clfAPYI 突变体感染的小鼠 (P ＜ 0.0001， 图 3)。在该实验中， 以 clfA 无效突变体刺激的小鼠产生显著多于 clfAPYI 突变体组的关节炎， 同时它们损失显著 更多的重量 ( 图 7 和 8)。因此， 通过与脓毒性关节炎实验中的全身性炎症的度量相类比发 现， 如果 ClfA 分子被表达， 则小鼠的生存被延长， 只要该 ClfA 分子没有纤维蛋白原结合性 质。
     将细菌注射进入关节
     为了测定关节中的炎性反应是否依赖于纤维蛋白原结合， 将 Newman 野生型、 Newman clfAPYI 或 Newman clfA 空白直接注射进入小鼠的膝关节， 从而绕过全身性区室。 3 天之后通过组织学方法研究滑膜炎， 包括关节腔的多形核渗透， 以及骨破坏。 小鼠在一个膝 4 4 4 处接受 2.4×10 cfu 的野生型、 2.4×10 cfu 的 clfA 无效突变体或 3.4×10 cfu 的 clfAPYI 突变体。 对于感染了野生型的膝， 关节腔内的滑膜炎和多形核渗透的组织学指数为 0.25(0， 3.0)， 对于 clfA 无效突变体为 2.38(0.25， 3.0)， 对于 clfAPYI 突变体为 0.25(0， 0.25)( 中 位数， 四分位数间距 )。对于野生型， 骨破坏的组织学指数是 0(0， 1.0)， 对于 clfA 无效突变 体为 1.0(0， 1.0)， 对于 clfAPYI 突变体为 0(0， 0)( 中位数， 四分位数间距 ； 在 clfAPYI 突变 体和 clfA 无效突变体之间 P ＝ 0.01)。由于 clfAPYI 突变体引发极少的滑膜炎和破坏， 所 以， 虽然存在 “给予小鼠的该菌株的量比其它菌株多 40％” 这一事实， 但是仍然得出结论 ： ClfA 促使的纤维蛋白原结合对于关节内的最大炎性反应是必需的。再次， 相对于纤维蛋白 原结合缺陷的 ClfA 突变体， ClfA 表达的缺失增强了炎症。
     菌株 LS-1 中的 PY 突变
     为了确定 ClfA 与纤维蛋白原结合的能力是否影响其它金黄色葡萄球菌菌株的 毒力， 将 clfAPYI、 clfAPYII 和 clfA 无效突变转导到表达 TSST-1 的金黄色葡萄球菌菌株 6 LS-1。 以 9.4×10 cfu 的 LS-1 野生型、 7.9×106cfu 的 LS-1 clfAPYI、 10.7×106cfu 的 LS-1clfAPYII 或 9.4×106cfu 的 LS-1 clfA 无效突变体刺激小鼠。通过监测存活率来研究脓 毒症。在 16 天之后， 以野生型菌株刺激的小鼠只有 40％是存活的， 而以 clfAPYI 突变体和 clfA 无效突变体组刺激的小鼠有 90％是存活的， 以 clfAPYII 突变体感染的小鼠有 80％是 存活的 ( 图 4)。LS-1 的 clfAPYI 突变体和 clfA 无效突变体的毒力显著较低 ( 分别为 P ＝ 0.014、 P ＝ 0.05 和 P ＝ 0.03)。
     以重组 ClfA 蛋白进行免疫
     在脓毒性关节炎模型和脓毒症模型中都研究了重组野生型 ClfA A 结构域蛋白 (rClfA) 和突变体 ClfAPYI 蛋白 (rClfAPY) 进行疫苗接种的效应。将小鼠致敏， 然后以对 6 照蛋白 BSA、 rClfA 或 rClfAPY 进行两次加强免疫， 然后以 4.0×10 cfu 的金黄色葡萄球菌 菌株 Newman 感染以诱导脓毒性关节炎， 或者以 2.3×107cfu 的菌株 Newman 感染以诱导脓 毒症。与对照小鼠相比， 以 rClfAPY( 即 ClfAPYI 重组蛋白 A 结构域 ) 进行的免疫对脓毒性 死亡产生了显著性保护 (P ＝ 0.01， 图 5)， 而 rClfA 免疫没有产生显著性保护。在细菌感染 之前的 1 天， 在 rClfAPY 免疫的小鼠中， 对于 rClfAPY 和 rClfA 的特异性血清抗体反应 (A405 ＝ 0.39(0.33， 0.56) 和 0.71(0.52， 0.81)) 比 rClfA 免疫的小鼠高得多 (A405 ＝ 0.13(0.07， 0.17) 和 0.15(0.10， 0.24)， 在两个对比中 P ＜ 0.0001( 中位数， 四分位数间距 ))。对照免 疫的动物仅具有背景水平 (A405nm ＝ 0 和 0.01(0， 0.01)( 中位数， 四分位数间距 ))。以较低 的关节炎细菌剂量感染的免疫小鼠与其中诱导了脓毒症的小鼠产生了相似的针对 rClfA 和 rClfAPY 的抗体反应 ( 数据未显示 )。以 rClfA 和 rClfAPY 免疫均具有对于发生关节炎 的保护， 虽然这种保护不是显著性的 ( 图 9)。
     在感染后第 5 至 9 天内， 与对照小鼠相比， 在 rClfAPY 和 rClfA 免疫的小鼠中重量 损失显著减少 ( 数据未显示 )。
     观察到在感染后第 11 天， 以 rClfAPY 和 rClfA 免疫的小鼠的肾脏中细菌生长的减 少趋势 (BSA ： 38(3， 436) ； rClfAPY ： 7(2， 17) ； rClfA ： 10(7， 54)×107cfu/ 对肾脏 )。
     为了获得不同免疫组中特异性抗体反应的更精确的测定， 在数个血清稀释度 ( 第 二轮 ) 中确定了反应。数据显示 ： 在以脓毒性和关节炎细菌剂量感染的小鼠中， 与来自 rClfA 野生型免疫的小鼠的血清相比， 来自 rClfAPY 免疫小鼠的血清的特异性抗体对于 rClfAPY 和 rClfA 野生型抗原的效价都较高， 这是因为， 在所有的比较中， 以 rClfAPY 免疫 的小鼠的每个血清稀释度中按照吸光度测定的抗体反应都显著较高 (P ＜ 0.0001 至 P ＝ 0.008， 图 12-15)。BSA 免疫仅引发了背景抗体反应。
     结论
     结果强烈表明 ： ClfA- 纤维蛋白原相互作用对于细菌毒力和疾病后果至关重要。 在引起脓毒性死亡的能力方面， ClfA 与纤维蛋白原结合的能力与增强的毒力相关。在所测 的两个葡萄球菌菌株中， clfAPY 突变体诱导的脓毒性死亡都低于野生型。同样， 在感染了 非纤维蛋白原结合性 clfAPY 突变体的小鼠中， 关节炎的严重性显著降低。
     纤维蛋白原 - 细菌细胞表面相互作用对于毒力的促进的一个可能机理是对于嗜 中性粒细胞的吞噬作用的抑制 (5)。嗜中性粒细胞对于金黄色葡萄球菌感染早期的宿主防 御是至关重要的 (13)。如果没有嗜中性粒细胞， 血液和肾脏中的细菌生长将强烈扩大， 关 节炎的频率和死亡率增加。通过 ClfA 进行的纤维蛋白原介导的对于嗜中性粒细胞的吞噬 作用的抑制可以至少部分解释野生型金黄色葡萄球菌相对于 clfAPY 突变体的更强烈的毒力。纤维蛋白原与 ClfA 的结合能够通过减少调理素沉积或通过减少嗜中性粒细胞受体与 调理素的接触而降低嗜中性粒细胞的调理吞噬。备选地， 结合的纤维蛋白原可能阻断未知 的保护性宿主因子与金黄色葡萄球菌的结合。另一个可能是纤维蛋白原 -ClfA 相互作用促 进细菌通过血管进入组织或促进在组织中的群集。
     出人意料的是， 我们的数据还表明， ClfA 无效突变体比 clfAPY 突变体菌株的毒力 更强。ClfA 蛋白有可能在体内具有除了与纤维蛋白原相互作用之外的功能。如本研究所 示， 这种相互作用对于宿主而言显然是不利的。ClfA 的其它功能至今不明， 但是 ClfA 表现 出来的非纤维蛋白原依赖性血小板的聚集可能导致循环中的大量金黄色葡萄球菌的捕获， 进而通过网状内皮组织系统将细菌 - 血小板复合物清除。在野生型和 clfAPY 突变菌株中 将容易地发生这种血小板聚集介导的葡萄球菌的清除， 但是在 clfA 敲除体中则不会发生。 虽然在野生型菌株中纤维蛋白原相互作用将掩盖其它事件， 但是在 clfAPY 突变体中这样 的细菌清除可能对于宿主是非常有益的。
     clfA 敲除突变体对于脓毒性死亡的保护程度与金黄色葡萄球菌菌株 LS-1 中的 clfAPY 突变体是相同的， 但是在菌株 Newman 中保护较少， 如果有所保护的话。ClfA 表达对 于细菌毒力的总体影响在不同的金黄色葡萄球菌菌株之间可以是不同的， 这取决于其它毒 力因子的表达水平和存在。
     考虑到在发炎的滑液中纤维蛋白原和纤维蛋白含量丰富， 关于 “clfAPY 突变体在 关节腔中是否显示出同样的或较低的毒力” 的问题是有一定的重要意义的。我们的数据表 明， clfAPY 突变体对于软骨和骨的破坏性较低。
     重组 ClfA A 结构域非纤维蛋白原结合性 P336Y338 突变体的保护效应比野生型 rClfA 更高。以 ClfAPY 进行免疫非常可能诱导更好的免疫反应， 因为针对免疫原和野生型 ClfA 蛋白均引发了更高的特异性抗体反应。 更重要的是， 其比野生型 ClfA 诱导产生更大的 抵抗脓毒性死亡的保护性免疫反应。
     总之， 我们的结果表明 rClfAPY 是比野生型重组 ClfA 更好的候选疫苗。 我们假设 ： 由于 ClfA 分子中的重要表位的掩藏， 所以在免疫期间野生型 ClfA 蛋白与纤维蛋白原的结 合降低了抗原呈递， 因此破坏了特异性抗体的产生。
     实施例 2
     包含 N2 和 N3 的 rClfA A 区域截短物 (rClfA 221-559)
     材料和方法
     在本实施例中沿用实施例 1 中所示的程序， 其中使用了
     -rClfA 221-559( 即包含对应于氨基酸 220-559 的 N2 和 N3 的 ClfA A 区域截短 物)
     -rClfAPY221-559 ； 和
     -BSA。
     每组有 15 只雌性 NMRI 小鼠， 在实验开始时其为 8 周龄。在本实施例中， 用于免疫 的构建体为 ClfA 野生型 / 原态 N2N3 截短物、 具有如实施例 1 中定义的突变 PY 的 ClfA N2N3 截短物。BSA 用作对照。
     以野生型和突变体重组 ClfA 进行疫苗接种
     根据实施例 1 的程序以 rClfA 221-559、 rClfAPY 221-559 或 BSA 对小鼠进行免疫。 将纯化的 rClfA221-559、 rClfAPY221-559( 即 ClfAPYI 重组蛋白 A 亚结构域 N2 和 N3) 或 BSA 溶解于 PBS 中并与弗氏完全佐剂以 1 ∶ 1 进行乳化。在第 0 天将 200μl 含有 30μg( ＝ 0.79nmol) 蛋白的乳液通过皮下注射。在第 12 天以不完全的弗氏佐剂中的生理 盐水中的 30μg 蛋白进行第一次加强免疫。在第 22 天进行第二次加强免疫。在第 31 天将 小鼠放血， 将血清冷冻用于后续的抗体反应分析。
     特异性抗体 -ELISA
     在第二次加强免疫之后 9 天从免疫小鼠获取血清样品。通过 ELISA 测定针对 rClfA221-559 和 rClfAPY221-559 的血清特异性抗体反应。以 PBS 中的 5μg/ml 的重组蛋 白包被微板 (96- 孔 ； Nunc)。封闭试剂、 血清样品、 生物素化的抗体和 ExtrAvidin- 过氧化 物酶均在 PBS 中稀释。根据以前的描述 (8) 进行该检验。所有的血清样品以 1 ∶ 5000、 1 ∶ 20000、 1 ∶ 80000 和 1 ∶ 320000 进行稀释， 以 405nm 处的吸光度监测抗体反应。
     结果
     特异性抗体反应
     按照实施例 1， 以 4 个不同的血清稀释度在 ELISA 检验中通过吸光度测定抗体反 应。获得的数据与实施例 1 中的数据非常相似。
     发现相对于以原态 rClfA221-599 进行的免疫， 以 rClfAPY221-559 进行的免疫非 常可能产生较高效价的针对原态 rClfA221-559 和 rClfAPY221-559 的特异性抗体， 因为除 了一个以外， 在所有的对比中， 在每个血清稀释度， 以 rClfAPY221-559 进行免疫的小鼠都 具有显著较高的以吸光度测定的抗体反应 (P ＝ 0.001 至 0.025， 见图 16 和 17)。BSA 免疫 仅引发背景水平的抗体反应。
     结论
     我们发现， 以 rClfAPY221-559 蛋白进行的免疫产生的针对免疫原和野生型 ClfA 蛋白的抗体反应都显著高于以原态蛋白进行的免疫。
     基于这些发现， 我们得出结论 ： 无论是实施例 1 中的包含氨基酸 40-550 的还是实 施例 2 中包含氨基酸 221 至 559 的 PY 蛋白， 以 PY- 免疫都引发比相应大小的原态 ClfA 进 行的免疫更好的免疫反应。
     实施例 3
     ClfA A 区域截短物 (δ/Δ 锁闭截短物 )
     材料和方法
     在本实施例中沿用实施例 1 中所示的程序， 其中使用了以下构建体
     -rClfA 221-531( 即包含 N2 和 N3 氨基酸 220-559 但不含锁闭肽氨基酸 532-538 和随后的富含脯氨酸残基的 rClfA A 区域截短物 )。
     每组有 15 只雌性 NMRI 小鼠， 在实验开始时其为 8 周龄。在本实施例中， 使用上述 构建体用于免疫。根据实施例 1 中的程序以上述截短物免疫小鼠。
     以野生型和突变体重组 ClfA 进行疫苗接种
     将纯化的 rClfA221-531 溶解于 PBS 中并与弗氏完全佐剂以 1 ∶ 1 进行乳化。在 第 0 天将 200μl 含有 0.79nmol 蛋白的乳液通过皮下注射。在第 12 天以不完全弗氏佐剂 中的生理盐水中的 0.79nmol 蛋白进行第一次加强免疫。在第 22 天进行第二次加强免疫。
     在第 31 天将小鼠放血， 将血清冷冻用于后续的抗体反应分析。
     特异性抗体 -ELISA
     在第二次加强免疫之后 9 天从免疫小鼠获取血清样品。通过 ELISA 测定特异性抗 体的血清水平。以 4.6μg/ml 的 rClfA221-531 蛋白包被微板 (96- 孔 ； Nunc)， 所述蛋白量 与实施例 1 和 2 中的 5μg/ml 的 rClfA221-559 和 rClfAPY221-559 是等摩尔量的。封闭试 剂、 血清样品、 生物素化的抗体和 ExtrAvidin- 过氧化物酶均在 PBS 中稀释。根据以前的描 述 (8) 进行该检验。所有的血清样品以 1 ∶ 5000、 1 ∶ 20000、 1 ∶ 80000 和 1 ∶ 320000 进 行稀释， 以 405nm 处的吸光度监测抗体反应。
     结果
     按照实施例 1， 以 ELISA- 检验中的吸光度测定抗体反应。 发现以 rClfA221-531 进 行的免疫产生免疫反应， 如特异性抗体反应所测 ( 图 18)。
     结论
     我们发现， rClfA221-531 作为免疫原发生作用， 因为该抗原引发特异性抗体反应。
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     本发明涉及改进的微生物抗原疫苗、 药物组合物、 免疫原性组合物和抗体及其在 治疗微生物感染， 特别是细菌来源的， 包括葡萄球菌 (Staphylococcal) 来源的微生物感染 中的用途。
     多重耐药性 (MDR) 是革兰氏阳性细菌尤其是医院中的日益严重的问题。抗生素和 其它治疗细菌感染的试剂的广泛使用已经引起细菌迅速产生针对所述试剂的抗性， 很多细 菌具有多重耐药性。因此， 目前需要提供改进的处理这样的耐药性感染的治疗。
     葡萄球菌是球形的革兰氏阳性细菌， 其通常按照葡萄样不规则成簇排列。有一些 是人类皮肤和粘膜的正常菌丛 (flora) 的成员， 其它的则引起化脓、 脓肿形成、 多种化脓性 感染， 甚至是致命的败血病。 致病性葡萄球菌通常引发溶血、 使血浆凝固并产生多种细胞外 酶类和毒素。
     葡萄球菌属中有至少 30 个种。具有临床重要性的三个主要种是金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、 表皮葡萄球菌 (Staphylococcus epidermidis) 和腐生葡萄球 菌 (Staphylococcus saprophyticus)。金黄色葡萄球菌是凝固酶阳性的， 这将其与其它的 种区分开。金黄色葡萄球菌是对于人类的主要病原体。几乎每个人在其一生中都具有一 些类型的金黄色葡萄球菌感染， 从食物中毒的严重性或轻微皮肤感染到严重的威胁生命的 感染。凝固酶阴性的葡萄球菌是正常的人类菌丛， 其有时引起感染， 通常与移植装置相关， 特别是在非常年幼的、 年老的和免疫缺陷的患者中。大约 75％的由凝固酶阴性的葡萄球 菌引起的感染都是由表皮葡萄球菌引起的。由沃氏葡萄球菌 (Staphylococcus warneri)、 人葡萄球菌 (Staphylococcus hominis) 和其它种引起的感染较不常见。腐生葡萄球菌 是年轻妇女中尿道感染的相对常见的诱因。葡萄球菌产生过氧化氢酶， 这将其与链球菌 (streptococci) 区别开来。路邓葡萄球菌 (S.lugdunensis) 也是临床相关的， 其存在于大 约 5-10％的感染性心内膜炎的病例中。
     在关节空间内， 金黄色葡萄球菌在主要成分为胶原的关节软骨内的定殖似乎是促 成脓毒性关节炎产生的重要因素。造血性获得的细菌性关节炎仍然是严重的医学问题。这 种迅速进展和高度破坏性的关节病难以根除。通常而言， 不产生严重的关节损伤的话， 有 50％以下的感染患者难以恢复。 金黄色葡萄球菌是从具有造血性和继发性骨髓炎的成年患 者中分离而来的主要病原体。
     在住院患者中， 葡萄球菌例如金黄色葡萄球菌是主要的感染诱因。伤口或留置的 医疗器械的最初局部感染能够导致更严重的侵入性感染例如败血病、 骨髓炎、 乳腺炎和心 内膜炎。在与医疗器械有关的感染中， 在移植之后较短时间内塑料和金属表面被宿主血浆 和基质蛋白例如纤维蛋白原和纤连蛋白包被。 金黄色葡萄球菌和其它葡萄球菌粘附到这些 蛋白上的这种能力对于感染的起始是必不可少的。 血管移植物、 静脉内导管、 动脉心瓣膜和 心脏辅助装置是血栓形成性的， 易于细菌的群集。一般而言， 在葡萄球菌中， 金黄色葡萄球 菌是这些感染中最具破坏性的病原体。
     在世界范围内的医院中已经观察到了对目前可用的治疗感染的多数抗生素呈现
     抗性的金黄色葡萄球菌分离体的显著增加。抵抗金黄色葡萄球菌的青霉素的开发是感染 控制和治疗中的一大进步。不幸的是， 青霉素抗性的生物迅速出现， 迫切需要新的抗生 素。随着每种新的抗生素的引进， 金黄色葡萄球菌能够对抗 β- 内酰胺酶——改变的青霉 素结合蛋白， 以及允许细菌存在的突变的细胞膜蛋白。因此， 出现了甲氧苯青霉素抗性的 金黄色葡萄球菌 (MRSA) 和多重耐药的生物并且在全世界的医院和疗养院留下了主要足迹 (Chambers， H.F.， Clin Microbiol Rev， 1： 173， 1988 ； 和 Mulligan， M.E. 等人， AmJ Med， 94 ： 313， 1993)。 目前， 引起医院中的感染的葡萄球菌菌株中几乎有一半对于除了万古霉素以外 的所有抗生素都是抗性的， 似乎万古霉素变得无效也只是时间的问题。
     因此， 迫切且日益需要用于治疗葡萄球菌例如金黄色葡萄球菌感染的治疗剂， 所 述治疗剂有效抵抗那些抗生素抗性的细菌菌株。
     在革兰氏阳性病原体例如葡萄球菌、 链球菌和肠球菌中， 被称为粘附素 (adhesin) 的蛋白通过例如促进群集、 附着至血液凝块和使组织受损而介导这样的感染。这些特异性 微生物表面粘附素被称为 MSCRAMM( 微生物表面成分识别性粘附基质分子 )(Patti， J. 等 人， Ann Rev Microbiol， 48 ： 585-617， 1994 ； Patti， J.and Hook， M.， Cur Opin Cell Biol.， 6： 752-758， 1994)。MSCRAMM 特异性识别并结合至细胞外基质 (ECM) 成分， 例如纤连蛋白、 纤维蛋白原、 胶原和弹性蛋白。在很多革兰氏阳性病原体中发现了这些 MSCRAMM， 其氨基酸 序列是相关的， 它们具有相似的模块 (modular) 设计和共同的结合结构域组构。 细菌细胞表面上的 MSCRAMM 和宿主组织内的配体以锁钥模式相互作用， 从而导致 细菌粘附至宿主。细菌生存通常需要粘附， 其帮助细菌规避宿主的防御机制和抗生素的挑 战。 一旦细菌成功粘附并群集在宿主组织中， 其生理即被显著改变， 并且分泌破坏性成分例 如毒素和酶。此外， 粘附细菌通常产生生物膜并迅速对多数抗生素的杀灭效应产生抗性。
     细菌能够表达识别多种基质蛋白的 MSCRAMM。MSCRAMM 中的配体结合位点似乎是 由氨基酸序列的相对较短的连续区段 ( 基序 ) 决定的。因为在几种不同的细菌物种中可 以发现相似的基序， 所以这些功能性基序似乎会进行种间转移 (Patti and Hook， Cur Opin Cell Biol， 6： 752-758， 1994)。另外， 有时单一的 MSCRAMM 能够结合数个 ECM 配体。
     MSCRAMM 能够通过与包括纤维蛋白原 (Fg) 和 / 或纤连蛋白 (Fn) 等的蛋白结合而 介导感染。纤维蛋白原和纤连蛋白是在血浆中发现的蛋白， 其在止血和凝固中发挥重要作 用。
     纤维蛋白原由 6 条多肽链组成 ： 2 条 Aα、 2 条 Bβ 和 2 条 γ- 链。γ- 链的 C 末端 部分在生物学上是重要的， 并且在血小板吸附和聚集中与血小板整联蛋白相互作用。该区 域也是金黄色葡萄球菌靶定的， 导致纤维蛋白原依赖性的细胞聚集和组织吸附。
     金黄色葡萄球菌具有数个表面表达的蛋白， 其刺激血小板激活和聚集。金黄色葡 萄球菌的 MSCRAMM 蛋白包括但不限于下列蛋白 ：
     - 纤维蛋白原结合蛋白聚集因子 A(ClfA) ；
     - 纤维蛋白原结合蛋白聚集因子 B(ClfB) ；
     - 纤连蛋白 - 纤维蛋白原结合蛋白 A(FnBPA) ；
     - 纤连蛋白 - 纤维蛋白原结合蛋白 B(FnBPB) ； 和
     - 金黄色葡萄球菌表面蛋白 SasA、 SasG、 SasK 等。
     下表 1 列举了各种金黄色葡萄球菌细胞壁锚定表面蛋白的选集
     细菌能够表达识别多种基质蛋白的 MSCRAMM。MSCRAMM 中的配体结合位点似乎是 由氨基酸序列的相对较短的连续区段 ( 基序 ) 决定的。因为在几种不同的细菌物种中可 以发现相似的基序， 所以这些功能性基序似乎会进行种间转移 (Patti and Hook， Cur Opin Cell Biol， 6： 752-758， 1994)。另外， 有时单一的 MSCRAMM 能够结合数个 ECM 配体。
     MSCRAMM 能够通过与包括纤维蛋白原 (Fg) 和 / 或纤连蛋白 (Fn) 等的蛋白结合而 介导感染。纤维蛋白原和纤连蛋白是在血浆中发现的蛋白， 其在止血和凝固中发挥重要作 用。
     纤维蛋白原由 6 条多肽链组成 ： 2 条 Aα、 2 条 Bβ 和 2 条 γ- 链。γ- 链的 C 末端 部分在生物学上是重要的， 并且在血小板吸附和聚集中与血小板整联蛋白相互作用。该区 域也是金黄色葡萄球菌靶定的， 导致纤维蛋白原依赖性的细胞聚集和组织吸附。
     金黄色葡萄球菌具有数个表面表达的蛋白， 其刺激血小板激活和聚集。金黄色葡 萄球菌的 MSCRAMM 蛋白包括但不限于下列蛋白 ：
     - 纤维蛋白原结合蛋白聚集因子 A(ClfA) ；
     - 纤维蛋白原结合蛋白聚集因子 B(ClfB) ；
     - 纤连蛋白 - 纤维蛋白原结合蛋白 A(FnBPA) ；
     - 纤连蛋白 - 纤维蛋白原结合蛋白 B(FnBPB) ； 和
     - 金黄色葡萄球菌表面蛋白 SasA、 SasG、 SasK 等。
     下表 1 列举了各种金黄色葡萄球菌细胞壁锚定表面蛋白的选集
     表1
    aa， 以氨基酸表示的蛋白长度。
     蛋白识别和结合的分子成分。 c
     分选酶识别的且存在于 C 末端细胞壁分选信号中的共有基序。 d
     以细胞壁表面蛋白为底物的分选酶。 e
     TNFR ： 肿瘤坏死因子受体。 f
     也与脱落的上皮细胞中的蛋白结合。促进对杀菌脂质和乳铁蛋白的抗性。 g
     也与脱落的鼻上皮细胞结合。参与生物膜的形成。
     其它的葡萄球菌表达类似于以上所列出的聚集因子或结合蛋白的表面表达的蛋 白 (MSCRAMM)。这些包括但不限于 ：
     - 来自表皮葡萄球菌的 SdrF、 SdrG 和 SdrH， 其中已经表明 SdrG/F 与纤维蛋白原和 胶原结合。
     - 来自路邓葡萄球菌的 Fbl 是与纤维蛋白原结合的蛋白。Fbl 是 Sdr 家族的成员， Sdr 家族是一组含有特征性丝氨酸 - 天冬氨酸重复区的葡萄球菌细胞表面蛋白。已经测绘 出 Fbl 的纤维蛋白原结合结构域为 313 个氨基酸， 并且与来自金黄色葡萄球菌的聚集因子 A(ClfA) 的相应区域具有 62％的同一性。
     其它的与配体结合的蛋白 / 粘附素包括 Isd 蛋白 ( 离子调控的表面决定子 )， 虽然 它们全部都不是 MSCRAMM 本身 ( 例如 IsdB 和 IsdH)， 但是它们促进细菌粘附至细胞外基质 成分， 在本文中将它们称为 “MSCRAMM 样蛋白” 。已经知道 IsdA 促进向鳞状细胞的粘附， 并 且对于纤维蛋白原和纤连蛋白的亲和性弱， 所以在技术上将其定义为 MSCRAMM。
     聚集因子 A(ClfA) 是第一个被鉴定出来的与纤维蛋白原的 γ- 链结合的金黄色葡 萄球菌粘附素。 随后认识到纤连蛋白 - 纤维蛋白原结合蛋白 A(FnBPA) 和纤连蛋白 - 纤维蛋 白原结合蛋白 B(FnBPB) 是与 Fg 的 γ- 链中相同的 C 末端肽区段结合的双功能蛋白。ClfA 和 FnBP 具有在革兰氏阳性菌中表达的所有细胞壁锚定蛋白包括 ClfB 共有的结构特征。
     例如， 聚集因子 A(ClfA) 是金黄色葡萄球菌的位于表面上的蛋白。ClfA 是金黄色 葡萄球菌的重要毒力因子。 其促成脓毒性关节炎和心内膜炎的病理发生。 ClfA 是具有相似 的结构 / 模块组构的表面结合蛋白家族 ( 包括但不限于 ClfB、 SdrD、 SdrE 等 ) 的原始型。
     ClfA 含有 520 个氨基酸的 N 末端 A 结构域 ( 纤维蛋白原结合区域 )， 其包括三个 单独折叠的亚结构域 N1、 N2 和 N3。A 结构域后面是丝氨酸 - 天冬氨酸二肽重复区域以及 细胞壁和膜跨越区域， 其含有用于分选酶促进的向细胞壁锚定的 LPDTG 基序。ClfA 实际上
    ba存在于所有的金黄色葡萄球菌菌株中 (Peacock SJ， Moore CE， Justice A， Kantzanou M， Story L， Mackie K， O′ NeillG， Day NPJ(2002)Virulent combinations of adhesin and toxin genes in natural populations of Staphylococcus aureus.Infect Immun 70 ： 4987-4996)。 其与纤维蛋白原的 γ- 链的 C 末端结合， 因此能够诱导纤维蛋白原溶液中的细 菌聚集 (McDevitt D， Nanavaty T， House-Pompeo K， Bell E， Turner N， McEntire L， Foster T， M(1997)Characterization of the interaction between the Staphylococcus aureus clumping factor(ClfA)and fibrinogen.Eur J Biochem247 ： 416-424 ； 和 McDevitt D， Francois P， Vaudaux P， Foster TJ(1994)Molecular characterization of the clumping factor(fibrinogen receptor)ofStaphylococcus aureus.Mol Microbiol 11 ： 237-248)。
     对 ClfA 和相关的纤维蛋白原结合蛋白 SdrG 和 ClfB 进行的三维结构分析已经 揭示 ： 在所有这些相关蛋白中， 配体结合 A 结构域均由三个亚结构域 N1、 N2 和 N3 组成， 其中对应于区域 N2-N3 的残基 221-559 是最小的保留与纤维蛋白原结合能力的截短物 (truncate)。已经发现氨基酸残基 532 至 538 对应于 ClfA 的锁闭肽 (latching peptide) 区域。每个亚结构域包含 9 个 β 链， 其构成新的 IgG 型折叠。这些蛋白中的纤维蛋白原 γ 链肽结合位点位于 N2 和 N3 之间的节点的疏水槽。已经发现这些蛋白的三维结构存在显著 的结构相似性， 这是由于存在一个或多个相关的氨基酸序列、 相似的模块设计和共同的结 合结构域组构。
     SdrC、 SdrD、 SdrE、 FnBPA-A( 所有 7 个同型 ) 和 FnBPB-B( 所有 7 个同型 ) 具有相 似的模块组构， 因此使用 PHYRE 分子模型， 预期这些蛋白将具有相同的三维结构。
     IsdA 和 IsdB 不具有与 Clf 或 Sdr 蛋白相同类型的结构。 它们具有新的被称为 NEAT 的基序， 该基序参与配体结合。 但是， NEAT 基序由 β 链夹心结构组成 ( 由 2 个 5 条链的反平 行 β 片层组成的 β 夹心折叠 ) 并且是 Ig 超家族成员 (Pilpa 等人 “Solution Structure of the NEAT(NEAr Transported)Domain from IsdH/HarA ： the Human Hemoglobin Receptor in Staplococcus aureus” J.Mol.Biol.(2006)360 ： 435-447)， 从这个意义上来讲， NEAT 基 序与 Clf 或 Sdr 的三维结构是相似的。已经解决了 IsdH 的 NEAT 基序的三维结构并预测了 环 1b-2 中的残基。
     金 黄 色 葡 萄 球 菌 上 ClfA 的 表 达 阻 碍 巨 噬 细 胞 和 嗜 中 性 粒 细 胞 的 吞 噬 作 用 (Palmqvist N ，Patti JM ，Tarkowski A ，Josefsson E(2004)Expression of staphylococcal clumping factor A impedes macrophage phagocytosis.Microb Infect 6： 188-195 ； 和 Higgins J， Loughman A， van Kessel KPM， van Strijp JAG， Foster TJ(2006) Clumping factor A of Staphylococcus aureus inhibits phagocytosis by human polymorphonuclear leukocytes.FEMS Microbiol Lett258 ： 290-296)。在嗜中性粒细胞 中， 这是由纤维蛋白原依赖性机制和纤维蛋白原非依赖性机制共同造成的。相反， 细菌表 达的 ClfA 通过与 GPIIb/IIIa 发生相互作用而激活血小板， 从而导致聚集。当纤维蛋白 原存在时， 这个作用进行得最为有效 ； 但是还存在血小板激活的纤维蛋白原非依赖性途径 (Loughman A， Fitzgerald JR， Brennan MP， Higgins J， Downer R， Cox D， FosterTJ(2005) Roles of fibrinogen， immunoglobulin and complement in platelet activation promoted by Staphylococcus aureus clumping factor A.Mol Microbiol 57 ： 804-818 ；和 O ′ Brien L， Kerrigan SW， Kaw G.， Hogan M.， PenadésJ.， Litt D.， Fitzgerald D.J.， Foster T.J.&Cox D.(2002)Multiple mechanisms for the activation of human platelet aggregation by Staphylococcus aureus ： roles for the clumping factors ClfA and ClfB， the serine-aspartate repeat protein SdrE and protein A.Mol Microbiol 44， 1033-1044)。
     ClfA 是 诱 导 小 鼠 中 的 脓 毒 性 关 节 炎 的 毒 力 因 子 (Josefsson E.， Hartford O.， O ′ Brien L， Patti JM， Foster T(2001)Protection against experimental Staphylococcus aureus arthritis by vaccination with clumping factor A， a novel virulence determinant.J Infect Dis 184 ： 1572-1580)。此外， ClfA 连同另一种纤维蛋 白原结合蛋白 ClfB 的消除引起在感染早期抵抗全身性炎症的保护 (Palmqvist N， Foster T， Fitzgerald R， Josefsson E， Tarkowski A(2005)Fibronectin-binding proteins and fibrinogen-binding clumping factors play distinct roles in staphylococcal arthritis and systemic inflammation.J Inf Dis191 ： 791-798)。
     已经分离并且表征了金黄色葡萄球菌的纤维蛋白原结合蛋白 ClfA， 其为例如美国 专利号 6,008,341 和 6,177,084 的主题。 ClfA 和 ClfB 具有相同的结构 ( 三维 ) 组构和大约 27％的氨基酸同一性。FnBPA 与 ClfA 具有大约 25％的氨基酸同一性。
     目前尚无基于 MSCRAMM 的疫苗被批准并上市。 是一种供体选择的葡 萄球菌静脉内人类免疫球蛋白 (IGIV)， 其靶向 ClfA 和 SdrG， 由于在 III 期临床试验表现较 差， 所以从临床试验被撤销。目前正在重新评估以确定它是不是葡萄球菌感染的可行性治 疗。
     WO 2005/116064 涉及 FnBPA， 其为金黄色葡萄球菌的多功能结合蛋白。FnBPA 的 N 末端 A 结构域类似于 ClFA， 已经发现其与纤维蛋白原结合。但是， FnBPA 的 C 末端 BCD 结构 域与纤连蛋白结合， 因此， FnBPA 是双功能的 MSCRAMM。
     WO 2005/116064 基于以下发现 ： 在存在转谷氨酰胺酶的情况下， 在细菌粘附素 FnBPA 和宿主蛋白纤连蛋白之间形成共价连接， 从而使得结合更加强烈并基本上是不可逆 的。纤维蛋白原是血液中的主要成分 ( ～ 3mg/ml)， 在血液中其作为凝固级联的最终靶标。 纤连蛋白含量较低， ～ 0.3mg/ml 或者对于每 10-15 个纤维蛋白原有一个 Fn 分子。纤维蛋 白原和纤连蛋白被认为与血液无关， 在血液中它们独立地循环。
     重要的是， WO 2005/116064 特别涉及因子 XIIIa 催化的共价交联。 WO2005/116064 分离了重组 FnBPA 中的多个突变体， 其中具有带正电荷侧链的残基 ( 即转谷氨酰胺酶底物 ) 被改变。此外， WO 2005/116064 涉及具有改变的共价纤连蛋白结合特性而非只有纤维蛋白 原结合特性的突变体。 此外， 该文献没有通过实验证明突变蛋白与配体的结合是否减少， 并 且没有提供任何支持性的免疫原性数据。
     因此， 鉴于多重耐药性在革兰氏阳性菌中的流行以及对这些多重耐药性细菌的成 功治疗和疫苗的缺乏， 任何能够不使用抗生素来处理这样的细菌感染的替代性治疗将具有 重要意义。
     此外， 对于任何已知的治疗或疫苗的效力的任何改进将具有重要意义， 特别是在 临床环境中。
     因此， 本发明旨在提供治疗这样的细菌感染的替代性和改进的治疗法。发明内容 根据本发明的第一个一般性方面， 提供了对其宿主配体的结合减少的重组葡萄球 菌 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白或其片段， 用于治疗。
     根据优选的实施方式， 提供了不具有结合纤维蛋白原的能力的重组葡萄球菌纤维 蛋白原结合性 MSCRAMM 蛋白或其包含至少一部分纤维蛋白原结合区域的片段， 用于治疗。
     根据本发明的第二方面， 提供了在个体中诱导免疫反应的方法和 / 或治疗患有微 生物感染的患者的方法， 其包括给予所述个体对其宿主配体的结合减少的重组葡萄球菌 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白或其片段， 或包含所述重组葡萄球菌 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白 或其片段的疫苗。
     根据本发明的第三方面， 提供了包含对其宿主配体的结合减少的重组葡萄球菌 MSCRAMM 蛋白或其片段的疫苗。
     根据本发明的第四方面， 提供了针对对其宿主配体的结合减少的重组葡萄球菌 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白或其片段而产生的抗体， 优选为超免疫血清的形式。
    根据本发明的第五方面， 提供了免疫原性药物组合物， 其包含对其宿主配体的结 合减少的重组葡萄球菌 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白或其片段以及药学上可接受的佐剂。
     详细描述
     在本说明书中， 术语 “粘附素” 、 “MSCRAMM” 和 “细胞壁锚定蛋白” 将被理解为可以 相互替换并且涵盖所有的源自微生物的配体结合蛋白。理想地， 这些蛋白与纤维蛋白原、 血红素或血红蛋白、 触珠蛋白 - 血红蛋白、 氯化血红素、 胶原和其它这样的配体结合。术语 “MSCRAMM 样” 蛋白旨在涵盖与这样的 MSCRAMM 蛋白具有相关的氨基酸序列、 相似的模块设 计和 / 或共同 / 相似的结合结构域组构 (organization) 的蛋白或粘附素， 例如 Isd 蛋白。 理想地， MSCRAMM 样蛋白具有相似的结合结构域组构 / 模块设计。另外， MSCRAMM 样蛋白与 MSCRAMM 蛋白可以具有至少 50％、 优选 60％、 优选 75％、 更优选 85％、 还更优选 95％， 又更 优选 99％或更高的氨基酸序列同一性。
     还应该理解， 本说明书所称的任何百分比同一性或同源性是使用可获得的常规方 法在序列的整个 / 完整长度上确定的。
     术语 “微生物 (micro-organism)” 、 “微生物 (microbe)” 、 “微生物的 (microbial)” 或类似的术语包括但不限于下列生物体， 包括 ： 细菌、 真菌、 病毒、 酵母和 / 或霉菌。
     术语 “免疫有效数量” 包括能够刺激 B 细胞和 / 或 T 细胞反应的那些量。
     根据本发明的第一个一般性方面， 提供了对其宿主配体的结合减少的重组葡萄球 菌 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白， 或其片段， 其包含至少一部分配体结合区域， 用于治疗。这 样的重组蛋白可用于治疗微生物感染， 例如治疗脓毒症、 脓毒性关节炎和 / 或心内膜炎或 其它类似的病状或疾病状态。 这样的微生物感染理想地是由葡萄球菌或其它类似的微生物 引起的。
     根据本发明的这个方面的一个特定实施方式， 所述重组 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋 白或其片段具有减少的或不具备与其宿主配体非共价结合的能力。
     因此， 应该理解， 重组葡萄球菌 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白或其片段可能具有减少
     的与其宿主配体的结合或者与其宿主配体的结合被阻止。
     根据本发明推论 ： MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白通过坞、 锁和锁闭 (Dock， Lock and Latching(DLL)) 与其配体结合过程中发生的非共价结合可能被减少或阻止。已经证明 MSCRAMM 与其配体结合的第一个步骤涉及通过 DLL 模型进行的非共价相互作用。这些是 MSCRAMM 与配体的首要的非共价相互作用。MSCRAMM- 配体结合的最后阶段涉及共价相互作 用。在这个特定实施方式中， 由于改变的坞、 锁和锁闭， 重组 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白或 其片段具有减少的或不具备与其宿主配体非共价结合的能力。一个或多个坞、 锁或锁闭步 骤可以被改变。
     DLL 模型是从 SdrG 与其配体的复合物的三维结构中阐明的。现在已经表明 ClfA 通过 DLL 机制的微小变化发挥作用 (Ganech 等人 (2008)“Astructural model of the Staphylococcus aureus Clfa-fibrinogen interaction opens new avenues for the design of anti-staphylococcal therapeutics” .PloS Pathog4(11) ； e1000226)。DLL 模 型特别涉及参与配体结合的非共价相互作用。对于所有其它的相似结构类型 ( 无论是按照 氨基酸相似性 / 同源性还是按照结构组构同源性 ) 的蛋白均推断具有 DLL 模型， 包括但不 限于 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白。 特别在涉及 MSCRAMM ClfA/ClfB 时， 发现最小配体结合结构域包含区域 A 的亚区 域 N1 至 N3， 特别是包含变体 Dev-IgG Ig 折叠的亚区域 N2 和 N3。变体 Dev-IgG Ig 折叠是 免疫球蛋白基序的新变体， 其也被称为 DE 变体。据推论， 在 ClfA/B 的两个 DEv-IgG 结构域 之间形成的疏水袋是纤维蛋白原 γ- 链的配体结合位点。实质上， 配体与分隔 N2 和 N3 的 疏水槽结合。特别地， 在配体结合过程中， 配体的未折叠肽成分插入位于 N2 和 N3 亚结构域 之间的槽。亚结构域 N3 的 C 末端的锁闭肽发生构象变化并插入亚结构域 N2 的两条 B 链 之间， 因此， 将配体锁定在适当位置。确实， 聚集因子中的残基 Tyr256、 Pro336、 Tyr338 和 408 411 Lys389( 它们被认为是与纤维蛋白原的 γ 链末端残基 AGDV 接触 ) 的突变取代使得该 蛋白丧失或显著降低其对纤维蛋白原的亲和力。下文将详述该具体实施方式的更多细节。
     虽然这些教导涉及聚集因子， 尤其是 ClfA， 但是它们同样适用于其它具有类似模 块结合结构域组构和以相似方式与配体结合的 MSCRAMM 和 / 或 MSCRAMM 样蛋白。
     因此， 为了提供对其宿主配体的结合减少的重组葡萄球菌 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样 蛋白或其片段， 可以改变全长蛋白、 配体结合结构域、 最小配体结合结构域或其片段以减少 或阻止与其宿主配体的结合。理想地， 对于 ClfA/ClfB 或其它类似 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样 蛋白， 可以改变区域 A 的亚区域 N2 和 N3( 其理想地包含变体 Dev-IgG Ig 折叠 ) 以阻止或 减少与其宿主配体的结合。这样的改变被设计为阻止配体与疏水槽的结合， 所述疏水槽分 隔 DLL 所需的最小配体结合结构域。
     可以使用全长蛋白、 配体结合结构域、 最小配体结合结构域或其片段， 通过氨基酸 取代或删除， 使配体结合结构域在氨基酸水平发生这样的改变。 应该理解， 还可以使用与配 体结合蛋白具有足够高的同源性的蛋白或其片段。本文定义的高同源性是指， 在全长 DNA 序列上至少 50％、 优选 60％、 优选 70％、 优选 80％、 更优选 90％、 还更优选 95％、 又更优选 95％至 99％、 又更优选 99％或更多的核苷酸的匹配， 或者， 当用于氨基酸序列时是指， 氨基 酸序列虽不相同但产生具有相同功能性和活性的蛋白。应该理解， 这些关于高同源性的论 述也适用于蛋白质的三维结构， 即模块结合结构域组构。
     应该理解， 可以使用完整的配体结合蛋白、 配体结合结构域、 最小配体结合结构域 或其片段。
     使用配体结合蛋白的截短的蛋白例如配体结合结构域、 最小配体结合结构域或使 用其片段对于操作简易性以及克服诸如不想要的蛋白切割等其它问题是有利的。例如， 存 在于最小配体结合结构域中的锁闭肽可以被删除 / 除去或改变。例如， 锁闭肽在 ClfA 中对 应于区域 A 的氨基酸 532 至 538 ； 在 ClfB 中对应于区域 A 的氨基酸 530 至 540(Walsh 等人 (2004)JBC 279(49) ： 50691-50699)。可以将这些残基改变、 取代或除去 / 删除以阻止配体 通过 DLL 与 MSCRAMM 结合。按照这种方式， MSCRAMM 与其配体的 DLL“锁闭” 被阻止。这种 “锁闭” 通过非共价相互作用的方式发生。在一个实施方式中， 沿着剩余区域 A 的 C 末端氨 基酸残基将全部锁闭肽除掉。根据另一个实施方式， 仅有锁闭肽区域被除掉。根据另外一 个实施方式， 锁闭肽区域发生氨基酸取代以减少或阻止配体结合 / 锁闭。这些论述适用于 所有的通过 DLL 或类似模型与配体结合的 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白。
     通过以这种方式改变 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白， 可以提供不具有与其配体结合 能力的配体结合蛋白， 在免疫之后其会刺激产生比野生型蛋白更大的免疫反应。 有利地， 这 减少了全身性炎症， 从而降低了微生物毒力。 因此， 这种缺少与其配体结合能力的改变的配 体结合性 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白可有利地用于微生物感染的治疗。因此， 这些发现呈 现了抵抗细菌感染的新的且有价值的疫苗 / 免疫治疗剂， 与源自野生型蛋白的疫苗或免疫 治疗剂相比， 其提供了更好的效果。
     根据本发明的一个实施方式， 所述配体是血红素、 血红蛋白或纤维蛋白原。 可以考 虑其它配体， 例如触珠蛋白 - 血红蛋白、 血红蛋白、 氯化血红素、 胶原等。
     根据本发明的另一个实施方式， 重组 MSCRAMM 蛋白选自 ： 纤维蛋白原结合蛋白 ； 或
     SdrD、 SdrE、 SdrG 和 / 或 SdrF。
     上文已经详述了纤维蛋白原结合蛋白， 包括但不限于 ClfA、 ClfB、 FnBPA、 FnBPB、 FbI、 IsdA 等。已经表明 SdrG/F 与胶原结合。其它的 MSCRAMM 包括 SasA、 SasG、 SasK 和 SdrH。
     重组 MSCRAMM 样蛋白可以选自 ： IsdA、 IsdB 和 / 或 IsdH。
     基于来自纤维蛋白原结合性 MSCRAMM ClfA 的发现， 可以在例如包括 IsdH 和 IsdB 的 Isd 蛋白的 NEAT(NEAr 转运子 ) 基序中产生相似的非配体结合性突变体。 如上文所详述， IsdA 和 IsdB 不具有与 Clf 或 Sdr 蛋白相同类型的结构。但是， Isd 中的 NEAT 基序直接参 与配体结合 ( 触珠蛋白 - 血红蛋白、 血红蛋白、 氯化血红素 )， 因此， NEAT 基序中的改变将以 改变 Clf 或 Sdr 的 DLL 或 DLL 样宿主配体相互作用的相同方式阻止宿主配体相互作用。很 多含有 NEAT 结构域的蛋白参与血红素 (haem) 的结合， 包括金黄色葡萄球菌中的 IsdA。据 推论 ： IsdA 与血红素结合的性质包含于 NEAT 结构域中。apo-IsdA NEAT 结构域和与血红素 的复合物中的晶体结构已经揭示出具有大的疏水性血红素结合袋的网格蛋白适配子样 β 夹心折叠。IsdB 具有两个 NEAT 基序 ； IsdA 具有一个 NEAT 基序。可以通过改变预测为配体 结合的残基来分离 Isd 蛋白的非配体结合性突变体， 例如通过改变 β 链和 / 或疏水袋之间 的残基来进行。另外， 可以改变 NEAT 基序来影响非共价的宿主 - 配体相互作用。
     根据本发明的该方面的另一个实施方式， 提供了在个体中诱导免疫反应和 / 或治 疗患有微生物感染的患者的方法， 其包括给予所述个体对其宿主配体的结合减少的重组葡萄球菌 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白或其片段， 或包含对其宿主配体的结合减少的重组葡萄 球菌 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白或其片段的疫苗。
     根据本发明的该方面的另一个实施方式， 提供了包含对其宿主配体的结合减少的 重组葡萄球菌 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白或其片段的疫苗。
     根据本发明的该方面的另一个实施方式， 提供了针对对其宿主配体的结合减少的 重组葡萄球菌 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白或其片段而产生的抗体， 优选为超免疫血清的形 式。
     根据本发明的该方面的另一个实施方式， 提供了免疫原性药物组合物， 其包含对 其宿主配体的结合减少的重组葡萄球菌 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白或其片段。
     根据本发明的优选实施方式， 提供了不具有与纤维蛋白原结合的能力的重组葡萄 球菌纤维蛋白原结合蛋白， 或其包含至少一部分纤维蛋白原结合区域的片段， 用于治疗。
     应该理解， 重组葡萄球菌纤维蛋白原结合蛋白或其片段可用于治疗微生物感染， 优选为葡萄球菌感染， 例如治疗脓毒症、 脓毒性关节炎和 / 或心内膜炎或其它类似的病状 或疾病状态。
     蛋白的纤维蛋白原结合区域被改变从而不再与纤维蛋白原结合。如上所述， 该改 变可以发生在核苷酸或氨基酸水平。应该理解， 还可以使用与纤维蛋白原结合蛋白具有足 够高的同源性的蛋白或其片段。 本文定义的高同源性是指， 在全长 DNA 序列上至少 50％、 优 选 60％、 优选 70％、 优选 80％、 更优选 90％、 还更优选 95％、 又更优选 95％至 99％、 又更优 选 99％的核苷酸的匹配， 或者， 当关于氨基酸序列使用时是指， 氨基酸序列虽不相同但产生 具有相同功能性和活性的蛋白。应该理解， 这些关于高同源性的论述也可以涉及蛋白质的 三维结构。
     应该理解， 可以使用完整的纤维蛋白原结合蛋白、 纤维蛋白原结合区域、 最小纤维 蛋白原结合区域或其片段。 使用截短的蛋白或其片段对于操作简易性以及克服诸如不想要 的蛋白切割等其它问题是有利的。这将在下文详述。
     理想地， 这样的片段应该包含 MSCRAMM 的至少一部分纤维蛋白原结合区域。使用 截短的蛋白或其片段 ( 包含例如仅有配体 - 纤维蛋白原结合区域的一个或多个亚结构域 ) 的好处在于， 能够在不发生降解的情况下以高产率纯化蛋白。ClfA 蛋白的纤维蛋白原结合 区域， 或者称为 A 区域， 包含 3 个亚区域 ： N1、 N2 和 N3。因此， 免疫原性片段可以包含 ClfA A 区域的亚区域 N1、 N2 和 / 或 N3 或其片段。因此， 例如， 涉及到 ClfA 时， 片段可以包含区 域 A 中的一个或多个亚结构域， N1、 N2 或 N3。理想地， 可以使用 N2 和 N3， 因为该截短物较 不容易发生蛋白酶解 ( 已经报道在 ClfA 和 ClfB 中的 N1 和 N2 之间存在蛋白酶切割位点 ) 并且可以在大肠杆菌中以较高水平表达。 N2 和 N3 是 Clf 蛋白的最小纤维蛋白原结合区域。
     应该理解， 虽然以下讨论涉及纤维蛋白原结合蛋白 ClfA， 但是这些论述同样适用 于其它的 MSCRAMM、 MSCRAMM 样蛋白， 特别是其它的在氨基酸或蛋白质结构水平上与 ClfA 在 结构上相似的纤维蛋白原结合蛋白， 例如 ClfB、 FbI 和 SdrF/G( 其也与胶原结合 )。此外， 这些教导适用于 FnBPA 和 FnBPB。因此， 虽然以下论述涉及纤维蛋白原结合蛋白， 但是它们 也同样适用于其它的与纤维蛋白原之外的配体结合的 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白。
     我们出乎意料地发现 ： 在免疫之后， 这种不具有与纤维蛋白原结合能力的改变的 纤维蛋白原结合蛋白、 截短物或其片段刺激产生比那些以正常方式结合至纤维蛋白原的野生型蛋白更大的免疫反应。 有利地， 当由金黄色葡萄球菌表达时， 这种改变的纤维蛋白原结 合蛋白不引起全身性炎症。因此， 微生物毒力降低。因此， 这种缺乏与纤维蛋白原结合能力 的改变的蛋白能够有利地用于治疗微生物感染。 与预期相反， 我们还发现， 改变的纤维蛋白 原结合蛋白的保护效应比野生型蛋白大。 我们发现包含这样的改变的重组蛋白的药物组合 物或疫苗比包含未经改变 ( 野生型 ) 的形式的相同重组蛋白 ( 例如 ClfA、 ClfB、 SdrG 等 ) 的药物组合物或疫苗更加有效。
     因此， 这些发现呈现了抵抗细菌感染的新的且有价值的疫苗 / 免疫治疗剂， 与同 样用作疫苗 / 免疫治疗剂的野生型蛋白相比， 其提供了更好的效果。
     应该理解， 改变的蛋白， 无论是 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样或纤维蛋白原或其它配体结 合， 可用于产生抗体， 包括单克隆、 多克隆、 嵌合、 人源化抗体或其片段， 以用于治疗这样的 微生物感染。然后可以提供包括这样的抗体例如超免疫血清的组合物， 这些组合物可用于 治疗感染了葡萄球菌感染的患者。
     因此， 蛋白或其活性片段可用于抑制葡萄球菌与细胞外基质 (ECM) 的结合并用于 预防 / 治疗患者中的葡萄球菌感染。
     此外， 蛋白或其活性片段以及针对所述蛋白的抗体可用于治疗来自葡萄球菌感染 的感染， 用于开发进行主动或被动疫苗接种的疫苗， 当作为药物组合物向伤口或医疗器械 施用时， 蛋白和抗体均可用作预防微生物感染的阻断剂。 例如， 这些蛋白或其片段可用于主 动疫苗， 针对这些蛋白的抗体可用于被动疫苗。 本文描述的这些疫苗和产品呈现出对于现有技术的显著改进， 现有技术教导了 MSCRAMM 进行免疫的一般性用途， 但是没有教导本文描述的出人意料的和改进的疫苗或产 品。
     蛋白质、 DNA 和抗体的制备在本领域是熟知的， 本文中将不再详细描述。在产生这 些分子的过程中理想地使用常规技术。 还应该理解本发明涵盖包含目标核酸或氨基酸序列 的核酸构建体、 包含这样的核酸构建体以表达目标蛋白的重组宿主细胞以及免疫原性组合 物。
     为了给药， 可以将蛋白组合物分散于无菌的等渗盐溶液或其它药学上可接受的佐 剂中。
     应该理解， 疫苗可以是 DNA 或蛋白质疫苗。
     可以通过注射 DNA、 蛋白质或抗体进行免疫接种。备选地， 可以给予包括并表达 DNA 的减毒的活的生物体。
     可以给予的 DNA、 蛋白质或抗体的量将取决于数个减轻要素， 包括， 对于启动子强 度、 蛋白表达和表达的基因的免疫原性的依赖性。对于每个新的应用可以改变这些因素以 获得想要的需要的免疫有效数量。
     根据本发明的另一个实施方式， 提供了在个体中诱导免疫反应和 / 或治疗患有微 生物感染的患者的方法， 其包括给予所述个体不具备与纤维蛋白原结合能力的重组葡萄球 菌纤维蛋白原结合蛋白或其至少包含纤维蛋白原结合区域的片段。
     根据本发明的另一个优选实施方式， 提供了一种疫苗， 其包含不具备与纤维蛋白 原结合能力的重组葡萄球菌纤维蛋白原结合蛋白或其含有至少一部分纤维蛋白原结合区 域的片段。
     根据本发明的另外一个优选实施方式， 提供了针对重组葡萄球菌纤维蛋白原结合 蛋白或其含有至少一部分纤维蛋白原结合区域的片段产生的抗体， 优选为超免疫血清的形 式， 所述重组葡萄球菌纤维蛋白原结合蛋白或其片段不具备与纤维蛋白原结合的能力。
     根据本发明的另外一个优选实施方式， 提供了一种免疫原性药物组合物， 其包含 不具备与纤维蛋白原结合能力的重组葡萄球菌纤维蛋白原结合蛋白或其含有至少一部分 纤维蛋白原结合区域的片段以及药学上可接受的佐剂。
     理想地， 重组葡萄球菌纤维蛋白原结合蛋白或其片段源自金黄色葡萄球菌、 表皮 葡萄球菌和 / 或路邓葡萄球菌。
     这些实施方式的纤维蛋白原结合蛋白可以选自下列 FbI、 SdrF 和 / 或 SdrG( 其也 与胶原结合 ) 的一种。 备选地， 纤维蛋白原结合蛋白可以选自下列一种 ： 纤维蛋白原结合蛋 白聚集因子 A(ClfA)、 纤维蛋白原结合蛋白聚集因子 B(ClfB)、 纤连蛋白 - 纤维蛋白原结合 蛋白 A(FnBPA)、 纤连蛋白 - 纤维蛋白原结合蛋白 B(FnBPB)。 IsdA 促进粘附， 并且对于纤维蛋 白原和纤连蛋白的亲和性较弱， 所以在技术上可以将其定义为纤维蛋白原结合性 MSCRAMM。
     应该理解， 这样的纤维蛋白原结合蛋白的纤维蛋白原结合区域内的核苷酸或氨基 酸取代或删除将产生不具备与纤维蛋白原结合能力的重组蛋白。 已经推论出 ClfA- 纤维蛋白原的结合是通过类似于 SdrG 的坞、 锁和锁闭 (DLL) 机 制发生的。上文详述了 DLL 模型。ClfA 的区域 A 负责蛋白 - 配体相互作用。如图 11 中所 示， 几个纤维蛋白原结合性 MSCRAMM 的模块结构是相似的， 都含有类似于 ClfA 的区域 A。
     纤维蛋白原 γ- 链肽结合位点位于 ClfA 的 N2 和 N3 之间的节点的疏水槽中。因 此， 以上提及的取代或删除被设计为改变 MSCRAMM 蛋白 - 配体相互作用并阻止 ClfA 与纤维 蛋白原的非共价结合。
     根据本发明的一个具体实施方式， 重组葡萄球菌纤维蛋白原结合蛋白是 ClfA 的 纤维蛋白原结合缺陷型突变体。在该实施方式中， ClfA 的纤维蛋白原结合区域 A 被任何方 式改变 ( 例如取代或删除突变 ) 从而其不再与纤维蛋白原结合。
     理想地， 纤维蛋白原结合蛋白是 ClfA， 但是， ClfA 具有与很多其它纤维蛋白原结 合蛋白相似的三维结构。因此， 应该理解， 这些关于 ClfA 的论述同样适用于其它 MSCRAMM 纤维蛋白原结合蛋白， 包括 ClfB、 FnBPA、 FnBPB、 FbI、 SdrG/F、 IsdA 等。所有这些蛋白都具 有相似的三维结构， 因此， 可以对纤维蛋白原结合区域进行相似的改变 / 突变以达到相同 的结果。
     ClfA 是 993 个氨基酸的蛋白， 其包含 520 个氨基酸的纤维蛋白原结合结构域 ( 从 氨基酸 40 至 559)。该纤维蛋白原结合结构域是包含亚区域 N1、 N2 和 N3 的 N 末端 A 结构 域。跨越 N1 至 N3 的从氨基酸 40 至氨基酸 559 的整个纤维蛋白原区域可用于本发明。备 选地， 可以使用 N1 至 N3 区域的截短物， 例如 221 至 559( 最小纤维蛋白原结合区域 )、 221 至 531( 不含锁闭肽和其后的残基的最小纤维蛋白原区域 ) 等。 理想地， 可以使用亚区域 N2 和 N3， 最小纤维蛋白原结合区域， 其对应于氨基酸残基 221 至 559。备选地， 可以使用这些 亚区域的片段。
     已经研究表明， ClfA 的涵盖了 N2 和 N3 区域的氨基酸残基 221 至 559 在与纤维蛋 白原结合的过程中发挥重要作用， 其为最小纤维蛋白原结合区域。我们还出乎意料地发现 该区域中的氨基酸残基突变产生可以被宿主免疫防御识别但是没有纤维蛋白原结合的表
     达蛋白， 因此， 降低了相关的毒力。ClfA 的这个区域 (339 个氨基酸的纤维蛋白原结合结构 域 ) 具有特异性的三维结构， 即所谓的 DE 变体 IgG 折叠， 其为最小 Fg 结合截短物， 如果被 改变的话 ( 通过取代或删除等 )， 能够提供改进的治疗。
     可以通过在核苷酸或氨基酸水平上进行取代、 添加或插入或删除来进行改变以导 致纤维蛋白原结合活性的丧失。理想地， 取代对蛋白或片段的三维结构 ( 例如， 所谓的 DE 变体 IgG 折叠 ) 造成负面影响， 所以它将不能再与纤维蛋白原结合。
     理想地， 核苷酸或氨基酸取代减少与纤维蛋白原的非共价相互作用， 优选通过阻 止配体与分隔纤维蛋白原结合蛋白的区域 A 的 N2 和 N3 的疏水袋结合。备选地， 对应于氨 基酸 532 至 538 的锁闭肽区域可以通过取代或删除被改变， 以阻止配体结合。另外， 可以使 用没有锁闭肽区域和任选地没有 C 末端蛋白残基的剩余部分即没有氨基酸残基 532 至 559 的截短物 / 片段。
     根据本发明的这个方面的一个具体实施方式， 可以通过分别将氨基酸 P336 替换为 丝氨酸和 / 或将氨基酸 Y338 替换为天冬氨酸来构建 ClfA 的纤维蛋白原结合缺陷的突变体。 残基的选择是基于 ClfA 的 X 射线晶体结构以及 “对脯氨酸或酪氨酸的单个改变降低结合活 性” 的观察。令人惊奇的是， 我们发现该突变体 ClfA 蛋白 (rClfAP336S Y338A) 刺激免疫反应 并且可用于产生更加有效的疫苗或抗体治疗。 所述取代可以发生在全长纤维蛋白原结合蛋 白、 纤维蛋白原结合区域、 最小纤维蛋白原结合区域或其片段中。
     根据本发明的这个方面的另一个具体实施方式， 可以通过分别将氨基酸 P336 替换 为天冬氨酸和 / 或将氨基酸 Y338 替换为丝氨酸来构建 ClfA 的纤维蛋白原结合缺陷的突变 体。 如同上一个实施方式一样， 该突变体 ClfA 蛋白 (rClfAP336A Y338S) 也可用于产生更加有 效的疫苗或抗体治疗。
     或者， 所述改变可以是删除的形式， 包括不含锁闭肽序列 ( 氨基酸 532 至 538) 的 纤维蛋白原结合区域， 以产生不具备与纤维蛋白原非共价结合能力的重组纤维蛋白原结合 蛋白。在该实施方式中， 使用了 ClfA 的区域 A 的氨基酸残基 221 至 531， 其没有锁闭肽和其 后的 C 末端残基。备选地， 可以考虑锁闭肽氨基酸 532 至 538 中的氨基酸取代， 其阻止纤维 蛋白原的 DLL。
     应该理解， Clf-Sdr 家族中的所有蛋白都通过 DLL 模型与配体结合。通过模拟三 维结构可以预测锁闭肽并制备没有锁闭肽的截短物， 不论是全长 (N1 至 N3) 还是最小配体 结合截短物 N2-N3 或其片段。
     我们发现这些取代的 rClfA 蛋白 ( 不论是删除突变体， 取代或截短物 ) 降低了毒 力和疾病后果， 并且令人惊奇地诱导比野生型蛋白少的全身性炎症。
     因此， 基于所测的蛋白， 预期以这些突变体蛋白进行的免疫将增强同时识别突变 体和野生型蛋白的抗体水平并且将提供比野生型蛋白更大的免疫反应。
     因此， 经过改变从而其不再与纤维蛋白原结合的 ClfA 是用于主动或被动免疫的 有用的候选治疗剂。按照这种方式， 经改变的 ClfA 蛋白本身可用作疫苗， 或者可以使用针 对这种改变的 ClfA 蛋白产生的抗体。如上所述， 疫苗可以是 DNA 或蛋白疫苗。
     下表中列出的以下序列可以根据本发明使用。
    另外的 N 残基 (N- 末端延伸 (6×His 标签和另外的残基 ) 包含 6 个 His 残基， 接 着是 Gly 和 Ser。另外的 C 末端残基包含 Lys， 接着是 Leu( 可以使用其它的另外的 N 和 C 末端残基 - 取决于所用的引物或需要的 N/C 末端标签 ) 2
     另外的 N 残基 (6×His 标签和另外的残基 ) 包含 6 个 His 残基， 接着是 Gly 和 Ser。另外的 C 末端残基包含 Arg， 接着是 Ser( 可以使用其它的另外的 N 和 C 末端残基 - 取 决于所用的引物或需要的 N/C 末端标签 ) 3
     不含对应于氨基酸残基 532 至 538 的锁闭肽和剩余的 A 区域 C 末端残基， 即没有 氨基酸残基 532 至 559。
     理想地， 重组葡萄球菌纤维蛋白原结合蛋白包含根据任意 SEQ ID NO ： 1 至 3 的氨 基酸序列或其片段， 其中残基 P336 和 / 或 Y338 被丝氨酸和 / 或丙氨酸取代。
     备选地， 重组葡萄球菌纤维蛋白原结合蛋白的片段包含根据任意 SEQID NO ： 4至 SEQ ID NO ： 14 的氨基酸序列。SEQ ID NO ： 4 和 5 仅对应于 ClfA 结构域 N1、 N2、 N3， 其分别 为 rClfA P336S Y338A 和 rClfA P336A Y338S， 如上表中所示。
     基于在 SdrG 中进行的锁闭中的取代推测 ： 在构象变化或 β 链互补方面存在缺陷 的锁闭中的取代在配体结合上也将是有缺陷的。 因此， 理想地， 取代发生于对应于锁闭肽的 氨基酸残基 532 至 538 并影响肽发生构象变化的能力或与配体的结合或二者皆有。 备选地， 改变可以包含一起除掉氨基酸残基 532 至 538(Δ 锁闭肽 )， 以产生相似的结果。 另外， 没有 氨基酸残基 532 至 559( 包括锁闭肽残基 ) 的 C 末端截短突变体也将影响与配体的结合。
     但是， 应该考虑到， 除了以上特别指明的那些之外， 也可以对其它的氨基酸残基进 行取代。 例如， 可以对 Glu 526、 Val 527、 Tyr 256 和 Lys 389 进行取代以改变蛋白或其片段 的纤维蛋白原结合性质。因此， 任何减少结合能力的取代均可以被考虑到。理想地， 这样的 取代或删除影响疏水袋和与之相关的与疏水沟中的配体结合的机制， 例如 ClfA 中的同源 物 Val527 和 ClfB 中的 N526。在 ClfB 中， 已经研究表明 Q235 和 N526 减少结合。以 FnBPA 进行了相似研究， 其中表明 N304 和 F306 对于 Fg 结合是重要的。因此， 这些氨基酸残基中 的突变将影响配体结合。
     应该理解， 这些论述对于其它纤维蛋白原结合蛋白例如 ClfB、 SdrG、 FnBPA、 FnBPB 同样适用。因此， 治疗 ( 疫苗、 抗体或药物组合物等 ) 可以包含完整的纤维蛋白原结合区域 或其片段。
     在 本 说 明 书 中， 术语 “包 括 (comprise)、 包 括 (comprises)、 包 括 (comprised) 和包括 (comprising)”或其任何变体以及术语 “包括 (include)、 包括 (includes)、 包括 (included) 和包括 (including)” 或其任何变体被认为是完全可以相互替换使用， 它们应 该被赋予最可能宽的解释。
     19本发明不限于以上描述的实施方式， 可以在权利要求的范围内在解释和细节方面变化。 现在将通过参考以下非限制性附图和实施例来描述本发明。
     图 1 至 15 显示了实施例 1 的结果。
     图 1 显示了在接种了金黄色葡萄球菌菌株 Newman， 和 clfAPYI、 clfAPYII 和 clfA 无效突变体的小鼠中以关节炎指数测定的关节炎的严重性 (A) 和体重丧失 (B)。接种 3.2×106-6.0×106cfu 的金黄色葡萄球菌菌株。数据表示为中位数 ( 正方形或中线 )、 四分 位数间距 ( 框 ) 和 80％中间间距 ( 须 )。汇集来自三次实验的数据。NNewman ＝ 27-30， NclfAPYI ＝ 30， NclfAPYII ＝ 10， NclfA ＝ 16-20。
     图 2 显示了以 3.2×106-6.0×106cfu 的金黄色葡萄球菌菌株 Newman， 和 clfAPYI、 clfAPYII 和 clfA 无效突变体接种之后 7-8 天的小鼠肾脏中的细菌生长。数据表示为每对 肾脏中的 cfu。 当检测不到生长时， 将计数设置为根据所用的稀释度的最高可能计数。 汇集 来自三次实验的数据。NNewman ＝ 26， NclfAPYI ＝ 30， NclfAPYII ＝ 10， NclfA ＝ 15。 7
     图 3 显示了分别接种 5.2、 5.1 或 3.3×10 cfu 的金黄色葡萄球菌菌株 Newman、 clfAPYI 突变体或 clfA 无效突变体之后的小鼠生存情况。从开始起每组 N ＝ 10。
     图 4 显示了分别接种 9.4、 7.9、 10.7 或 9.8×106cfu 的金黄色葡萄球菌菌株 LS-1， 和 clfAPYI、 clfAPYII 或 clfA 无效突变体之后的小鼠生存情况。从开始起每组 N ＝ 15。
     图 5 显示了以 BSA、 重组 ClfA 或重组 ClfAPY( 即 ClfAPYI 重组蛋白 A 结构域 ) 免 7 疫并接种了 2.3×10 cfu 的金黄色葡萄球菌 Newman 的小鼠的生存情况。 从开始起每组 N ＝ 15。
     图 6 显示了接种了 3.2×106-6.0×106cfu 的金黄色葡萄球菌菌株 Newman 野生型， 和 clfAPYI、 clfAPYII 和 clfA 无效突变体的关节炎小鼠的频率。汇集来自三次实验的数 据。NNewman ＝ 27-30， NclfAPYI ＝ 30， NclfAPYII ＝ 10， NclfA ＝ 16-20。
     图 7 显示了分别接种了 5.2、 5.1 或 3.3×107cfu 的金黄色葡萄球菌菌株 Newman 野 生型、 clfAPYI 突变体或 clfA 无效突变体的小鼠中以关节炎指数测定的关节炎的严重性。 数据表示为中位数 ( 正方形 )、 四分位数间距 ( 框 ) 和 80％中间间距 ( 须 )。NNewman ＝ 0-10， NclfAPYI ＝ 9-10， NclfA ＝ 0-10。
     图 8 显示了分别接种了 5.2、 5.1 或 3.3×107cfu 的金黄色葡萄球菌菌株 Newman 野生型、 clfAPYI 突变体或 clfA 无效突变体的小鼠中的体重丧失。数据表示为中位数 ( 中 线 )、 四分位数间距 ( 框 ) 和 80％中间间距 ( 须 )。NNewman ＝ 0-10， NclfAPYI ＝ 9-10， NclfA ＝ 0-10。
     图 9 显示了以 BSA、 重组 ClfA 或重组 ClfAPY( 即 ClfAPYI 重组蛋白 A 结构域 ) 免 6 疫并接种了 4.0×10 cfu 的金黄色葡萄球菌 Newman 的小鼠中以关节炎指数测定的关节炎 的严重性。数据表示为中位数 ( 正方形 )、 四分位数间距 ( 框 ) 和 80％中间间距 ( 须 )。从 开始起， 每组 NBSA ＝ 14， NclfAPY ＝ 14， NclfA ＝ 15。
     图 10 给出了野生型 ClfA A 结构域蛋白 (rClfA)、 仅结构域 N123 的核苷酸和氨基 酸序列， 其中以高亮标出了在以下实施例中被改变以产生 rClfAPYI/II(SEQ ID No.3) 的残 基 (P336 和 Y338)。在以下实施例中用于疫苗接种的正是这个重组蛋白 A 结构域。
     图 11 显示了 FnBPA、 ClfB、 ClfA 和 SdrG 蛋白结构的示例性图。区域 A 是纤维蛋白
     原结合区域， S 是信号序列， W 是细胞壁跨越结构域， M 是膜锚定， 其包括 LPXTG 基序， + 表示 带正电的残基， R 是重复区域。在 ClfA 中， 区域 A 包含 N123( 未显示 )。FnBPA 的 BCD 区域 ( 以及 FnBPB 的较短的 CD 区域 - 未显示 ) 与纤连蛋白结合。
     图 12 显 示 了 在 第 二 次 加 强 免 疫 9 天 之 后， 对 于 用 牛 血 清 白 蛋 白 (BSA)、 重组 ClfA40-559(rClfA) 或 重 组 ClfAPY40-559(rClfAPY) 免 疫 的 小 鼠 血 清 样 品 中 的 重 组 ClfAPY40-559 的特异性抗体反应， 1 天之后以 2.3×107cfu/ 小鼠进行金黄色葡萄球菌菌株 Newman 野生型的感染以诱导脓毒症。数据表示为中位数 ( 中线 )、 四分位数间距 ( 框 ) 和 80％中间间距 ( 须 )。NBSA ＝ 13-15， NrClfA ＝ 15， NrClfAPY ＝ 15。
     图 13 显 示 了 在 第 二 次 加 强 免 疫 9 天 之 后， 对 于 用 牛 血 清 白 蛋 白 (BSA)、 重组 ClfA40-559(rClfA) 或 重 组 ClfAPY40-559(rClfAPY) 免 疫 的 小 鼠 血 清 样 品 中 的 重 组 ClfA40-559 的特异性抗体反应， 1 天之后以 2.3×107cfu/ 小鼠进行金黄色葡萄球菌菌株 Newman 野生型的感染以诱导脓毒症。数据表示为中位数 ( 中线 )、 四分位数间距 ( 框 ) 和 80％中间间距 ( 须 )。NBSA ＝ 13-15， NrClfA ＝ 15， NrClfAPY ＝ 15。
     图 14 显 示 了 在 第 二 次 加 强 免 疫 9 天 之 后， 对 于 用 牛 血 清 白 蛋 白 (BSA)、 重组 ClfA40-559(rClfA) 或 重 组 ClfAPY40-559(rClfAPY) 免 疫 的 小 鼠 血 清 样 品 中 的 重 组 ClfAPY40-559 的特异性抗体反应， 1 天之后以 4.0×106cfu/ 小鼠进行金黄色葡萄球菌菌 株 Newman 野生型的感染以诱导脓毒性关节炎。数据表示为中位数 ( 中线 )、 四分位数间距 ( 框 ) 和 80％中间间距 ( 须 )。NBSA ＝ 14-15， NrClfA ＝ 15， NrClfAPY ＝ 15。
     图 15 显 示 了 在 第 二 次 加 强 免 疫 9 天 之 后， 对 于 用 牛 血 清 白 蛋 白 (BSA)、 重组 ClfA40-559(rClfA) 或 重 组 ClfAPY40-559(rClfAPY) 免 疫 的 小 鼠 血 清 样 品 中 的 重 组 ClfA40-559 的特异性抗体反应， 1 天之后以 4.0×106cfu/ 小鼠进行金黄色葡萄球菌菌株 Newman 野生型的感染以诱导脓毒性关节炎。数据表示为中位数 ( 中线 )、 四分位数间距 ( 框 ) 和 80％中间间距 ( 须 )。NBSA ＝ 14-15， NrClfA ＝ 15， NrClfAPY ＝ 15。
     实施例 2 的图 16 显示了在第二次加强免疫 9 天之后， 对于用牛血清白蛋白 (BSA)、 重组 ClfA221-559(rClfA221-559) 或重组 ClfAPY221-559(rClfAPY221-559) 免疫的小鼠血 清样品中的重组 ClfAPY221-559 的特异性抗体反应。 数据表示为中位数 ( 中线 )、 四分位数 间距 ( 框 ) 和 80％中间间距 ( 须 )。NBSA ＝ 15， NrClfA221-559 ＝ 14-15， NrClfAPY221-559 ＝ 14-15。
     实施例 2 的图 17 显示了在第二次加强免疫 9 天之后， 对于用牛血清白蛋白 (BSA)、 重组 ClfA221-559(rClfA221-559) 或重组 ClfAPY221-559(rClfAPY221-559) 免疫的小鼠血 清样品中的重组 ClfA221-559 的特异性抗体反应。 数据表示为中位数 ( 中线 )、 四分位数间 距 ( 框 ) 和 80％中间间距 ( 须 )。NBSA ＝ 15， NrClfA221-559 ＝ 14-15， NrClfAPY221-559 ＝ 14-15。
     实 施 例 3 的 图 18 显 示 了 在 第 二 次 加 强 免 疫 9 天 之 后，对 于 用 重 组 ClfAPY221-531(rClfA221-531) 免疫的小鼠血清样品中的重组 ClfA221-53l 的特异性抗体 反应。数据表示为中位数 ( 中线 )、 四分位数间距 ( 框 ) 和 80％中间间距 ( 须 )。NrClfA221-531 ＝ 14-15。 实施例
    
    实施例 1 包含 N1、 N2 和 N3( 氨基酸 40-559) 的 rClfA A 区域截短物材料和方法
     在本部分末尾处提供了实施例中给出的括号中的数字参考文献的全部细节。
     小鼠
     NMRI 小鼠获自 Scanbur BK(Sollentuna， 瑞典 )， 维持在瑞典哥德堡大学风湿病学 系的动物厂房中。哥德堡动物实验伦理委员会批准了该实验。每个笼子中饲养 10 只动物， 以 12 小时的光照 - 黑暗进行循环， 以标准实验室食品和水随意饲养。在实验开始时， 动物 为 6 至 16 周龄。
     细菌菌株
     为了感染动物， 使用了金黄色葡萄球菌野生型菌株 Newman(14) 和 LS-1(11) 及其 构建衍生物。 在菌株 Newman 中构建 clfA P336SY338A(clfAPYI) 和 clfAP336AY338S(clfAPYII) 衍 生物并将其转导至菌株 LS-1( 见下文 )。 还使用了删除突变体 Newman clfA2::Tn917 突变体 DU5876(3) 和 LS-1 clfA2::Tn917 突变体 (J.R.Fitzgerald 等人， 未发表 )。细菌在血液琼 脂板上生长 48 小时， 收获并于 -20℃冷冻于含有 5％ ( 重量 / 体积 )BSA(Sigma Chemicals) 和 10％ ( 体积 / 体积 ) 二甲基亚砜的 PBS 中。在注射到动物中之前， 将细菌悬浮液解冻， 在 PBS 中洗涤， 并调整至合适的细胞浓度。在每次刺激时根据血液琼脂板上的培养和计数 菌落测定活细菌的数目。 在金黄色葡萄球菌 Newman 和 LS-1 中构建 clfAPYI 和 clfAPYII 突变
     在本实验中， 使用了包含对应于氨基酸 40-559 的 N1、 N2 和 N3 的全长 ClfAA 区域 截短物。在以下描述和附图中 ：
     -ClfA 也可被称作 rClfA 40-559(SEQ ID NO 3) ；
     -ClfA P336SY338A 也可被称作 clfAPYI、 rclfAPY 或 rclfAPYI( 即 clfAPYI40-559) (SEQ ID NO 4) ； 和
     -ClfA P336AY338S 也可被称作 clfAPYII、 rclfAPYII( 即 clfAPYII 40-559)(SEQ ID NO 5)。
     将 在 clfA 中 含 有 P336S 和 Y338A 突 变 的 1.02kb 的 pCF77PY 的 PstI-BamHI 片 段 (Loughman 等人， 2005) 克隆进入 pBluescriptII SK-(Stratagene)。使用 HindIII 将该质 粒线性化并连接进入 HindIII- 切割的 pTSermC(J.Higgins， 未发表 ) 以产生质粒 pARM， 其 为温度敏感性的大肠杆菌 - 金黄色葡萄球菌穿梭质粒， 其含有 P336S 和 Y338A 取代。
     为了降低由于取代 P336 和 Y338 而产生功能性或免疫反应性表位的未知风险， 我们 产生了 产生了第二个突变体， 其中取代的顺序是反的， 即产生 P336A 和 Y338S。为了产生这个， 类似于 pARM 但是包含 P336A 和 Y338S 取代的质粒 pJH2。使用与用以制备 pCF77PY(6) 相同的 侧翼引物和一对不同的重叠突变引物 ( 突变以黑体和下划线表示 ) 进行重叠引物 PCR 以产 生 pCF77PYII ：
     F3 ： GCAACTTTGACCATGGCCGCTTCTATTGACCCTGAAAATG 和
     R3 ： CATTTTCAGGGTCAATAGAAGCGGCCATGGTCAAAGTTGC
     如上所述， 使用该质粒的 1.02kb PstI-HindIII 片段用于产生 pJH2——一种温度 敏感性大肠杆菌 - 金黄色葡萄球菌穿梭质粒， 其含有 P336A 和 Y338S 取代。
     通过电穿孔将 pARM 和 pJH2 都转移到 RN4220(15) 中， 然后使用噬菌体 85(16) 将 其转导到金黄色葡萄球菌 Newman(14) 和 LS-1(11) 中。在这些菌株中， 诱导该质粒使其
     插入到染色体中， 然后进行切割， 将突变留在一定比例的转化子的染色体中， 产生 Newman clfAPYI、 Newman clfAPYII、 LS-1clfAPYI 和 LS-1clfAPYII。就质粒的损失和纤维蛋白原结 合活性的丧失筛选转化子。 使用 clfA 探针通过 Southern 杂交验证 clfA 基因的完整性 ( 数 据未显示 )。使用抗 -ClfA 区域 A 的多克隆兔子抗血清通过 Westem 免疫印迹验证免疫反应 性蛋白 (ClfAPY) 的表达 ( 数据未显示 )。通过在来自基因组 DNA 的 KpnI-BamHI 片段上进 行 PCR 和产物的商业测序对突变进行验证。所测序的菌株 LS-1 的 clfA 基因的大约 700 个 碱基与菌株 Newman 的 Newman clfA 基因中的对应碱基是相同的。
     重组 ClfA 和 ClfAPY 的产生
     按照以前的描述 (17)， 从 pCF40 产生 His 标记的重组 ClfA 区域 A、 结构域 N123( 氨 基酸 40-559)， 其中增加了另外的通过阴离子交换柱的抛光步骤。使用质粒 pCF77PY(6) 作 为模板， 将 clfAPYI 结构域 N123 克隆进入 pQE30 中以产生 pCF40PY。使用该质粒， 还通过镍 亲和层析和阴离子交换层析产生了重组 ClfAPY， 如同对于 rClfA 的描述一样。在浓缩和冷 冻干燥之前， 以 PBS 将洗脱物透析两次。
     脓毒性关节炎和脓毒症实验
     在实验 1-3 中， 以菌株 Newman 感染所有的小鼠 ( 每组 n ＝ 10) 以引发关节炎， 在 实验 4 和 5 中， 分别以菌株 Newman 和 LS-1 感染小鼠 ( 每组 n ＝ 10) 以引发脓毒症。
     实 验 1 通过静脉 内注射 3.5×106cfu/ 小鼠的金 黄色 葡萄球菌菌株 Newman 或 4.3×106cfu/ 小鼠的 Newman clfAPYI 突变体感染小鼠， 二者均处于 200μl PBS 中。监测 临床关节炎和重量变化直至第 7 天。在第 8 天将小鼠杀死， 测定肾脏中细菌的生长并且测 定血清 IL-6 和总 IgG 水平。在前和后足的关节处进行滑膜炎和骨破坏的组织学研究。
     实验 2 分别以 5.0×106cfu、 6.0×106cfu 或 4.3×106cfu 的金黄色葡萄球菌菌株 Newman、 clfAPYI 突变体或 Newman clfA::ErmR(clfA 无效突变体 ) 感染小鼠。监测临床关 节炎和重量变化直至第 7 天。 在第 7 天将小鼠杀死， 测定肾脏中细菌的生长 ； 测定血清 IL-6 和总 IgG 水平。在前和后足的关节处进行滑膜炎和骨破坏的组织学研究。
     实验 3 分别以 4.7×106cfu、 3.2×106cfu、 3.9×106cfu 或 4.8×106cfu 的金黄色葡 萄球菌菌株 Newman、 clfAPYI 突变体、 Newman clfAPYII 突变体或 NewmanclfA 无效突变体 感染小鼠。监测临床关节炎和重量变化直至第 7 天。在第 8 天将小鼠杀死， 测定肾脏中细 菌的生长 .
     实验 1-3 的结果是非常相似的， 所以将数据汇集并一起呈现。
     在实验 4 中， 将小鼠分别用 5.2×107cfu、 5.1×107cfu 或 3.3×107cfu 的金黄色葡 萄球菌菌株 Newman、 clfAPYI 突变体或 clfA 无效突变体静脉内注射。监测死亡率、 重量变 化和临床关节炎直至第 10 天。
     在 实 验 5 中，将 小 鼠 分 别 用 9.4×106cfu、 7.9×106cfu、 10.7×106cfu 或 9.8×106cfu 的金黄色葡萄球菌菌株 LS-1、 LS-1clfAPYI 突变体、 LS-1 clfAPYII 突变体或 LS-1 clfA 无效突变体感染。监测死亡率、 临床关节炎和重量变化直至第 16 天。
     关节内注射细菌
     分别以 2.4×104cfu、 2.4×104cfu 或 3.4×104cfu 的菌株 Newman 野生型、 clfAPYI 突变体或 clfA 敲除突变体 ( 处于 20μl PBS 中 ) 注射每只小鼠的一个膝关节。每组 N ＝ 10。在 3 天后杀死小鼠， 收集膝关节用于组织病理学检查。以野生型和突变体重组 ClfA 进行疫苗接种
     将纯化的 rClfA40-559、 rClfAPY40-559( 即 rClfAPYI) 或 BSA 溶解于生理盐水中 并与弗氏完全佐剂 (Difco Laboratories) 以 1 ∶ 1 进行乳化。在第 0 天将 200μl 含有 30μg( ＝ 0.53nmol) 蛋白的乳液皮下 (s.c.) 注射。在第 11 天以不完全的弗氏佐剂中的生 理盐水中的 30μg 蛋白进行第一次加强免疫。在第 21 天进行第二次加强免疫。在第 30 天 将小鼠放血， 将血清冷冻用于后续的抗体反应分析。
     在第 31 天， 以 4.0×106cfu/ 小鼠通过静脉内注射感染每组 14-15 只小鼠以诱导 脓毒性关节炎， 或者以 2.3×107cfu/ 小鼠诱导脓毒症。监测临床关节炎、 重量变化和死亡 率分别达 11 和 15 天。在脓毒性关节炎实验中测定肾脏中的细菌生长。
     感染小鼠的临床评价
     以不知情方式进行临床评价。目测检查每个肢体。检查产生 0 至 3 的评分 (0 是 没有肿胀和红斑 ； 1 是轻微肿胀和 / 或红斑 ； 2 是中度肿胀和 / 或红斑 ； 3 是显著肿胀和 / 或 红斑 )。通过将动物的所有四肢的评分相加而获得关节炎指数。还通过测定全身性炎症的 迹象即重量减轻、 警戒性降低和皮毛发皱来检查每只小鼠的总体状况。在严重全身性感染 的情况下， 当判定某小鼠病得太严重以致于活不过 24 小时的时候， 通过断颈法将其杀死并 且认为是由于脓毒症而死亡的。
     组织学检查
     使用以前描述的方法 (18) 的修改 (8) 来进行关节的组织学检查。
     感染的肾脏的细菌学检查
     无菌分离肾脏、 置于冰上、 匀浆、 在 PBS 中连续稀释并涂布于血液琼脂板上。在 37℃温育 24 小时之后， 测定每对肾脏的 cfu 数目。
     血清 IgG 的测定
     通过放射状免疫扩散技术 (19) 测定血清中的总 IgG 水平。山羊抗小鼠 IgG 和小 鼠 IgG 标准物购自 Southern Biotech， Birmingham， AL。
     特异性抗体 -ELISA
     在第二次加强免疫之后 9 天从经免疫的小鼠获取血清样品。通过 ELISA 测定针 对 rClfA 和 rClfAPY 的血清特异性抗体反应。以 PBS 中的 5μg/ml 的重组蛋白包被微板 (96- 孔 ； Nunc)。封闭试剂、 血清样品、 生物素化的抗体和 ExtrAvidin- 过氧化物酶均在 PBS 中稀释。根据以前的描述 (8) 进行该检验。所有的血清样品以 1 ∶ 20000 稀释， 以 405nm 处的吸光度监测抗体反应。
     在第二轮中， 为了获得不同免疫组中特异性抗体反应的更精确的测定， 在数个 血清稀释度中测定反应。因此， 所有的血清样品以 1 ∶ 5000、 1 ∶ 20000、 1 ∶ 80000 和 1 ∶ 320000 稀释， 以 405nm 处的吸光度监测抗体反应。
     IL-6 分析
     根据以前描述的方法 (20) 检测血清 IL-6。
     统计学分析
     使用 Mann-Whitney U 检验进行统计学评价。P ＜ 0.05 被认为是显著性的。除非 另有指明， 否则数据报告为中位数、 四分位数间距和 80％中间间距。
     结果ClfA 与纤维蛋白原结合必需的两个氨基酸的替换阻碍了脓毒性关节炎和脓毒症的发生 通过等位基因交换将已知为 ClfA 与纤维蛋白原结合必需的两个氨基酸 (P336 和 Y338) 改变以产生菌株 Newman 和 LS1 的突变体， 其在细胞表面表达非纤维蛋白原结合性 ClfA 蛋白。通过 Western 印迹检测该蛋白的表达水平和完整性， 证明了该突变蛋白在细菌 表面表达良好并且表达的蛋白是正确的大小。
     研究了 Newman 野生型和 Newman clfA P336S Y338A(clfAPYI) 引发脓毒性关节炎的 能力。通过静脉内分别接种 3.5×106 至 5.0×106 的菌落形成单位 (cfu) 和 3.2×106 至 6.0×106cfu 的 Newman 野生型和 clfAPYI 突变体诱导脓毒性关节炎。对关节炎的发展临床 研究 7 天。在整个实验期间， 相比野生型菌株， clfAPYI 突变体引发的关节炎严重性显著较 低 (P ＞ 0.001， 图 1A)。在多数时间点， 对于 Newman clfAPYI， 关节炎的频率较低 ( 图 6)。
     出乎意料的是， ClfAPYI 分子中的新的氨基酸组成似乎适合与宿主的抗细菌防御 相互作用。 为了检验这个可能性， 制备了一种新的构建体， 其中以不同的氨基酸来取代 P336 6 和 Y338(clfA P336A Y338S ： clfAPYII)。以 3.9×10 cfu 的 NewmanclfAPYII 接种的小鼠产生 的关节炎程度与 clfAPYI 突变体一样低 ( 图 1A)， 并且具有相似的频率 ( 图 6)。这个结果 强烈表明， 纤维蛋白原结合的丧失促成关节炎水平的降低。
     ClfA 可能通过不涉及纤维蛋白原结合的机制参与关节炎的发生。 为测试这个可能 性， 将缺少 ClfA 蛋白的 ClfA 删除突变体与表达修饰的非纤维蛋白原结合性 ClfA 蛋白的突 变体进行比较。但是， 以 4.3×106 至 4.8×106cfu 的 clfA 无效突变体感染的小鼠产生的关 节炎与 clfAPYI 和 clfAPYII 突变体感染的小鼠在方式上没有差异 ( 图 1A)。关节炎的频率 也是不可区分的 ( 图 6)。
     还对感染的关节进行了组织学研究。在实验 1 和 2 中， 相比野生型感染的小鼠， Newman clfAPYI 感染的小鼠中的滑膜炎均显著较轻 ( 分别为 P ＝ 0.02 和 0.001)。 在 Newman clfAPYI 感染的样品中， 几乎不存在骨破坏 ( 骨破坏是人类脓毒性关节炎后遗症的主要诱 因 )( 实验 2， P ＝ 0.001)。与 Newman 野生型感染的小鼠相比， Newman clfA 无效突变体诱 导的滑膜炎和骨破坏均较轻 ( 分别为 P ＝ 0.003 和 0.006)， 但是在某种程度上比 Newman clfAPYI 组严重， 虽然不是很显著。
     接下来分析了 clfA 突变对于感染过程造成的代谢后果。以 Newman 野生型菌株感 染的小鼠在实验过程中体重下降了高达大约 30％。 以纤维蛋白原结合缺陷的突变体 Newman clfAPYI 和 Newman clfAPYII 感染的小鼠重量几乎没有任何减少 (P ＞ 0.0001 相对于野生 型 )。相反， Newman clfA 无效突变体对于重量损失具有中等效应， 导致显著小于野生型菌 株， 但是显著高于 clfAPYI 和 clfAPYII 突变体菌株 ( 在多数情况下 P ≤ 0.02， 图 1B)。
     在感染的第 7-8 天分析了作为全身性炎症反应的度量的血清 IL-6 水平。IL-6 的 表达模式类似于重量变化。Newman 野生型引发高水平的血清 IL-6(4.8(2.8， 5.7)ng/ml)， Newman clfAPYI 突变体引发显著较低的 IL-6(0.2(0.07， 2.4)ng/ml， P ＜ 0.0001) 而 Newman clfA 无效突变体产生中等的反应 (2.5(1.3， 3.2)ng/ml)， 其与野生型和 clfAPYI 突变体组 均有显著差异 ( 分别为 P ＝ 0.009 和 P ＝ 0.008)( 中位数， 四分位数间距 )。
     与 Newman clfAPY 突变体和 Newman clfA 无效突变体这两者相比， 在 Newman 野 生型感染的小鼠中， 肾脏中的细菌生长显著较高 ( 分别为 P ＜ 0.0001， P ＝ 0.011， 和P＝
     0.005 ； 图 2)。相比于 Newman clfAPYI- 感染的小鼠， Newman clfA 无效突变体 - 感染的小 鼠的肾脏中的细菌生长显著较高 (P ＝ 0.0005， 图 2)。
     在感染的第 7-8 天测定了小鼠血清中的总 IgG。Newman clfAPYI- 和 NewmanclfA 无效突变体 - 感染的两个组中的 IgG 水平的增加都显著低于以野生型菌株感染的小鼠 ( 分 别 为 3.1(1.2， 4.9) ； 2.3(1.0， 2.6) ； 和 6.4(5.0， 11.0)( 中 位 数， 四分位数间距 ) ； P ≤ 0.0003)。在两个突变体组之间没有显著性差异。
     在 Newman 野生型感染的小鼠中死亡率是 17％， 在 Newman clfAPYI 和 clfAPYII 突 变体组中是 0％， 在 Newman clfA 无效突变体组中是 30％。在野生型和 clfAPYI 组之间以 及在 clfAPYI 和 clfA 无效突变体组之间的死亡率存在显著性差异 ( 分别为 P ＜ 0.05 和 P ＜ 0.01)。
     在感染了表达纤维蛋白原结合缺陷的 ClfA 的金黄色葡萄球菌的小鼠中， 全身性 炎症的直接和间接迹象似乎较低。出人意料的是， 不表达 ClfA 的菌株都诱导了比表达 ClfAPY 突变体的菌株更强烈的全身性炎症。
     通过增加金黄色葡萄球菌的接种剂量诱导了脓毒症。 以 5.2×107cfu 的 Newman 野 生型、 5.1×107cfu 的 Newman clfAPYI 突变体和 3.3×107cfu 的 Newman clfA 无效突变体 注射小鼠。 在 5 天内， 所有的感染了野生型的小鼠都死亡， 但是在注射 10 天后， 10 只注射了 clfAPYI 突变体的小鼠中仅有 1 只死亡 (P ＜ 0.0001， 图 3)。注射了 clfA 无效突变体的小 鼠的生存时间也显著短于 clfAPYI 突变体感染的小鼠 (P ＜ 0.0001， 图 3)。在该实验中， 以 clfA 无效突变体刺激的小鼠产生显著多于 clfAPYI 突变体组的关节炎， 同时它们损失显著 更多的重量 ( 图 7 和 8)。因此， 通过与脓毒性关节炎实验中的全身性炎症的度量相类比发 现， 如果 ClfA 分子被表达， 则小鼠的生存被延长， 只要该 ClfA 分子没有纤维蛋白原结合性 质。
     将细菌注射进入关节
     为了测定关节中的炎性反应是否依赖于纤维蛋白原结合， 将 Newman 野生型、 Newman clfAPYI 或 Newman clfA 空白直接注射进入小鼠的膝关节， 从而绕过全身性区室。 3 天之后通过组织学方法研究滑膜炎， 包括关节腔的多形核渗透， 以及骨破坏。 小鼠在一个膝 4 4 4 处接受 2.4×10 cfu 的野生型、 2.4×10 cfu 的 clfA 无效突变体或 3.4×10 cfu 的 clfAPYI 突变体。 对于感染了野生型的膝， 关节腔内的滑膜炎和多形核渗透的组织学指数为 0.25(0， 3.0)， 对于 clfA 无效突变体为 2.38(0.25， 3.0)， 对于 clfAPYI 突变体为 0.25(0， 0.25)( 中 位数， 四分位数间距 )。对于野生型， 骨破坏的组织学指数是 0(0， 1.0)， 对于 clfA 无效突变 体为 1.0(0， 1.0)， 对于 clfAPYI 突变体为 0(0， 0)( 中位数， 四分位数间距 ； 在 clfAPYI 突变 体和 clfA 无效突变体之间 P ＝ 0.01)。由于 clfAPYI 突变体引发极少的滑膜炎和破坏， 所 以， 虽然存在 “给予小鼠的该菌株的量比其它菌株多 40％” 这一事实， 但是仍然得出结论 ： ClfA 促使的纤维蛋白原结合对于关节内的最大炎性反应是必需的。再次， 相对于纤维蛋白 原结合缺陷的 ClfA 突变体， ClfA 表达的缺失增强了炎症。
     菌株 LS-1 中的 PY 突变
     为了确定 ClfA 与纤维蛋白原结合的能力是否影响其它金黄色葡萄球菌菌株的 毒力， 将 clfAPYI、 clfAPYII 和 clfA 无效突变转导到表达 TSST-1 的金黄色葡萄球菌菌株 6 LS-1。 以 9.4×10 cfu 的 LS-1 野生型、 7.9×106cfu 的 LS-1 clfAPYI、 10.7×106cfu 的 LS-1clfAPYII 或 9.4×106cfu 的 LS-1 clfA 无效突变体刺激小鼠。通过监测存活率来研究脓 毒症。在 16 天之后， 以野生型菌株刺激的小鼠只有 40％是存活的， 而以 clfAPYI 突变体和 clfA 无效突变体组刺激的小鼠有 90％是存活的， 以 clfAPYII 突变体感染的小鼠有 80％是 存活的 ( 图 4)。LS-1 的 clfAPYI 突变体和 clfA 无效突变体的毒力显著较低 ( 分别为 P ＝ 0.014、 P ＝ 0.05 和 P ＝ 0.03)。
     以重组 ClfA 蛋白进行免疫
     在脓毒性关节炎模型和脓毒症模型中都研究了重组野生型 ClfA A 结构域蛋白 (rClfA) 和突变体 ClfAPYI 蛋白 (rClfAPY) 进行疫苗接种的效应。将小鼠致敏， 然后以对 6 照蛋白 BSA、 rClfA 或 rClfAPY 进行两次加强免疫， 然后以 4.0×10 cfu 的金黄色葡萄球菌 菌株 Newman 感染以诱导脓毒性关节炎， 或者以 2.3×107cfu 的菌株 Newman 感染以诱导脓 毒症。与对照小鼠相比， 以 rClfAPY( 即 ClfAPYI 重组蛋白 A 结构域 ) 进行的免疫对脓毒性 死亡产生了显著性保护 (P ＝ 0.01， 图 5)， 而 rClfA 免疫没有产生显著性保护。在细菌感染 之前的 1 天， 在 rClfAPY 免疫的小鼠中， 对于 rClfAPY 和 rClfA 的特异性血清抗体反应 (A405 ＝ 0.39(0.33， 0.56) 和 0.71(0.52， 0.81)) 比 rClfA 免疫的小鼠高得多 (A405 ＝ 0.13(0.07， 0.17) 和 0.15(0.10， 0.24)， 在两个对比中 P ＜ 0.0001( 中位数， 四分位数间距 ))。对照免 疫的动物仅具有背景水平 (A405nm ＝ 0 和 0.01(0， 0.01)( 中位数， 四分位数间距 ))。以较低 的关节炎细菌剂量感染的免疫小鼠与其中诱导了脓毒症的小鼠产生了相似的针对 rClfA 和 rClfAPY 的抗体反应 ( 数据未显示 )。以 rClfA 和 rClfAPY 免疫均具有对于发生关节炎 的保护， 虽然这种保护不是显著性的 ( 图 9)。
     在感染后第 5 至 9 天内， 与对照小鼠相比， 在 rClfAPY 和 rClfA 免疫的小鼠中重量 损失显著减少 ( 数据未显示 )。
     观察到在感染后第 11 天， 以 rClfAPY 和 rClfA 免疫的小鼠的肾脏中细菌生长的减 少趋势 (BSA ： 38(3， 436) ； rClfAPY ： 7(2， 17) ； rClfA ： 10(7， 54)×107cfu/ 对肾脏 )。
     为了获得不同免疫组中特异性抗体反应的更精确的测定， 在数个血清稀释度 ( 第 二轮 ) 中确定了反应。数据显示 ： 在以脓毒性和关节炎细菌剂量感染的小鼠中， 与来自 rClfA 野生型免疫的小鼠的血清相比， 来自 rClfAPY 免疫小鼠的血清的特异性抗体对于 rClfAPY 和 rClfA 野生型抗原的效价都较高， 这是因为， 在所有的比较中， 以 rClfAPY 免疫 的小鼠的每个血清稀释度中按照吸光度测定的抗体反应都显著较高 (P ＜ 0.0001 至 P ＝ 0.008， 图 12-15)。BSA 免疫仅引发了背景抗体反应。
     结论
     结果强烈表明 ： ClfA- 纤维蛋白原相互作用对于细菌毒力和疾病后果至关重要。 在引起脓毒性死亡的能力方面， ClfA 与纤维蛋白原结合的能力与增强的毒力相关。在所测 的两个葡萄球菌菌株中， clfAPY 突变体诱导的脓毒性死亡都低于野生型。同样， 在感染了 非纤维蛋白原结合性 clfAPY 突变体的小鼠中， 关节炎的严重性显著降低。
     纤维蛋白原 - 细菌细胞表面相互作用对于毒力的促进的一个可能机理是对于嗜 中性粒细胞的吞噬作用的抑制 (5)。嗜中性粒细胞对于金黄色葡萄球菌感染早期的宿主防 御是至关重要的 (13)。如果没有嗜中性粒细胞， 血液和肾脏中的细菌生长将强烈扩大， 关 节炎的频率和死亡率增加。通过 ClfA 进行的纤维蛋白原介导的对于嗜中性粒细胞的吞噬 作用的抑制可以至少部分解释野生型金黄色葡萄球菌相对于 clfAPY 突变体的更强烈的毒力。纤维蛋白原与 ClfA 的结合能够通过减少调理素沉积或通过减少嗜中性粒细胞受体与 调理素的接触而降低嗜中性粒细胞的调理吞噬。备选地， 结合的纤维蛋白原可能阻断未知 的保护性宿主因子与金黄色葡萄球菌的结合。另一个可能是纤维蛋白原 -ClfA 相互作用促 进细菌通过血管进入组织或促进在组织中的群集。
     出人意料的是， 我们的数据还表明， ClfA 无效突变体比 clfAPY 突变体菌株的毒力 更强。ClfA 蛋白有可能在体内具有除了与纤维蛋白原相互作用之外的功能。如本研究所 示， 这种相互作用对于宿主而言显然是不利的。ClfA 的其它功能至今不明， 但是 ClfA 表现 出来的非纤维蛋白原依赖性血小板的聚集可能导致循环中的大量金黄色葡萄球菌的捕获， 进而通过网状内皮组织系统将细菌 - 血小板复合物清除。在野生型和 clfAPY 突变菌株中 将容易地发生这种血小板聚集介导的葡萄球菌的清除， 但是在 clfA 敲除体中则不会发生。 虽然在野生型菌株中纤维蛋白原相互作用将掩盖其它事件， 但是在 clfAPY 突变体中这样 的细菌清除可能对于宿主是非常有益的。
     clfA 敲除突变体对于脓毒性死亡的保护程度与金黄色葡萄球菌菌株 LS-1 中的 clfAPY 突变体是相同的， 但是在菌株 Newman 中保护较少， 如果有所保护的话。ClfA 表达对 于细菌毒力的总体影响在不同的金黄色葡萄球菌菌株之间可以是不同的， 这取决于其它毒 力因子的表达水平和存在。
     考虑到在发炎的滑液中纤维蛋白原和纤维蛋白含量丰富， 关于 “clfAPY 突变体在 关节腔中是否显示出同样的或较低的毒力” 的问题是有一定的重要意义的。我们的数据表 明， clfAPY 突变体对于软骨和骨的破坏性较低。
     重组 ClfA A 结构域非纤维蛋白原结合性 P336Y338 突变体的保护效应比野生型 rClfA 更高。以 ClfAPY 进行免疫非常可能诱导更好的免疫反应， 因为针对免疫原和野生型 ClfA 蛋白均引发了更高的特异性抗体反应。 更重要的是， 其比野生型 ClfA 诱导产生更大的 抵抗脓毒性死亡的保护性免疫反应。
     总之， 我们的结果表明 rClfAPY 是比野生型重组 ClfA 更好的候选疫苗。 我们假设 ： 由于 ClfA 分子中的重要表位的掩藏， 所以在免疫期间野生型 ClfA 蛋白与纤维蛋白原的结 合降低了抗原呈递， 因此破坏了特异性抗体的产生。
     实施例 2
     包含 N2 和 N3 的 rClfA A 区域截短物 (rClfA 221-559)
     材料和方法
     在本实施例中沿用实施例 1 中所示的程序， 其中使用了
     -rClfA 221-559( 即包含对应于氨基酸 220-559 的 N2 和 N3 的 ClfA A 区域截短 物)
     -rClfAPY221-559 ； 和
     -BSA。
     每组有 15 只雌性 NMRI 小鼠， 在实验开始时其为 8 周龄。在本实施例中， 用于免疫 的构建体为 ClfA 野生型 / 原态 N2N3 截短物、 具有如实施例 1 中定义的突变 PY 的 ClfA N2N3 截短物。BSA 用作对照。
     以野生型和突变体重组 ClfA 进行疫苗接种
     根据实施例 1 的程序以 rClfA 221-559、 rClfAPY 221-559 或 BSA 对小鼠进行免疫。 将纯化的 rClfA221-559、 rClfAPY221-559( 即 ClfAPYI 重组蛋白 A 亚结构域 N2 和 N3) 或 BSA 溶解于 PBS 中并与弗氏完全佐剂以 1 ∶ 1 进行乳化。在第 0 天将 200μl 含有 30μg( ＝ 0.79nmol) 蛋白的乳液通过皮下注射。在第 12 天以不完全的弗氏佐剂中的生理 盐水中的 30μg 蛋白进行第一次加强免疫。在第 22 天进行第二次加强免疫。在第 31 天将 小鼠放血， 将血清冷冻用于后续的抗体反应分析。
     特异性抗体 -ELISA
     在第二次加强免疫之后 9 天从免疫小鼠获取血清样品。通过 ELISA 测定针对 rClfA221-559 和 rClfAPY221-559 的血清特异性抗体反应。以 PBS 中的 5μg/ml 的重组蛋 白包被微板 (96- 孔 ； Nunc)。封闭试剂、 血清样品、 生物素化的抗体和 ExtrAvidin- 过氧化 物酶均在 PBS 中稀释。根据以前的描述 (8) 进行该检验。所有的血清样品以 1 ∶ 5000、 1 ∶ 20000、 1 ∶ 80000 和 1 ∶ 320000 进行稀释， 以 405nm 处的吸光度监测抗体反应。
     结果
     特异性抗体反应
     按照实施例 1， 以 4 个不同的血清稀释度在 ELISA 检验中通过吸光度测定抗体反 应。获得的数据与实施例 1 中的数据非常相似。
     发现相对于以原态 rClfA221-599 进行的免疫， 以 rClfAPY221-559 进行的免疫非 常可能产生较高效价的针对原态 rClfA221-559 和 rClfAPY221-559 的特异性抗体， 因为除 了一个以外， 在所有的对比中， 在每个血清稀释度， 以 rClfAPY221-559 进行免疫的小鼠都 具有显著较高的以吸光度测定的抗体反应 (P ＝ 0.001 至 0.025， 见图 16 和 17)。BSA 免疫 仅引发背景水平的抗体反应。
     结论
     我们发现， 以 rClfAPY221-559 蛋白进行的免疫产生的针对免疫原和野生型 ClfA 蛋白的抗体反应都显著高于以原态蛋白进行的免疫。
     基于这些发现， 我们得出结论 ： 无论是实施例 1 中的包含氨基酸 40-550 的还是实 施例 2 中包含氨基酸 221 至 559 的 PY 蛋白， 以 PY- 免疫都引发比相应大小的原态 ClfA 进 行的免疫更好的免疫反应。
     实施例 3
     ClfA A 区域截短物 (δ/Δ 锁闭截短物 )
     材料和方法
     在本实施例中沿用实施例 1 中所示的程序， 其中使用了以下构建体
     -rClfA 221-531( 即包含 N2 和 N3 氨基酸 220-559 但不含锁闭肽氨基酸 532-538 和随后的富含脯氨酸残基的 rClfA A 区域截短物 )。
     每组有 15 只雌性 NMRI 小鼠， 在实验开始时其为 8 周龄。在本实施例中， 使用上述 构建体用于免疫。根据实施例 1 中的程序以上述截短物免疫小鼠。
     以野生型和突变体重组 ClfA 进行疫苗接种
     将纯化的 rClfA221-531 溶解于 PBS 中并与弗氏完全佐剂以 1 ∶ 1 进行乳化。在 第 0 天将 200μl 含有 0.79nmol 蛋白的乳液通过皮下注射。在第 12 天以不完全弗氏佐剂 中的生理盐水中的 0.79nmol 蛋白进行第一次加强免疫。在第 22 天进行第二次加强免疫。
     在第 31 天将小鼠放血， 将血清冷冻用于后续的抗体反应分析。
     特异性抗体 -ELISA
     在第二次加强免疫之后 9 天从免疫小鼠获取血清样品。通过 ELISA 测定特异性抗 体的血清水平。以 4.6μg/ml 的 rClfA221-531 蛋白包被微板 (96- 孔 ； Nunc)， 所述蛋白量 与实施例 1 和 2 中的 5μg/ml 的 rClfA221-559 和 rClfAPY221-559 是等摩尔量的。封闭试 剂、 血清样品、 生物素化的抗体和 ExtrAvidin- 过氧化物酶均在 PBS 中稀释。根据以前的描 述 (8) 进行该检验。所有的血清样品以 1 ∶ 5000、 1 ∶ 20000、 1 ∶ 80000 和 1 ∶ 320000 进 行稀释， 以 405nm 处的吸光度监测抗体反应。
     结果
     按照实施例 1， 以 ELISA- 检验中的吸光度测定抗体反应。 发现以 rClfA221-531 进 行的免疫产生免疫反应， 如特异性抗体反应所测 ( 图 18)。
     结论
     我们发现， rClfA221-531 作为免疫原发生作用， 因为该抗原引发特异性抗体反应。
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     aa， 以氨基酸表示的蛋白长度。
     蛋白识别和结合的分子成分。 c
     分选酶识别的且存在于 C 末端细胞壁分选信号中的共有基序。 d
     以细胞壁表面蛋白为底物的分选酶。 e
     TNFR ： 肿瘤坏死因子受体。 f
     也与脱落的上皮细胞中的蛋白结合。促进对杀菌脂质和乳铁蛋白的抗性。 g
     也与脱落的鼻上皮细胞结合。参与生物膜的形成。
     其它的葡萄球菌表达类似于以上所列出的聚集因子或结合蛋白的表面表达的蛋 白 (MSCRAMM)。这些包括但不限于 ：
     - 来自表皮葡萄球菌的 SdrF、 SdrG 和 SdrH， 其中已经表明 SdrG/F 与纤维蛋白原和 胶原结合。
     - 来自路邓葡萄球菌的 Fbl 是与纤维蛋白原结合的蛋白。Fbl 是 Sdr 家族的成员， Sdr 家族是一组含有特征性丝氨酸 - 天冬氨酸重复区的葡萄球菌细胞表面蛋白。已经测绘 出 Fbl 的纤维蛋白原结合结构域为 313 个氨基酸， 并且与来自金黄色葡萄球菌的聚集因子 A(ClfA) 的相应区域具有 62％的同一性。
     其它的与配体结合的蛋白 / 粘附素包括 Isd 蛋白 ( 离子调控的表面决定子 )， 虽然 它们全部都不是 MSCRAMM 本身 ( 例如 IsdB 和 IsdH)， 但是它们促进细菌粘附至细胞外基质 成分， 在本文中将它们称为 “MSCRAMM 样蛋白” 。已经知道 IsdA 促进向鳞状细胞的粘附， 并 且对于纤维蛋白原和纤连蛋白的亲和性弱， 所以在技术上将其定义为 MSCRAMM。
     聚集因子 A(ClfA) 是第一个被鉴定出来的与纤维蛋白原的 γ- 链结合的金黄色葡 萄球菌粘附素。 随后认识到纤连蛋白 - 纤维蛋白原结合蛋白 A(FnBPA) 和纤连蛋白 - 纤维蛋 白原结合蛋白 B(FnBPB) 是与 Fg 的 γ- 链中相同的 C 末端肽区段结合的双功能蛋白。ClfA 和 FnBP 具有在革兰氏阳性菌中表达的所有细胞壁锚定蛋白包括 ClfB 共有的结构特征。
     例如， 聚集因子 A(ClfA) 是金黄色葡萄球菌的位于表面上的蛋白。ClfA 是金黄色 葡萄球菌的重要毒力因子。 其促成脓毒性关节炎和心内膜炎的病理发生。 ClfA 是具有相似 的结构 / 模块组构的表面结合蛋白家族 ( 包括但不限于 ClfB、 SdrD、 SdrE 等 ) 的原始型。
     ClfA 含有 520 个氨基酸的 N 末端 A 结构域 ( 纤维蛋白原结合区域 )， 其包括三个 单独折叠的亚结构域 N1、 N2 和 N3。A 结构域后面是丝氨酸 - 天冬氨酸二肽重复区域以及 细胞壁和膜跨越区域， 其含有用于分选酶促进的向细胞壁锚定的 LPDTG 基序。ClfA 实际上
     蛋白识别和结合的分子成分。 c
     分选酶识别的且存在于 C 末端细胞壁分选信号中的共有基序。 d
     以细胞壁表面蛋白为底物的分选酶。 e
     TNFR ： 肿瘤坏死因子受体。 f
     也与脱落的上皮细胞中的蛋白结合。促进对杀菌脂质和乳铁蛋白的抗性。 g
     也与脱落的鼻上皮细胞结合。参与生物膜的形成。
     其它的葡萄球菌表达类似于以上所列出的聚集因子或结合蛋白的表面表达的蛋 白 (MSCRAMM)。这些包括但不限于 ：
     - 来自表皮葡萄球菌的 SdrF、 SdrG 和 SdrH， 其中已经表明 SdrG/F 与纤维蛋白原和 胶原结合。
     - 来自路邓葡萄球菌的 Fbl 是与纤维蛋白原结合的蛋白。Fbl 是 Sdr 家族的成员， Sdr 家族是一组含有特征性丝氨酸 - 天冬氨酸重复区的葡萄球菌细胞表面蛋白。已经测绘 出 Fbl 的纤维蛋白原结合结构域为 313 个氨基酸， 并且与来自金黄色葡萄球菌的聚集因子 A(ClfA) 的相应区域具有 62％的同一性。
     其它的与配体结合的蛋白 / 粘附素包括 Isd 蛋白 ( 离子调控的表面决定子 )， 虽然 它们全部都不是 MSCRAMM 本身 ( 例如 IsdB 和 IsdH)， 但是它们促进细菌粘附至细胞外基质 成分， 在本文中将它们称为 “MSCRAMM 样蛋白” 。已经知道 IsdA 促进向鳞状细胞的粘附， 并 且对于纤维蛋白原和纤连蛋白的亲和性弱， 所以在技术上将其定义为 MSCRAMM。
     聚集因子 A(ClfA) 是第一个被鉴定出来的与纤维蛋白原的 γ- 链结合的金黄色葡 萄球菌粘附素。 随后认识到纤连蛋白 - 纤维蛋白原结合蛋白 A(FnBPA) 和纤连蛋白 - 纤维蛋 白原结合蛋白 B(FnBPB) 是与 Fg 的 γ- 链中相同的 C 末端肽区段结合的双功能蛋白。ClfA 和 FnBP 具有在革兰氏阳性菌中表达的所有细胞壁锚定蛋白包括 ClfB 共有的结构特征。
     例如， 聚集因子 A(ClfA) 是金黄色葡萄球菌的位于表面上的蛋白。ClfA 是金黄色 葡萄球菌的重要毒力因子。 其促成脓毒性关节炎和心内膜炎的病理发生。 ClfA 是具有相似 的结构 / 模块组构的表面结合蛋白家族 ( 包括但不限于 ClfB、 SdrD、 SdrE 等 ) 的原始型。
     ClfA 含有 520 个氨基酸的 N 末端 A 结构域 ( 纤维蛋白原结合区域 )， 其包括三个 单独折叠的亚结构域 N1、 N2 和 N3。A 结构域后面是丝氨酸 - 天冬氨酸二肽重复区域以及 细胞壁和膜跨越区域， 其含有用于分选酶促进的向细胞壁锚定的 LPDTG 基序。ClfA 实际上
    ba存在于所有的金黄色葡萄球菌菌株中 (Peacock SJ， Moore CE， Justice A， Kantzanou M， Story L， Mackie K， O′ NeillG， Day NPJ(2002)Virulent combinations of adhesin and toxin genes in natural populations of Staphylococcus aureus.Infect Immun 70 ： 4987-4996)。 其与纤维蛋白原的 γ- 链的 C 末端结合， 因此能够诱导纤维蛋白原溶液中的细 菌聚集 (McDevitt D， Nanavaty T， House-Pompeo K， Bell E， Turner N， McEntire L， Foster T， M(1997)Characterization of the interaction between the Staphylococcus aureus clumping factor(ClfA)and fibrinogen.Eur J Biochem247 ： 416-424 ； 和 McDevitt D， Francois P， Vaudaux P， Foster TJ(1994)Molecular characterization of the clumping factor(fibrinogen receptor)ofStaphylococcus aureus.Mol Microbiol 11 ： 237-248)。
     对 ClfA 和相关的纤维蛋白原结合蛋白 SdrG 和 ClfB 进行的三维结构分析已经 揭示 ： 在所有这些相关蛋白中， 配体结合 A 结构域均由三个亚结构域 N1、 N2 和 N3 组成， 其中对应于区域 N2-N3 的残基 221-559 是最小的保留与纤维蛋白原结合能力的截短物 (truncate)。已经发现氨基酸残基 532 至 538 对应于 ClfA 的锁闭肽 (latching peptide) 区域。每个亚结构域包含 9 个 β 链， 其构成新的 IgG 型折叠。这些蛋白中的纤维蛋白原 γ 链肽结合位点位于 N2 和 N3 之间的节点的疏水槽。已经发现这些蛋白的三维结构存在显著 的结构相似性， 这是由于存在一个或多个相关的氨基酸序列、 相似的模块设计和共同的结 合结构域组构。
     SdrC、 SdrD、 SdrE、 FnBPA-A( 所有 7 个同型 ) 和 FnBPB-B( 所有 7 个同型 ) 具有相 似的模块组构， 因此使用 PHYRE 分子模型， 预期这些蛋白将具有相同的三维结构。
     IsdA 和 IsdB 不具有与 Clf 或 Sdr 蛋白相同类型的结构。 它们具有新的被称为 NEAT 的基序， 该基序参与配体结合。 但是， NEAT 基序由 β 链夹心结构组成 ( 由 2 个 5 条链的反平 行 β 片层组成的 β 夹心折叠 ) 并且是 Ig 超家族成员 (Pilpa 等人 “Solution Structure of the NEAT(NEAr Transported)Domain from IsdH/HarA ： the Human Hemoglobin Receptor in Staplococcus aureus” J.Mol.Biol.(2006)360 ： 435-447)， 从这个意义上来讲， NEAT 基 序与 Clf 或 Sdr 的三维结构是相似的。已经解决了 IsdH 的 NEAT 基序的三维结构并预测了 环 1b-2 中的残基。
     金 黄 色 葡 萄 球 菌 上 ClfA 的 表 达 阻 碍 巨 噬 细 胞 和 嗜 中 性 粒 细 胞 的 吞 噬 作 用 (Palmqvist N ，Patti JM ，Tarkowski A ，Josefsson E(2004)Expression of staphylococcal clumping factor A impedes macrophage phagocytosis.Microb Infect 6： 188-195 ； 和 Higgins J， Loughman A， van Kessel KPM， van Strijp JAG， Foster TJ(2006) Clumping factor A of Staphylococcus aureus inhibits phagocytosis by human polymorphonuclear leukocytes.FEMS Microbiol Lett258 ： 290-296)。在嗜中性粒细胞 中， 这是由纤维蛋白原依赖性机制和纤维蛋白原非依赖性机制共同造成的。相反， 细菌表 达的 ClfA 通过与 GPIIb/IIIa 发生相互作用而激活血小板， 从而导致聚集。当纤维蛋白 原存在时， 这个作用进行得最为有效 ； 但是还存在血小板激活的纤维蛋白原非依赖性途径 (Loughman A， Fitzgerald JR， Brennan MP， Higgins J， Downer R， Cox D， FosterTJ(2005) Roles of fibrinogen， immunoglobulin and complement in platelet activation promoted by Staphylococcus aureus clumping factor A.Mol Microbiol 57 ： 804-818 ；和 O ′ Brien L， Kerrigan SW， Kaw G.， Hogan M.， PenadésJ.， Litt D.， Fitzgerald D.J.， Foster T.J.&Cox D.(2002)Multiple mechanisms for the activation of human platelet aggregation by Staphylococcus aureus ： roles for the clumping factors ClfA and ClfB， the serine-aspartate repeat protein SdrE and protein A.Mol Microbiol 44， 1033-1044)。
     ClfA 是 诱 导 小 鼠 中 的 脓 毒 性 关 节 炎 的 毒 力 因 子 (Josefsson E.， Hartford O.， O ′ Brien L， Patti JM， Foster T(2001)Protection against experimental Staphylococcus aureus arthritis by vaccination with clumping factor A， a novel virulence determinant.J Infect Dis 184 ： 1572-1580)。此外， ClfA 连同另一种纤维蛋 白原结合蛋白 ClfB 的消除引起在感染早期抵抗全身性炎症的保护 (Palmqvist N， Foster T， Fitzgerald R， Josefsson E， Tarkowski A(2005)Fibronectin-binding proteins and fibrinogen-binding clumping factors play distinct roles in staphylococcal arthritis and systemic inflammation.J Inf Dis191 ： 791-798)。
     已经分离并且表征了金黄色葡萄球菌的纤维蛋白原结合蛋白 ClfA， 其为例如美国 专利号 6,008,341 和 6,177,084 的主题。 ClfA 和 ClfB 具有相同的结构 ( 三维 ) 组构和大约 27％的氨基酸同一性。FnBPA 与 ClfA 具有大约 25％的氨基酸同一性。
     目前尚无基于 MSCRAMM 的疫苗被批准并上市。 是一种供体选择的葡 萄球菌静脉内人类免疫球蛋白 (IGIV)， 其靶向 ClfA 和 SdrG， 由于在 III 期临床试验表现较 差， 所以从临床试验被撤销。目前正在重新评估以确定它是不是葡萄球菌感染的可行性治 疗。
     WO 2005/116064 涉及 FnBPA， 其为金黄色葡萄球菌的多功能结合蛋白。FnBPA 的 N 末端 A 结构域类似于 ClFA， 已经发现其与纤维蛋白原结合。但是， FnBPA 的 C 末端 BCD 结构 域与纤连蛋白结合， 因此， FnBPA 是双功能的 MSCRAMM。
     WO 2005/116064 基于以下发现 ： 在存在转谷氨酰胺酶的情况下， 在细菌粘附素 FnBPA 和宿主蛋白纤连蛋白之间形成共价连接， 从而使得结合更加强烈并基本上是不可逆 的。纤维蛋白原是血液中的主要成分 ( ～ 3mg/ml)， 在血液中其作为凝固级联的最终靶标。 纤连蛋白含量较低， ～ 0.3mg/ml 或者对于每 10-15 个纤维蛋白原有一个 Fn 分子。纤维蛋 白原和纤连蛋白被认为与血液无关， 在血液中它们独立地循环。
     重要的是， WO 2005/116064 特别涉及因子 XIIIa 催化的共价交联。 WO2005/116064 分离了重组 FnBPA 中的多个突变体， 其中具有带正电荷侧链的残基 ( 即转谷氨酰胺酶底物 ) 被改变。此外， WO 2005/116064 涉及具有改变的共价纤连蛋白结合特性而非只有纤维蛋白 原结合特性的突变体。 此外， 该文献没有通过实验证明突变蛋白与配体的结合是否减少， 并 且没有提供任何支持性的免疫原性数据。
     因此， 鉴于多重耐药性在革兰氏阳性菌中的流行以及对这些多重耐药性细菌的成 功治疗和疫苗的缺乏， 任何能够不使用抗生素来处理这样的细菌感染的替代性治疗将具有 重要意义。
     此外， 对于任何已知的治疗或疫苗的效力的任何改进将具有重要意义， 特别是在 临床环境中。
     因此， 本发明旨在提供治疗这样的细菌感染的替代性和改进的治疗法。发明内容 根据本发明的第一个一般性方面， 提供了对其宿主配体的结合减少的重组葡萄球 菌 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白或其片段， 用于治疗。
     根据优选的实施方式， 提供了不具有结合纤维蛋白原的能力的重组葡萄球菌纤维 蛋白原结合性 MSCRAMM 蛋白或其包含至少一部分纤维蛋白原结合区域的片段， 用于治疗。
     根据本发明的第二方面， 提供了在个体中诱导免疫反应的方法和 / 或治疗患有微 生物感染的患者的方法， 其包括给予所述个体对其宿主配体的结合减少的重组葡萄球菌 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白或其片段， 或包含所述重组葡萄球菌 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白 或其片段的疫苗。
     根据本发明的第三方面， 提供了包含对其宿主配体的结合减少的重组葡萄球菌 MSCRAMM 蛋白或其片段的疫苗。
     根据本发明的第四方面， 提供了针对对其宿主配体的结合减少的重组葡萄球菌 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白或其片段而产生的抗体， 优选为超免疫血清的形式。
    根据本发明的第五方面， 提供了免疫原性药物组合物， 其包含对其宿主配体的结 合减少的重组葡萄球菌 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白或其片段以及药学上可接受的佐剂。
     详细描述
     在本说明书中， 术语 “粘附素” 、 “MSCRAMM” 和 “细胞壁锚定蛋白” 将被理解为可以 相互替换并且涵盖所有的源自微生物的配体结合蛋白。理想地， 这些蛋白与纤维蛋白原、 血红素或血红蛋白、 触珠蛋白 - 血红蛋白、 氯化血红素、 胶原和其它这样的配体结合。术语 “MSCRAMM 样” 蛋白旨在涵盖与这样的 MSCRAMM 蛋白具有相关的氨基酸序列、 相似的模块设 计和 / 或共同 / 相似的结合结构域组构 (organization) 的蛋白或粘附素， 例如 Isd 蛋白。 理想地， MSCRAMM 样蛋白具有相似的结合结构域组构 / 模块设计。另外， MSCRAMM 样蛋白与 MSCRAMM 蛋白可以具有至少 50％、 优选 60％、 优选 75％、 更优选 85％、 还更优选 95％， 又更 优选 99％或更高的氨基酸序列同一性。
     还应该理解， 本说明书所称的任何百分比同一性或同源性是使用可获得的常规方 法在序列的整个 / 完整长度上确定的。
     术语 “微生物 (micro-organism)” 、 “微生物 (microbe)” 、 “微生物的 (microbial)” 或类似的术语包括但不限于下列生物体， 包括 ： 细菌、 真菌、 病毒、 酵母和 / 或霉菌。
     术语 “免疫有效数量” 包括能够刺激 B 细胞和 / 或 T 细胞反应的那些量。
     根据本发明的第一个一般性方面， 提供了对其宿主配体的结合减少的重组葡萄球 菌 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白， 或其片段， 其包含至少一部分配体结合区域， 用于治疗。这 样的重组蛋白可用于治疗微生物感染， 例如治疗脓毒症、 脓毒性关节炎和 / 或心内膜炎或 其它类似的病状或疾病状态。 这样的微生物感染理想地是由葡萄球菌或其它类似的微生物 引起的。
     根据本发明的这个方面的一个特定实施方式， 所述重组 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋 白或其片段具有减少的或不具备与其宿主配体非共价结合的能力。
     因此， 应该理解， 重组葡萄球菌 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白或其片段可能具有减少
     的与其宿主配体的结合或者与其宿主配体的结合被阻止。
     根据本发明推论 ： MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白通过坞、 锁和锁闭 (Dock， Lock and Latching(DLL)) 与其配体结合过程中发生的非共价结合可能被减少或阻止。已经证明 MSCRAMM 与其配体结合的第一个步骤涉及通过 DLL 模型进行的非共价相互作用。这些是 MSCRAMM 与配体的首要的非共价相互作用。MSCRAMM- 配体结合的最后阶段涉及共价相互作 用。在这个特定实施方式中， 由于改变的坞、 锁和锁闭， 重组 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白或 其片段具有减少的或不具备与其宿主配体非共价结合的能力。一个或多个坞、 锁或锁闭步 骤可以被改变。
     DLL 模型是从 SdrG 与其配体的复合物的三维结构中阐明的。现在已经表明 ClfA 通过 DLL 机制的微小变化发挥作用 (Ganech 等人 (2008)“Astructural model of the Staphylococcus aureus Clfa-fibrinogen interaction opens new avenues for the design of anti-staphylococcal therapeutics” .PloS Pathog4(11) ； e1000226)。DLL 模 型特别涉及参与配体结合的非共价相互作用。对于所有其它的相似结构类型 ( 无论是按照 氨基酸相似性 / 同源性还是按照结构组构同源性 ) 的蛋白均推断具有 DLL 模型， 包括但不 限于 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白。 特别在涉及 MSCRAMM ClfA/ClfB 时， 发现最小配体结合结构域包含区域 A 的亚区 域 N1 至 N3， 特别是包含变体 Dev-IgG Ig 折叠的亚区域 N2 和 N3。变体 Dev-IgG Ig 折叠是 免疫球蛋白基序的新变体， 其也被称为 DE 变体。据推论， 在 ClfA/B 的两个 DEv-IgG 结构域 之间形成的疏水袋是纤维蛋白原 γ- 链的配体结合位点。实质上， 配体与分隔 N2 和 N3 的 疏水槽结合。特别地， 在配体结合过程中， 配体的未折叠肽成分插入位于 N2 和 N3 亚结构域 之间的槽。亚结构域 N3 的 C 末端的锁闭肽发生构象变化并插入亚结构域 N2 的两条 B 链 之间， 因此， 将配体锁定在适当位置。确实， 聚集因子中的残基 Tyr256、 Pro336、 Tyr338 和 408 411 Lys389( 它们被认为是与纤维蛋白原的 γ 链末端残基 AGDV 接触 ) 的突变取代使得该 蛋白丧失或显著降低其对纤维蛋白原的亲和力。下文将详述该具体实施方式的更多细节。
     虽然这些教导涉及聚集因子， 尤其是 ClfA， 但是它们同样适用于其它具有类似模 块结合结构域组构和以相似方式与配体结合的 MSCRAMM 和 / 或 MSCRAMM 样蛋白。
     因此， 为了提供对其宿主配体的结合减少的重组葡萄球菌 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样 蛋白或其片段， 可以改变全长蛋白、 配体结合结构域、 最小配体结合结构域或其片段以减少 或阻止与其宿主配体的结合。理想地， 对于 ClfA/ClfB 或其它类似 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样 蛋白， 可以改变区域 A 的亚区域 N2 和 N3( 其理想地包含变体 Dev-IgG Ig 折叠 ) 以阻止或 减少与其宿主配体的结合。这样的改变被设计为阻止配体与疏水槽的结合， 所述疏水槽分 隔 DLL 所需的最小配体结合结构域。
     可以使用全长蛋白、 配体结合结构域、 最小配体结合结构域或其片段， 通过氨基酸 取代或删除， 使配体结合结构域在氨基酸水平发生这样的改变。 应该理解， 还可以使用与配 体结合蛋白具有足够高的同源性的蛋白或其片段。本文定义的高同源性是指， 在全长 DNA 序列上至少 50％、 优选 60％、 优选 70％、 优选 80％、 更优选 90％、 还更优选 95％、 又更优选 95％至 99％、 又更优选 99％或更多的核苷酸的匹配， 或者， 当用于氨基酸序列时是指， 氨基 酸序列虽不相同但产生具有相同功能性和活性的蛋白。应该理解， 这些关于高同源性的论 述也适用于蛋白质的三维结构， 即模块结合结构域组构。
     应该理解， 可以使用完整的配体结合蛋白、 配体结合结构域、 最小配体结合结构域 或其片段。
     使用配体结合蛋白的截短的蛋白例如配体结合结构域、 最小配体结合结构域或使 用其片段对于操作简易性以及克服诸如不想要的蛋白切割等其它问题是有利的。例如， 存 在于最小配体结合结构域中的锁闭肽可以被删除 / 除去或改变。例如， 锁闭肽在 ClfA 中对 应于区域 A 的氨基酸 532 至 538 ； 在 ClfB 中对应于区域 A 的氨基酸 530 至 540(Walsh 等人 (2004)JBC 279(49) ： 50691-50699)。可以将这些残基改变、 取代或除去 / 删除以阻止配体 通过 DLL 与 MSCRAMM 结合。按照这种方式， MSCRAMM 与其配体的 DLL“锁闭” 被阻止。这种 “锁闭” 通过非共价相互作用的方式发生。在一个实施方式中， 沿着剩余区域 A 的 C 末端氨 基酸残基将全部锁闭肽除掉。根据另一个实施方式， 仅有锁闭肽区域被除掉。根据另外一 个实施方式， 锁闭肽区域发生氨基酸取代以减少或阻止配体结合 / 锁闭。这些论述适用于 所有的通过 DLL 或类似模型与配体结合的 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白。
     通过以这种方式改变 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白， 可以提供不具有与其配体结合 能力的配体结合蛋白， 在免疫之后其会刺激产生比野生型蛋白更大的免疫反应。 有利地， 这 减少了全身性炎症， 从而降低了微生物毒力。 因此， 这种缺少与其配体结合能力的改变的配 体结合性 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白可有利地用于微生物感染的治疗。因此， 这些发现呈 现了抵抗细菌感染的新的且有价值的疫苗 / 免疫治疗剂， 与源自野生型蛋白的疫苗或免疫 治疗剂相比， 其提供了更好的效果。
     根据本发明的一个实施方式， 所述配体是血红素、 血红蛋白或纤维蛋白原。 可以考 虑其它配体， 例如触珠蛋白 - 血红蛋白、 血红蛋白、 氯化血红素、 胶原等。
     根据本发明的另一个实施方式， 重组 MSCRAMM 蛋白选自 ： 纤维蛋白原结合蛋白 ； 或
     SdrD、 SdrE、 SdrG 和 / 或 SdrF。
     上文已经详述了纤维蛋白原结合蛋白， 包括但不限于 ClfA、 ClfB、 FnBPA、 FnBPB、 FbI、 IsdA 等。已经表明 SdrG/F 与胶原结合。其它的 MSCRAMM 包括 SasA、 SasG、 SasK 和 SdrH。
     重组 MSCRAMM 样蛋白可以选自 ： IsdA、 IsdB 和 / 或 IsdH。
     基于来自纤维蛋白原结合性 MSCRAMM ClfA 的发现， 可以在例如包括 IsdH 和 IsdB 的 Isd 蛋白的 NEAT(NEAr 转运子 ) 基序中产生相似的非配体结合性突变体。 如上文所详述， IsdA 和 IsdB 不具有与 Clf 或 Sdr 蛋白相同类型的结构。但是， Isd 中的 NEAT 基序直接参 与配体结合 ( 触珠蛋白 - 血红蛋白、 血红蛋白、 氯化血红素 )， 因此， NEAT 基序中的改变将以 改变 Clf 或 Sdr 的 DLL 或 DLL 样宿主配体相互作用的相同方式阻止宿主配体相互作用。很 多含有 NEAT 结构域的蛋白参与血红素 (haem) 的结合， 包括金黄色葡萄球菌中的 IsdA。据 推论 ： IsdA 与血红素结合的性质包含于 NEAT 结构域中。apo-IsdA NEAT 结构域和与血红素 的复合物中的晶体结构已经揭示出具有大的疏水性血红素结合袋的网格蛋白适配子样 β 夹心折叠。IsdB 具有两个 NEAT 基序 ； IsdA 具有一个 NEAT 基序。可以通过改变预测为配体 结合的残基来分离 Isd 蛋白的非配体结合性突变体， 例如通过改变 β 链和 / 或疏水袋之间 的残基来进行。另外， 可以改变 NEAT 基序来影响非共价的宿主 - 配体相互作用。
     根据本发明的该方面的另一个实施方式， 提供了在个体中诱导免疫反应和 / 或治 疗患有微生物感染的患者的方法， 其包括给予所述个体对其宿主配体的结合减少的重组葡萄球菌 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白或其片段， 或包含对其宿主配体的结合减少的重组葡萄 球菌 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白或其片段的疫苗。
     根据本发明的该方面的另一个实施方式， 提供了包含对其宿主配体的结合减少的 重组葡萄球菌 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白或其片段的疫苗。
     根据本发明的该方面的另一个实施方式， 提供了针对对其宿主配体的结合减少的 重组葡萄球菌 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白或其片段而产生的抗体， 优选为超免疫血清的形 式。
     根据本发明的该方面的另一个实施方式， 提供了免疫原性药物组合物， 其包含对 其宿主配体的结合减少的重组葡萄球菌 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白或其片段。
     根据本发明的优选实施方式， 提供了不具有与纤维蛋白原结合的能力的重组葡萄 球菌纤维蛋白原结合蛋白， 或其包含至少一部分纤维蛋白原结合区域的片段， 用于治疗。
     应该理解， 重组葡萄球菌纤维蛋白原结合蛋白或其片段可用于治疗微生物感染， 优选为葡萄球菌感染， 例如治疗脓毒症、 脓毒性关节炎和 / 或心内膜炎或其它类似的病状 或疾病状态。
     蛋白的纤维蛋白原结合区域被改变从而不再与纤维蛋白原结合。如上所述， 该改 变可以发生在核苷酸或氨基酸水平。应该理解， 还可以使用与纤维蛋白原结合蛋白具有足 够高的同源性的蛋白或其片段。 本文定义的高同源性是指， 在全长 DNA 序列上至少 50％、 优 选 60％、 优选 70％、 优选 80％、 更优选 90％、 还更优选 95％、 又更优选 95％至 99％、 又更优 选 99％的核苷酸的匹配， 或者， 当关于氨基酸序列使用时是指， 氨基酸序列虽不相同但产生 具有相同功能性和活性的蛋白。应该理解， 这些关于高同源性的论述也可以涉及蛋白质的 三维结构。
     应该理解， 可以使用完整的纤维蛋白原结合蛋白、 纤维蛋白原结合区域、 最小纤维 蛋白原结合区域或其片段。 使用截短的蛋白或其片段对于操作简易性以及克服诸如不想要 的蛋白切割等其它问题是有利的。这将在下文详述。
     理想地， 这样的片段应该包含 MSCRAMM 的至少一部分纤维蛋白原结合区域。使用 截短的蛋白或其片段 ( 包含例如仅有配体 - 纤维蛋白原结合区域的一个或多个亚结构域 ) 的好处在于， 能够在不发生降解的情况下以高产率纯化蛋白。ClfA 蛋白的纤维蛋白原结合 区域， 或者称为 A 区域， 包含 3 个亚区域 ： N1、 N2 和 N3。因此， 免疫原性片段可以包含 ClfA A 区域的亚区域 N1、 N2 和 / 或 N3 或其片段。因此， 例如， 涉及到 ClfA 时， 片段可以包含区 域 A 中的一个或多个亚结构域， N1、 N2 或 N3。理想地， 可以使用 N2 和 N3， 因为该截短物较 不容易发生蛋白酶解 ( 已经报道在 ClfA 和 ClfB 中的 N1 和 N2 之间存在蛋白酶切割位点 ) 并且可以在大肠杆菌中以较高水平表达。 N2 和 N3 是 Clf 蛋白的最小纤维蛋白原结合区域。
     应该理解， 虽然以下讨论涉及纤维蛋白原结合蛋白 ClfA， 但是这些论述同样适用 于其它的 MSCRAMM、 MSCRAMM 样蛋白， 特别是其它的在氨基酸或蛋白质结构水平上与 ClfA 在 结构上相似的纤维蛋白原结合蛋白， 例如 ClfB、 FbI 和 SdrF/G( 其也与胶原结合 )。此外， 这些教导适用于 FnBPA 和 FnBPB。因此， 虽然以下论述涉及纤维蛋白原结合蛋白， 但是它们 也同样适用于其它的与纤维蛋白原之外的配体结合的 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样蛋白。
     我们出乎意料地发现 ： 在免疫之后， 这种不具有与纤维蛋白原结合能力的改变的 纤维蛋白原结合蛋白、 截短物或其片段刺激产生比那些以正常方式结合至纤维蛋白原的野生型蛋白更大的免疫反应。 有利地， 当由金黄色葡萄球菌表达时， 这种改变的纤维蛋白原结 合蛋白不引起全身性炎症。因此， 微生物毒力降低。因此， 这种缺乏与纤维蛋白原结合能力 的改变的蛋白能够有利地用于治疗微生物感染。 与预期相反， 我们还发现， 改变的纤维蛋白 原结合蛋白的保护效应比野生型蛋白大。 我们发现包含这样的改变的重组蛋白的药物组合 物或疫苗比包含未经改变 ( 野生型 ) 的形式的相同重组蛋白 ( 例如 ClfA、 ClfB、 SdrG 等 ) 的药物组合物或疫苗更加有效。
     因此， 这些发现呈现了抵抗细菌感染的新的且有价值的疫苗 / 免疫治疗剂， 与同 样用作疫苗 / 免疫治疗剂的野生型蛋白相比， 其提供了更好的效果。
     应该理解， 改变的蛋白， 无论是 MSCRAMM 或 MSCRAMM 样或纤维蛋白原或其它配体结 合， 可用于产生抗体， 包括单克隆、 多克隆、 嵌合、 人源化抗体或其片段， 以用于治疗这样的 微生物感染。然后可以提供包括这样的抗体例如超免疫血清的组合物， 这些组合物可用于 治疗感染了葡萄球菌感染的患者。
     因此， 蛋白或其活性片段可用于抑制葡萄球菌与细胞外基质 (ECM) 的结合并用于 预防 / 治疗患者中的葡萄球菌感染。
     此外， 蛋白或其活性片段以及针对所述蛋白的抗体可用于治疗来自葡萄球菌感染 的感染， 用于开发进行主动或被动疫苗接种的疫苗， 当作为药物组合物向伤口或医疗器械 施用时， 蛋白和抗体均可用作预防微生物感染的阻断剂。 例如， 这些蛋白或其片段可用于主 动疫苗， 针对这些蛋白的抗体可用于被动疫苗。 本文描述的这些疫苗和产品呈现出对于现有技术的显著改进， 现有技术教导了 MSCRAMM 进行免疫的一般性用途， 但是没有教导本文描述的出人意料的和改进的疫苗或产 品。
     蛋白质、 DNA 和抗体的制备在本领域是熟知的， 本文中将不再详细描述。在产生这 些分子的过程中理想地使用常规技术。 还应该理解本发明涵盖包含目标核酸或氨基酸序列 的核酸构建体、 包含这样的核酸构建体以表达目标蛋白的重组宿主细胞以及免疫原性组合 物。
     为了给药， 可以将蛋白组合物分散于无菌的等渗盐溶液或其它药学上可接受的佐 剂中。
     应该理解， 疫苗可以是 DNA 或蛋白质疫苗。
     可以通过注射 DNA、 蛋白质或抗体进行免疫接种。备选地， 可以给予包括并表达 DNA 的减毒的活的生物体。
     可以给予的 DNA、 蛋白质或抗体的量将取决于数个减轻要素， 包括， 对于启动子强 度、 蛋白表达和表达的基因的免疫原性的依赖性。对于每个新的应用可以改变这些因素以 获得想要的需要的免疫有效数量。
     根据本发明的另一个实施方式， 提供了在个体中诱导免疫反应和 / 或治疗患有微 生物感染的患者的方法， 其包括给予所述个体不具备与纤维蛋白原结合能力的重组葡萄球 菌纤维蛋白原结合蛋白或其至少包含纤维蛋白原结合区域的片段。
     根据本发明的另一个优选实施方式， 提供了一种疫苗， 其包含不具备与纤维蛋白 原结合能力的重组葡萄球菌纤维蛋白原结合蛋白或其含有至少一部分纤维蛋白原结合区 域的片段。
     根据本发明的另外一个优选实施方式， 提供了针对重组葡萄球菌纤维蛋白原结合 蛋白或其含有至少一部分纤维蛋白原结合区域的片段产生的抗体， 优选为超免疫血清的形 式， 所述重组葡萄球菌纤维蛋白原结合蛋白或其片段不具备与纤维蛋白原结合的能力。
     根据本发明的另外一个优选实施方式， 提供了一种免疫原性药物组合物， 其包含 不具备与纤维蛋白原结合能力的重组葡萄球菌纤维蛋白原结合蛋白或其含有至少一部分 纤维蛋白原结合区域的片段以及药学上可接受的佐剂。
     理想地， 重组葡萄球菌纤维蛋白原结合蛋白或其片段源自金黄色葡萄球菌、 表皮 葡萄球菌和 / 或路邓葡萄球菌。
     这些实施方式的纤维蛋白原结合蛋白可以选自下列 FbI、 SdrF 和 / 或 SdrG( 其也 与胶原结合 ) 的一种。 备选地， 纤维蛋白原结合蛋白可以选自下列一种 ： 纤维蛋白原结合蛋 白聚集因子 A(ClfA)、 纤维蛋白原结合蛋白聚集因子 B(ClfB)、 纤连蛋白 - 纤维蛋白原结合 蛋白 A(FnBPA)、 纤连蛋白 - 纤维蛋白原结合蛋白 B(FnBPB)。 IsdA 促进粘附， 并且对于纤维蛋 白原和纤连蛋白的亲和性较弱， 所以在技术上可以将其定义为纤维蛋白原结合性 MSCRAMM。
     应该理解， 这样的纤维蛋白原结合蛋白的纤维蛋白原结合区域内的核苷酸或氨基 酸取代或删除将产生不具备与纤维蛋白原结合能力的重组蛋白。 已经推论出 ClfA- 纤维蛋白原的结合是通过类似于 SdrG 的坞、 锁和锁闭 (DLL) 机 制发生的。上文详述了 DLL 模型。ClfA 的区域 A 负责蛋白 - 配体相互作用。如图 11 中所 示， 几个纤维蛋白原结合性 MSCRAMM 的模块结构是相似的， 都含有类似于 ClfA 的区域 A。
     纤维蛋白原 γ- 链肽结合位点位于 ClfA 的 N2 和 N3 之间的节点的疏水槽中。因 此， 以上提及的取代或删除被设计为改变 MSCRAMM 蛋白 - 配体相互作用并阻止 ClfA 与纤维 蛋白原的非共价结合。
     根据本发明的一个具体实施方式， 重组葡萄球菌纤维蛋白原结合蛋白是 ClfA 的 纤维蛋白原结合缺陷型突变体。在该实施方式中， ClfA 的纤维蛋白原结合区域 A 被任何方 式改变 ( 例如取代或删除突变 ) 从而其不再与纤维蛋白原结合。
     理想地， 纤维蛋白原结合蛋白是 ClfA， 但是， ClfA 具有与很多其它纤维蛋白原结 合蛋白相似的三维结构。因此， 应该理解， 这些关于 ClfA 的论述同样适用于其它 MSCRAMM 纤维蛋白原结合蛋白， 包括 ClfB、 FnBPA、 FnBPB、 FbI、 SdrG/F、 IsdA 等。所有这些蛋白都具 有相似的三维结构， 因此， 可以对纤维蛋白原结合区域进行相似的改变 / 突变以达到相同 的结果。
     ClfA 是 993 个氨基酸的蛋白， 其包含 520 个氨基酸的纤维蛋白原结合结构域 ( 从 氨基酸 40 至 559)。该纤维蛋白原结合结构域是包含亚区域 N1、 N2 和 N3 的 N 末端 A 结构 域。跨越 N1 至 N3 的从氨基酸 40 至氨基酸 559 的整个纤维蛋白原区域可用于本发明。备 选地， 可以使用 N1 至 N3 区域的截短物， 例如 221 至 559( 最小纤维蛋白原结合区域 )、 221 至 531( 不含锁闭肽和其后的残基的最小纤维蛋白原区域 ) 等。 理想地， 可以使用亚区域 N2 和 N3， 最小纤维蛋白原结合区域， 其对应于氨基酸残基 221 至 559。备选地， 可以使用这些 亚区域的片段。
     已经研究表明， ClfA 的涵盖了 N2 和 N3 区域的氨基酸残基 221 至 559 在与纤维蛋 白原结合的过程中发挥重要作用， 其为最小纤维蛋白原结合区域。我们还出乎意料地发现 该区域中的氨基酸残基突变产生可以被宿主免疫防御识别但是没有纤维蛋白原结合的表
     达蛋白， 因此， 降低了相关的毒力。ClfA 的这个区域 (339 个氨基酸的纤维蛋白原结合结构 域 ) 具有特异性的三维结构， 即所谓的 DE 变体 IgG 折叠， 其为最小 Fg 结合截短物， 如果被 改变的话 ( 通过取代或删除等 )， 能够提供改进的治疗。
     可以通过在核苷酸或氨基酸水平上进行取代、 添加或插入或删除来进行改变以导 致纤维蛋白原结合活性的丧失。理想地， 取代对蛋白或片段的三维结构 ( 例如， 所谓的 DE 变体 IgG 折叠 ) 造成负面影响， 所以它将不能再与纤维蛋白原结合。
     理想地， 核苷酸或氨基酸取代减少与纤维蛋白原的非共价相互作用， 优选通过阻 止配体与分隔纤维蛋白原结合蛋白的区域 A 的 N2 和 N3 的疏水袋结合。备选地， 对应于氨 基酸 532 至 538 的锁闭肽区域可以通过取代或删除被改变， 以阻止配体结合。另外， 可以使 用没有锁闭肽区域和任选地没有 C 末端蛋白残基的剩余部分即没有氨基酸残基 532 至 559 的截短物 / 片段。
     根据本发明的这个方面的一个具体实施方式， 可以通过分别将氨基酸 P336 替换为 丝氨酸和 / 或将氨基酸 Y338 替换为天冬氨酸来构建 ClfA 的纤维蛋白原结合缺陷的突变体。 残基的选择是基于 ClfA 的 X 射线晶体结构以及 “对脯氨酸或酪氨酸的单个改变降低结合活 性” 的观察。令人惊奇的是， 我们发现该突变体 ClfA 蛋白 (rClfAP336S Y338A) 刺激免疫反应 并且可用于产生更加有效的疫苗或抗体治疗。 所述取代可以发生在全长纤维蛋白原结合蛋 白、 纤维蛋白原结合区域、 最小纤维蛋白原结合区域或其片段中。
     根据本发明的这个方面的另一个具体实施方式， 可以通过分别将氨基酸 P336 替换 为天冬氨酸和 / 或将氨基酸 Y338 替换为丝氨酸来构建 ClfA 的纤维蛋白原结合缺陷的突变 体。 如同上一个实施方式一样， 该突变体 ClfA 蛋白 (rClfAP336A Y338S) 也可用于产生更加有 效的疫苗或抗体治疗。
     或者， 所述改变可以是删除的形式， 包括不含锁闭肽序列 ( 氨基酸 532 至 538) 的 纤维蛋白原结合区域， 以产生不具备与纤维蛋白原非共价结合能力的重组纤维蛋白原结合 蛋白。在该实施方式中， 使用了 ClfA 的区域 A 的氨基酸残基 221 至 531， 其没有锁闭肽和其 后的 C 末端残基。备选地， 可以考虑锁闭肽氨基酸 532 至 538 中的氨基酸取代， 其阻止纤维 蛋白原的 DLL。
     应该理解， Clf-Sdr 家族中的所有蛋白都通过 DLL 模型与配体结合。通过模拟三 维结构可以预测锁闭肽并制备没有锁闭肽的截短物， 不论是全长 (N1 至 N3) 还是最小配体 结合截短物 N2-N3 或其片段。
     我们发现这些取代的 rClfA 蛋白 ( 不论是删除突变体， 取代或截短物 ) 降低了毒 力和疾病后果， 并且令人惊奇地诱导比野生型蛋白少的全身性炎症。
     因此， 基于所测的蛋白， 预期以这些突变体蛋白进行的免疫将增强同时识别突变 体和野生型蛋白的抗体水平并且将提供比野生型蛋白更大的免疫反应。
     因此， 经过改变从而其不再与纤维蛋白原结合的 ClfA 是用于主动或被动免疫的 有用的候选治疗剂。按照这种方式， 经改变的 ClfA 蛋白本身可用作疫苗， 或者可以使用针 对这种改变的 ClfA 蛋白产生的抗体。如上所述， 疫苗可以是 DNA 或蛋白疫苗。
     下表中列出的以下序列可以根据本发明使用。
    另外的 N 残基 (N- 末端延伸 (6×His 标签和另外的残基 ) 包含 6 个 His 残基， 接 着是 Gly 和 Ser。另外的 C 末端残基包含 Lys， 接着是 Leu( 可以使用其它的另外的 N 和 C 末端残基 - 取决于所用的引物或需要的 N/C 末端标签 ) 2
     另外的 N 残基 (6×His 标签和另外的残基 ) 包含 6 个 His 残基， 接着是 Gly 和 Ser。另外的 C 末端残基包含 Arg， 接着是 Ser( 可以使用其它的另外的 N 和 C 末端残基 - 取 决于所用的引物或需要的 N/C 末端标签 ) 3
     不含对应于氨基酸残基 532 至 538 的锁闭肽和剩余的 A 区域 C 末端残基， 即没有 氨基酸残基 532 至 559。
     理想地， 重组葡萄球菌纤维蛋白原结合蛋白包含根据任意 SEQ ID NO ： 1 至 3 的氨 基酸序列或其片段， 其中残基 P336 和 / 或 Y338 被丝氨酸和 / 或丙氨酸取代。
     备选地， 重组葡萄球菌纤维蛋白原结合蛋白的片段包含根据任意 SEQID NO ： 4至 SEQ ID NO ： 14 的氨基酸序列。SEQ ID NO ： 4 和 5 仅对应于 ClfA 结构域 N1、 N2、 N3， 其分别 为 rClfA P336S Y338A 和 rClfA P336A Y338S， 如上表中所示。
     基于在 SdrG 中进行的锁闭中的取代推测 ： 在构象变化或 β 链互补方面存在缺陷 的锁闭中的取代在配体结合上也将是有缺陷的。 因此， 理想地， 取代发生于对应于锁闭肽的 氨基酸残基 532 至 538 并影响肽发生构象变化的能力或与配体的结合或二者皆有。 备选地， 改变可以包含一起除掉氨基酸残基 532 至 538(Δ 锁闭肽 )， 以产生相似的结果。 另外， 没有 氨基酸残基 532 至 559( 包括锁闭肽残基 ) 的 C 末端截短突变体也将影响与配体的结合。
     但是， 应该考虑到， 除了以上特别指明的那些之外， 也可以对其它的氨基酸残基进 行取代。 例如， 可以对 Glu 526、 Val 527、 Tyr 256 和 Lys 389 进行取代以改变蛋白或其片段 的纤维蛋白原结合性质。因此， 任何减少结合能力的取代均可以被考虑到。理想地， 这样的 取代或删除影响疏水袋和与之相关的与疏水沟中的配体结合的机制， 例如 ClfA 中的同源 物 Val527 和 ClfB 中的 N526。在 ClfB 中， 已经研究表明 Q235 和 N526 减少结合。以 FnBPA 进行了相似研究， 其中表明 N304 和 F306 对于 Fg 结合是重要的。因此， 这些氨基酸残基中 的突变将影响配体结合。
     应该理解， 这些论述对于其它纤维蛋白原结合蛋白例如 ClfB、 SdrG、 FnBPA、 FnBPB 同样适用。因此， 治疗 ( 疫苗、 抗体或药物组合物等 ) 可以包含完整的纤维蛋白原结合区域 或其片段。
     在 本 说 明 书 中， 术语 “包 括 (comprise)、 包 括 (comprises)、 包 括 (comprised) 和包括 (comprising)”或其任何变体以及术语 “包括 (include)、 包括 (includes)、 包括 (included) 和包括 (including)” 或其任何变体被认为是完全可以相互替换使用， 它们应 该被赋予最可能宽的解释。
     19本发明不限于以上描述的实施方式， 可以在权利要求的范围内在解释和细节方面变化。 现在将通过参考以下非限制性附图和实施例来描述本发明。
     图 1 至 15 显示了实施例 1 的结果。
     图 1 显示了在接种了金黄色葡萄球菌菌株 Newman， 和 clfAPYI、 clfAPYII 和 clfA 无效突变体的小鼠中以关节炎指数测定的关节炎的严重性 (A) 和体重丧失 (B)。接种 3.2×106-6.0×106cfu 的金黄色葡萄球菌菌株。数据表示为中位数 ( 正方形或中线 )、 四分 位数间距 ( 框 ) 和 80％中间间距 ( 须 )。汇集来自三次实验的数据。NNewman ＝ 27-30， NclfAPYI ＝ 30， NclfAPYII ＝ 10， NclfA ＝ 16-20。
     图 2 显示了以 3.2×106-6.0×106cfu 的金黄色葡萄球菌菌株 Newman， 和 clfAPYI、 clfAPYII 和 clfA 无效突变体接种之后 7-8 天的小鼠肾脏中的细菌生长。数据表示为每对 肾脏中的 cfu。 当检测不到生长时， 将计数设置为根据所用的稀释度的最高可能计数。 汇集 来自三次实验的数据。NNewman ＝ 26， NclfAPYI ＝ 30， NclfAPYII ＝ 10， NclfA ＝ 15。 7
     图 3 显示了分别接种 5.2、 5.1 或 3.3×10 cfu 的金黄色葡萄球菌菌株 Newman、 clfAPYI 突变体或 clfA 无效突变体之后的小鼠生存情况。从开始起每组 N ＝ 10。
     图 4 显示了分别接种 9.4、 7.9、 10.7 或 9.8×106cfu 的金黄色葡萄球菌菌株 LS-1， 和 clfAPYI、 clfAPYII 或 clfA 无效突变体之后的小鼠生存情况。从开始起每组 N ＝ 15。
     图 5 显示了以 BSA、 重组 ClfA 或重组 ClfAPY( 即 ClfAPYI 重组蛋白 A 结构域 ) 免 7 疫并接种了 2.3×10 cfu 的金黄色葡萄球菌 Newman 的小鼠的生存情况。 从开始起每组 N ＝ 15。
     图 6 显示了接种了 3.2×106-6.0×106cfu 的金黄色葡萄球菌菌株 Newman 野生型， 和 clfAPYI、 clfAPYII 和 clfA 无效突变体的关节炎小鼠的频率。汇集来自三次实验的数 据。NNewman ＝ 27-30， NclfAPYI ＝ 30， NclfAPYII ＝ 10， NclfA ＝ 16-20。
     图 7 显示了分别接种了 5.2、 5.1 或 3.3×107cfu 的金黄色葡萄球菌菌株 Newman 野 生型、 clfAPYI 突变体或 clfA 无效突变体的小鼠中以关节炎指数测定的关节炎的严重性。 数据表示为中位数 ( 正方形 )、 四分位数间距 ( 框 ) 和 80％中间间距 ( 须 )。NNewman ＝ 0-10， NclfAPYI ＝ 9-10， NclfA ＝ 0-10。
     图 8 显示了分别接种了 5.2、 5.1 或 3.3×107cfu 的金黄色葡萄球菌菌株 Newman 野生型、 clfAPYI 突变体或 clfA 无效突变体的小鼠中的体重丧失。数据表示为中位数 ( 中 线 )、 四分位数间距 ( 框 ) 和 80％中间间距 ( 须 )。NNewman ＝ 0-10， NclfAPYI ＝ 9-10， NclfA ＝ 0-10。
     图 9 显示了以 BSA、 重组 ClfA 或重组 ClfAPY( 即 ClfAPYI 重组蛋白 A 结构域 ) 免 6 疫并接种了 4.0×10 cfu 的金黄色葡萄球菌 Newman 的小鼠中以关节炎指数测定的关节炎 的严重性。数据表示为中位数 ( 正方形 )、 四分位数间距 ( 框 ) 和 80％中间间距 ( 须 )。从 开始起， 每组 NBSA ＝ 14， NclfAPY ＝ 14， NclfA ＝ 15。
     图 10 给出了野生型 ClfA A 结构域蛋白 (rClfA)、 仅结构域 N123 的核苷酸和氨基 酸序列， 其中以高亮标出了在以下实施例中被改变以产生 rClfAPYI/II(SEQ ID No.3) 的残 基 (P336 和 Y338)。在以下实施例中用于疫苗接种的正是这个重组蛋白 A 结构域。
     图 11 显示了 FnBPA、 ClfB、 ClfA 和 SdrG 蛋白结构的示例性图。区域 A 是纤维蛋白
     原结合区域， S 是信号序列， W 是细胞壁跨越结构域， M 是膜锚定， 其包括 LPXTG 基序， + 表示 带正电的残基， R 是重复区域。在 ClfA 中， 区域 A 包含 N123( 未显示 )。FnBPA 的 BCD 区域 ( 以及 FnBPB 的较短的 CD 区域 - 未显示 ) 与纤连蛋白结合。
     图 12 显 示 了 在 第 二 次 加 强 免 疫 9 天 之 后， 对 于 用 牛 血 清 白 蛋 白 (BSA)、 重组 ClfA40-559(rClfA) 或 重 组 ClfAPY40-559(rClfAPY) 免 疫 的 小 鼠 血 清 样 品 中 的 重 组 ClfAPY40-559 的特异性抗体反应， 1 天之后以 2.3×107cfu/ 小鼠进行金黄色葡萄球菌菌株 Newman 野生型的感染以诱导脓毒症。数据表示为中位数 ( 中线 )、 四分位数间距 ( 框 ) 和 80％中间间距 ( 须 )。NBSA ＝ 13-15， NrClfA ＝ 15， NrClfAPY ＝ 15。
     图 13 显 示 了 在 第 二 次 加 强 免 疫 9 天 之 后， 对 于 用 牛 血 清 白 蛋 白 (BSA)、 重组 ClfA40-559(rClfA) 或 重 组 ClfAPY40-559(rClfAPY) 免 疫 的 小 鼠 血 清 样 品 中 的 重 组 ClfA40-559 的特异性抗体反应， 1 天之后以 2.3×107cfu/ 小鼠进行金黄色葡萄球菌菌株 Newman 野生型的感染以诱导脓毒症。数据表示为中位数 ( 中线 )、 四分位数间距 ( 框 ) 和 80％中间间距 ( 须 )。NBSA ＝ 13-15， NrClfA ＝ 15， NrClfAPY ＝ 15。
     图 14 显 示 了 在 第 二 次 加 强 免 疫 9 天 之 后， 对 于 用 牛 血 清 白 蛋 白 (BSA)、 重组 ClfA40-559(rClfA) 或 重 组 ClfAPY40-559(rClfAPY) 免 疫 的 小 鼠 血 清 样 品 中 的 重 组 ClfAPY40-559 的特异性抗体反应， 1 天之后以 4.0×106cfu/ 小鼠进行金黄色葡萄球菌菌 株 Newman 野生型的感染以诱导脓毒性关节炎。数据表示为中位数 ( 中线 )、 四分位数间距 ( 框 ) 和 80％中间间距 ( 须 )。NBSA ＝ 14-15， NrClfA ＝ 15， NrClfAPY ＝ 15。
     图 15 显 示 了 在 第 二 次 加 强 免 疫 9 天 之 后， 对 于 用 牛 血 清 白 蛋 白 (BSA)、 重组 ClfA40-559(rClfA) 或 重 组 ClfAPY40-559(rClfAPY) 免 疫 的 小 鼠 血 清 样 品 中 的 重 组 ClfA40-559 的特异性抗体反应， 1 天之后以 4.0×106cfu/ 小鼠进行金黄色葡萄球菌菌株 Newman 野生型的感染以诱导脓毒性关节炎。数据表示为中位数 ( 中线 )、 四分位数间距 ( 框 ) 和 80％中间间距 ( 须 )。NBSA ＝ 14-15， NrClfA ＝ 15， NrClfAPY ＝ 15。
     实施例 2 的图 16 显示了在第二次加强免疫 9 天之后， 对于用牛血清白蛋白 (BSA)、 重组 ClfA221-559(rClfA221-559) 或重组 ClfAPY221-559(rClfAPY221-559) 免疫的小鼠血 清样品中的重组 ClfAPY221-559 的特异性抗体反应。 数据表示为中位数 ( 中线 )、 四分位数 间距 ( 框 ) 和 80％中间间距 ( 须 )。NBSA ＝ 15， NrClfA221-559 ＝ 14-15， NrClfAPY221-559 ＝ 14-15。
     实施例 2 的图 17 显示了在第二次加强免疫 9 天之后， 对于用牛血清白蛋白 (BSA)、 重组 ClfA221-559(rClfA221-559) 或重组 ClfAPY221-559(rClfAPY221-559) 免疫的小鼠血 清样品中的重组 ClfA221-559 的特异性抗体反应。 数据表示为中位数 ( 中线 )、 四分位数间 距 ( 框 ) 和 80％中间间距 ( 须 )。NBSA ＝ 15， NrClfA221-559 ＝ 14-15， NrClfAPY221-559 ＝ 14-15。
     实 施 例 3 的 图 18 显 示 了 在 第 二 次 加 强 免 疫 9 天 之 后，对 于 用 重 组 ClfAPY221-531(rClfA221-531) 免疫的小鼠血清样品中的重组 ClfA221-53l 的特异性抗体 反应。数据表示为中位数 ( 中线 )、 四分位数间距 ( 框 ) 和 80％中间间距 ( 须 )。NrClfA221-531 ＝ 14-15。 实施例
    
    实施例 1 包含 N1、 N2 和 N3( 氨基酸 40-559) 的 rClfA A 区域截短物材料和方法
     在本部分末尾处提供了实施例中给出的括号中的数字参考文献的全部细节。
     小鼠
     NMRI 小鼠获自 Scanbur BK(Sollentuna， 瑞典 )， 维持在瑞典哥德堡大学风湿病学 系的动物厂房中。哥德堡动物实验伦理委员会批准了该实验。每个笼子中饲养 10 只动物， 以 12 小时的光照 - 黑暗进行循环， 以标准实验室食品和水随意饲养。在实验开始时， 动物 为 6 至 16 周龄。
     细菌菌株
     为了感染动物， 使用了金黄色葡萄球菌野生型菌株 Newman(14) 和 LS-1(11) 及其 构建衍生物。 在菌株 Newman 中构建 clfA P336SY338A(clfAPYI) 和 clfAP336AY338S(clfAPYII) 衍 生物并将其转导至菌株 LS-1( 见下文 )。 还使用了删除突变体 Newman clfA2::Tn917 突变体 DU5876(3) 和 LS-1 clfA2::Tn917 突变体 (J.R.Fitzgerald 等人， 未发表 )。细菌在血液琼 脂板上生长 48 小时， 收获并于 -20℃冷冻于含有 5％ ( 重量 / 体积 )BSA(Sigma Chemicals) 和 10％ ( 体积 / 体积 ) 二甲基亚砜的 PBS 中。在注射到动物中之前， 将细菌悬浮液解冻， 在 PBS 中洗涤， 并调整至合适的细胞浓度。在每次刺激时根据血液琼脂板上的培养和计数 菌落测定活细菌的数目。 在金黄色葡萄球菌 Newman 和 LS-1 中构建 clfAPYI 和 clfAPYII 突变
     在本实验中， 使用了包含对应于氨基酸 40-559 的 N1、 N2 和 N3 的全长 ClfAA 区域 截短物。在以下描述和附图中 ：
     -ClfA 也可被称作 rClfA 40-559(SEQ ID NO 3) ；
     -ClfA P336SY338A 也可被称作 clfAPYI、 rclfAPY 或 rclfAPYI( 即 clfAPYI40-559) (SEQ ID NO 4) ； 和
     -ClfA P336AY338S 也可被称作 clfAPYII、 rclfAPYII( 即 clfAPYII 40-559)(SEQ ID NO 5)。
     将 在 clfA 中 含 有 P336S 和 Y338A 突 变 的 1.02kb 的 pCF77PY 的 PstI-BamHI 片 段 (Loughman 等人， 2005) 克隆进入 pBluescriptII SK-(Stratagene)。使用 HindIII 将该质 粒线性化并连接进入 HindIII- 切割的 pTSermC(J.Higgins， 未发表 ) 以产生质粒 pARM， 其 为温度敏感性的大肠杆菌 - 金黄色葡萄球菌穿梭质粒， 其含有 P336S 和 Y338A 取代。
     为了降低由于取代 P336 和 Y338 而产生功能性或免疫反应性表位的未知风险， 我们 产生了 产生了第二个突变体， 其中取代的顺序是反的， 即产生 P336A 和 Y338S。为了产生这个， 类似于 pARM 但是包含 P336A 和 Y338S 取代的质粒 pJH2。使用与用以制备 pCF77PY(6) 相同的 侧翼引物和一对不同的重叠突变引物 ( 突变以黑体和下划线表示 ) 进行重叠引物 PCR 以产 生 pCF77PYII ：
     F3 ： GCAACTTTGACCATGGCCGCTTCTATTGACCCTGAAAATG 和
     R3 ： CATTTTCAGGGTCAATAGAAGCGGCCATGGTCAAAGTTGC
     如上所述， 使用该质粒的 1.02kb PstI-HindIII 片段用于产生 pJH2——一种温度 敏感性大肠杆菌 - 金黄色葡萄球菌穿梭质粒， 其含有 P336A 和 Y338S 取代。
     通过电穿孔将 pARM 和 pJH2 都转移到 RN4220(15) 中， 然后使用噬菌体 85(16) 将 其转导到金黄色葡萄球菌 Newman(14) 和 LS-1(11) 中。在这些菌株中， 诱导该质粒使其
     插入到染色体中， 然后进行切割， 将突变留在一定比例的转化子的染色体中， 产生 Newman clfAPYI、 Newman clfAPYII、 LS-1clfAPYI 和 LS-1clfAPYII。就质粒的损失和纤维蛋白原结 合活性的丧失筛选转化子。 使用 clfA 探针通过 Southern 杂交验证 clfA 基因的完整性 ( 数 据未显示 )。使用抗 -ClfA 区域 A 的多克隆兔子抗血清通过 Westem 免疫印迹验证免疫反应 性蛋白 (ClfAPY) 的表达 ( 数据未显示 )。通过在来自基因组 DNA 的 KpnI-BamHI 片段上进 行 PCR 和产物的商业测序对突变进行验证。所测序的菌株 LS-1 的 clfA 基因的大约 700 个 碱基与菌株 Newman 的 Newman clfA 基因中的对应碱基是相同的。
     重组 ClfA 和 ClfAPY 的产生
     按照以前的描述 (17)， 从 pCF40 产生 His 标记的重组 ClfA 区域 A、 结构域 N123( 氨 基酸 40-559)， 其中增加了另外的通过阴离子交换柱的抛光步骤。使用质粒 pCF77PY(6) 作 为模板， 将 clfAPYI 结构域 N123 克隆进入 pQE30 中以产生 pCF40PY。使用该质粒， 还通过镍 亲和层析和阴离子交换层析产生了重组 ClfAPY， 如同对于 rClfA 的描述一样。在浓缩和冷 冻干燥之前， 以 PBS 将洗脱物透析两次。
     脓毒性关节炎和脓毒症实验
     在实验 1-3 中， 以菌株 Newman 感染所有的小鼠 ( 每组 n ＝ 10) 以引发关节炎， 在 实验 4 和 5 中， 分别以菌株 Newman 和 LS-1 感染小鼠 ( 每组 n ＝ 10) 以引发脓毒症。
     实 验 1 通过静脉 内注射 3.5×106cfu/ 小鼠的金 黄色 葡萄球菌菌株 Newman 或 4.3×106cfu/ 小鼠的 Newman clfAPYI 突变体感染小鼠， 二者均处于 200μl PBS 中。监测 临床关节炎和重量变化直至第 7 天。在第 8 天将小鼠杀死， 测定肾脏中细菌的生长并且测 定血清 IL-6 和总 IgG 水平。在前和后足的关节处进行滑膜炎和骨破坏的组织学研究。
     实验 2 分别以 5.0×106cfu、 6.0×106cfu 或 4.3×106cfu 的金黄色葡萄球菌菌株 Newman、 clfAPYI 突变体或 Newman clfA::ErmR(clfA 无效突变体 ) 感染小鼠。监测临床关 节炎和重量变化直至第 7 天。 在第 7 天将小鼠杀死， 测定肾脏中细菌的生长 ； 测定血清 IL-6 和总 IgG 水平。在前和后足的关节处进行滑膜炎和骨破坏的组织学研究。
     实验 3 分别以 4.7×106cfu、 3.2×106cfu、 3.9×106cfu 或 4.8×106cfu 的金黄色葡 萄球菌菌株 Newman、 clfAPYI 突变体、 Newman clfAPYII 突变体或 NewmanclfA 无效突变体 感染小鼠。监测临床关节炎和重量变化直至第 7 天。在第 8 天将小鼠杀死， 测定肾脏中细 菌的生长 .
     实验 1-3 的结果是非常相似的， 所以将数据汇集并一起呈现。
     在实验 4 中， 将小鼠分别用 5.2×107cfu、 5.1×107cfu 或 3.3×107cfu 的金黄色葡 萄球菌菌株 Newman、 clfAPYI 突变体或 clfA 无效突变体静脉内注射。监测死亡率、 重量变 化和临床关节炎直至第 10 天。
     在 实 验 5 中，将 小 鼠 分 别 用 9.4×106cfu、 7.9×106cfu、 10.7×106cfu 或 9.8×106cfu 的金黄色葡萄球菌菌株 LS-1、 LS-1clfAPYI 突变体、 LS-1 clfAPYII 突变体或 LS-1 clfA 无效突变体感染。监测死亡率、 临床关节炎和重量变化直至第 16 天。
     关节内注射细菌
     分别以 2.4×104cfu、 2.4×104cfu 或 3.4×104cfu 的菌株 Newman 野生型、 clfAPYI 突变体或 clfA 敲除突变体 ( 处于 20μl PBS 中 ) 注射每只小鼠的一个膝关节。每组 N ＝ 10。在 3 天后杀死小鼠， 收集膝关节用于组织病理学检查。以野生型和突变体重组 ClfA 进行疫苗接种
     将纯化的 rClfA40-559、 rClfAPY40-559( 即 rClfAPYI) 或 BSA 溶解于生理盐水中 并与弗氏完全佐剂 (Difco Laboratories) 以 1 ∶ 1 进行乳化。在第 0 天将 200μl 含有 30μg( ＝ 0.53nmol) 蛋白的乳液皮下 (s.c.) 注射。在第 11 天以不完全的弗氏佐剂中的生 理盐水中的 30μg 蛋白进行第一次加强免疫。在第 21 天进行第二次加强免疫。在第 30 天 将小鼠放血， 将血清冷冻用于后续的抗体反应分析。
     在第 31 天， 以 4.0×106cfu/ 小鼠通过静脉内注射感染每组 14-15 只小鼠以诱导 脓毒性关节炎， 或者以 2.3×107cfu/ 小鼠诱导脓毒症。监测临床关节炎、 重量变化和死亡 率分别达 11 和 15 天。在脓毒性关节炎实验中测定肾脏中的细菌生长。
     感染小鼠的临床评价
     以不知情方式进行临床评价。目测检查每个肢体。检查产生 0 至 3 的评分 (0 是 没有肿胀和红斑 ； 1 是轻微肿胀和 / 或红斑 ； 2 是中度肿胀和 / 或红斑 ； 3 是显著肿胀和 / 或 红斑 )。通过将动物的所有四肢的评分相加而获得关节炎指数。还通过测定全身性炎症的 迹象即重量减轻、 警戒性降低和皮毛发皱来检查每只小鼠的总体状况。在严重全身性感染 的情况下， 当判定某小鼠病得太严重以致于活不过 24 小时的时候， 通过断颈法将其杀死并 且认为是由于脓毒症而死亡的。
     组织学检查
     使用以前描述的方法 (18) 的修改 (8) 来进行关节的组织学检查。
     感染的肾脏的细菌学检查
     无菌分离肾脏、 置于冰上、 匀浆、 在 PBS 中连续稀释并涂布于血液琼脂板上。在 37℃温育 24 小时之后， 测定每对肾脏的 cfu 数目。
     血清 IgG 的测定
     通过放射状免疫扩散技术 (19) 测定血清中的总 IgG 水平。山羊抗小鼠 IgG 和小 鼠 IgG 标准物购自 Southern Biotech， Birmingham， AL。
     特异性抗体 -ELISA
     在第二次加强免疫之后 9 天从经免疫的小鼠获取血清样品。通过 ELISA 测定针 对 rClfA 和 rClfAPY 的血清特异性抗体反应。以 PBS 中的 5μg/ml 的重组蛋白包被微板 (96- 孔 ； Nunc)。封闭试剂、 血清样品、 生物素化的抗体和 ExtrAvidin- 过氧化物酶均在 PBS 中稀释。根据以前的描述 (8) 进行该检验。所有的血清样品以 1 ∶ 20000 稀释， 以 405nm 处的吸光度监测抗体反应。
     在第二轮中， 为了获得不同免疫组中特异性抗体反应的更精确的测定， 在数个 血清稀释度中测定反应。因此， 所有的血清样品以 1 ∶ 5000、 1 ∶ 20000、 1 ∶ 80000 和 1 ∶ 320000 稀释， 以 405nm 处的吸光度监测抗体反应。
     IL-6 分析
     根据以前描述的方法 (20) 检测血清 IL-6。
     统计学分析
     使用 Mann-Whitney U 检验进行统计学评价。P ＜ 0.05 被认为是显著性的。除非 另有指明， 否则数据报告为中位数、 四分位数间距和 80％中间间距。
     结果ClfA 与纤维蛋白原结合必需的两个氨基酸的替换阻碍了脓毒性关节炎和脓毒症的发生 通过等位基因交换将已知为 ClfA 与纤维蛋白原结合必需的两个氨基酸 (P336 和 Y338) 改变以产生菌株 Newman 和 LS1 的突变体， 其在细胞表面表达非纤维蛋白原结合性 ClfA 蛋白。通过 Western 印迹检测该蛋白的表达水平和完整性， 证明了该突变蛋白在细菌 表面表达良好并且表达的蛋白是正确的大小。
     研究了 Newman 野生型和 Newman clfA P336S Y338A(clfAPYI) 引发脓毒性关节炎的 能力。通过静脉内分别接种 3.5×106 至 5.0×106 的菌落形成单位 (cfu) 和 3.2×106 至 6.0×106cfu 的 Newman 野生型和 clfAPYI 突变体诱导脓毒性关节炎。对关节炎的发展临床 研究 7 天。在整个实验期间， 相比野生型菌株， clfAPYI 突变体引发的关节炎严重性显著较 低 (P ＞ 0.001， 图 1A)。在多数时间点， 对于 Newman clfAPYI， 关节炎的频率较低 ( 图 6)。
     出乎意料的是， ClfAPYI 分子中的新的氨基酸组成似乎适合与宿主的抗细菌防御 相互作用。 为了检验这个可能性， 制备了一种新的构建体， 其中以不同的氨基酸来取代 P336 6 和 Y338(clfA P336A Y338S ： clfAPYII)。以 3.9×10 cfu 的 NewmanclfAPYII 接种的小鼠产生 的关节炎程度与 clfAPYI 突变体一样低 ( 图 1A)， 并且具有相似的频率 ( 图 6)。这个结果 强烈表明， 纤维蛋白原结合的丧失促成关节炎水平的降低。
     ClfA 可能通过不涉及纤维蛋白原结合的机制参与关节炎的发生。 为测试这个可能 性， 将缺少 ClfA 蛋白的 ClfA 删除突变体与表达修饰的非纤维蛋白原结合性 ClfA 蛋白的突 变体进行比较。但是， 以 4.3×106 至 4.8×106cfu 的 clfA 无效突变体感染的小鼠产生的关 节炎与 clfAPYI 和 clfAPYII 突变体感染的小鼠在方式上没有差异 ( 图 1A)。关节炎的频率 也是不可区分的 ( 图 6)。
     还对感染的关节进行了组织学研究。在实验 1 和 2 中， 相比野生型感染的小鼠， Newman clfAPYI 感染的小鼠中的滑膜炎均显著较轻 ( 分别为 P ＝ 0.02 和 0.001)。 在 Newman clfAPYI 感染的样品中， 几乎不存在骨破坏 ( 骨破坏是人类脓毒性关节炎后遗症的主要诱 因 )( 实验 2， P ＝ 0.001)。与 Newman 野生型感染的小鼠相比， Newman clfA 无效突变体诱 导的滑膜炎和骨破坏均较轻 ( 分别为 P ＝ 0.003 和 0.006)， 但是在某种程度上比 Newman clfAPYI 组严重， 虽然不是很显著。
     接下来分析了 clfA 突变对于感染过程造成的代谢后果。以 Newman 野生型菌株感 染的小鼠在实验过程中体重下降了高达大约 30％。 以纤维蛋白原结合缺陷的突变体 Newman clfAPYI 和 Newman clfAPYII 感染的小鼠重量几乎没有任何减少 (P ＞ 0.0001 相对于野生 型 )。相反， Newman clfA 无效突变体对于重量损失具有中等效应， 导致显著小于野生型菌 株， 但是显著高于 clfAPYI 和 clfAPYII 突变体菌株 ( 在多数情况下 P ≤ 0.02， 图 1B)。
     在感染的第 7-8 天分析了作为全身性炎症反应的度量的血清 IL-6 水平。IL-6 的 表达模式类似于重量变化。Newman 野生型引发高水平的血清 IL-6(4.8(2.8， 5.7)ng/ml)， Newman clfAPYI 突变体引发显著较低的 IL-6(0.2(0.07， 2.4)ng/ml， P ＜ 0.0001) 而 Newman clfA 无效突变体产生中等的反应 (2.5(1.3， 3.2)ng/ml)， 其与野生型和 clfAPYI 突变体组 均有显著差异 ( 分别为 P ＝ 0.009 和 P ＝ 0.008)( 中位数， 四分位数间距 )。
     与 Newman clfAPY 突变体和 Newman clfA 无效突变体这两者相比， 在 Newman 野 生型感染的小鼠中， 肾脏中的细菌生长显著较高 ( 分别为 P ＜ 0.0001， P ＝ 0.011， 和P＝
     0.005 ； 图 2)。相比于 Newman clfAPYI- 感染的小鼠， Newman clfA 无效突变体 - 感染的小 鼠的肾脏中的细菌生长显著较高 (P ＝ 0.0005， 图 2)。
     在感染的第 7-8 天测定了小鼠血清中的总 IgG。Newman clfAPYI- 和 NewmanclfA 无效突变体 - 感染的两个组中的 IgG 水平的增加都显著低于以野生型菌株感染的小鼠 ( 分 别 为 3.1(1.2， 4.9) ； 2.3(1.0， 2.6) ； 和 6.4(5.0， 11.0)( 中 位 数， 四分位数间距 ) ； P ≤ 0.0003)。在两个突变体组之间没有显著性差异。
     在 Newman 野生型感染的小鼠中死亡率是 17％， 在 Newman clfAPYI 和 clfAPYII 突 变体组中是 0％， 在 Newman clfA 无效突变体组中是 30％。在野生型和 clfAPYI 组之间以 及在 clfAPYI 和 clfA 无效突变体组之间的死亡率存在显著性差异 ( 分别为 P ＜ 0.05 和 P ＜ 0.01)。
     在感染了表达纤维蛋白原结合缺陷的 ClfA 的金黄色葡萄球菌的小鼠中， 全身性 炎症的直接和间接迹象似乎较低。出人意料的是， 不表达 ClfA 的菌株都诱导了比表达 ClfAPY 突变体的菌株更强烈的全身性炎症。
     通过增加金黄色葡萄球菌的接种剂量诱导了脓毒症。 以 5.2×107cfu 的 Newman 野 生型、 5.1×107cfu 的 Newman clfAPYI 突变体和 3.3×107cfu 的 Newman clfA 无效突变体 注射小鼠。 在 5 天内， 所有的感染了野生型的小鼠都死亡， 但是在注射 10 天后， 10 只注射了 clfAPYI 突变体的小鼠中仅有 1 只死亡 (P ＜ 0.0001， 图 3)。注射了 clfA 无效突变体的小 鼠的生存时间也显著短于 clfAPYI 突变体感染的小鼠 (P ＜ 0.0001， 图 3)。在该实验中， 以 clfA 无效突变体刺激的小鼠产生显著多于 clfAPYI 突变体组的关节炎， 同时它们损失显著 更多的重量 ( 图 7 和 8)。因此， 通过与脓毒性关节炎实验中的全身性炎症的度量相类比发 现， 如果 ClfA 分子被表达， 则小鼠的生存被延长， 只要该 ClfA 分子没有纤维蛋白原结合性 质。
     将细菌注射进入关节
     为了测定关节中的炎性反应是否依赖于纤维蛋白原结合， 将 Newman 野生型、 Newman clfAPYI 或 Newman clfA 空白直接注射进入小鼠的膝关节， 从而绕过全身性区室。 3 天之后通过组织学方法研究滑膜炎， 包括关节腔的多形核渗透， 以及骨破坏。 小鼠在一个膝 4 4 4 处接受 2.4×10 cfu 的野生型、 2.4×10 cfu 的 clfA 无效突变体或 3.4×10 cfu 的 clfAPYI 突变体。 对于感染了野生型的膝， 关节腔内的滑膜炎和多形核渗透的组织学指数为 0.25(0， 3.0)， 对于 clfA 无效突变体为 2.38(0.25， 3.0)， 对于 clfAPYI 突变体为 0.25(0， 0.25)( 中 位数， 四分位数间距 )。对于野生型， 骨破坏的组织学指数是 0(0， 1.0)， 对于 clfA 无效突变 体为 1.0(0， 1.0)， 对于 clfAPYI 突变体为 0(0， 0)( 中位数， 四分位数间距 ； 在 clfAPYI 突变 体和 clfA 无效突变体之间 P ＝ 0.01)。由于 clfAPYI 突变体引发极少的滑膜炎和破坏， 所 以， 虽然存在 “给予小鼠的该菌株的量比其它菌株多 40％” 这一事实， 但是仍然得出结论 ： ClfA 促使的纤维蛋白原结合对于关节内的最大炎性反应是必需的。再次， 相对于纤维蛋白 原结合缺陷的 ClfA 突变体， ClfA 表达的缺失增强了炎症。
     菌株 LS-1 中的 PY 突变
     为了确定 ClfA 与纤维蛋白原结合的能力是否影响其它金黄色葡萄球菌菌株的 毒力， 将 clfAPYI、 clfAPYII 和 clfA 无效突变转导到表达 TSST-1 的金黄色葡萄球菌菌株 6 LS-1。 以 9.4×10 cfu 的 LS-1 野生型、 7.9×106cfu 的 LS-1 clfAPYI、 10.7×106cfu 的 LS-1clfAPYII 或 9.4×106cfu 的 LS-1 clfA 无效突变体刺激小鼠。通过监测存活率来研究脓 毒症。在 16 天之后， 以野生型菌株刺激的小鼠只有 40％是存活的， 而以 clfAPYI 突变体和 clfA 无效突变体组刺激的小鼠有 90％是存活的， 以 clfAPYII 突变体感染的小鼠有 80％是 存活的 ( 图 4)。LS-1 的 clfAPYI 突变体和 clfA 无效突变体的毒力显著较低 ( 分别为 P ＝ 0.014、 P ＝ 0.05 和 P ＝ 0.03)。
     以重组 ClfA 蛋白进行免疫
     在脓毒性关节炎模型和脓毒症模型中都研究了重组野生型 ClfA A 结构域蛋白 (rClfA) 和突变体 ClfAPYI 蛋白 (rClfAPY) 进行疫苗接种的效应。将小鼠致敏， 然后以对 6 照蛋白 BSA、 rClfA 或 rClfAPY 进行两次加强免疫， 然后以 4.0×10 cfu 的金黄色葡萄球菌 菌株 Newman 感染以诱导脓毒性关节炎， 或者以 2.3×107cfu 的菌株 Newman 感染以诱导脓 毒症。与对照小鼠相比， 以 rClfAPY( 即 ClfAPYI 重组蛋白 A 结构域 ) 进行的免疫对脓毒性 死亡产生了显著性保护 (P ＝ 0.01， 图 5)， 而 rClfA 免疫没有产生显著性保护。在细菌感染 之前的 1 天， 在 rClfAPY 免疫的小鼠中， 对于 rClfAPY 和 rClfA 的特异性血清抗体反应 (A405 ＝ 0.39(0.33， 0.56) 和 0.71(0.52， 0.81)) 比 rClfA 免疫的小鼠高得多 (A405 ＝ 0.13(0.07， 0.17) 和 0.15(0.10， 0.24)， 在两个对比中 P ＜ 0.0001( 中位数， 四分位数间距 ))。对照免 疫的动物仅具有背景水平 (A405nm ＝ 0 和 0.01(0， 0.01)( 中位数， 四分位数间距 ))。以较低 的关节炎细菌剂量感染的免疫小鼠与其中诱导了脓毒症的小鼠产生了相似的针对 rClfA 和 rClfAPY 的抗体反应 ( 数据未显示 )。以 rClfA 和 rClfAPY 免疫均具有对于发生关节炎 的保护， 虽然这种保护不是显著性的 ( 图 9)。
     在感染后第 5 至 9 天内， 与对照小鼠相比， 在 rClfAPY 和 rClfA 免疫的小鼠中重量 损失显著减少 ( 数据未显示 )。
     观察到在感染后第 11 天， 以 rClfAPY 和 rClfA 免疫的小鼠的肾脏中细菌生长的减 少趋势 (BSA ： 38(3， 436) ； rClfAPY ： 7(2， 17) ； rClfA ： 10(7， 54)×107cfu/ 对肾脏 )。
     为了获得不同免疫组中特异性抗体反应的更精确的测定， 在数个血清稀释度 ( 第 二轮 ) 中确定了反应。数据显示 ： 在以脓毒性和关节炎细菌剂量感染的小鼠中， 与来自 rClfA 野生型免疫的小鼠的血清相比， 来自 rClfAPY 免疫小鼠的血清的特异性抗体对于 rClfAPY 和 rClfA 野生型抗原的效价都较高， 这是因为， 在所有的比较中， 以 rClfAPY 免疫 的小鼠的每个血清稀释度中按照吸光度测定的抗体反应都显著较高 (P ＜ 0.0001 至 P ＝ 0.008， 图 12-15)。BSA 免疫仅引发了背景抗体反应。
     结论
     结果强烈表明 ： ClfA- 纤维蛋白原相互作用对于细菌毒力和疾病后果至关重要。 在引起脓毒性死亡的能力方面， ClfA 与纤维蛋白原结合的能力与增强的毒力相关。在所测 的两个葡萄球菌菌株中， clfAPY 突变体诱导的脓毒性死亡都低于野生型。同样， 在感染了 非纤维蛋白原结合性 clfAPY 突变体的小鼠中， 关节炎的严重性显著降低。
     纤维蛋白原 - 细菌细胞表面相互作用对于毒力的促进的一个可能机理是对于嗜 中性粒细胞的吞噬作用的抑制 (5)。嗜中性粒细胞对于金黄色葡萄球菌感染早期的宿主防 御是至关重要的 (13)。如果没有嗜中性粒细胞， 血液和肾脏中的细菌生长将强烈扩大， 关 节炎的频率和死亡率增加。通过 ClfA 进行的纤维蛋白原介导的对于嗜中性粒细胞的吞噬 作用的抑制可以至少部分解释野生型金黄色葡萄球菌相对于 clfAPY 突变体的更强烈的毒力。纤维蛋白原与 ClfA 的结合能够通过减少调理素沉积或通过减少嗜中性粒细胞受体与 调理素的接触而降低嗜中性粒细胞的调理吞噬。备选地， 结合的纤维蛋白原可能阻断未知 的保护性宿主因子与金黄色葡萄球菌的结合。另一个可能是纤维蛋白原 -ClfA 相互作用促 进细菌通过血管进入组织或促进在组织中的群集。
     出人意料的是， 我们的数据还表明， ClfA 无效突变体比 clfAPY 突变体菌株的毒力 更强。ClfA 蛋白有可能在体内具有除了与纤维蛋白原相互作用之外的功能。如本研究所 示， 这种相互作用对于宿主而言显然是不利的。ClfA 的其它功能至今不明， 但是 ClfA 表现 出来的非纤维蛋白原依赖性血小板的聚集可能导致循环中的大量金黄色葡萄球菌的捕获， 进而通过网状内皮组织系统将细菌 - 血小板复合物清除。在野生型和 clfAPY 突变菌株中 将容易地发生这种血小板聚集介导的葡萄球菌的清除， 但是在 clfA 敲除体中则不会发生。 虽然在野生型菌株中纤维蛋白原相互作用将掩盖其它事件， 但是在 clfAPY 突变体中这样 的细菌清除可能对于宿主是非常有益的。
     clfA 敲除突变体对于脓毒性死亡的保护程度与金黄色葡萄球菌菌株 LS-1 中的 clfAPY 突变体是相同的， 但是在菌株 Newman 中保护较少， 如果有所保护的话。ClfA 表达对 于细菌毒力的总体影响在不同的金黄色葡萄球菌菌株之间可以是不同的， 这取决于其它毒 力因子的表达水平和存在。
     考虑到在发炎的滑液中纤维蛋白原和纤维蛋白含量丰富， 关于 “clfAPY 突变体在 关节腔中是否显示出同样的或较低的毒力” 的问题是有一定的重要意义的。我们的数据表 明， clfAPY 突变体对于软骨和骨的破坏性较低。
     重组 ClfA A 结构域非纤维蛋白原结合性 P336Y338 突变体的保护效应比野生型 rClfA 更高。以 ClfAPY 进行免疫非常可能诱导更好的免疫反应， 因为针对免疫原和野生型 ClfA 蛋白均引发了更高的特异性抗体反应。 更重要的是， 其比野生型 ClfA 诱导产生更大的 抵抗脓毒性死亡的保护性免疫反应。
     总之， 我们的结果表明 rClfAPY 是比野生型重组 ClfA 更好的候选疫苗。 我们假设 ： 由于 ClfA 分子中的重要表位的掩藏， 所以在免疫期间野生型 ClfA 蛋白与纤维蛋白原的结 合降低了抗原呈递， 因此破坏了特异性抗体的产生。
     实施例 2
     包含 N2 和 N3 的 rClfA A 区域截短物 (rClfA 221-559)
     材料和方法
     在本实施例中沿用实施例 1 中所示的程序， 其中使用了
     -rClfA 221-559( 即包含对应于氨基酸 220-559 的 N2 和 N3 的 ClfA A 区域截短 物)
     -rClfAPY221-559 ； 和
     -BSA。
     每组有 15 只雌性 NMRI 小鼠， 在实验开始时其为 8 周龄。在本实施例中， 用于免疫 的构建体为 ClfA 野生型 / 原态 N2N3 截短物、 具有如实施例 1 中定义的突变 PY 的 ClfA N2N3 截短物。BSA 用作对照。
     以野生型和突变体重组 ClfA 进行疫苗接种
     根据实施例 1 的程序以 rClfA 221-559、 rClfAPY 221-559 或 BSA 对小鼠进行免疫。 将纯化的 rClfA221-559、 rClfAPY221-559( 即 ClfAPYI 重组蛋白 A 亚结构域 N2 和 N3) 或 BSA 溶解于 PBS 中并与弗氏完全佐剂以 1 ∶ 1 进行乳化。在第 0 天将 200μl 含有 30μg( ＝ 0.79nmol) 蛋白的乳液通过皮下注射。在第 12 天以不完全的弗氏佐剂中的生理 盐水中的 30μg 蛋白进行第一次加强免疫。在第 22 天进行第二次加强免疫。在第 31 天将 小鼠放血， 将血清冷冻用于后续的抗体反应分析。
     特异性抗体 -ELISA
     在第二次加强免疫之后 9 天从免疫小鼠获取血清样品。通过 ELISA 测定针对 rClfA221-559 和 rClfAPY221-559 的血清特异性抗体反应。以 PBS 中的 5μg/ml 的重组蛋 白包被微板 (96- 孔 ； Nunc)。封闭试剂、 血清样品、 生物素化的抗体和 ExtrAvidin- 过氧化 物酶均在 PBS 中稀释。根据以前的描述 (8) 进行该检验。所有的血清样品以 1 ∶ 5000、 1 ∶ 20000、 1 ∶ 80000 和 1 ∶ 320000 进行稀释， 以 405nm 处的吸光度监测抗体反应。
     结果
     特异性抗体反应
     按照实施例 1， 以 4 个不同的血清稀释度在 ELISA 检验中通过吸光度测定抗体反 应。获得的数据与实施例 1 中的数据非常相似。
     发现相对于以原态 rClfA221-599 进行的免疫， 以 rClfAPY221-559 进行的免疫非 常可能产生较高效价的针对原态 rClfA221-559 和 rClfAPY221-559 的特异性抗体， 因为除 了一个以外， 在所有的对比中， 在每个血清稀释度， 以 rClfAPY221-559 进行免疫的小鼠都 具有显著较高的以吸光度测定的抗体反应 (P ＝ 0.001 至 0.025， 见图 16 和 17)。BSA 免疫 仅引发背景水平的抗体反应。
     结论
     我们发现， 以 rClfAPY221-559 蛋白进行的免疫产生的针对免疫原和野生型 ClfA 蛋白的抗体反应都显著高于以原态蛋白进行的免疫。
     基于这些发现， 我们得出结论 ： 无论是实施例 1 中的包含氨基酸 40-550 的还是实 施例 2 中包含氨基酸 221 至 559 的 PY 蛋白， 以 PY- 免疫都引发比相应大小的原态 ClfA 进 行的免疫更好的免疫反应。
     实施例 3
     ClfA A 区域截短物 (δ/Δ 锁闭截短物 )
     材料和方法
     在本实施例中沿用实施例 1 中所示的程序， 其中使用了以下构建体
     -rClfA 221-531( 即包含 N2 和 N3 氨基酸 220-559 但不含锁闭肽氨基酸 532-538 和随后的富含脯氨酸残基的 rClfA A 区域截短物 )。
     每组有 15 只雌性 NMRI 小鼠， 在实验开始时其为 8 周龄。在本实施例中， 使用上述 构建体用于免疫。根据实施例 1 中的程序以上述截短物免疫小鼠。
     以野生型和突变体重组 ClfA 进行疫苗接种
     将纯化的 rClfA221-531 溶解于 PBS 中并与弗氏完全佐剂以 1 ∶ 1 进行乳化。在 第 0 天将 200μl 含有 0.79nmol 蛋白的乳液通过皮下注射。在第 12 天以不完全弗氏佐剂 中的生理盐水中的 0.79nmol 蛋白进行第一次加强免疫。在第 22 天进行第二次加强免疫。
     在第 31 天将小鼠放血， 将血清冷冻用于后续的抗体反应分析。
     特异性抗体 -ELISA
     在第二次加强免疫之后 9 天从免疫小鼠获取血清样品。通过 ELISA 测定特异性抗 体的血清水平。以 4.6μg/ml 的 rClfA221-531 蛋白包被微板 (96- 孔 ； Nunc)， 所述蛋白量 与实施例 1 和 2 中的 5μg/ml 的 rClfA221-559 和 rClfAPY221-559 是等摩尔量的。封闭试 剂、 血清样品、 生物素化的抗体和 ExtrAvidin- 过氧化物酶均在 PBS 中稀释。根据以前的描 述 (8) 进行该检验。所有的血清样品以 1 ∶ 5000、 1 ∶ 20000、 1 ∶ 80000 和 1 ∶ 320000 进 行稀释， 以 405nm 处的吸光度监测抗体反应。
     结果
     按照实施例 1， 以 ELISA- 检验中的吸光度测定抗体反应。 发现以 rClfA221-531 进 行的免疫产生免疫反应， 如特异性抗体反应所测 ( 图 18)。
     结论
     我们发现， rClfA221-531 作为免疫原发生作用， 因为该抗原引发特异性抗体反应。
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