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1、10申请公布号CN101982065A43申请公布日20110302CN101982065ACN101982065A21申请号201010278552022申请日20100907A01H4/0020060171申请人河北科技师范学院地址066004河北省秦皇岛市海港区河北大街西段360号河北科技师范学院72发明人项殿芳闫淑芳王娜74专利代理机构秦皇岛市维信专利事务所13102代理人戴辉54发明名称一种简化无核葡萄胚挽救的方法57摘要一种简化无核葡萄胚挽救的方法，通过无核葡萄胚的离体胚挽救，包括综合培养基的制备、幼果的选取、消毒、胚珠离体培养、剥胚、胚培养，选取盛花后72D的种子败育型无核葡萄幼。
2、果，流水冲洗，在超净工作台分别用升汞、酒精消毒，无菌条件下剥出胚珠。然后接种在综合培养基上，暗培养，培养基PH5862，培养温度2530。胚珠培养4060D时对其剥胚处理，继续接种在综合培养基上，并采用光照培养20004000LX，2030D时胚开始萌发，下部逐渐发出胚根，上部逐渐长出两片子叶，最后成苗。利用本发明的方法，使发育培养基、萌发培养基、成苗培养基合为一体，简化并加速了无核葡萄胚挽救。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书4页CN101982067A1/2页21一种简化无核葡萄胚挽救的方法，其方法步骤是1综合培养基的制备，首先选取原料硝酸钾。
3、0095、硝酸铵0072、磷酸二氢钾00068、硫酸镁00185、氯化钙00166、硼酸00003、硫酸锰000223、硫酸锌0001、钼酸钠0000025、硫酸铜0000008、烟酸000005、盐酸硫胺素000005、盐酸吡哆醇000005、甘氨酸00002、柠檬酸铁0001、GA300000100003、IAA00000100003混合成含有激素的混合母液，将混合母液中加入蔗糖0、0030、006、琼脂000030、0006混合成含有激素的母液，待母液溶解完毕定容形成综合培养基，将综合培养基PH值调制5865，然后将分装好的综合培养基放入高压灭菌锅中灭菌，灭菌条件压强105MPA，温度1。
4、21，灭菌时间1520MIN备用；2选取盛花后72D的种子败育型无核葡萄幼果，流水冲洗，在超净工作台前分别用升汞、酒精消毒，无菌条件下剥出胚珠；3将无菌胚珠接种在综合培养基上，暗培养，培养基PH5862，培养温度2530；4胚珠培养4060D时对其剥胚处理，继续接种在综合培养基上，并采用光照培养20004000LX，2030D时胚开始萌发，下部逐渐发出胚根，上部逐渐长出两片子叶，最后成苗。2根据权利要求1所述的简化无核葡萄胚挽救的方法，其特征是，所述步骤1综合培养基原料的浓度配比是硝酸钾0095、硝酸铵0072、磷酸二氢钾00068、硫酸镁00185、氯化钙00166、硼酸00003、硫酸锰0。
5、00223、硫酸锌0001、钼酸钠0000025、硫酸铜0000008、烟酸000005、盐酸硫胺素000005、盐酸吡哆醇000005、甘氨酸00002、VB50000025、柠檬酸铁0001、GA300000100003、IAA00000100003、蔗糖0、0030、006、琼脂000030、0006。3根据权利要求1所述的简化无核葡萄胚挽救的方法，其特征是，综合培养基原料的浓度配比是硝酸钾0095、硝酸铵0072、磷酸二氢钾00068、硫酸镁00185、氯化钙00166、硼酸00003、硫酸锰000223、硫酸锌0001、钼酸钠0000025、硫酸铜0000008、烟酸000005、盐。
6、酸硫胺素000005、盐酸吡哆醇000005、甘氨酸00002、VB50000025、柠檬酸铁0001、GA300000100003、IBA00000100003、蔗糖0、0030、006、琼脂000030、0006。4根据权利要求1所述的简化无核葡萄胚挽救的方法，其特征是，综合培养基原料的浓度配比是硝酸钾0095、硝酸铵0072、磷酸二氢钾00068、硫酸镁00185、氯化钙00166、硼酸00003、硫酸锰000223、硫酸锌0001、钼酸钠0000025、硫酸铜0000008、烟酸000005、盐酸硫胺素000005、盐酸吡哆醇000005、甘氨酸00002、VB50000025、柠檬酸。
7、铁0001、GA300000100003、6BA00000100003、蔗糖0、0030、006、琼脂000030、0006。5根据权利要求1所述的简化无核葡萄胚挽救的方法，其特征是，综合培养基原料的浓度配比是硝酸钾0095、硝酸铵0072、磷酸二氢钾00068、硫酸镁00185、氯化钙00166、硼酸00003、硫酸锰000223、硫酸锌0001、钼酸钠0000025、硫酸铜0000008、烟酸000005、盐酸硫胺素000005、盐酸吡哆醇000005、甘氨酸00002、VB50000025、柠檬酸铁0001、GA300000100003、L半胱权利要求书CN101982065ACN101。
8、982067A2/2页3氨酸0000100003水解酪蛋白001006、蔗糖0、0030、006、琼脂000030、0006。权利要求书CN101982065ACN101982067A1/4页4一种简化无核葡萄胚挽救的方法技术领域0001本发明涉及一种简化无核葡萄胚挽救的方法，有效简化培养步骤，加速了成苗过程。背景技术0002胚挽救技术即配制一种培养基成分类似于胚囊环境中周围组织供给胚的营养成分，在合子胚败育之前进行离体培养，使即将败育的胚继续发育，最终萌发成完整植株。这项技术实现了常规杂交育种所无法得到的无核植株。自1902年HABERLANDT根据细胞理论提出植物细胞“全能性”假设以来，植。
9、物胚培养得以快速发展。1904年HANNING第一次成功地用萝卜和辣根菜的胚在人工培养基上做了系统性植物胚培养。而1929年，LAIBACH利用胚培养挽救了宿根亚麻和奥地利亚麻的杂交胚，为离体胚培养解决种属间杂交不育奠定了基础。20世纪3040年代，该项技术开始广泛应用于果树的胚挽救研究上。迄今已在柑桔、葡萄、苹果、梨及核果类的杏、梅、桃、樱桃等多种果树树种上获得成功。胚挽救技术的应用不仅克服了胚败育问题，还大大缩短了育种周期，对推动果树育种发挥了重要作用。0003有关无核葡萄胚挽救的研究已有很多报道，最早始于80年代初。如1982年，RAMMING等首次报道了利用改良WHITE培养基进行无核。
10、葡萄胚的胚珠培养，并获得了2株实生苗。以后田莉莉等、郝燕等、王飞等、潘学军等、刘小宁等对无核葡萄进行了胚挽救，并获得了幼苗，但以上所有挽救培养过程中均需依次设计三种培养基发育培养基、萌发培养基、成苗培养基，才能最终挽救成功。到目前为止，自始至终仅用一种培养基进行无核葡萄胚挽救即可成功获得幼苗的还未见报道。发明内容0004鉴于上述技术的现状，本发明提供了一种简化无核葡萄胚挽救的方法，旨在将发育培养基、萌发培养基、成苗培养基合为一体的简化培养基的方法，将会大大方便操作过程，既简化培养步骤，又加速成苗过程。这对于种质创新、远缘杂交、三倍体育种、杂交不亲和、缩短育种周期、品种改良能保证高效率的获得无核。
11、葡萄杂交后代，为种质创新、远缘杂交、三倍体育种方面提供了一种新的技术平台。0005本发明的一种简化无核葡萄胚挽救的方法，其方法步骤包括00061、综合培养基的制备，选取下述浓度配比的原料0007硝酸钾0095、硝酸铵0072、磷酸二氢钾00068、硫酸镁00185、氯化钙00166、硼酸00003、硫酸锰000223、硫酸锌0001、钼酸钠0000025、硫酸铜0000008、烟酸000005、盐酸硫胺素000005、盐酸吡哆醇000005、甘氨酸00002、柠檬酸铁0001、GA300000100003、IAA00000100003混合成含有激素的混合母液，将混合母液中加入蔗糖0、0030、。
12、006、琼脂000030、0006，待混合母液溶解完毕定容形成综合培养基，将综合培养基PH值调制5865，然后将分装好的综合培养基放入高压灭菌锅中灭菌，灭菌条件压强105MPA，温度121，灭菌时间说明书CN101982065ACN101982067A2/4页51520MIN备用；00082、外植体选择与预处理，选取盛花后72D的种子败育型无核葡萄幼果，流水冲洗，在超净工作台前分别用升汞、酒精消毒，无菌条件下剥出胚珠；00093、胚珠培养，将无菌胚珠接种在综合培养基上，暗培养，培养基PH5862，培养温度2530；00104、胚培养，胚珠培养4060D后，对其进行剥胚处理，继续接种在综合培养基。
13、上，并采用光照培养20004000LX，2030D胚开始萌发，下部长出胚根，上部逐渐长出两片子叶，最后成苗。0011根据本发明的就是方案，所指的综合培养基的原料组分及浓度配比为0012硝酸钾0095、硝酸铵0072、磷酸二氢钾00068、硫酸镁00185、氯化钙00166、硼酸00003、硫酸锰000223、硫酸锌0001、钼酸钠0000025、硫酸铜0000008、烟酸000005、盐酸硫胺素000005、盐酸吡哆醇000005、甘氨酸00002、VB50000025、柠檬酸铁0001、GA300000100003、IAA00000100003、蔗糖0、0030、006、琼脂000030、0。
14、006。0013进一步地，硝酸钾0095、硝酸铵0072、磷酸二氢钾00068、硫酸镁00185、氯化钙00166、硼酸00003、硫酸锰000223、硫酸锌0001、钼酸钠0000025、硫酸铜0000008、烟酸000005、盐酸硫胺素000005、盐酸吡哆醇000005、甘氨酸00002、VB50000025、柠檬酸铁0001、GA300000100003、IBA00000100003、蔗糖0、0030、006、琼脂000030、0006。0014进一步地，硝酸钾0095、硝酸铵0072、磷酸二氢钾00068、硫酸镁00185、氯化钙00166、硼酸00003、硫酸锰000223、硫酸锌。
15、0001、钼酸钠0000025、硫酸铜0000008、烟酸000005、盐酸硫胺素000005、盐酸吡哆醇000005、甘氨酸00002、VB50000025、柠檬酸铁0001、GA300000100003、6BA00000100003、蔗糖0、0030、006、琼脂000030、0006。0015进一步地，硝酸钾0095、硝酸铵0072、磷酸二氢钾00068、硫酸镁00185、氯化钙00166、硼酸00003、硫酸锰000223、硫酸锌0001、钼酸钠0000025、硫酸铜0000008、烟酸000005、盐酸硫胺素000005、盐酸吡哆醇000005、甘氨酸00002、VB50000025。
16、、柠檬酸铁0001、GA300000100003、L半胱氨酸0000100003水解酪蛋白001006、蔗糖0、0030、006、琼脂000030、0006O0016本发明中，所述的外植体品种是选用金田皇家无核葡萄和克瑞森无核葡萄。晚熟金田皇家无核葡萄是产自河北科技师范学院新选育的晚熟葡萄无核新品种，该品种继承了父本皇家秋天的无核特性，且在无核品种中属于大粒品种，未经药剂处理下，平均粒重63G，可溶性固形物含量达196。该品种种子退化晚，且在果实成熟时留下核的残迹，但均不影响口感。克瑞森无核葡萄是一个晚熟的鲜食葡萄品种，因为外表有着靓丽的颜色所以也被称为淑女红。它的果穗中等偏大，平均穗重500。
17、克，平均粒重4克。由于这种葡萄的可溶性固形物达到19，糖酸比可以达到201，所以特别清香甘甜，口感很好。0017本发明具有的有益效果是，通过对无核葡萄胚珠培养在简化培养基上，自始至终不经过转换培养基即可获得杂交后代，首次实现了将发育培养基、萌发培养基、成苗培养基说明书CN101982065ACN101982067A3/4页6三个步骤改变为一种综合培养基，即在同一种培养基上实现了无核葡萄的胚挽救，利用此方法简化了试验步骤、不需要多次更换培养基种类、节省了人力物力。因此，这种方法将会大大方便操作过程，既简化培养步骤，又加速成苗过程，为建立一套系统、完善、高效的无核葡萄胚挽救技术奠定坚实基础，这对于。
18、种质创新、远缘杂交、三倍体育种、杂交不亲和、缩短育种周期、品种改良等方面的研究都具有十分重要的意义。具体实施方式0018下面将结合本发明的实施例作进一步说明。0019实施例10020首先选用硝酸钾950MG/L、硝酸铵720MG/L、磷酸二氢钾68MG/L、硫酸镁185MG/L、氯化钙166MG/L、硼酸3MG/L、硫酸锰223MG/L、硫酸锌100MG/L、钼酸钠025MG/L、硫酸铜008MG/L、烟酸05MG/L、盐酸硫胺素05MG/L、盐酸吡哆醇05MG/L、甘氨酸20MG/L、VB5柠檬酸铁GA330MG/LIAA30MG/L的母液和激素，加入蔗糖30G/L1、琼脂3G/L1，培养基。
19、溶解完毕定容后将PH值调制6，然后将分装好的培养基放入高压灭菌锅中灭菌，灭菌条件压强105MPA，温度121，灭菌时间15MIN达到要求压强以后开始计时制得综合培养基，再选取盛花后72D的种子败育型无核葡萄幼果，采用流水冲洗，在超净工作台前分别用升汞、酒精消毒，无菌条件下剥出胚珠，将无菌胚珠接种在综合培养基上暗培养，培养基PH58，培养温度25，胚珠培养40D对其进行剥胚处理，继续接种在综合培养基上，并采用光照培养2000LX，20D时胚开始萌发，下部逐渐发出胚根，上部逐渐长出两片子叶见，最后成苗。0021实施例20022综合培养基的原料组分及浓度配比为硝酸钾950MG/L、硝酸铵720MG/。
20、L、磷酸二氢钾68MG/L、硫酸镁185MG/L、氯化钙166MG/L硼酸3MG/L、硫酸锰223MG/L、硫酸锌100MG/L、钼酸钠025MG/L、硫酸铜008MG/L烟酸05MG/L、盐酸硫胺素05MG/L、盐酸吡哆醇05MG/L、甘氨酸20MG/LVB5025MG/L柠檬酸铁10MG/LGA30130MG/LIAA0130MG/L、蔗糖30G/L160G/L1、琼脂3G/L160G/L1。其无核葡萄的胚挽救方法步骤同上述实施例1相同，故省略描述。0023实施例30024综合培养基的原料组分及浓度配比为硝酸钾950MG/L、硝酸铵720MG/L、磷酸二氢钾68MG/L、硫酸镁185MG/。
21、L、氯化钙166MG/L硼酸3MG/L、硫酸锰223MG/L、硫酸锌100MG/L、钼酸钠025MG/L、硫酸铜008MG/L烟酸05MG/L、盐酸硫胺素05MG/L、盐酸吡哆醇05MG/L、甘氨酸20MG/LVB5025MG/L柠檬酸铁10MG/LGA30130MG/LIBA0130MG/L、蔗糖30G/L160G/L1、琼脂3G/L160G/L1。其无核葡萄的胚挽救方法步骤同上述实施例1相同，故省略描述。0025实施例40026综合培养基的原料组分及浓度配比为硝酸钾950MG/L、硝酸铵720MG/L、磷酸二氢钾68MG/L、硫酸镁185MG/L、氯化钙166MG/L硼酸3MG/L、硫酸锰。
22、223MG/L、硫酸锌100MG/L、钼酸钠025MG/L、硫酸铜008MG/L烟酸05MG/L、盐酸硫胺素05MG/L、盐酸吡哆醇05MG/L、甘氨酸20MG/LVB5025MG/L柠檬酸铁10MG/LGA30130MG/L6BA01说明书CN101982065ACN101982067A4/4页730MG/L、蔗糖30G/L160G/L1、琼脂3G/L160G/L1。其无核葡萄的胚挽救方法步骤同上述实施例1相同，故省略描述。0027实施例50028综合培养基的原料组分及浓度配比为硝酸钾950MG/L、硝酸铵720MG/L、磷酸二氢钾68MG/L、硫酸镁185MG/L、氯化钙166MG/L硼酸3MG/L、硫酸锰223MG/L、硫酸锌100MG/L、钼酸钠025MG/L、硫酸铜008MG/L烟酸05MG/L、盐酸硫胺素05MG/L、盐酸吡哆醇05MG/L、甘氨酸20MG/LVB5025MG/L柠檬酸铁10MG/LGA30130MG/LL半胱氨酸1030MG/L水解酪蛋白100600MG/L、蔗糖30G/L160G/L1、琼脂3G/L160G/L1。其无核葡萄的胚挽救方法步骤同上述实施例1相同，故省略描述。说明书CN101982065A。