可植入装置或生物假体的生物活性涂层 本发明总体涉及可植入装置，更具体的是可植入装置的涂层、所述装置和产生该装置的方法。本发明特别适于产生基于胶原基质的经脱细胞并随后经涂层的生物假体装置。
背景技术
生物假体装置可以置换或修复受损动脉、心脏瓣膜、静脉或其他软组织，这为外科医生提供了一种治疗因疾病、先天缺陷而引起瓣膜缺损和其他严重并发症的方法。
主要方法包括：
---天然瓣膜的去除和生物假体瓣膜的手术置换；
---天然动脉或静脉的去除和生物假体动脉或静脉的手术置换；
---生物假体分流器的植入；
--用脱细胞肠基质重构具有血管化基质的生物结构诸如气管。
植入后，存在术后栓塞、钙化或感染的高风险。
关于将生物结构使用生物假体移植物进行置换，需要注意确保用内皮细胞全面覆盖表面。例如，为了在心脏瓣膜上获得内皮细胞层，需要在生物反应器中将脱细胞生物心脏瓣膜与内皮细胞共同培养。然而，这些技术太复杂、费时和易于感染，进而有效性受到限制。
US 5,192,312公开了一种同种异体移植物或异种移植物，其经过生长因子(bFGF)处理，并与细胞(成纤维细胞)一起保温，其中所述细胞相应于生长因子而迁移和增殖。虽然可以改善活力和寿命，也可以降低或放缓植入物的退变，但是只有使用不易获得的自体细胞才能避免过敏并发症或不良免疫反应，。
因此，本发明的一个目标就是提供一种无免疫原性或低免疫原性的易得的生物人工移植物。本发明的另一个目标是提供一种可植入装置或假体，其更易使用受体的内皮细胞在体内重建(repopulate)或重塑。还有一个目标就是促进异种移植物的应用，避免同种移植物低供应，特别是对于儿科患者。
【发明内容】
与现有技术中使用的用内皮细胞覆盖生物假体装置的体外技术相比，本发明的一个方面包括含有CCN1的假体涂层，其中CCN1作为生物活性分子，这样可以增加可植入装置中内皮细胞在原位的整体重建。该经CCN1处理的装置大大增加了内皮细胞的定殖，因而也增加了装置整体的生物相容性。
因此，为解决本发明的问题，通常为可植入装置提供涂层，所述可植入装置意图用于人体内需要和期望受体自己的细胞即自体细胞在体内重建或重塑的部位，该涂层的特征在于，它包含一种细胞外基质相关(matrix-associated)蛋白质(“基质蛋白”)或该蛋白的片段或具有该蛋白的构建体，所述蛋白可以调控细胞粘附或细胞迁移，优选增加生长因子刺激的细胞增殖，与作为标准的CCN1相对比，每一种都有相应的基本功能，其中所述涂层沉积在装置表面。
优选地是，该细胞外基质相关蛋白质是CCN家族成员，更优选为CCN1。
可以测试细胞外基质相关蛋白质介导细胞粘附或细胞迁移或增加生长因子刺激的细胞增殖的能力，例如以如下方式进行：仅在含有或不含所测细胞外基质相关蛋白质涂层方面不同而其他条件完全相同时，细胞在体外接种到组织或植入物材料的试样中。细胞粘附将增加至少20％，即经过一定时间的培养，表面细胞密度比对照品高至少20％。
CCN1也被命名为富半胱氨酸血管生成诱导因子、61(CYR61)、GIG1或胰岛素样生长因子结合蛋白10(IGFBP10)。CCN1是一种蛋白，分子量为42kDa，由381个氨基酸组成，其中有36个半胱氨酸。CCN1是一种结合整合素(intergin)和肝素的细胞外基质蛋白。CCN1可以促进细胞增殖、趋化性、血管生成和细胞粘附。通过上调皮肤成纤维细胞中与血管生成、炎症和基质重塑有关的大量基因的表达，CCN1显示在伤口愈合中发挥作用。该上调包括VEGA-A、VEGA-C、MMP1、MMP3、TMP1、uPA、PAI1和整合素α-3及α-5，而1型胶原α-1和α-2亚基的表达是下调的。CCN1介导基因调控依赖于肝素结合。通过整合素α-6/β-1，CCN1可以促进细胞粘附和粘附信号传导；通过整合素α-v/β-5，CCN1可以促进细胞迁移；通过整合素α-v/β-3相互作用，CCN1可以促进细胞增殖。CCN1代表这样的细胞外基质相关蛋白质，其可以调控基本的成纤维细胞生长因子信号、血管生成，并结合整合素α(v)β(3)。所述蛋白可以购买得到。
CCN1属于CCN家族，一组与细胞外基质特别相关的分泌蛋白。这些CCN蛋白呈现模块结构，并且包括最多4个不同的功能域(Leask，A.Abraham，D.J.，J.Cell Sci，2006，119：4803-10和Brigstock，D.R.，“The CCN family...”，Journal ofEndocrinology(2003)，178，169-175)。
令人惊奇地是，可以发现，在意外事故或外科手术之后的重建中，CCN1特别适于调节可植入组织基质，即所有种类的组织补片，生物人工植入装置或生物假体，以改善其移植后的持续性和寿命。更特别和优选地是，使用脱细胞基质显示对患者的免疫原性降低，优选根据本发明处理脱细胞软组织胶原基质。
依据这些发现，相对于至少促进内皮细胞粘附这一点来说，基本上具有此相同功能的每个分子都可被认为是CCN1等同物。在此使用的术语“CCN1”意指CCN1和其功能等同物，如使得与原始CCN1不同的点突变修饰，以及指CCN1片段，特别是那些含有CCN1至少一个完整功能域或结构的片段，或指具有CCN1的构建体，例如，连接有运输或载体分子或其他化学的连接分子，条件是保留重点在细胞粘附方面的CCN1基本功能。
因此同样可以得出结论，即使是不同于上述描述的其他可植入装置，其中期望或意图单独的或组合其他各种细胞群的内皮细胞群，依据本发明的涂层也可具有明显的优越性。例如在组织基质是从胶原人工构建地或使用生物聚合物来替代胶原的情况中。
此外，任一用于植入天然器官或血管系统之中或接近处的装置都可使用本发明涂层，这些装置并不限于下述实施例中出现的具体装置。
本发明同样包括涂有本发明涂层的可植入生物假体，其将用于人体中需要和期望受体自体细胞优选受体内皮细胞的体内定殖的部位，还包括按照下述步骤制备所述可植入生物假体的方法：
a).提供动物或人来源的可植入组织；
b).从组织或器官中去除天然细胞以提供组织基质(脱细胞)；
C).用上述细胞外基质相关蛋白或其片段或具备相应细胞粘附功能的具有该蛋白的构建体来处理所述组织基质，从而将该蛋白沉积于基质表面以制备有涂层的装置。
【具体实施方式】
可以使用各种技术将CCN1沉积于基底即可植入装置之上或其内而获得本发明涂层。
依据本发明的一个方面，装置，优选脱细胞生物假体，浸在或泡在含有CCN1(如上所述的CCN1含义)的溶液中。CCN1同样可以喷涂于植入物表面或采用本领域人员已知的任一其他技术来应用。溶剂可为任一适宜流体，例如细胞培养基或生理溶液等。经过一个或数个循环浸或泡，通常CCN1在移植物的表面或至少部分表面沉积后，具有涂层的装置优选没有干燥，尽管并不排除精细的干燥。CCN1沉积方法使装置含有一层紧密粘附性生物活性分子的薄膜，优选在平面融合。
因此在一个优选实施例中，所述涂层是湿润的富含蛋白质涂层。
依据本发明的可植入装置意图用于人体中期望或意图受体内皮细胞在体内的重建或重塑的部位，而且具有沉积在装置表面并含有CCN1或其片段或具备相应细胞粘附功能的含有CCN1的构建体上。
所述装置优选假体装置，这意味着在意外事故或外科手术中丧失的天然组织或器官或器官的一部分被替代。
因此假体装置可为可植入组织、移植体、分流器、血管或器官或器官的一部分。
依据本发明的优选实施例，所述组织假体源于动物或人来源，并包括基于胶原的组织基质。
此外，优选地是，组织假体是心脏、心脏瓣膜、动脉、静脉、任一血管、肺组织或肠组织的一部分，特别是EP 1 230 939 B1中公开的血管化肠组织。
为大量降低生物假体的抗原性，天然生物组织必须完全地脱细胞。因此，根据本发明优选实施例中的装置包含脱细胞组织基质。脱细胞同样也是本领域的已知方法，本领域技术人员可为所需应用选择合适的技术。
优选地，脱细胞可通过酶处理、渗透溶胞，包括低渗-和/或高渗处理、用洗涤剂和/或细胞毒性化学品、螯合剂处理、机械方法或其中两种或多种方法的结合处理。
酶处理中优选胰蛋白酶/EDTA(0.05％/0.02％)。渗透溶胞处理中最优选低渗(10mM)和高渗(1.5M KCl)溶液系列，特别是DE 10 2005 023 599 A1中公开的处理。用tris缓冲液脱细胞、或用Triton X-100(0.5％)、SDS(0.5％)、脱氧胆酸钠(0.5％)和其他的洗涤剂脱细胞-或它们在任一浓度下和各种培养温度下的任一组合，都有效而且令人满意。
根据本发明的可植入和脱细胞装置的制备方法包括如下步骤：
a).提供动物或人来源的可植入组织；
b).从组织或器官中去除天然细胞以提供组织基质(脱细胞)；
c).用CCN1或其片段或具备相应细胞粘附功能的具有CCN1的构建体处理组织基质，将CCN1沉积于基质表面以产生有涂层的装置。
如上所述，步骤c)的处理优选包括如下的技术之一：将该组织浸在或泡在CCN1溶液中；用CCN1溶液冲洗该组织；将CCN1溶液喷涂于组织表面，在此CCN1理解为上述限定的含义。
本发明具有数个优点：
在各种生物假体装置上涂层的紧密粘附的生物活性分子薄膜为用于内皮细胞定殖的装置提供了吸引人的性能。结果是，在已优选其他装置的条件下，生物假体装置也可以使用，这就为医生和患者都提供了更多的选择。例如，同种移植物已是活动性心内膜炎患者瓣膜替代物的优选装置。同种移植物供应量少、需求量大，而且主要为儿科病例所保留。因此，含有生物活性涂层的生物假体装置向成人心内膜炎病例提供了重要的新选择。
为规避儿科患者同种移植物供应量低，含有生物活性涂层的异种源的生物假体装置可以作为一个替代。而且，含有生物活性涂层的生物假体动静脉分流器在透析患者中的移植会使一种适于透析的活性人造的和抗穿刺的血管在体内快速生成。
虽然本发明连同优选实施例已被公开，但是本领域的技术人员还会发现形式和细节上可以有所变化，其并不背离本发明的精神和范畴。
例如，即使某些技术已被公开为优选，但是其他方法，包括涂层沉积的化学方法或者脱细胞的机械方法，也属于本发明的构思。
实施例1
绵羊PV(来自于绵羊的肺动脉瓣)使用洗涤剂溶液(0.5％-脱氧胆酸钠/0.5％-SDS)来脱细胞。可以通过组织染色(H&E)来评估脱细胞的完全度。脱细胞PV腔表面的涂层是在含有500ng重组CCN1(ABNOVA(台湾)公司)的10ml细胞培养基DMEM中慢旋转12h下完成的。免疫染色显示CCN1完全覆盖了被涂层的PV腔表面。
内皮细胞的有效重建，通过在体外生物反应器中接种和脉动流培养来验证。然而，这些涂有CCN1的瓣膜的优越性通过体内测试来验证。
这些脱细胞和涂有CCN1的PV正位移植到幼羊中。三个月后，瓣膜的功能通过超声心动图来评估，并有所有病例(n＝4)中瓣膜完全合格，没有任何泄露迹象。对绵羊实施安乐死后，瓣膜的组织学分析显示瓣叶的壁、心室和肺侧都被内皮单层完全覆盖了。与其不同的是，在绵羊模型中移植3个月后，脱细胞但没涂CCN1的瓣膜缺乏体内再内皮化。
实施例2
现有的完全脱细胞生物血管化肠基质的血管床充满通过椎弓根的动脉分支注射的含有500ng重组CCN1(ABNOVA(台湾)公司)的3mLEBM-2基质溶液。在37℃下、空气中加入5％CO2的完全湿润气氛中过夜培养。在培养期间，将生物血管化基质放入Petri盘(d＝10cm)中，其含有EBM-2以防止基质变干。该处理引起血管床壁的完全涂层，这一点可由CCN1的免疫组织化学染色来验证。
在移植入患者前，该方法将使少量内皮细胞在体外有效地再接种。
总之，脱细胞基质暴露于含有重组CCN1的基质中可以得到含有该分子的表面涂层，其会依次引起生物反应器中培养的(实施例1&2)内皮细胞的体外粘附和绵羊模型(实施例1)中正位移植的内皮细胞的体内粘附。