肿瘤抑素TUMSTATIN和自杀基因HSVTK非融合重组腺相关病毒载体双靶点治疗膀胱癌.pdf

肿瘤抑素Tumstatin和自杀基因HSV-TK非融合重组腺相关病毒载体双靶点治疗膀胱癌
    【技术领域】

    本发明主要涉及肿瘤的基因治疗领域，更具体的是指通过基因重组技术构建肿瘤抑素(Tumstatin)和自杀基因(TK)非融合双靶点表达重组AAV载体(rAAV-TK-IRES-Tu)，并经过病毒的包装、纯化获得高纯度高浓度病毒颗粒，该病毒颗粒用于抑制实体肿瘤及其血管的生长。

    背景技术

    膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，手术是其主要治疗手段，手术后若不给予其他治疗，其近期复发率为60～90％，远期复发率几乎为100％，而由于局部放疗和全身性化疗毒副作用严重和抗药性，目前在临床中几乎不被使用。膀胱腔内生物免疫治疗是一种有效的佐剂和给药途径，但大约30～45％的患者对此治疗无反应，且因为反复经尿道插入导尿管给药、严重的毒性反应、抗药性和较低的药物利用度，从而影响了临床治疗疗程和效果。

    实体瘤的生长和转移是血管依赖性的，膀胱癌的生长与转移也是血管生成依赖性的，新生血管容易造成瘤细胞逸入血管形成血行转移。抑制肿瘤血管生成是治疗膀胱癌的一个热点。Tumstatin是近年发现的作用较Endostatin作用更强的肿瘤特异性血管生成抑制因子，是来源于基底膜人IV型胶原α3链的一个多肽片段。Tumstatin并不改变细胞内的各种基因mRNA表达水平，而是能够在蛋白质水平对细胞内蛋白质合成产生整体上的抑制，并且特异性地作用于肿瘤血管内皮细胞，而不影响到正常内皮细胞。Tumstatin是组织基质来源的内源性蛋白，具有内源性蛋白药物的优点：反复用药很少产生耐药性；无细胞毒药物的巨大毒副作用，又可直接作用于血管内皮细胞，抗瘤谱广，对大部份血管依赖性实体瘤均有效，对生理过程的血管生成无影响，它在肿瘤生物治疗中具有极大的潜力。

    自杀基因疗法又称为药物敏感基因疗法，即将前药转换酶基因(自杀基因)直接转染肿瘤细胞，该基因编码特殊的酶，可将原先对哺乳动物细胞无毒性的前药在肿瘤细胞中代谢为有抗肿瘤作用的有效产物，该产物作为DNA合成的核苷替代物掺入DNA中，干扰细胞DNA的合成，从而引起这些肿瘤细胞的凋亡。由于人体细胞中缺乏催化前体药物的酶系统，所以前体药物只在被感染的细胞中被激活，只对自杀基因呈阳性的细胞起诱导凋亡的作用，而不损害患者的正常细胞。单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(herpes simplex virus thymidine kinase，HSV-TK)是研究最多的自杀基因，其前体药物是环氧鸟苷(GCV)。HSV-TK催化GCV磷酸化生成GCV-MP，该步骤在GCV代谢形成GCV-TP的过程中是限速步骤。GCV-TP能抑制DNA聚合酶活性，阻止DNA复制，从而杀死肿瘤细胞。

    上世纪90年代开始，基因治疗作为肿瘤的全新第五代辅助疗法已成为人类征服癌症的最具前景的方法。然而，在膀胱癌基因治疗中仍存在一些无法回避的问题：①选择高表达、低免疫原性、无插入致畸及生物安全性好的载体是基因治疗的核心技术；②肿瘤的发生、发展是一个多基因、多通道调控的过程，所以采用针对单一靶点调控肿瘤细胞分化、加速凋亡过程的基因治疗，其抗肿瘤作用有限；③融合基因治疗可能会使另一基因的抗肿瘤作用减弱甚至失活。

    因此，本发明人采用生物安全性高、低免疫原性的基因重组腺相关病毒载体(Adeno-associated virus，AAV)技术平台，构建特异高效地抗肿瘤血管生成的肿瘤抑素和自杀基因非融合重组AAV载体，并在肿瘤抑素中加入信号肽，利用AAV对膀胱癌细胞的高度亲和力，使感染后膀胱癌细胞持续表达，并分泌肿瘤抑素抑制血管生成，使肿瘤在缺血的状态下增强其对前药及自杀基因的敏感性，协同双靶点治疗膀胱癌，达到治疗与预防肿瘤复发作用。

    【发明内容】

    本发明选择了新型的腺相关病毒载体系统。腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)属于微小病毒科(Parvoviridae)，体积微小、无被膜、具有二十面体结构，病毒颗粒直径20-26nm，含有4.7-6kb的线状单链DNA基因组。腺相关病毒载体因其特殊的优越性成为目前研究的热点，这是因为：①AAV是一种缺陷型病毒，大多数人都受过其感染，但未发现引起任何疾病，是一种安全的病毒；②用AAV作载体可以感染多种类型的人体细胞，可以使治疗基因在体内获得长期、稳定的表达；③基因组易于操作，大部分基因可被替代而保留感染能力，在构建载体时去掉了AAV病毒本身的基因，避免了病毒可能引起的免疫反应；(4)AAV载体的理化性质稳定，在制备、储存和用药过程中与很多传统药物条件相似，可以体内注射方式给予患者；(5)既感染分裂细胞，也可感染非分裂细胞，野生型AAV可定点整合到19号染色体中。正是AAV的这些特点，使得它成为目前最热门的基因治疗载体，为基因治疗创造了条件。

    本发明联合应用肿瘤抑素(Tumstatin)和自杀基因(HSV-TK)双靶点基因治疗膀胱癌。目前，膀胱癌基因治疗多数研究集中在单一自杀基因或者单一细胞因子，即使是双靶点基因治疗，多数是采用融合基因治疗恶性肿瘤。但是，这在一定程度上不能同时正确充分发挥每个被融合基因的功能。而将HSV-TK和Tumstatin联合起来进行研究尚未见报道，所以本发明采用pIRES载体构建非融合载体，以充分发挥每个目的基因的生物学效应。

    本发明建立了鼠种植膀胱癌模型和新的基因治疗途径。本发明直接将肿瘤细胞接种于实验动物模型特定部位，动物模型作为细胞实验和临床实验之间的过渡环节，具有十分重要的作用，是当前研究膀胱癌发病机制、生物学行为及防治的重要途径。本发明将膀胱肿瘤细胞T24细胞接种于裸鼠皮下建立膀胱癌动物模型，用以评价重组AAV-TK-IRES-Tumstatin双靶点基因治疗对膀胱癌的抗肿瘤效果。

    综上所述，根据膀胱癌的生物学特性和临床实践中膀胱癌的复发与转移的规律，灵活应用分子生物学和基因工程的研究进展，本发明建立了高效、靶向、低毒副作用、协同作用强的双靶点基因输送及表达系统。通过应用重组AAV-TK-IRES-Tumstatin非融合性双靶点载体直接原位基因治疗的研究，为膀胱癌患者，特别是晚期伴有局部及远处转移的患者提供新的治疗方案。

    【附图说明】

    图1A～C为该发明的流程图：图1A双靶点载体构建与重组AAV病毒包装；图1B体外实验鉴定rAAV-TK-IRES-Tu生物学功能；图1C动物实验分析rAAV-TK-IRES-Tu生物学功能。

    图2A～G是该发明所用的载体结构图：图2A pMD-19T simple载体结构示意图；图2BpUC57e载体结构示意图；图2C pAAV-MCS结构图；图2D pIRES-MCS质粒结构图；图2EpCMV-MCS结构图；图2F pRC质粒图谱；图2G pHelper质粒图谱。

    图3A～L为该发明过程中验证结果的电泳图：图3A pAAV-TK克隆双酶切电泳图(1.Marker/DL2000/Takara，2～4三个克隆酶切出的片段大小都为1.1kb左右)；图3B pAAV-Tu和pIRES-MCS质粒PCR扩增结果(1.pAAV-Tu PCR大约730bp，2.Marker/DL2000/Takara，3.pIRES-MCS PCR大约650bp)；图3CpMD-19Tsimple-Tu克隆双酶切电泳图(1～3.克隆①～③，①，③克隆酶切出的片段大小在730bp左右，符合预期，为正确的克隆，②号克隆为错误克隆，4.Marker/DL2000/Takara)；图3D pMD-19Tsimple-IRES克隆双酶切电泳图(1～3.克隆①～③，②，③克隆酶切出的片段大小在600bp左右，符合预期，为正确的克隆，①号克隆为错误克隆，4.Marker/DL2000/Takara)；图3E pCMV-TK克隆双酶切电泳图(1.Marker/DL2000/Takara，2～4.克隆①～③，克隆酶切出的片段大小在1.1kb左右，符合预期，为正确的克隆)；图3FpCMV-TK-IRES克隆双酶切电泳图(1.Marker/DL2000/Takara，2～4.克隆①～③，②克隆酶切出的片段大小在600bp左右，符合预期，为正确的克隆，①，③号克隆为错误克隆)；图3GpCMV-TK-IRES-Tu克隆双酶切电泳图(1～3.克隆①～③，三个克隆酶切出的片段大小都为700bp左右，符合预期，故三个克隆均为正确的克隆4.Marker Wide Range 500-15000)；图3HpAAV-TK-IRES-Tu克隆双酶切电泳图(1～3.克隆①～③，三个克隆酶切出的片段大小都为2.3kb左右，符合预期，故三个克隆均为正确的克隆，4.Marker Wide Range 500-15000)；图3I pAAV-TK，pAAV-TK-IRES-Tu酶切电泳图(1.pAAV-TK酶切后，2.pAAV-TK-IRES-Tu酶切后，Marker DL2000)；图3J PCR产物电泳图(1.pAAV-TK-IRES-Tu PCR产物，2.pAAV-TK PCR产物，3.Marker)；图3K rAAV病毒SDS-PAGE考马斯亮蓝的染色结果(泳道1：蛋白Marker；泳道2-5：纯化后的rAAV病毒，可以看到特征性的三条带)；图3L T24细胞感染rAAV-Tu和rAAV-MCS后基因组提取，PCR扩增Tu片段基因1％电泳图(1.DNA Marker 2000，2.4rAAV-MCS感染后，3.5rAAV-Tu感染后)。

    图4：重组腺相关病毒包装过程示意图。

    图5A：正常AAV-293细胞显微镜观察(×100)；图5B：三质粒共转染AAV-293细胞显微镜观察(×100)；

    图5C：rAAV病毒颗粒电镜形态，病毒呈多面体结构，颗粒直径在20-25nm；图5D：病毒颗粒包装过程电子显微镜透射扫描图。

    图6HPLC法分析rAAV2的纯度。

    图7A～F本发明中对人脐静脉内皮细胞的相关研究观察图。图7A：倒置显微镜(×100)培养72小时的人脐静脉内皮细胞；图7B：人脐静脉内皮细胞胞HE染色显微镜图(×200)；图7C：人脐静脉内皮细胞胞硝酸银染色显微镜图(×400)；图7D：人脐静脉内皮细胞胞透射电镜图；图7E：人脐静脉内皮细胞胞硝酸八因子免疫组化显微镜图(×100，200)；图7F：各组人脐静脉内皮细胞Hoechst 33258染色后激光共聚焦显微镜观察图(×400)，从左至右为rAAV-Tu组、rAAV-MCS组、rAAV-TKITu组；。

    图8A～F本发明中对膀胱肿瘤T24细胞的相关研究观察图。图8A：rAAV-EGFP转染T24细胞72小时荧光显微镜观察；图8B：rAAV2感染细胞激光共聚焦电子显微镜观察；图8C：T24细胞(左)、HSV-TK/T24细胞(右)HE染色图；图8D：T24细胞(左)、HSV-TK/T24细胞(右)透射电镜图；图8E各组重组腺相关病毒对T24细胞作用的细胞免疫组化图(rAAV-MCS、rAAV-TK、rAAV-TKITu、对照)；图8F各组重组腺相关病毒对T24细胞作用的细胞线粒体膜电位图(rAAV-TK、rAAV-TKITu、rAAV-MCS、对照)；

    图9内皮抑素处理后HUVEC细胞生长曲线图。

    图10A～B该发明过程中验证结果的流式细胞仪凋亡检测图：图10A经内皮抑素处理的HUVEC细胞Annexin V染色流式细胞仪凋亡检测图；图10B各组重组腺相关病毒对T24细胞作用的Annexin V染色流式细胞仪凋亡检测图(rAAV-TK、rAAV-TKITu、rAAV-MCS、正常细胞)。

    图11A～E动物实验部分相关图例：图11A重组腺相关病毒注射对裸鼠移植瘤的抑制作用；图11B裸鼠移植瘤治疗后大体观(从上到下分组顺序为：rAAV-TK组、rAAV-TKITu组、rAAV-MCS组、rAAV-Tu组、空白对照组)；图11C鼠移植瘤组织的HE染色观察(对照组，治疗组，×200)；图11D移植瘤的八因子相关抗原免疫组化染色(×400)；图11E裸鼠各脏器HE染色图(心、肺、肝、肾、脾)。

    【具体实施方式】

    应用基因工程和分子生物学技术，采用pIRES载体构建携带有自杀基因和内皮抑素基因的非融合AAV载体，充分发挥每个目的基因的生物学效应。①RT-PCR法从肿瘤组织中获得Tumstatin的cDNA，PCR法从pAdTrack-TK质粒中获得TK基因，并引入终止密码，分别亚克隆到T载体上。②利用酶切、连接、转化细菌、阳性克隆筛选等分子生物学实验方法，分别构建pAAV-Tumstatin，pAAV-TK-IRES-Tumstatin和pAAV-TK质粒。所构建质粒通过酶切、测序等方法鉴定(步骤见图1A)。具体酶切连接等载体改造策略及相关操作详见实施例1。

    包装、纯化、浓缩及鉴定含有治疗基因片段的重组腺相关病毒颗粒。①采用AAV Helperfree系统(参考Strategene该病毒包装系统的用户指南)，三质粒共转染(pHelper、pRC、pAAV)对数生长期293细胞。②采用“氯仿处理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提”三个步骤分离、浓缩和纯化提取rAAV-TK、rAAV-Tumstatin、rAAV-TKITu病毒颗粒。③用聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)、电子显微镜、ELISA等方法检测病毒纯度和滴度(步骤见图1A)。相关操作可详见实施例2。

    鉴定人脐静脉内皮细胞；鉴定重组腺相关病毒对膀胱肿瘤细胞的转染影响；鉴定体外杀伤膀胱肿瘤细胞的效果①研究比较rAAV-TKITu双靶点对血管内皮细胞(HUVEC)趋化作用的抑制效果。②凋亡细胞光学检测、流式细胞术及Annexin V检测等方法研究比较rAAV-TK、rAAV-TKITu对膀胱肿瘤细胞的凋亡作用。③MTT法研究比较rAAV-TK及rAAV-TKITu不同前药浓度及不同作用时间对膀胱肿瘤细胞的杀伤作用(步骤见图1B)。实施例3详细的描述了该过程。

    构建裸鼠膀肮肿瘤模型，分析rAAV-TK-IRES-ES双靶点基因治疗效果。①建立膀胱癌动物模型：将膀胱肿瘤细胞T24细胞接种于裸鼠皮下，成瘤率约为93％。②采用夹心ELISA法检测经rAAV-Tumstatin及rAAV-TK-Tu瘤内注射后实验动物血清中Tumstatin的浓度。③用rAAV-TK、rAAV-Tumstatin及rAAV-TK-Tu分别瘤内注射研究其成瘤率、抑瘤率及肿瘤生长情况，观察肿瘤生长速度，经常规肿瘤组织HE染色检测，然后采用抗凝血因子VIII相关抗原，免疫组化方法进行微血管密度(MVD)检测，评价新生血管和成熟血管的变化(步骤见图1C)。详见实施例4。

    实施例1含自杀基因及内皮抑素基因非融合重组腺相关病毒表达载体的构建

    1、构建pAAV-TK

    提取pAdTrack-CMV-TK质粒后，通过电泳、PCR及测序证实TK序列为正确序列。PCR扩增带ClaI、EcoRI位点的TK基因片段，胶回收PCR产物并连接至pMD-19T simple载体后构建pMD-19Tsimple-TK质粒(图2A)，用ClaI、EcoRI双酶切鉴定pMD-19Tsimple-TK，1％琼脂糖凝胶电泳示：酶切出的片段大小为1.1kb左右，符合预期，并将酶切正确的pMD-19Tsimple-TK克隆送交测序，与原序列完全一致。把TK克隆至pAAV-MCS载体(图2C)，pAAV-小量提取pAAV-TK质粒后，用ClaI、XbaI双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳结果显示克隆酶切出的片段大小都为1.1kb左右，证明构建pAAV-TK成功(图3A)。

    2、构建过渡质粒pCMV-TK-IRES-Tu

    RT-PCR法从膀胱肿瘤组织中获得Tumstatin的cDNA，大约730bp，克隆至pUC57载体(图2B)，提取pUC57-Tu质粒PCR扩增后，可获得730bp的Tu基因片段，经基因测序证实为正确序列。提取pIRES-MCS质粒(图2D)PCR扩增后，可获得650bp的IRES基因片段，经基因测序证实为正确序列。PCR扩增带酶切位点的Tu、IRES基因片段，产物经过1％琼脂糖凝胶电泳后证实大约为730bp和650bp(图3B)，胶回收PCR产物并连接至pMD-19T simple载体后，电转化至感受态DH5α，涂培养液于培养基倒置培养24小时，挑选克隆摇菌并小量提取质粒后，分别双酶切鉴定pMD-19Tsimple-Tu/IRES，1％琼脂糖凝胶电泳示：克隆酶切出的片段大小符合正确克隆(图3C～D)，将酶切正确的pMD-19Tsimple-Tu/IRES克隆送交测序，与原序列完全一致。用ClaI、EcoRI两步法双酶切pMD-19Tsimple-TK及pCMV(图2E)，连接pCMV大片段和pMD-19Tsimple-TK小片段，用ClaI、EcoRI双酶切鉴定pCMV-TK，酶切出的片段大小为1.1kb左右构建pCMV-TK成功(图3E)。用XbaI、EcoRI两步法双酶切pMD-19Tsimple-IRES及pCMV-TK，连接pCMV-TK大片段和pMD-19Tsimple-IRES小片段，用XbaI、EcoRI双酶切鉴定pCMV-TK-IRES，酶切出的片段大小为600bp左右，构建pCMV-TK-IRES成功(图3F)。XbaI、BamI两步法双酶切及pCMV-TK-IRES，胶回收pCMV-TK-IRES大片段和pMD-19Tsimple-Tu小片段，选取克隆后，小量提取质粒，用XbaI、BamII双酶切鉴定pCMV-TK-IRES-Tu，酶切出的片段大小为2.2kb左右，为正确克隆，过渡质粒pCMV-TK-IRES-Tu构建成功(图3G)。

    3、质粒pAAV-TK-IRES-Tu的构建

    分别用两步法双酶切pCMV-TK-IRES-Tu及pAAV-MCS，胶回收pAAV-MCS大片段和pCMV-TK-IRES-Tu小片段，选取克隆后，小量提取质粒，用ClaI、XbaI双酶切鉴定pAAV-TK-IRES-Tu，酶切出的片段大小为2.3kb左右，为正确克隆，构建pAAV-TK-IRES-Tu成功(图3H)。

    4、质粒pAAV-TK、pAAV-TK-IRES-Tu中的ITR序列的鉴定

    ITR序列在病毒的包装、复制中起着至关重要的作用，因此本发明用PstI、NotI双酶切和PCR两种方法来鉴定质粒pAAV-TK、pAAV-TK-IRES-Tu中的ITR序列。具体操作如下：用PstI、NotI分别双酶切pAAV-TK、pAAV-TK-IRES-Tu，2％琼脂糖凝胶电泳示：pAAV-TK，pAAV-TK-IRES-Tu中均有137bp左右的条带切出(图3I)，PCR产物1％凝胶电泳示大小在均3kb左右(图3J)，符合预期，说明pAAV-TK-IRES-Tu，pAAV-TK上两重组质粒中均有ITR序列。

    实施例2重组腺相关病毒的包装、纯化、浓缩及鉴定

    1、利用AAV-Helper free system包装系统，pRC、pHelper三质粒电穿孔和磷酸钙共沉淀转染AAV-293细胞包装腺相关病毒，并用“氯仿-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提”来进行AAV病毒的粗纯化、冰乙醇沉淀法浓缩腺相关病毒。

    本发明所利用的Helper-Free包装系统最显著的特点是用一个辅助质粒代替了野生型腺病毒。该质粒包含了腺病毒的E2A，E4和VA RNA基因，而另外一个AAV包装所必需的基因E1A和E1B存在293细胞中。这样的设计是建立在发现AAV病毒的复制和包装并不需要腺病毒的所有基因参与，仅仅是E1，E2A，E4和VA RNA基因表达就可以完成。Helper-Free包装系统最大的好处是避免了野生型腺病毒的产生，给后期纯化工作带来极大的便利，从而使AAV制品的安全性提高。因此这一系统得到了普遍应用。其具体原理见图4。

    用去内毒素超纯质粒大量提取试剂盒大量提取pRC、pHelper(pRC和pHelper质粒图谱见图2F～G)、pAAV-TK、pAAV-TK-IRES-Tu及pAAV-Tu质粒，并用1％凝胶电泳进行鉴定，正确后保存菌种。通过去内毒素超纯质粒大量提取试剂盒大量提取无内毒素质粒，通过1％凝胶电泳后，与提供质粒大小一致。

    AAV-293细胞状态与特征简述：贴壁生长，细胞单个生长时可呈梭形、三角形(图5A)，当细胞相互接触生长后变成鹅卵石样，4～5天一代。细胞传代时不需要胰酶消化，直接吹打即可。电转化或者磷酸钙转化72小时后原先贴壁生长的AAV-293细胞由于病毒的大量扩增，293细胞死亡，变圆漂起。当90％的细胞变圆漂起时，提示病毒扩增完毕，可以进入分离纯化阶段(图5B)。

    2、本发明通过Philips Tcnai-20电子显微镜扫描和透射观察重组腺相关病毒的形态及其从细胞核到细胞表面的分泌过程；采用AVSachTM ELISA法测定病毒的rAAV2颗粒滴度；采用SDS-PAGE和HPLC鉴定病毒及其纯度。

    病毒样品经过负染色后，电子显微镜扫描时可见较高浓度的病毒颗粒，有一定程度聚集，大小约为20nm(图5C)。经过电转化或者磷酸钙转化72小时后的AAV-293细胞，切片后投射电子显微镜观察，可见病毒从细胞核到细胞表面的分泌过程(图5D)。SDS-聚丙烯酸酰凝胶(SDS-PAGE)法检测病毒，AAV2的外壳由3种蛋白质组成，即VP1、VP2、VP3，分子量依次为87、73、61kD，在SDS-PAGE电泳后考马斯亮蓝染色可见3条特征性条带(图3K)；AVSachTM ELISA法测定rAAV病毒颗粒滴度达2×10¹⁰v.p/ml，浓缩后可达到2×10^11-12v.p/ml。浓缩后的样品的HPLC分析见图6：可见单一的AAV病毒峰，纯度大于98％。说明浓缩前后病毒纯度无明显变化(病毒样本保藏于天津市泌尿外科研究所)。

    实施例3rAAV-TK-IRES-Tu双靶点膀胱癌基因治疗的体外实验研究

    1、鉴定人脐静脉内皮细胞

    本发明是利用HE染色、硝酸银染色、免疫组化及电子显微镜对人脐静脉内皮细胞进行鉴定。

    人脐静脉内皮细胞早期呈小多角、球形、呈团状，少数细胞伸展，48～72h生长最快，逐渐生长成梭形，有些细胞排列呈鱼贯状相连，间有旋祸状排列。核清晰，呈圆形或椭圆形，核分裂相多见，1～2核仁，胞浆丰富，内含小颗粒。于3～4天后融合，7～10d胞体呈多角形，相互嵌合，为单层呈铺路石状排列(图7A～B)。

    硝酸银染色后光镜观察到银颗粒沉淀在内皮细胞边缘，使内皮细胞出现典型的多边形(图7C)。经固定、脱水、包埋、超薄切片、重金属染色后，透射电镜观察到内皮细胞具有Webel-Plade小体(W-P小体)的特征性细胞器，其外包单位膜的秆状细胞器，长约3um，内有6～26条直径为15nm的平行细管(图7D)。HUVEC八因子相关抗原免疫组化可见细胞胞质中有棕黄色颗粒，说明为HUVEC细胞(图7E)。

    2、膀胱肿瘤细胞的转染及鉴定

    本发明采用携带绿色荧光蛋白报告基因的rAAV-EGFP转染膀胱肿瘤T24细胞，来确定重组腺相关病毒对该细胞的转染情况及转染效率；通过提取经rAAV-Tu、rAAV-MCS、rAAV-TK及rAAV-TK-IRES-Tu转染后的细胞基因组，PCR分别扩增Tu、TK及TK-IRES-Tu(TKITu)基因片段来鉴定重组腺相关病毒的活性；同时比较转染rAAV-TK前后T24细胞的形态、细胞周期等的变化来明确rAAV-TK对该细胞的影响。

    rAAV-EGFP转染T24细胞72小时后，在荧光显微镜下可以看到大量细胞表达报告蛋白(图8A)，绿色荧光分布在整个细胞中，以胞核最为集中，说明在T24细胞中可以表达携带的外源基因EGFP。流式细胞仪检测结果显示：以不同剂量(0.1×10⁴、1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、2×10⁶)v.p./cell感染细胞后可见荧光细胞数比例分别为2％、5％、35％、62％和57％，故在本研究中使用的最适MOI值为1×10⁶v.p./cell。

    本发明采用FV10-ASW激光共聚焦电子显微镜观察rAAV2感染细胞的动态过程：用低温处理法使细胞同步化，FV10-ASW激光共聚焦电子显微镜观察rAAV2感染细胞时，可见病毒颗粒首先与细胞膜受体结合，然后逐步进入细胞核，具体见图8B。

    提取病毒感染后的细胞基因组，PCR扩增目的片段鉴定rAAV的生物活性：病毒颗粒感染T24细胞72小时后，提取细胞基因组，PCR扩增目的片段，1％凝胶电泳可见大约1.1kb、2.8kb和730bp(图3L)的基因片段，测序后与预期序列一致，说明重组腺相关病毒具有生物活性，可以转染T24细胞。

    转HSV-TK基因T24细胞传代培养后，提取细胞基因组，PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳及测序结果均正确，说明转HSV-TK基因T24细胞可以稳定携带TK基因。倒置显微镜观察，T24细胞为单层贴壁生长的核仁比较大的多角形细胞，转染HSV-TK基因的T24细胞形态与其亲本细胞形态相似，为多角形上皮细胞；细胞HE染色经导致显微镜观察，转染HSV-TK基因的T24细胞与其亲本细胞形态相似，伸展良好，细胞核大而亮，为多角形的上皮细胞(图8C)。透射电镜观察，转染前、后，细胞超微结构无明显差异，细胞表面微绒毛较为均较丰富，细胞核大，异型性明显，染色质分布均匀，可见1～2个细胞核(图8D)。

    经流式细胞仪检测T24细胞、HSV-TK/T24细胞周期分布，结果见表1，证明：基因转染对T24细胞无明显影响。

    表1T24细胞、HSV-TK/T24细胞周期分布

    

    3、重组腺相关病毒rAAV-Tu、rAAV-TK-IRES-Tu(TKITu)体外转染膀胱肿瘤细胞

    本发明通过rAAV-Tu、rAAV-TKITu重组腺相关病毒体外转染T24膀胱肿瘤细胞，鉴定培养上清液中内皮抑素的浓度；同时，研究内皮抑素对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞生长的影响及诱导凋亡的检测。

    分别用含有人内皮抑素的重组腺相关病毒(rAAV-Tu、rAAV-TKITu)和空病毒(rAAV-MCS)转染T24膀胱肿瘤细胞培养72小时，收集培养液上清，Tumastatin浓度各组分别为：rAAV-Tu组(60.08ng/ml)、rAAV-TKITu组(58.14ng/ml)、rAAV-MCS组(0ng/ml)，说明rAAV-Tu、rAAV-TKITu病毒转染肿瘤细胞后可以同等分泌内皮抑素。

    内皮抑素基因转染细胞的培养液浓缩后处理HUVEC细胞24h、48h、72h，用MTT法检测570nm波长的光密度值(OD570nm)，结果显示空病毒(rAAV-MCS)转染对内皮细胞无明显影响；与对照组相比，rAAV-Tu、rAAV-TKITu转染细胞的培养液在24h时就对内皮细胞增殖具有抑制作用，48h，72h时更加显著(p＜0.05)(图9)。另外，本发明还利用细胞凋亡荧光Hoechst 33258检测试剂盒初步判断HUVEC细胞的凋亡：HUVEC各组细胞Hoechst 33258染色后，TKITu组细胞和Tu组细胞染色呈现强蓝色荧光，rAAV-MCS组和RPIM 1640组细胞染色呈现微弱荧光(图7F)。初步说明rAAV-Tu、rAAV-TKITu均可以诱导HUVEC细胞凋亡。

    重组腺相关病毒(rAAV-Tu、rAAV-TKITu)转染细胞的培养液上清处理HUVEC细胞72h后，流式细胞仪检测结果显示，rAAV-Tu、rAAV-TKITu两组凋亡率分别是37.02％和32.14％，明显高于空病毒转染组(7.90％)和空白对照组(0.30％)(图10A)。说明基因转染rAAV-Tu、rAAV-TKITu细胞产生的内皮抑素均具有诱导内皮细胞凋亡的生物活性。

    4、重组腺相关病毒rAAV-TK、rAAV-TKITu对膀胱肿瘤细胞作用的体外研究

    本发明通过细胞免疫组化、凯基线粒体(JC-1)细胞凋亡检测试剂盒、流式细胞仪来检测该系统对T24细胞凋亡的诱导作用。

    rAAV-MCS、rAAV-TK、rAAV-TKITu转染T24细胞后，光镜下观察rAAV-TK、rAAV-TKITu两组细胞胞质中有棕黄色颗粒，呈阳性结果(图8E)，表明重组rAAV-TK、rAAV-TKITu均可引起肿瘤细胞的凋亡。

    本发明采用细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒检测.rAAV-TK、rAAV-TKITu对T24细胞的早期凋亡作用：重组腺相关病毒(rAAV-TK、rAAV-TKITu)转染T24细胞24h后，这两组细胞在荧光显微镜下观察可见有大量的绿色荧光存在，而在阳性和阴性对照组中则以红色荧光居多(图8F)。

    重组腺相关病毒(rAAV-TK、rAAV-TKITu)转染T24细胞72h后，流式细胞仪检测结果显示，rAAV-TK、rAAV-TKITu两组凋亡率分别是34.12％和36.91％，明显高于空病毒转染组和空白对照组(图10B)。说明基因转染rAAV-TK、rAAV-TKITu均可以诱导膀胱肿瘤细胞凋亡。

    rAAV-TK、rAAV-TKITu两组细胞24、48、72小时后，流式细胞仪检测细胞周期及DNA含量的变化，与0时检点对照结果见表2，.结果表明：rAAV-TK、rAAV-rAAV-TKITu两组细胞24～48小时期间，G1期细胞逐渐增加，而S期细胞逐渐减少，表明细胞周期受阻于G1期；但是从48～72小时期间，S期细胞明显增加，同时G1期却减少，表明细胞被阻滞于S期，并且有明显的亚G1期峰出现，表示凋亡细胞能够站到10％左右的百分比。

    表2.rAAV-TK、rAAV-TKITu对T24细胞周期分布百分比动态变化

    

    -/-：.rAAV-TK/rAAV-TKITu

    从本实施例结果总体看来：基因转染rAAV-Tu、rAAV-TKITu均可以同等地诱导HUVEC细胞凋亡；基因转染rAAV-TK、rAAV-TKITU均可以同等地诱导膀胱肿瘤细胞凋亡，为下一步的动物实验奠定了一定的理论与实验支持。

    实施例4构建裸鼠膀肮肿瘤模型，分析rAAV-TK-IRES-Tu双靶点基因治疗效果

    本发明人已经成功构建了含有内皮抑素和自杀基因的双靶点的重组腺相关病毒颗粒(rAAV-TK-IRES-Tu)，并完成了其体外转染实验，在本实施例中将继续研究其对裸鼠体内的转染效率及抑瘤作用。

    1、裸鼠体内移植瘤模型的建立

    取对数生长期的T24细胞，0.25％胰酶消化，PBS洗2遍，用生理盐水重悬，计数，调整细胞浓度为2×10⁷/ml，在每只裸鼠皮下分别接种0.2ml。大约3周后，成瘤率约为93％，此时开始随机分组，此时开始随机分组，组间无差异后开始给予治疗。

    2、重组腺相关病毒(rAAV-TK-IRES-Tu)对裸鼠移植瘤的抑制作用

    瘤内注射rAAV-TU、rAAV-TK、rAAV-TKITu大约9天后，肿瘤生长受到显著抑制，治疗结束后：各组肿瘤的体积分别是：rAAV-Tu组(0.75±0.08)cm³、rAAV-TK组(0.71±0.11)cm³、rAAV-TKITu组(0.52±0.09)cm³、rAAV-MCS组(1.27±0.13)cm³和空白对照组(1.24±0.17)cm³；rAAV-Tu、rAAV-TK、rAAV-TKITu3组分别与阳性对照与阴性对照比较，差异均有显著性(p均＜0.05)；rAAV-TKITu组与rAAV-Tu组、rAAV-TK组比较，差异均有显著性(p均＜0.05)；rAAV-Tu组与rAAV-TK组比较，差异没有显著性(p＞0.05)(具体见图11A)；处死裸鼠后，剥取移植瘤，大体观见图11B。

    3、裸鼠移植瘤组织的病理学改变

    HE染色显示rAAV-TU、rAAV-TK、rAAV-TKITu 3组处理后的裸鼠移植瘤组织中出现大片坏死，癌巢多呈岛状分布，rAAV-TKITu组尤为明显，肿瘤细胞细胞核大，异型性明显；对照组组织中坏死较少，癌细胞分布均匀(图11C)。

    4、裸鼠移植瘤的微血管密度

    用免疫组织化方法标记微血管内皮细胞(图11D)，计数微血管密度，结果显示各组裸鼠移植瘤MVD分别：rAAV-Tu组(18.72±2.53)个/HP、rAAV-TK组(21.74±4.62)个/HP、rAAV-TKITu组(12.73±1.78)个/HP、rAAV-MCS组(52.38±6.46)个/HP和空白对照组(49.94±7.17)个/HP；治疗组显著低于空白对照组和空病毒组(p＜0.05)；rAAV-TKITu组较rAAV-Tu组和rAAV-TK组显著降低，组间差异有显著统计学意义(p＜0.05)。

    5、荷瘤裸鼠血液中内皮抑素表达

    ELISA结果显示荷瘤裸鼠血清中的内皮抑素分别如下：rAAV-Tu组(38.52±6.53)μg/L、rAAV-TKITu组(40.33±7.48)μg/L；而rAAV-TK组、rAAV-MCS和空白对照组裸鼠血清中未检测到内皮抑素的表达。说明在体内腺相关病毒可介导内皮抑素基因高效转染肝癌细胞，并表达内皮抑素蛋白。

    6、重组腺相关病毒对裸鼠各重要脏器的影响

    分别取心、肝、皮、肺、肾组织经福尔马林固定、石蜡包埋、HE染色显微镜下观察。各重要脏器未见异常，说明重组腺相关病毒对实验动物没有全身毒副作用，是一种比较安全的基因治疗的病毒载体(图11E)。

    综上，本发明人成功构建了重组rAAV-TK-IRES-Tu腺相关病毒，体外和体内实验表明rAAV-TK-IRES-Tu可有效抑制膀胱癌的血管生成和肿瘤的生长，双靶点基因治疗膀胱肿瘤，为膀胱癌原位基因治疗提供一种有效的辅助方法。

    【序列表】

    天津医科大学第二附属医院天津市泌尿外科研究所

    肿瘤抑素Tumstatin和自杀基因HSV-TK非融合重组腺相关病毒载体双靶点治疗膀胱癌单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(herpes simplex virus thymidine kinase，HSV-TK)

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    肿瘤抑素Tumstatin

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