一种含附属器的组织工程皮肤的制备方法 【技术领域】
本发明属于医用生物材料的组织工程技术领域，具体涉及采用羊膜来源细胞构建具有附属器组织工程皮肤的方法。
背景技术
皮肤是人体最大的器官，具有保护机体、调节体温、排泄废物的功能，是覆盖与保护体表和内脏器官的重要组织。炎症、溃疡、外伤、烧伤、肿瘤术后以及先天畸形等原因常造成皮肤和粘膜的缺损及异常。正常的皮肤含有分化良好的表皮层和真皮层，理想的愈合创面应具有完整的表皮层、真皮层以及毛囊、汗腺等附属器结构；表皮层能够起到屏障和保护作用，防止有害物质通过体表进入机体；真皮层为皮肤提供机械保护和外观特征，在创面愈合、生长、抵抗细菌及防御外伤方面发挥着重要作用；毛囊、汗腺等附属器结构主要参与皮肤新陈代谢及温度调节。
大量的实验和临床证明，组织工程方法制备的皮肤替代物能够用于创面修复重建，国内外已有成熟的组织工程全层皮肤产品上市销售。但目前的皮肤产品不具有毛囊和汗腺等附属器，毛囊可帮助皮肤排热及参与皮肤新陈代谢，汗腺具有分泌汗液、调节体温的作用。各种原因造成的皮肤损伤，在伤及真皮深层，使汗腺不能再生，导致汗液排泄障碍，严重影响患者生活质量。
另外，现有商品化的组织工程皮肤是使用成体细胞进行创面治疗，这不但影响治疗效果，还存在因受体免疫排斥导致治疗失败的风险；而且，来自成体组织的成纤维细胞、间充质干细胞、表皮细胞的增殖速度和代谢缓慢，细胞分泌蛋白的能力弱。由于表皮层与真皮层能否建立紧密的连接，取决于表皮细胞能否合成充足的半桥粒，以及表皮细胞与间充质干细胞能否合成分泌大量的细胞外基质；这是因为表皮层与表皮层下基膜的紧密连接需要表皮细胞能够合成大量的半桥粒参与，而基膜则是由真皮层中成纤维细胞或间充质干细胞与表皮层的表皮细胞共同分泌的细胞外基质形成。现有组织工程皮肤的表皮层脱落正是由于表皮层与真皮层缺乏有效连接所造成。
因表皮细胞在体外培养过程中，有失去角质化特征的趋势，致使所制备的组织工程皮肤的表皮层脆性增大，不能正常发挥表皮层的功能，这也是多年困扰组织工程皮肤领域的技术难题。
由于间充质干细胞具有较强的增殖及多向分化能力，现已广泛应用于组织工程皮肤的构建。间充质干细胞作为种子细胞，接种于组织工程皮肤用于人体治疗，所以间充质干细胞的生命活力直接决定着组织工程皮肤的治疗效果。本申请人研究证实，间充质干细胞的生命活力与来源组织的年龄有着密切关系，来源于胚胎组织的间充质干细胞比来自于成年组织的同类细胞有更强的生命活力，同时，胚胎组织来源的间充质干细胞的免疫原性远远低于成年组织的；最近的研究发现，间充质干细胞能够调节受体的免疫排斥，降低应用于受体后免疫排斥的风险。所以，胚胎来源的间充质干细胞比成体组织来源的间充质干细胞具有更加广阔的应用前景。
由于这些显著的优势，来源于人体胚胎时期，且无伦理争议的羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞被人们寄予了厚望，成为当前研究的热点。通过研究发现，羊膜间充质干细胞的细胞状态介于成体干细胞与胚胎干细胞之间，属于“年轻的”成体干细胞，一般传至30代仍能保持旺盛的代谢功能，羊膜来源的这两种细胞都被证明具有多向诱导分化能力。并且羊膜间充质干细胞移植入体内后能够调节受体的免疫排斥，提高皮肤移植的成功率。同时，研究还证实羊膜上皮细胞具有促进表皮类细胞角质化分化状态地作用。这些特点使得羊膜来源细胞作为组织工程的种子细胞应用成为可能。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种含附属器的组织工程皮肤的制备方法，所制备的组织工程皮肤含有毛囊、汗腺的附属器结构，在用于修复皮肤或软组织损伤形成的创面，能够减少瘢痕形成、在创面生成毛囊及汗腺结构、恢复创面的外观及散热功能、调节受体免疫排斥，且使表皮层与真皮层连接紧密，表皮层不易脱落，完成受损皮肤的全层修复。
本发明含附属器的组织工程皮肤的制备方法，包括有细胞的获得、扩大培养、定向诱导分化，以及组织工程双层皮肤的制备，其特征在于：是在凝胶溶液中接种羊膜间充质干细胞、向毛乳头方向诱导的羊膜间充质干细胞、羊膜上皮细胞、向汗腺上皮方向诱导的羊膜上皮细胞，经真皮层培养后，再经形成毛囊、汗腺结构的诱导培养，于其表面再接种羊膜上皮细胞和经向角质形成细胞诱导的羊膜上皮细胞，经组织工程双层皮肤的培养得到含有毛囊、汗腺结构的组织工程皮肤；其中的毛囊结构由向毛乳头方向诱导后的羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞共同构建，汗腺结构由向汗腺上皮方向诱导后的羊膜上皮细胞构建；以羊膜上皮细胞和向角质形成细胞方向诱导后的羊膜上皮细胞构建表皮层，以具有诱导形成毛囊、汗腺结构作用的凝胶溶液与羊膜间充质干细胞构建真皮层；所述的凝胶溶液含有细胞外基质和有诱导形成毛囊、汗腺结构作用的蛋白。
本发明含附属器的组织工程皮肤制备方法的具体步骤包括：
步骤一.材料、培养液及细胞的准备
制备细胞外基质：取新鲜动物胚胎皮肤剪碎绞成肉泥，加入4倍体积的3％(V/V)乙酸溶液在4℃条件下搅拌12小时，该乙酸溶液含有1g/L浓度的胃蛋白酶；离心取上清，加入NaCl至终浓度为0.9M盐析沉淀，离心取沉淀，将沉淀物溶解于0.1M的Tris-HCl溶液(pH7.2)，向其中加入NaCl至终浓度为1.7M盐析沉淀，离心取上清，再加入NaCl至终浓度为2.6M盐析沉淀，离心弃上清，沉淀物用V/V为1％的乙酸溶液溶解后，用超纯水透析纯化；经真空冻干后消毒，获得细胞外基质；
制备具有诱导形成毛囊、汗腺结构作用的凝胶溶液：无菌条件下，将制备的细胞外基质溶于V/V为0.1％的乙酸溶液中，浓度为5～12mg/ml(4℃储存可防止细胞外基质降解)；将该溶液在冰浴下紫外线照射，操作过程确保处于冷却状态；按该溶液的体积比分别加入10％的胎牛血清和10％的DMEM培养基，再加入wnt3a蛋白300～500ng/ml和硫酸肝素糖蛋白100～300ng/ml，调pH至7.2，得到凝胶溶液；
配制培养液A(羊膜上皮细胞向角质形成细胞方向诱导培养基)，其组分按500ml体积计包括：商用培养基DMEM 360ml、商用培养基F12 90ml、胎牛血清50ml、腺嘌呤180～260mM、胰岛素2～10μg/ml、转铁蛋白5～10μg/ml、表皮生长因子(EGF)5～15ng/ml、氢化可的松0.2～0.5μg/ml；
配制培养液B(间充质干细胞向毛乳头方向诱导培养基)，其组分按500ml体积计包括：商用培养基DMEM 300ml、商用培养基F12 125ml、胎牛血清75ml、wnt3a蛋白50～150ng/ml、成纤维生长因子2(FGF-2)3～8ng/ml；
配制培养液C(羊膜上皮细胞向汗腺上皮样细胞诱导培养基)，其组分按500ml体积计包括：商用培养基DMEM 450ml、胎牛血清50ml、神经生长因子(NGF)10～15ng/ml、表皮生长因子5～15ng/ml、转化生长因子(TGF-β)10～20ng/ml、硫酸肝素糖蛋白50～100ng/ml；
配制培养液D(组织工程真皮培养基)，其组分按500ml体积计包括：商用培养基DMEM 300ml、商用培养基F12 150ml、胎牛血清50ml、胰岛素样生长因子6～18ng/ml、表皮生长因子5～15ng/ml、成纤维细胞生长因子5～15ng/ml；
配制培养液E(组织工程双层皮肤培养基)，其组分按500ml体积计包括：商用培养基DMEM 450ml、胎牛血清50ml、胰岛素样生长因子6～18ng/ml、表皮生长因子5～15ng/ml；
配制培养液F(毛囊样结构诱导培养基)，其组分按500ml体积计包括：商用培养基DMEM 450ml、胎牛血清50ml、成纤维生长因子2(FGF-2)5～15ng/ml、表皮生长因子5～15ng/ml、wnt3a蛋白100～200ng/ml、骨形态发生蛋白(BMP)50～200ng/ml；
配制培养液G(汗腺样结构诱导培养基)，其组分按500ml体积计包括：商用培养基DMEM 450ml、胎牛血清50ml、神经生长因子(NGF)20～80ng/ml、表皮生长因子5～15ng/ml、转化生长因子(TGF-β)5～15ng/ml、硫酸肝素糖蛋白50～250ng/ml；
羊膜间充质干细胞的分离培养方法可参考：Isolation of amnioticstem cell lines with potential for therapy.Nature biotechnology.2007 JAN；25(1)或是其他已有技术，将获得的干细胞采用培养液B扩大培养，完成羊膜间充质干细胞向毛乳头方向的诱导，备用；羊膜上皮细胞的分离培养方法可参考：Stem Cell Characteristics of Amniotic Epithelial Cells.Stem cell.2005；23：1549～1559或是其他已有技术，将获得的羊膜上皮细胞采用培养液A扩大培养，诱导分化为角质形成细胞，备用；将获得的羊膜上皮细胞采用培养液C扩大培养，诱导生成汗腺上皮样细胞，备用；
步骤二.组织工程皮肤真皮层的培养：在所制备的凝胶溶液中按105～107个/ml的细胞浓度加入羊膜间充质干细胞；再加入向毛乳头方向诱导后的羊膜间充质干细胞与羊膜上皮细胞混合形成的细胞团，加入的细胞团数量为10～30个/ml，细胞团的细胞数为103～104个/团，二种细胞的比例为1∶1；再按105～107个/ml细胞浓度加入向汗腺上皮方向诱导后的羊膜上皮细胞，置于5％CO2环境中37℃条件下培养1小时，待凝胶固化后，按培养液D∶培养液F为1∶1比例混合培养液，用该培养液培养4天，每天换液，完成组织工程皮肤真皮层的制备(其可单独使用)；
步骤三.组织工程毛囊和汗腺的诱导培养：将制备的组织工程真皮用培养液F与培养液G按2∶1比例混合的培养液培养3天，每天换液；再使用培养液G培养2天，每天换液，使其中的毛囊和汗腺结构诱导成熟；
步骤四.组织工程双层皮肤的培养：在诱导培养后的真皮层表面按104～2×104个/cm2的密度接种羊膜上皮细胞，按3×104～6×104个/cm2的密度接种向角质形成细胞方向诱导后的羊膜上皮细胞，再用培养液E与培养液G按1∶2比例混合的培养液培养2天，每天换液，完成制备。
本发明制备方法中所制备的真皮层可作为组织工程真皮单独使用，也可继续按本发明复合表皮层后作为双层皮肤使用。本发明制备的含有毛囊、汗腺结构的组织工程皮肤，不仅具备现有组织工程皮肤的优点(如具有弹性、韧性)，还因为采用胚胎期羊膜细胞，细胞新陈代谢旺盛、增殖能力强，细胞外基质分泌充分，表皮层与下部基膜及真皮层细胞的连接紧密，不易脱落，极大地提高了组织工程皮肤移植的成功率，更快的促进创面愈合；且羊膜上皮细胞分化形成的角质形成细胞具有维持表皮层角质化的特点，有利于保持表皮层的结构功能，提高组织工程皮肤的修复和替代效果；所含的毛囊和汗腺结构能够调节创面新陈代谢、温度，加快创面的功能恢复。
本发明采用羊膜细胞参与构建组织工程皮肤，能保证所制备的组织工程皮肤免疫排斥反应低，且羊膜间充质干细胞具有调节移植受体免疫排斥的作用，有利于组织工程皮肤与创面的整合，到达更好的医疗、美容修复目的；所采用的羊膜组织为分娩后废弃组织，原料来源广泛，且羊膜来源的细胞增殖能力强，传代次数多，有利于种子细胞的大规模生产，降低了产业化成本。
【具体实施方式】
以下结合具体实例对本发明技术方案作进一步的详细说明。实例中所采用细胞的获得和扩大培养以及细胞外基质的制备，是按上述方案操作得到，这里不再赘述；其中wnt3a蛋白、硫酸肝素糖蛋白和骨形态发生蛋白为Sigma公司生产。
实例1、
步骤1.培养液配制及细胞定向诱导
配制培养液A(羊膜上皮细胞向角质形成细胞方向诱导培养基)，其组分按500ml体积计包括：商用培养基DMEM360ml、商用培养基F12 90ml、胎牛血清50ml、腺嘌呤200mM、胰岛素2μg/ml、转铁蛋白6μg/ml、表皮生长因子15ng/ml、氢化可的松0.2μg/ml；
配制培养液B(间充质干细胞向毛乳头方向诱导培养基)，其组分按500ml体积计包括：商用培养基DMEM 300ml、商用培养基F12 125ml、胎牛血清75ml、wnt3a蛋白150ng/ml、成纤维生长因子2(FGF-2)4ng/ml；
配制培养液C(羊膜上皮细胞向汗腺上皮样细胞诱导培养基)，其组分按500ml体积计包括：商用培养基DMEM 450ml、胎牛血清50ml、神经生长因子(NGF)12ng/ml、表皮生长因子15ng/ml、转化生长因子(TGF-β)10ng/ml、硫酸肝素糖蛋白100ng/ml；
配制培养液D(组织工程真皮培养基)，其组分按500ml体积计包括：商用培养基DMEM 300ml、商用培养基F12 150ml、胎牛血清50ml、胰岛素样生长因子7ng/ml、表皮生长因子5ng/ml、成纤维细胞生长因子6ng/ml；
配制培养液E(组织工程双层皮肤培养基)，其组分按500ml体积计包括：商用培养基DMEM 450ml、胎牛血清50ml、胰岛素样生长因子10ng/ml、表皮生长因子15ng/ml；
配制培养液F(毛囊样结构诱导培养基)，其组分按500ml体积计包括：商用培养基DMEM 450ml、胎牛血清50ml、成纤维生长因子2(FGF-2)15ng/ml、表皮生长因子5ng/ml、wnt3a蛋白150ng/ml、骨形态发生蛋白100ng/ml；
配制培养液G(汗腺样结构诱导培养基)，其组分按500ml体积计包括：商用培养基DMEM 450ml、胎牛血清50ml、神经生长因子60ng/ml、表皮生长因子10ng/ml、转化生长因子8ng/ml、硫酸肝素糖蛋白200ng/ml；
使用培养液A诱导羊膜上皮细胞向角质形成细胞方向分化，使用培养液B诱导间充质干细胞向毛乳头样细胞分化，使用培养液C诱导羊膜上皮细胞向汗腺上皮样细胞分化，备用；
步骤2.无菌条件下，将细胞外基质溶于V/V为0.1％的乙酸溶液中，制成6mg/ml的细胞外基质溶液，冰浴下紫外灯照射30分钟，再按该溶液体积比分别加入10％的DMEM培养基和10％的胎牛血清，加入wnt3a蛋白500ng/ml，硫酸肝素糖蛋白150ng/ml，调pH至7.2，得到凝胶溶液；
步骤3.将羊膜间充质干细胞按106个/ml的浓度混合于凝胶溶液中，然后加入25个/ml(103个细胞/团)向毛乳头方向诱导后的羊膜间充质干细胞与羊膜上皮细胞按1∶1混合后离心形成的细胞团，再将羊膜上皮细胞向汗腺上皮方向诱导后，按105个/ml的浓度混合于该凝胶溶液中，置于5％CO2环境中37℃条件下培养1小时，待其固化后，加入培养液D与培养液F按1∶1混合的培养液，培养4天，每天换液，得到的组织工程真皮即可使用；
步骤4.将制备的组织工程真皮采用培养液F与培养液G按2∶1混合的培养液培养3天，每天换液；再使用培养液G培养2天，每天换液；
步骤5.在诱导培养后的组织工程真皮表面接种104个/cm2密度的羊膜上皮细胞和3×104个/cm2密度的经向角质形成细胞方向诱导后的羊膜上皮细胞，再用培养液E与培养液G按1∶2比例混合的培养液培养2天，每天换液，得到含有毛囊、汗腺结构的组织工程皮肤。
所制备的组织工程双层皮肤中毛囊结构相对汗腺结构较多，可用于头部皮肤创面的修复，有利于创面毛囊结构的尽快重建，达到创面修复的功能及外观要求。
实施例2、
步骤1.培养液配制及细胞定向诱导
配制培养液A(羊膜上皮细胞向角质形成细胞方向诱导培养基)，其组分按500ml体积计包括：商用培养基DMEM360ml、商用培养基F12 90ml、胎牛血清50ml、腺嘌呤260mM、胰岛素5μg/ml、转铁蛋白5μg/ml、表皮生长因子13ng/ml、氢化可的松0.4μg/ml；
配制培养液B(间充质干细胞向毛乳头方向诱导培养基)，其组分按500ml体积计包括：商用培养基DMEM 300ml、商用培养基F12 125ml、胎牛血清75ml、wnt3a蛋白130ng/ml、成纤维生长因子2(FGF-2)8ng/ml；
配制培养液C(羊膜上皮细胞向汗腺上皮样细胞诱导培养基)，其组分按500ml体积计包括：商用培养基DMEM 450ml、胎牛血清50ml、神经生长因子(NGF)15ng/ml、表皮生长因子10ng/ml、转化生长因子(TGF-β)20ng/ml、硫酸肝素糖蛋白80ng/ml；
配制培养液D(组织工程真皮培养基)，其组分按500ml体积计包括：商用培养基DMEM 300ml、商用培养基F12 150ml、胎牛血清50ml、胰岛素样生长因子10ng/ml、表皮生长因子10ng/ml、成纤维细胞生长因子10ng/ml；
配制培养液E(组织工程双层皮肤培养基)，其组分按500ml体积计包括：商用培养基DMEM 450ml、胎牛血清50ml、胰岛素样生长因子8ng/ml、表皮生长因子13ng/ml；
配制培养液F(毛囊样结构诱导培养基)，其组分按500ml体积计包括：商用培养基DMEM 450ml、胎牛血清50ml、成纤维生长因子2 10ng/ml、表皮生长因子6ng/ml、wnt3a蛋白100ng/ml、骨形态发生蛋白80ng/ml；
配制培养液G(汗腺样结构诱导培养基)，其组分按500ml体积计包括：商用培养基DMEM 450ml、胎牛血清50ml、神经生长因子80ng/ml、表皮生长因子15ng/ml、转化生长因子10ng/ml、硫酸肝素糖蛋白250ng/ml；
使用培养液A诱导羊膜上皮细胞向角质形成细胞方向分化，使用培养液B诱导间充质干细胞向毛乳头样细胞分化，使用培养液C诱导羊膜上皮细胞向汗腺上皮样细胞分化，备用；
步骤2.无菌条件下，将细胞外基质溶于V/V为0.1％的乙酸溶液中，制成9mg/ml的细胞外基质溶液，冰浴下紫外灯照射30分钟，再按该溶液体积比分别加入10％的DMEM培养液和10％的胎牛血清，加入wnt3a蛋白300ng/ml，硫酸肝素糖蛋白300ng/ml，调pH至7.2，得到凝胶溶液；
步骤3.将羊膜间充质干细胞按105个/ml的浓度混合于凝胶溶液中，然后加入10个/ml(104个细胞/团)向毛乳头方向诱导后的羊膜间充质干细胞与羊膜上皮细胞按1∶1混合后离心形成的细胞团，再将羊膜上皮细胞向汗腺上皮方向诱导后，按107个/ml的浓度混合于该凝胶溶液中，置于5％CO2环境中37℃条件下培养1小时，待其固化后，加入培养液D与培养液F按1∶1混合的培养液，培养4天，每天换液，得到的组织工程真皮即可使用；
步骤4.将制备的组织工程真皮采用培养液F与培养液G按2∶1混合的培养液培养3天，每天换液；再使用培养液G培养2天，每天换液；
步骤5.在诱导培养后的组织工程真皮表面接种1.5×104个/cm2密度的羊膜上皮细胞和4.5×104个/cm2密度的经向角质形成细胞方向诱导后的羊膜上皮细胞，再用培养液E与培养液G按1∶2比例混合的培养液培养2天，每天换液，得到含有毛囊、汗腺结构的组织工程皮肤。
所制备的组织工程双层皮肤含有少量毛囊结构，由于使用了高浓度的汗腺样上皮细胞及汗腺诱导蛋白，制备的组织工程皮肤具有较多的汗腺结构，可用于II度烧伤创面修复，有利于烧伤病人创面温度调节。