三环癸-9-基-黄原酸酯的立体异构体 相关申请的交叉参考
本申请要求2007年7月3日递交的美国临时申请号60/958,370的优先权，将其全部内容作为参考并入本发明中。
【发明领域】
本发明提供了三环癸-9-基黄原酸酯的光学活性立体异构体、及其制备方法和药物组合物。也提供了将其用于治疗、预防或改善病毒感染和这样的感染引起的疾病的方法。
背景技术
三环癸-9-基黄原酸酯是包含五个手性中心的复杂分子，其在理论上可以产生32个立体异构体。然而，由于其环状结构的限制，该分子存在的立体异构体比理论可能性少得多。一些立体异构体显示在方案1中，包括四个对映体对：O-外/C-外，(9R)-1A和(9S)-1A、O-外/C-内，(9R)-1B和(9S)-1B、O-内/C-外，(9R)-1C和(9S)-1C、和O-内/C-内，(9R)-1D和(9S)-1D。
英国专利GB 2,091,244以及美国专利号4,602,037和4,981,869描述了三环癸-9-基-黄原酸酯的立体异构体混合物，其被称为D609。如在美国申请公开号2005/0085448中表征的，D609包含83％的外消旋的O-外/C-外立体异构体1A和17％的外消旋的O-外/C-内1B、O-内/C-外1C和O-内/C-内1D。
已经报道D609显示出多种生物活性，包括抗肿瘤活性(美国专利号4,602,037；Amtmann和Sauer，Cancer Lett.1987，35，237-244；Furstenberger等人，Int.J.Cancer 1989，43，508-512；Schick et al.Cancer Lett.1989，46.143-147；Schick等人，Cancer Lett.1989，46，149-152；Sauer等人，Cancer Lett.1990，53，97-102；PorN-Ares等人，Exp.Cell.Res.1997，235，48-54)、抗病毒活性(Sauer等人，Pro.Natl.Acad.ScL USA 1984，81，3263-3267；Amtmann等人，Biochem.Pharmacol.1987，36，1545-1549；Villanueva等人，Virology1991，181，101-108；Walro和Rosenthal，Antiviral Res.1997，36，63-72)和抗炎活性(Machleidt等人，J.Exp.Med.1996，184，725-733；Tschaikowsky等人，J.Pharmacol.1998，285，800-804)。
方案1
还报道D609是一种磷脂酰胆碱-特异性磷脂酶C(PC-PLC)的特异性抑制剂(Amtmann，Drugs Exp.Clin.Res.1996，22，287-294；Muller-Decker，Biochem.Biophys.Res.Commun.1989，162，198-205)。PC-PLC水解磷脂酰胆碱产生第二信使二酰甘油，其激活蛋白激酶C(PKC)和/或酸性神经磷脂酶(aSMase)。已经提出通过D609抑制PC-PLC可用于抑制PKC和aSMase的活性(Schutze等人，Cell 1992，71，765-776；Wiegmann等人，Cell 1994，78，1005-1015；Cifone等人，EMBO J.1995，14，5859-5868；Amtmann，DrugsExp.Clin.Res.1996，22，287-294；Machleidt等人，J.Exp.Med.1996，184，725-733；Yamamoto等人，Biochem.J.1997，325，223-228)。PKC的抑制可以部分地解释D609的抗增殖和抗肿瘤活性(Muller-Decker等人，Exp.CellRes.1988，777，295-302；Muller-Decker等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.1989，162，198-205；Amtmann，Drugs Exp.Clin.Res.1996，22，287-294)。D609抑制aSMase可以导致神经酰胺生成减少，从而抑制神经酰胺-介导的信号转导(Schutze等人，Cell 1992，71，765-776；Wiegmann等人，Cell 1994，78，1005-1015；Machleidt等人，J.Exp.Med.1996，184，725-733)，例如PKC-z(Simarro等人，J.Immunol.1999，162，5149-5155)、细胞分裂素(丝裂原)活化蛋白激酶(Buscher等人，MoI Cell.Biol.1995，15，466-475；Monick等人，J.Immunol.1999，162，3005-3012)和核因子-kB(NF-kB)(Cell 1992，71，765-776；Wiegmann等人，Cell 1994，78，1005-1015)的活化。
另外，美国专利号4,851,435、WO 96/14841、和美国申请公开号2004/0122086和2005/0085448描述了应用助剂，例如离子型去垢剂、脂质和类固醇来增强D609作为抗病毒剂或抗肿瘤剂的治疗效果。
Gonzalez-Roura等人(Lipid 2002，37，401-406)和美国专利申请公开号2005/0085448描述了外消旋的O-外/C-外1A、O-外/C-内1B、O-内/C-外1C和O-内/C-内1D立体异构体的合成。然而，Gonzalez-Roura等人报道这些非对映异构体在其抗PC-特异性磷脂酶C的抑制活性方面没有显著性差异。
上述生物学研究是使用D609进行的，D609是一种三环癸-9-基黄原酸酯的复合二立体异构混合物或外消旋混合物。特别地需要找到三环癸-9-基黄原酸酯的一种光学纯立体异构体化合物，其具有D609的治疗优点，但是避免或减少了D609或其它抗病毒剂的非故意的、不期望的、不需要的、不利的或副的作用。
在本发明中对各参考文献的引证并不意味着这样的参考文献是本申请的现有技术。
发明简述
本发明提供光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。在一实施方案中，本发明提供光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸的药学上可接受的盐，其包括但不限于锂盐、镁盐、钙盐、钠盐、钾盐和锌盐。
所述光学活性的单一立体异构体可用于治疗病毒感染的药物组合物和方法。据本发明人所知，还不存在合成三环癸-9-基黄原酸酯的单一对映异构体或从三环癸-9-基黄原酸酯或外消旋的O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸或其衍生物中分离单一对映异构体的报道。本发明提供三种用于制备这样的光学活性的对映异构体的方法。
在一实施方案中，光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药在与手性单齿膦复合的过渡金属催化剂存在下，通过不对称氢化硅烷化烯5合成的：
在另一实施方案中，光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药是通过酶拆分不饱和的酯11的外消旋混合物来制备的：
在另一实施方案中，光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药是通过酶拆分饱和的酯13的外消旋混合物制备的：
本发明还提供药物组合物，其包含光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药；与一种或多种药学上可接受地赋形剂或载体的组合。在某些实施方案中，所述药物组合物包含光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸的药学上可接受的盐，例如锂盐、镁盐、钙盐、钠盐、钾盐或锌盐。在某些实施方案中，所述药物组合物以表面给药的剂型提供。
本发明进一步提供一种用于治疗、预防或改善由病毒引起的疾病的一种或多种症状的方法，其包括向个体施用治疗有效量的光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。在一实施方案中，所述疾病为性传播疾病。在另一实施方案中，所述病毒为致癌病毒。在另一实施方案中，所述病毒为乳头瘤(pallipoma)病毒。在另一实施方案中，所述病毒为单纯疱疹病毒。
本发明提供一种用于抑制病毒复制的方法，其包括用有效量的光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药来接触所述病毒。在一实施方案中，所述病毒为性传播的。在另一实施方案中，所述疾病为致癌病毒。在另一实施方案中，所述病毒为乳头瘤病毒。在另一实施方案中，所述病毒为单纯疱疹病毒。
本发明提供一种用于抑制磷脂酰胆碱-特异性磷脂酶C活性的方法，其包括用有效量的光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药来接触所述磷脂酶C。
【附图说明】
图1显示与INF-γ的作用相比，光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸或其药学上可接受的盐对一代的(single passage)HPV-31-感染的CIN612 9E角质形成细胞生长的影响。
图2显示光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸或其药学上可接受的盐对HPV-31-特异性RNA和DNA水平的影响，和对HPV-31-感染的CIN612 9E角质形成细胞中细胞增殖的影响。
图3显示与INF-γ相比，光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸或其药学上可接受的盐对多代的HPV-31-感染的CIN6129E角质形成细胞生长的影响。
图4显示与INF-γ相比，光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸或其药学上可接受的盐对多代的A431细胞生长的影响。
图5显示(A)用光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸或其药学上可接受的盐(A)处理的HPV-31-感染的CIN6129E角质形成细胞和(B)未处理的CIN6129E细胞的细胞形态。
图6显示与INF-γ相比，光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸或其药学上可接受的盐对多代的HPV-31-感染的CIN6129E角质形成细胞中的HPV-31-特异性DNA水平的影响。
图7显示与INF-γ相比，光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸或其药学上可接受的盐对多代的HPV-31-感染的CIN612 9E角质形成细胞中的HPV-31-特异性RNA水平的影响。
发明详述
为了帮助理解本发明公开的内容，如下定义多个术语。
除非另外特别地说明，本发明使用的单数形式“一个(种)”和“所述”可以指复数冠词。通常，本发明使用的命名法和本发明描述的有机化学、药物化学和药理学的实验方法是众所周知的和本领域通常应用的。除非另有定义，本发明所用的所有技术和科学术语通常具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。
术语“个体”指动物，包括但不限于：灵长类动物(例如人类)、母牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠或小鼠。术语“个体”和“患者”在本发明中可互换地使用，例如，提及的哺乳动物个体，如人类个体。
术语“治疗”意味着包括减缓或消除障碍、疾病或病症；或一种或多种与所述障碍、疾病或病症相关的症状；或减缓或根除所述障碍、疾病或病症本身的病因。
术语“预防”指延迟或消除障碍、疾病或病症；和/或一种或多种与所述障碍、疾病或病症相关的症状；使个体免于获得疾病或减少个体获得障碍、疾病或病症的风险的方法。
术语“治疗有效量”指当施用时，在某种程度上足够预防一种或多种待治疗的障碍、疾病或病症的症状的发展或减缓其的化合物的量。术语“治疗有效量”也指研究人员、兽医、医生或临床医师寻求的足够引发细胞、组织、系统、动物或人类生物学或医学反应得化合物的量。
术语“药学上可接受的载体”、“药学上可接受的赋形剂”、“生理学可接受的载体”或“生理学可接受的赋形剂”指药学上可接受的物质、组合物或赋形剂，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包囊物质。在一实施方案中，每种组分为在与药物制剂的其它成分相容含义上的“药学上可接受的”，并且适于与人类和动物的组织或器官接触，而没有过度的毒性、刺激、变态反应、免疫原性或其它问题或并发症，与合理的益处/危险比例相称。参见，Remington：The Science and Practice ofPharmacy，第21版，Lippincott Williams&Wilkins：Philadelphia，PA，2005；Handbook of Pharmaceutical Excipients，第5版，Rowe等人编辑，ThePharmaceutical Press and the American Pharmaceutical Association：2005；和Handbook of Pharmaceutical Additives，第3版，Ash和Ash Eds.，GowerPublishing Company：2007；Pharmaceutical Preformulation and Formulation，Gibson编辑，CRC Press LLC：Boca Raton，FL，2004。
术语“活性成分”和“活性物质”指单独或与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合施用于个体用于治疗、预防或改善病症或疾病的一种或多种症状的化合物。如本发明使用的“活性成分”和“活性物质”具体指本发明描述的化合物光学活性异构体。
术语“药物”、“治疗剂”和“化疗剂”指施用于个体以治疗、预防或改善病症或疾病的一种或多种症状的化合物或其药物组合物。
术语“释放控制赋形剂”指与常规立即释放剂型中的赋形剂相比，其主要功能是改变从剂型中释放活性物质的持续时间或位置的赋形剂。
术语“非释放控制赋形剂”指与常规立即释放剂型中的赋形剂相比，其主要功能不包括改变从剂型中释放活性物质的持续时间或位置的赋形剂。
术语“烷基”指直链饱和一价烃基或支链饱和一价烃基。除非另有说明，术语“烷基”也同时包括直链和支链烷基。在某些实施方案中，烷基为具有1至20(C1-20)、1至15(C1-15)、1至10(C1-10)或1至6(C1-6)个碳原子的直链饱和一价烃基，或3至20(C3-20)、3至15(C3-15)、3至10(C3-10)或3至6(C3-6)个碳原子的支链饱和一价烃基。如本发明使用的直链C1-6和支链C3-6烷基也称为“低级烷基”。烷基的实例包括但不限于：甲基、乙基、丙基(包括所有的异构形式)、正丙基、异丙基、丁基(包括所有异构形式)、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基(包括所有异构形式)和己基(包括所有异构形式)。例如，C1-6烷基指1至6个碳原子的直链饱和一价烃基或3至6个碳原子的支链饱和一价烃基。在某些实施方案中，烷基可以被一个或多个如本发明描述的取代基Q取代。
术语“环烷基”指环状饱和的桥连或非桥连一价烃基，其可任选地被一个或多个如本发明描述的取代基Q取代。在某些实施方案中，所述环烷基具有3至20(C3-20)、3至15(C3-15)、3至10(C3-10)或3至7(C3-7)个碳原子。环烷基基团的实例包括但不限于：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、十氢萘基和金刚烷基。
术语“芳基”指包含至少一个芳香烃环的单环芳香基和/或多环一价芳香基。在某些实施方案中，所述芳基具有6至20(C6-20)、6至15(C6-15)或6至10(C6-10)个环原子。芳基基团的实例包括但不限于：苯基、萘基、芴基、薁基(azulenyl)、蒽基、菲基、芘基、联苯基和三联苯基。芳基也指二环或三环碳环，其中一个环是芳香的，而其它环可以是饱和的、部分不饱和的或芳香的，例如二氢萘基、茚基、茚满基或四羟基萘基(四氢萘基)。在某些实施方案中，芳基也可以任选地被一个或多个如本发明描述的取代基Q取代。
术语“杂芳基”指包含至少一个芳香环的单环芳香基和/或多环芳香基，其中至少一个芳香环含有一个或多个独立地选自O、S和N的杂原子。杂芳基基团的每个环可以包含一个或两个O原子、一个或两个S原子和/或一个至四个N原子，条件是每个环中杂原子的总量为四个或更少，并且每个环包含至少一个碳原子。所述杂芳基可以在其引起形成稳定化合物的任何杂原子或碳原子位点连接到主结构。在某些实施方案中，所述杂芳基具有5至20、5至15或5至10个环原子。单环杂芳基基团的实例包括但不限于：吡咯基、吡唑基、吡唑啉基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、噻二唑基、异噻唑基、呋喃基、噻吩基、噁二唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基和三嗪基。二环杂芳基基团的实例包括但不限于：吲哚基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并噻吩基、喹啉基、四氢异喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并吡喃基、吲嗪基、苯并呋喃基、异苯并呋喃基、色酮基、香豆素基、噌啉基、喹喔啉基、吲唑基、嘌呤基、吡咯并吡啶基、呋喃并吡啶基、噻吩并吡啶基、二氢异吲哚基和四氢喹啉基。三环杂芳基基团的实例包括但不限于：卡唑基、苯并吲哚基、菲咯啉基、吖啶基、菲啶基和呫吨基。在某些实施方案中，杂芳基也可以任选地被一个或多个如本发明描述的取代基Q取代。
术语“杂环基”或“杂环”指包含至少一个非芳香环的单环非芳香环系统和/或多环环系统，其中一个或多个非芳香环原子为独立地选自O、S或N的杂原子；并且其余环原子为碳原子。在某些实施方案中，所述杂环基或杂环基团具有3至20、3至15、3至10、3至8、4至7或5至6个环原子。在某些实施方案中，所述杂环为单环、二环、三环或四环环系统，其可以包括稠合的或桥连的环系统，其中氮原子或硫原子可以任选地被氧化，氮原子可以任选地季铵化，一些环可以被部分地或完全地饱和或者芳香化。所述杂环可以在任何杂原子或碳原子处连接到主结构，形成稳定的化合物。这样的杂环基的实例包括但不限于：吖啶基、氮杂卓基、苯并咪唑基、苯并吲哚基、苯并异噁唑基、苯并异噁嗪基、苯并[4，6]咪唑并[1，2a]吡啶基、苯并二噁烷基、苯并间二氧杂环戊烯基、苯并呋喃酮基、苯并呋喃基、苯并萘并呋喃基、苯并吡喃酮基、苯并吡喃基、苯并四氢呋喃基、苯并四氢噻吩基、苯并噻二唑基、苯并噻唑基、苯并苯硫基、苯并三唑基、苯并噻喃基、苯丙噁嗪基、苯并噁唑基、β咔啉基、卡唑基、苯并二氢吡喃基、色酮基、噌啉基、香豆素基、十氢异喹啉基、二苯并呋喃基、二氢苯并异噻嗪基、二氢苯并异噁嗪基、二氢呋喃基、二氢吡喃基、二氧戊环基、二氢吡嗪基、二氢吡啶基、二氢吡唑基、二氢嘧啶基、二氢吡咯基、二氧戊环基、1，4-二噻吩基(dithianyl)、呋喃酮基、呋喃基、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、咪唑并吡啶基、咪唑并噻唑基、吲唑基、二氢吲哚基、吲嗪基、吲哚基、异苯并四氢呋喃基、异苯并四氢噻吩基、异苯并噻吩基、异色满基、异香豆素基、异二氢氮茚基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑烷基、异噻唑基、异噁唑烷基、异噁唑基、吗啉基、萘啶基、八氢吲哚基、噁二唑基、噁唑烷酮基、噁唑烷基、噁唑并吡啶基、噁唑基、环氧乙烷基、萘嵌间二氮杂苯基、菲啶基、phenathrolinyl、吩砒嗪基(phenarsazinyl)、吩嗪基、吩噻嗪基、酞嗪基、哌嗪基、哌啶基、4-哌啶酮基、蝶啶基、嘌呤基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑基、哒嗪基、吡啶基、吡啶并吡啶基、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯啉基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、奎宁环基、四氢呋喃基、四氢呋喃基、四氢异喹啉基、四氢吡喃基、四氢噻吩基、四唑基、噻二唑并嘧啶基、噻二唑基、硫代吗啉基、噻唑烷基、噻唑基、噻吩基、三嗪基、三唑基和1，3，5-三噻烷基(trithianyl)。在某些实施方案中，杂环也可以任选地被一个或多个如本发明描述的取代基Q取代。
术语“酰基”指-C(O)R基团，其中R为烷基、环烷基、烯基、杂环、芳基或杂芳基，各自如本发明定义的。酰基基团的实例包括但不限于：乙酰基、丙酰基、丁酰基、并丁酰基、戊酰基、己酰基、庚酰基、辛酰基、壬酰基、癸酰基、十二烷酰基、十四烷酰基、十六烷酰基、十八烷酰基、二十烷酰基、二十二烷酰基、肉豆蔻脑酰基、棕榈油酰基、油酰基、亚油酰基、花生四烯酰基、苯甲酰基、吡啶并羰基和糠酰基。
术语“卤素”、“卤化物”或“卤代”指氟、氯、溴或碘。
术语“任选取代的”是指基团例如烷基、亚烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基或杂环基可以被一个或多个取代基取代，所述取代基独立地选自例如：卤素、氰基、(-CN)、硝基(-NO2)、-SRa、-S(O)Ra、-S(O)2Ra、-Ra、-C(O)Ra、-C(O)ORa、-C(O)NRbRc、-C(NRa)NRbRc、-ORa、-OC(O)Ra、-OC(O)ORa、-OC(O)NRbRc、-OC(＝NRa)NRbRc、-OS(O)Ra、-OS(O)2R8、-OS(0)NRaRb、-OS(O)2NRaRb、-NRaRb、-NRaC(O)Rb、-NRaC(O)ORb、-NRaC(O)NRbRc、-NRaC(NRb)NRcRd、-NRaS(O)Rb、-NRaS(O)2Rb、-NRaS(O)RbRc或-NRaS(O)2RbRc；其中Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地为例如烷基、烯基、环烷基、芳基、杂芳基或杂环基。
术语“任选取代的”是指基团例如烷基、环烷基、烯基、环烷基、芳基、杂芳基、杂环基或酰基可以被一个或多个取代基Q取代，在一实施方案中，其被一个、两个、三个或四个取代基Q取代，其中各个Q独立地选自：氰基、卤素和硝基；C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7环烷基、C6-14芳基、杂芳基和杂环基；和-C(O)Re、-C(O)ORe、-C(O)NRfRg、-C(NRe)NRfRg、-ORe、-OC(O)Re、-OC(O)ORe、-OC(O)NRfR8、-OC(＝NRe)NRfRg、-OS(O)Re、-OS(O)2Re、-OS(O)NRfRg、-OS(O)2NRfRg、-NRfRg、-NReC(O)Rf、-NReC(O)ORf、-NReC(O)NRfRg、-NReC(＝NRh)NRfRg、-NReS(O)Rf、-NReS(O)2Rf、-NReS(O)NRfRg、-NReS(O)2NRfRe、-SRe、-S(O)Re或-S(O)2Re；其中Re、Rf、Rg和Rh各自独立地为氢；C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7环烷基、C6-14芳基、杂芳基或杂环基；或Rf和Rg与它们连接的N原子一起形成杂环。
术语“光学活性的”和“对映异构活性的”在本发明中可互换地使用，指化合物包含至少足够过量的一种对映异构体多于其它对映异构体，从而该化合物混合物旋转平面偏振光。对映异构体的光学活性典型地表示为对映体过量(e.e.)。在某些实施方案中，“光学活性的”和“对映异构体活性的”指下述分子集合，所述分子具有的对映体过量为不少于约50％、不少于约70％、不少于约80％、不少于约90％、不少于约91％、不少于约92％、不少于约93％、不少于约94％、不少于约95％、不少于约96％、不少于约98％、不少于约99％或不少于约99.5％、不少于约99.8％。在某些实施方案中，所述化合物包含基于所述消旋体总重量的约95％或更多的(-)对映异构体和约5％或更少的(+)对映异构体。
在描述光学活性化合物中，前缀R和S用于表示所述分子围绕手性中心的绝对构型。(+)和(-)用于表示化合物的旋光性，即，其中光学活性化合物旋转平面偏振光的方向。(-)前缀指示化合物为左旋的，即，该化合物向左或逆时针方向旋转平面偏振光。(+)前缀指示化合物为右旋的，即，该化合物向右或顺时针方向旋转平面偏振光。然而，旋光性的符号(+)和(-)不涉及分子的绝对构型R和S。
术语“溶剂化物”指本发明提供的化合物或其盐，其进一步包含通过非共价分子间作用力结合的化学当量或非化学当量的溶剂。当溶剂为水时，所述溶剂化物为水合物。
术语“IC50”指在测量反应的实验中最大反应抑制50％所需要的化合物的量、浓度或剂量。
术语“三环癸-9-基黄原酸酯”指式1的三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸，或药学上可接受的盐或溶剂化物。
三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸
三环5.2.1.02.6-癸-9-基-黄原酸是包含五个手性中心的复杂分子，理论上其可以产生32个立体异构体。然而，由于其环状结构的限制，该分子存在比理论可能性少得多的立体异构体。一些立体异构体在方案1中显示，包括四个对映体对，O-外/C-外、(9R)-1A和(9S)-1A；O-外/C-内，(9R)-1B和(9S)-1B；O-内/C-外，(9R)-1C和(9S)-1C；和O-内/C-内，(9R)-1D和(9S)-1D。
本发明预期采用光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A作为治疗剂具有优于外消旋或非对映体的混合物的一些优点。首先，光学纯的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A是显著有效的，因而允许使用较低剂量或浓度以获得与外消旋的或非对映体的混合物相同的益处。第二，本发明预期减少或避免与使用非对映体的或外消旋的混合物相关的不需要的、不期望的、不利的或副的作用。事实上，与外消旋的或非对映体的混合物相比，光学纯的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A具有增强的治疗指数(参见，如本发明公开的实施例)。使用本发明描述的光学纯的异构体或其组合物的其它预期益处可以包括使药代动力学特征简单化、减少不期望的药物-药物相互作用和减少患者-患者间变化。
因此，本发明提供光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。
在某些实施方案中，所述光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药具有的对映体过量不少于约50％、不少于约60％、不少于约70％、不少于约80％、不少于约85％、不少于约90％、不少于约91％、不少于约92％、不少于约93％、不少于约94％、不少于约95％、不少于约96％、不少于约97％、不少于约98％、不少于约99％、不少于约99.5％、不少于约99.9％、不少于约99.95％、不少于约99.99％或约100％。
在某些实施方案中，光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药的对映体过量不少于约50％。在某些实施方案中，所述对映体过量不少于约60％。在某些实施方案中，所述对映体过量不少于约70％。在某些实施方案中，所述对映体过量不少于约80％。在某些实施方案中，所述对映体过量不少于约85％。在某些实施方案中，所述对映体过量不少于约90％。在某些实施方案中，所述对映体过量不少于约91％。在某些实施方案中，所述对映体过量不少于约92％。在某些实施方案中，所述对映体过量不少于约93％。在某些实施方案中，所述对映体过量不少于约94％。在某些实施方案中，所述对映体过量不少于约95％。在某些实施方案中，所述对映体过量不少于约96％。在某些实施方案中，所述对映体过量不少于约97％。在某些实施方案中，所述对映体过量不少于约98％。在某些实施方案中，所述对映体过量不少于约99％。在某些实施方案中，所述对映体过量不少于约99.5％。在某些实施方案中，所述对映体过量不少于约99.9％。在某些实施方案中，所述对映体过量不少于约99.95％。在某些实施方案中，所述对映体过量不少于约99.99％。在某些实施方案中，所述对映体过量为约100％。
在某些实施方案中，所述光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药包含不少于约60％、不少于约70％、不少于约80％、不少于约90％、不少于约95％、不少于约96％、不少于约97％、不少于约98％、不少于约99％、不少于约99.5％、不少于约99.8％、不少于约99.9％或约100％重量的(-)-对映异构体。
在某些实施方案中，光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药中(-)-对映异构体的含量不少于约60％重量。在某些实施方案中，(-)-对映异构体的含量不少于约70％重量。在某些实施方案中，(-)-对映异构体的含量不少于约80％重量。在某些实施方案中，(-)-对映异构体的含量不少于约90％重量。在某些实施方案中，(-)-对映异构体的含量不少于约95％重量。在某些实施方案中，(-)-对映异构体的含量不少于约96％重量。在某些实施方案中，(-)-对映异构体的含量不少于约97％重量。在某些实施方案中，(-)-对映异构体的含量不少于约98％重量。在某些实施方案中，(-)-对映异构体的含量不少于约99％重量。在某些实施方案中，(-)-对映异构体的含量不少于约99.5％重量。在某些实施方案中，(-)-对映异构体的含量不少于约99.8％重量。在某些实施方案中，(-)-对映异构体的含量不少于约99.9％重量。在某些实施方案中，(-)-对映异构体的含量为约100％重量。
在另一实施方案中，本发明提供光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A的药学上可接受的盐。用于制备所述药学上可接受的盐的合适的碱包括但不限于无机碱，所述无机碱包括但不限于：氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化锌和氢氧化铵；和有机碱，例如伯胺、仲胺、叔胺或季胺、脂肪族胺和芳香族胺，包括但不限于：L-精氨酸、苯乙苄胺、苄星青霉素(benzathine)、N，N′-二苄基乙二胺、N-苄基苯乙胺、胆碱、丹醇、二乙醇胺、二乙胺、二甲胺、二丙胺、二异丙胺、2-(二乙氨基)-乙醇、乙醇胺、乙胺、乙二胺、异丙胺、N-甲基-葡糖胺、海巴明青霉素(hydrabamine)、1H-咪唑、L-赖氨酸、吗啉、4-(2-羟乙基)-吗啉、甲胺、哌啶、哌嗪、丙胺、吡咯烷、1-(2-羟乙基)-吡咯烷、吡啶、喹核碱、喹啉、异喹啉、三乙醇胺、三甲胺、三乙胺、氯普鲁卡因、普鲁卡因、N-甲基-D-葡糖胺、2-氨基-2-(羟甲基)-1，3-丙二醇、1-对-氯苄基-2-吡咯烷-1-基甲基-苯并咪唑、三(羟甲基)氨基甲烷和氨基丁三醇。对于另外的药学上可接受的碱的评论，参见Berge等人，J.Pharm.Sci.1977，66，1-19；和“Handbook of Pharmaceutical Salts，Properties，and Use，”Stah和Wermuth编辑；Wiley-VCH and VHCA，Zurich，2002。
在某些实施方案中，光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A的药学上可接受的盐为无机盐，包括但不限于：碱金属盐，例如锂盐、钠盐和钾盐；碱土金属盐，例如钙盐和镁盐；锌盐；和铵盐。在某些实施方案中，所述药学上可接受的盐为碱金属盐。在某些实施方案中，所述药学上可接受的盐为碱土金属盐。在某些实施方案中，所述药学上可接受的盐为锂盐。在某些实施方案中，所述药学上可接受的盐为镁盐。在某些实施方案中，所述药学上可接受的盐为钙盐。在某些实施方案中，所述药学上可接受的盐为钠盐。在某些实施方案中，所述药学上可接受的盐为钾盐。在某些实施方案中，所述药学上可接受的盐为锌盐。在某些实施方案中，所述药学上可接受的盐为铵盐。
在另一实施方案中，光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A的药学上可接受的盐为有机盐。用于制备所述药学上可接受的盐的合适的有机碱为如本发明描述的那些。
在另一实施方案中，本发明提供光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A的前药，其包括但不限于：在WO 2005/032492中公开的那些，将其全部内容作为参考并入本发明中。
化合物的前药是在体内容易转变为母体化合物的母体化合物的功能衍生物。前药通常是有用的，因为在某些情况下，它们可能比母体化合物更容易施用。例如，它们可以通过口服施用来生物利用，而母体化合物不可以。所述前药在药物组合物也可以具有比母体化合物高的溶解度。前药可以通过多种机制转变成母体药物，所述机制包括酶处理和代谢性水解。参见，Harper，Progress in Drug Research 1962，4，221-294；Morozowich等人的“Design of Biopharmaceutical Properties through Prodrugs and Analogs，”Roche编辑，APHA Acad.Pharm.Sci.1977；“Bioreversible Carriers in Drug inDrug Design，Theory and Application，”Roche编辑，APHA Acad.Pharm.Sci.1987；“Design of Prodrugs，”Bundgaard，Elsevier，1985；Wang等人，Curr.Pharm.Design 1999，5，265-287；Pauletti等人，Adv.Drug.Delivery Rev.1997，27，235-256；Mizen等人，Pharm.Biotech.1998，11，345-365；Gaignault等人，Pract.Med.Chem.1996，671-696；Asgharnejad in“Transport Processes inPharmaceutical Systems，”Amidon等人，Ed.，Marcell Dekker，185-218，2000；Balant等人，Eur.J.Drug Metab.Pharmacokinet.1990，15，143-53；Balimaneand Sinko.adv.Drug Delivery Rev.1999，39，183-209；Browne，Clin.Neuropharmacol.1997，20，1-12；Bundgaard，Arch.Pharm.Chem.1979，86，1-39；Bundgaard，Controlled Drug Delivery 1987，17，179-96；Bundgaard，Adv.Drug Delivery Rev.1992，5，1-38；Fleisher等人，Adv.Drug Delivery Rev.1996，19，115-130；Fleisher等人，Methods Enzymol 1985，112，360-381；Farquhar等人，J.Pharm.Sci.1983，72，324-325；Freeman等人，J.Chem.Soc，Chem.Commun.1991，875-877；Friis和Bundgaard，Eur.J.Pharm.Sci.1996，4，49-59；Gangwar等人，Des.Biopharm.Prop.Prodrugs Analogs，1977，409-421；Nathwani和Wood，Drugs 1993，45，866-94；Sinhababu和Thakker，Adv.DrugDelivery Rev.1996，19，241-273；Stella等人，Drugs 1985，29，455-73；Tan等人，Adv.Drug Delivery Rev.1999，39，117-151；Taylor，Adv.Drug DeliveryRev.1996，19，131-148；Valentino and Borchardt，Drug Discovery Today 1997，2，148-155；Wiebe and Knaus，Adv.Drug Delivery Rev.1999，39，63-80；Waller等人，Br.J.Clin.Pharmac.1989，28，497-507。
在一实施方案中，光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A的前药是式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物：
其中Ra为用一个或多个选自S、O、N和P的杂原子取代的烷基。
在另一实施方案中，所述前药为式(II)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物：
其中Rb、Rc和Rd各自独立地为H或烷基。
式(II)的前药的合成在方案2中举例说明(Krise等人，J.Pharm.ScL1999，88，922-927；和Krise等人，J.Pharm.Sci.1999，88，928-932)。化合物2与光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A的钾盐发生取代反应生成式(II)的相应光学活性前药。在某些实施方案中，Rb为H。在某些实施方案中，Rc和Rd各自独立地为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。在某些实施方案中，Rc和Rd各自独立地为甲基、正丙基或叔丁基。在某些实施方案中，Rc和Rd都是甲基。在某些实施方案中，Rc和Rd都是正丙基。在某些实施方案中，Rc和Rd都是叔丁基。在某些实施方案中，Rb为H，Rc和Rd各自独立地为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。
方案2
在另一实施方案中，所述前药为式(III)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物：
其中Rb和Rc各自独立地为H或烷基。在某些实施方案中，Rb为H。在某些实施方案中，Rc为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。Rc为甲基、正丙基或正丁基。在某些实施方案中，Rb为H，且Rc为甲基、正丙基或叔丁基。
式(III)的前药的合成在方案3中举例说明。使乙酸氯甲酯3(其根据Bodor等人(J.Org.Chem.1983，48，5280-5284)合成的)与光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A的钾盐反应，得到式(III)的相应光学活性的前药4，其中Rb为H.
方案3
光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸的制备
1.不对称氢化硅烷化：
本发明提供一种用于合成光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药的不对称氢化硅烷化方法(方案4)。如本发明使用的结构中的星号“*”指示基团可能的连接位点，从而，当所述基团连接至期望的位点时，得到的光学活性化合物将如所期望的在相同方向上具有(+)或(-)的光学活性。
在本发明中通过合成光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药来阐述该方法。如果需要，所述方法同样适用于合成光学活性的(+)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。
方案4
在一实施方案中，所述方法包括在与手性单齿膦复合的过渡金属催化剂存在下，使非手性的C-外烯5与硅烷反应，得到光学活性的有机硅烷6。
在另一实施方案中，所述方法进一步包括用氧化剂氧化所述光学活性的有机硅烷6，得到保留立体化学的光学活性的烷醇7。
在另一实施方案，所述方法进一步包括将所述光学活性的烷醇7转化成光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。
在另一实施方案中，所述方法包括步骤：a)在与手性单齿膦复合的过渡金属催化剂存在下，使非手性的C-外烯5与硅烷反应，得到光学活性的有机硅烷6；b)用氧化剂氧化该光学活性的有机硅烷6，得到保留立体化学的光学活性的烷醇7；和c)将所述光学活性的烷醇7转化成光学活性(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。
用于不对称氢化硅烷化反应的合适的硅烷包括但不限于式(IV)的化合物：
其中
R1、R2和R3各自独立地为H；卤素；C1-6烷基，任选地被下述基团取代：一个或多个取代基Q，在一实施方案中，一个、两个或三个取代基Q；或-OR4，其中R4为C1-6烷基、C3-7环烷基或C6-10芳基，各自任选地被一个或多个取代基Q取代，在一实施方案中，各自任选地被一个、两个或三个取代基Q取代。
合适的硅烷的实例包括但不限于：三氯硅烷、甲基二氯硅烷、二甲基氯硅烷、甲氧基二氯硅烷、三乙基硅烷、五甲基二硅氧烷(HSiMe2OTMS)和1，1-二甲基-3，3-二苯基-3-叔-丁基二硅氧烷(HSiMe2OTBDPS)。在某些实施方案中，所述硅烷为三氯硅烷。在某些实施方案中，所述硅烷为甲基二氯硅烷。在某些实施方案中，所述硅烷为二甲基氯硅烷。在某些实施方案中，所述硅烷为甲氧基二氯硅烷。在某些实施方案中，所述硅烷为三乙基硅烷。在某些实施方案中，所述硅烷为五甲基二硅氧烷(HSiMe2OTMS)。在某些实施方案中，所述硅烷为1，1-二甲基3，3-二苯基-3-叔丁基二硅氧烷(HSiMe2OTBDPS)。
在不对称氢化硅烷化反应中用作催化剂的合适的过渡金属包括但不限于：铂、铟、钯、铑和钌。所述过渡金属催化剂可以是非均质的或均质的。在某些实施方案中，所述过渡金属催化剂为铂。在某些实施方案中，所述过渡金属催化剂为铱。在某些实施方案中，所述过渡金属催化剂为钯。在某些实施方案中，所述过渡金属催化剂铑。在某些实施方案中，所述过渡金属催化剂为钌。
合适的手性单齿膦配体包括但不限于：式(V)的化合物：
其中
R5为H；C1-6烷基，任选地被下述基团取代：一个或多个取代基Q，在一实施方案中，一个、两个或三个取代基Q；或-OR8，其中R8为C1-6烷基、C3-7环烷基，或C6-10芳基，各自任选地被一个或多个取代基Q取代，在一实施方案中，各自任选地被一个、两个或三个取代基Q取代；和
R6和R7各自独立地为C6-10芳基，任选地被一个或多个取代基Q取代，在一实施方案中，任选地被一个、两个、三个、四个或五个取代基Q取代。
在某些实施方案中，R5为烷基，包括但不限于：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基和己基。在某些实施方案中，R5为甲基、乙基、正-丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。在某些实施方案中，R5为OR8，其中R8为C1-6烷基、C3-7环烷基或C6-10芳基。在某些实施方案中，R8为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基或己基。在某些实施方案中，R5为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。在某些实施方案中，R6和R7各自独立地为苯基；或单-、二-、三-、四-或五卤代苯基。在某些实施方案中，R6和R7为苯基。在某些实施方案中，R5为-OR8，其中R8为甲基。在某些实施方案中，R5为-OR8，其中R8为甲基；和R6和R7为苯基。
O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药的手性主要由使用的手性单齿膦的手性决定。例如，与式II的(R)-(+)-单齿膦配体复合的钯，其中R5为甲氧基，R6和R7为苯基，导致形成光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-醇(7)，其导致形成保留立体化学的光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。
用于氧化所述光学活性的有机硅烷6的合适的氧化剂包括但不限于：过氧化氢；和过酸，例如过乙酸(AcOOH)和间-氯过苯甲酸。在某些实施方案中，所述氧化剂为过氧化氢。在某些实施方案中，所述氧化剂为过酸。在某些实施方案中，所述氧化剂为过乙酸或间-氯过苯甲酸。
使用本领域技术人员已知的方法，可以容易地将光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-醇转变为光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，所述方法参见“Xanthates and Related Compounds，”Rao Ed.，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，1971，第7-31页；美国专利号4,602,037；和Gonzalez-Roura等人，Lipids 2002，37，401-40。
起始原料非手性的C-外烯5是由双环戊二烯8制备的，如方案5所示。首先，用氢溴酸处理双环戊二烯8，经由华-米二氏重排得到C-外-溴代烯9(Brunson等人，J.Am.Chem.Soc.1945，67，1178-1180)。氢化C-外-溴代烯9，得到C-外溴代烷10，然后，将其脱溴化，形成非手性的C-外烯5(Youngblood等人，J.Org.Chem.1956，27，1436-1438；Osawa等人，J.Org.Chem.1982，47，1923-1932)。
方案5
2.酶拆分：方法I
本发明还提供一种通过酶拆分不饱和的酯11来合成光学合成的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药的方法：
其中R9C(O)-为C1-24酰基。
式11的结构代表两对对映异构体(R)-11A和(S)-11A，和(R)-11B和(S)-11B。在某些实施方案中，在酶拆分中使用的酯11为所有四种立体异构体(R)-11A、(S)-11A、(R)-11B和(S)-11B的混合物。在某些实施方案中，在酶拆分中使用的酯11为(R)-11A和(S)-11A的混合物，例如其外消旋混合物。在某些实施方案中，在酶拆分中使用的酯11为(R)-11B和(R)-11B的混合物，例如其外消旋混合物。
在某些实施方案中，酰基为乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、己酰基、庚酰基、辛酰基、壬酰基、癸酰基、十二烷酰基、十四烷酰基、十六烷酰基、十八烷酰基、二十烷酰基、二十二烷酰基、肉豆蔻脑酰基、棕榈油酰基、油酰基、亚油酰基或花生四烯酰基。在某些实施方案中，所述酰基为乙酰基。在某些实施方案中，所述酰基为丙酰基。在某些实施方案中，所述酰基为丁酰基。在某些实施方案中，所述酰基为异丁酰基。在某些实施方案中，所述酰基为戊酰基。在某些实施方案中，所述酰基为己酰基。在某些实施方案中，所述酰基为庚酰基。在某些实施方案中，所述酰基为辛酰基。在某些实施方案中，所述酰基为壬酰基。在某些实施方案中，所述酰基为癸酰基。在某些实施方案中，所述酰基为十二烷酰基。在某些实施方案中，所述酰基为十四烷酰基。在某些实施方案中，所述酰基为十六烷酰基。在某些实施方案中，所述酰基为十八烷酰基。在某些实施方案中，所述酰基为二十烷酰基。在某些实施方案中，所述酰基为二十二烷酰基。在某些实施方案中，所述酰基为肉豆蔻脑酰基。在某些实施方案中，所述酰基为棕榈油酰基。在某些实施方案中，所述酰基为油酰基。在某些实施方案中，所述酰基为亚油酰基。在某些实施方案中，所述酰基为花生四烯酰基。在某些实施方案中，所述酰基为天然脂肪酰基，包括但不限于：丁酰基、己酰基、辛酰基、癸酰基、十二烷酰基、十四烷酰基、十六烷酰基、十八烷酰基、二十烷酰基、二十二烷酰基、肉豆蔻脑酰基、棕榈油酰基、油酰基、亚油酰基和花生四烯酰基。
在一实施方案中，所述方法包括步骤：用水解酶选择性地水解不饱和的酯11，取决于酶的特异性，得到光学活性的(+)或(-)-烯醇12，并且保留另一种对映异构体作为光学活性的未反应的酯11，其具有相反光学活性(方案6)。如果期望的对映异构体是酯形式，所述方法也可包括在酶催化水解之后，使用常规方法例如层析法从光学活性的未反应的酯11中分离出光学活性的烯醇12的步骤。当期望的对映异构体是光学活性的未反应的酯11时，所述方法进一步包括将光学活性的酯11转化成相应光学活性的醇12的步骤，其可以使用本领域技术人员已知的常规方法完成，例如，用碱例如氢氧化锂、氢氧化钠或氢氧化钾处理光学活性的酯11。
如本发明使用的术语“水解酶”指水解酶或包含水解酶的微生物。所述水解酶可以从任何来源获得，包括但不限于：动物、植物和微生物。所述酶可以以任何常规形式应用，例如以纯化形式、粗制形式、微生物发酵液、发酵液或发酵液的滤液。另外，所述酶或微生物可以是固定化的。
在酶拆分中使用的合适的水解酶包括但不限于：脂肪酶、酯酶、肽酶、酰胺酶和酰基转移酶。
合适的脂肪酶包括但不限于：Amano PS-30(洋葱假单胞菌)、AmanoGC-20(念珠地丝菌)、Amano APF(Aspergillus niger)、Amano AK(Pseudomonas sp.)、荧光假单胞菌脂酶、Amano Lipase P30(Pseudomonassp.)、Amano P(Pseudomonas fluorescens)、Amano AY-30(Candidacylindracea)、Amano N(Rhizopus niveus)、Amano R(Penicillium sp.)、Amano FAP(Rhizopus oryzae)、Amano AP-12(Aspergillus nlger)、AmanoMAP(Mucor melhei)、Amano GC-4(念珠地丝菌)、Sigma L-0382和L-3126(porcine pancrease)、Lipase OF、Lipase R(Rhizopus sp.)、Sigma L-3001(Wheat germ)、Sigma L-1754(Candida cytindracea)、Sigma L-0763(Chromobacterlum vlscosum)、Amano K-30(Aspergillus nlger)和南极假丝酵母(Candida antactica)脂酶A或荧光假单胞菌脂肪酶。合适的肽酶包括但不限于：稻根霉菌肽酶。
方案6
在某些实施方案中，所述酶拆分在缓冲溶液中进行，所述缓冲溶液包括无机酸盐缓冲液，例如磷酸二氢钾或磷酸二氢钠；和有机酸盐缓冲液，例如柠檬酸钠。取决于使用的特异性酶或微生物，所述缓冲液的浓度可以在约0.005至约2M或约0.005至约0.5M的范围内变化。
根据酯11的溶解度，可以向反应混合物中加入表面活性剂以使酶解物增溶。合适的表面活性剂包括但不限于：非离子表面活性剂，例如烷基芳基聚醚醇、辛基苯氧基聚乙氧基乙醇和Triton X-100。
也可以加入有机溶剂作为共溶剂以促进所述酶拆分。合适的溶剂包括但不限于：乙腈、叔丁基甲醚、THF、DMSO、DMF和醇。
在另一实施方案中，所述方法用于制备(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，如方案6所示，其包括步骤：a)用水解酶选择性地水解酯11，得到光学活性的(-)-酯11和光学活性的(+)-烯醇12；b)水解该光学活性的(-)-酯11，得到光学活性的(-)-烯醇12；c)还原该光学活性的(-)-烯醇12，得到保留立体化学的光学活性的(-)烷醇7；和d)将该光学活性的(-)-烷醇7转化成光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。
在本发明提供的方法中，水解反应(步骤b)和还原反应(步骤c)不限于任何特定顺序。如果需要，还原反应可以在水解反应之前进行。
如果需要，也可以类似地制备(+)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。用于合成(+)对映异构体的方法包括步骤：a)用水解酶选择性地水解酯11，得到光学活性的(-)-酯11和光学活性的(+)-烯醇12；b)还原该光学活性的(+)-烯醇12，得到保留立体化学的光学活性的(+)-烷醇7；和c)将光学活性的(+)-烷醇7转化成光学活性的(+)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。
在某些实施方案中，所述水解酶为脂酶、酯酶、肽酶、酰胺酶或酰基转移酶。在某些实施方案中，所述水解酶为脂酶。在某些实施方案中，所述水解酶为肽酶。在某些实施方案中，所述水解酶为酯酶。在某些实施方案中，所述水解酶为酰胺酶。在某些实施方案中，所述水解酶为酰基转移酶。在某些实施方案中，所述水解酶为各自任选固定的稻根霉菌肽酶、南极假丝酵母脂酶A或荧光假单胞菌脂酶。在某些实施方案中，所述水解酶为稻根霉菌肽酶、南极假丝酵母脂酶A或固定的南极假丝酵母脂酶A。在某些实施方案中，所述水解酶为稻根霉菌肽酶。在某些实施方案中，所述水解酶为南极假丝酵母脂酶A。在某些实施方案中，所述水解酶为固定的南极假丝酵母脂酶A。
在某些实施方案中，在所述酶拆分中使用的酶为催化量的，即，在所述酶拆分反应中酶的含量不大于酯11的约50％、不大于约25％、不大于约20％、不大于约15％或不大于约10％重量。在某些实施方案中，在所述酶拆分中使用的酶不大于酯11的约50％重量。在某些实施方案中，在所述酶拆分中使用的酶不大于酯11的约25％重量。在某些实施方案中，在所述酶拆分中使用的酶为不大于酯11的约20％重量。在某些实施方案中，在所述酶拆分中使用的酶不大于酯11的约15％重量。在某些实施方案中，在所述酶拆分中使用的酶不大于酯11的约10％重量。
在某些实施方案中，所述酶拆分是在约5至约100℃、约10至约75℃、约15至60℃、约20至约50℃、约25至约40℃、约30至约40℃的温度下进行的。在某些实施方案中，所述温度为约5至约100℃。在某些实施方案中，所述温度为约10至约75℃。在某些实施方案中，所述温度为约15至约60℃。在某些实施方案中，所述温度为约20至约50℃。在某些实施方案中，所述温度为约25至约40℃。在某些实施方案中，所述温度为约30至约40℃。
在某些实施方案中，所述拆分进行的持续时间不超过约48小时、不超过约36小时或不超过约24小时。
起始原料O-外/C-外-酯11是由双环戊二烯8制备的，如方案7所示。首先，用硫酸处理双环戊二烯8，形成O-外/C-外烯醇12(Brunson和Riener，J.Am.Chem.Soc.1945，67，723-728)，接着，进行酰化，得到起始原料O-外/C-外-酯11。
方案7
3.酶拆分：方法II
在另一实施方案中，光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药是通过酶拆分酯13制备的：
其中R9C(O)-如本发明描述的。式13的结构代表两种对映异构体(R)-13和(S)-13。
在一实施方案中，所述方法包括步骤：用水解酶选择性地水解酯13，取决于酶的特异性，得到光学活性的(+)或(-)-烷醇7，并且保留另一种对映异构体作为光学活性的未反应的酯13，其具有相反光学活性。所述方法也可包括在酶催化水解之后，使用常规方法，例如层析法从光学活性的未反应的酯13中分离出光学活性的烷醇7的步骤。当期望的对映异构体是光学活性的未反应的酯13时，所述方法进一步包括将光学活性的酯13转化成相应光学活性的醇7的步骤，其可以使用本领域技术人员已知的常规方法完成，例如，用碱例如氢氧化锂、氢氧化钠和氢氧化钾处理光学活性的酯13。合适的反应条件和参数，例如水解酶、溶剂和缓冲液都是如本发明描述的那些。
在另一实施方案中，用于制备(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药的方法，包括步骤：a)用水解酶选择性地水解酯13，得到光学活性的(-)-酯13和光学活性的(+)-烷醇7；b)水解该光学活性的(-)-酯13，得到光学活性的(-)-烷醇7；和c)将光学活性的(-)-烷醇7转化成光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。
如果需要，也可以类似地制备(+)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。用于合成(+)对映异构体的方法包括步骤：a)用水解酶选择性地水解酯13，得到光学活性的(-)-酯13和光学活性的(+)-烷醇7；b)将该光学活性的(+)-烷醇7转化成光学活性的(+)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。
在某些实施方案中，所述水解酶为各自任选固定的稻根霉菌肽酶、南极假丝酵母脂酶A或荧光假单胞菌脂酶。在某些实施方案中，所述水解酶为稻根霉菌肽酶、南极假丝酵母脂酶A或荧光假单胞菌脂酶。在某些实施方案中，所述水解酶为稻根霉菌肽酶。在某些实施方案中，所述水解酶为南极假丝酵母脂酶A。在某些实施方案中，所述水解酶为荧光假单胞菌脂酶。
起始原料酯13是由O-外/C-外烯醇12制备的，如方案7所示。将O-外/C-外烯醇12氢化成O-外/C-外烯醇7，接着酰化，得到起始原料O-外/C-外酯13。
方案8
所述光学活性的O-外/C-外三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药也可以使用本领域技术人员已知的其它常规方法和技术制备。例如，外消旋的O-外/C-外三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A可以通过如下方法拆分：与光学活性的碱反应，形成非对映异构体，接着层析或分级结晶，并用游离再生，或转化成其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。
或者，外消旋的O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药可以使用手性柱或TLC来色谱拆分。用于分离所述对映异构体的各种手性柱和洗脱液都是可获得的，并且用于分离的适宜条件可以由本领域技术人员根据已知的方法凭经验确定。可获得用于分离本发明提供的对映异构体的示例性手性柱包括但不限于：OB、OB-H、OD、OD-H、OF、OG、OJ和OK。
另外的方法和技术可以在例如Enantiomers，Racemates and Resolutions，Jacques等人，Wiley-Interscience，New York，1981；Wilen，Collet和Jacques，Tetrahedron 1977，2725-2736；Stereochemistry of Carbon Compounds，Eliel，McGraw-Hill，New York，1962；Wilen in Tables of Resolving Agents andOptical Resolutions，Eliel，Ed.，Univ.of Notre Dame Press，Notre Dame，Indianapolis，1972，第268-298页；Stereochemistry of Organic Compounds，Eliel，Wilen和Manda，John Wiley&Sons，Inc.，1994；和StereoselectiveSynthesis A Practical Approach，Nogradi，VCH Publishers，Inc.，New York，1995中找到。
O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药的光学活性的立体异构体；和手性中间体，例如化合物6、7和11至13的同一性和光学纯度可以通过旋光分析、NMR或本领域已知的其它分析方法确定。
药物组合物
本发明提供药物组合物，其包含作为活性成分的光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，与一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体的组合。在某些实施方案中，所述药物组合物包含至少一种释放控制赋形剂或载体。在某些实施方案中，所述药物组合物包含至少一种非释放控制赋形剂或载体。在某些实施方案中，所述药物组合物包含至少一种释放控制和至少一种非释放控制赋形剂或载体。
本发明提供的药物组合物可以以单位剂型或多剂型(multiple-dosageform)提供。如本发明使用的单位剂型指适于施用至人类或动物个体，且如本领域已知的分别进行包装的物理分散单位。每个单位剂量包含足够产生期望治疗效果的预定量的活性成分与需要的药物载体或赋形剂。单位剂型的实例包括安瓿、注射器和分别包装的片剂和胶囊。单位剂型可以以其部分或多倍给药。多剂型为多个相同的单位剂型，其被包装在单一容器中，需要按分离的单位剂型施用。多剂型的实例包括小瓶、片剂或胶囊瓶、或品脱或加仑瓶。
所述光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A，和其药学上可接受的盐、溶剂化物及前药可以单独施用，或者与一种或多种其它活性成分组合施用。本发明提供的药物组合物可以配制成用于口服、肠胃外和表面施用的多种剂型。所述药物组合物也可以配制成改性释放剂型，包括延迟-、延缓-、延长-、缓释-、脉冲-、控制-、促进-和快速-、靶向-、程序化-释放剂型和胃滞留剂型。这些剂型都可以根据本领域技术人员已知的常规方法和技术制备(参见Remington：The Science and Practice ofPharmacy，supra；Modified-Release Drug Deliver Technology，Rathbone等人编辑，Eds.，Drugs and the Pharmaceutical Science，Marcel Dekker，Inc.：NewYork，NY，2002；Vol.126)。
在一实施方案中，所述药物组合物以用于口服施用至个体的剂型提供，其包含光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，和一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体。所述药物组合物也可以包括一种或多种进一步增强其药理学性质的助剂。合适的助剂包括但不限于：离子洗涤剂、脂质和类固醇。离子洗涤剂的实例包括C6-19脂肪酸及其盐，例如癸酸、十一烷酸、月桂酸、癸酸钾、十一烷酸钾、月桂酸钾、癸酸钠、十一烷酸钠和月桂酸钠；和C8-18烷基硫酸盐，包括十二烷基硫酸钠和十二烷基硫酸钾。脂质的实施例包括磷脂类，例如磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇；糖脂例如神经节苷脂(ganglisoide)；和神经鞘脂类，例如鞘磷脂。类固醇类的实例包括硬脂酰胺、胆固醇；胆甾烷醇、胆烷酸、菠菜甾醇和α，β，γ-sisterol。
在另一实施方案中，所述药物组合物以肠胃外施用至个体的剂型提供，其包含光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，和一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体。所述药物组合物也可以包含一种或多种如本发明描述的进一步增强其药理学特性的助剂。
在另一实施方案中，所述药物组合物以表面施用至个体的剂型提供，其包含光学活性(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药，和一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体。所述药物组合物也可以包含一种或多种如本发明描述的进一步增强其药理学特性的助剂。
本发明提供的药物组合物可以一次性施用，或者按时间间隔多次给药，应当理解，精确剂量和治疗的持续时间可以随待治疗患者的年龄、体重和病症而变化，并可以使用已知的试验设计或根据体内或体外试验或诊断数据外推确定。应进一步理解，对于任何具体的个体，特定剂量方案应当根据个体需要和施用或监督施用所述制剂的人员的专业判断随时调整。
A.口服施用
本发明提供的药物组合物可以以口服施用的固体、半固体或液体剂型提供。如本发明使用的，口服施用还包括含服、舌面和舌下施用。合适的口服剂型包括但不限于：片剂、胶囊、丸剂、糖锭剂、锭剂、软锭剂、扁囊剂、小球、加药口香糖、颗粒剂、散装粉末剂、泡腾或非泡腾粉剂或颗粒剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、溶液剂、糯米纸囊剂、撒剂、酏剂和糖浆剂。除了活性成分之外，药物组合物可以包含一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂，其包括但不限于：粘合剂、填充剂、稀释剂、崩解剂、润湿剂、润滑剂、助流剂、着色剂、染料迁移抑制剂、甜味剂和调味剂。
粘合剂或造粒剂赋予片剂粘性，以保护片剂在压制后保持完整。合适的粘合剂或造粒剂包括但不限于：淀粉例如玉米淀粉、马铃薯淀粉和预胶化淀粉(例如STARCH 1500)；明胶；糖类，例如蔗糖、葡萄糖、葡萄糖、糖蜜和乳糖；天然树胶和合成树胶，例如阿拉伯胶、海藻酸、海藻酸盐、鹿角菜的提取物、Panwar gum、印度树胶、mucilage of isabgol husks、羧甲基纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、硅酸铝镁盐(Veegum)、落叶松阿拉伯半乳聚糖、粉状西黄蓍胶和瓜尔胶；纤维素，例如乙基纤维素、醋酸纤维素、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟乙基纤维素(HEC)、羟丙基纤维素(HPC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)；微晶纤维素，例如AVICEL-PH-101、AVICEL-PH-103、AVICEL RC-581、AVICEL-PH-105(FMC Corp.，Marcus Hook，PA)；及其混合物。合适的填充剂包括但不限于：滑石、碳酸钙、微晶纤维素、粉末状纤维素、葡聚糖结合剂、高岭土、甘露醇、硅酸、山梨醇、淀粉、预胶化淀粉及其混合物。所述粘合剂或填充剂在本发明提供的药物组合物中的存在量可以为约50至约99％重量。
合适的稀释剂包括但不限于：磷酸二钙、硫酸钙、乳糖、山梨醇、蔗糖、肌醇、纤维素、高岭土、甘露醇、氯化钠、无水淀粉和粉末状糖。某些稀释剂例如甘露醇、乳糖、山梨醇、蔗糖和肌醇，当以足量存在时，可以赋予某些压制片以通过咀嚼从而在口腔中发生崩解的性质。这样的压制片可以用作咀嚼片。
合适的崩解剂包括但不限于：琼脂；膨润土；纤维素，例如甲基纤维素和羧甲基纤维素；木制品；天然海绵；阳离子交换树脂；海藻酸；树胶，例如瓜尔胶和Veegum HV；桔浆；交联纤维素，例如交联羧甲纤维素；交联聚合物，例如交聚维酮；交联淀粉；碳酸钙；微晶纤维素，例如淀粉羟乙酸钠；聚克立林钾；淀粉，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉和预胶化淀粉；粘土；aligns；及其混合物。崩解剂在本发明提供的药物组合物中的含量根据制剂的类型变化，并且其是本领域普通技术人员容易判断的。本发明提供的药物组合物可以包含约0.5至约15％，或约1至约5％重量的崩解剂。
合适的润滑剂包括但不限于：硬脂酸钙；硬脂酸镁；矿物油；轻质矿物油；甘油；山梨醇；甘露醇；二醇，例如山萮酸甘油酯和聚乙二醇(PEG)；硬脂酸；十二烷基硫酸钠；滑石；氢化植物油，包括花生油、棉籽油、葵花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；硬脂酸锌；油酸乙酯；月桂酸乙酯；琼脂；淀粉；石松子；二氧化硅或二氧化硅凝胶剂，例如200(W.R.Grace Co.，Baltimore，MD)和CAB-O-S(Cabot Co.of Boston，MA)；及其混合物。本发明提供的药物组合物可以包含约0.1至约5％重量的润滑剂。
合适的助流剂包括胶态二氧化硅、CAB-O-(Cabot Co.of Boston，MA)和不含石棉的滑石。着色剂包括任何批准的、证实的、混悬在氧化铝水合物上的水溶性的FD&C染料，和水不溶性的FD&C染料，和色淀及其混合物。色淀为水溶性染料吸附至重金属水合氧化物上，得到不溶性形式的染料的组合。调味剂包括从植物，例如果实提取的天然调味剂，和得到令人愉快的味觉的化合物例如薄荷和水杨酸甲酯的合成性混合物。甜味剂包括蔗糖、乳糖、甘露醇、果汁、甘油和人工甜味料，糖精和阿司帕坦。合适的乳化剂包括明胶、阿拉伯胶、西黄蓍胶、膨润土和表面活性剂，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(20)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯80(80)和油酸三乙醇胺酯。悬浮剂和分散剂包括羧甲基纤维素钠、果胶、西黄蓍胶、硅酸铝镁、阿拉伯胶、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。防腐剂包括甘油、尼泊金甲酯和尼泊金丙酯、苯甲酸、苯甲酸钠和醇。润湿剂包括单硬脂酸丙二醇酯、脱水山梨糖醇单油酸酯、单月桂酸二甘醇酯和聚氧乙烯月桂醚。溶剂包括甘油、山梨醇、乙醇和果汁。在乳剂中使用的非水液体的实例包括矿物油和棉籽油。有机酸包括柠檬酸和酒石酸。二氧化碳的来源包括碳酸氢钠和碳酸钠。
应当理解许多载体和赋形剂可以起多种功能作用，甚至在相同的制剂中。
[本发明提供的药物组合物可以以压制片、研磨片、可咀嚼锭剂、速溶片、多层压制片或肠包衣片、糖包衣或膜包衣片提供。肠包衣片为用物质包衣的压制片，所述物质能抗胃酸作用但在肠中溶解或崩解，从而保护活性成分免于胃酸环境的破坏。肠包衣包括但不限于：脂肪酸、脂质、水杨酸苯酯、蜡、紫胶、含氨紫胶和醋酸纤维素对苯二甲酸酯。糖衣片为被糖衣包裹的压制片，所述糖衣在掩蔽令人不愉快的味道或气味方面和在保护片剂免于氧化方面有利。膜包衣片为用水溶性物质的薄层层覆盖的压制片。膜包衣包括但不限于：羟乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙二醇4000和醋酞纤维素对苯二甲酸酯。膜包衣赋予与糖衣相同的一般特性。多层压制片为通过超过一次压制循环制备的压制片，包括层压片和压制包衣或干包衣片。
所述片剂剂型可以由单独的粉末、结晶或颗粒形式的活性成分或者与一种或多种本发明描述的载体或赋形剂的组合来制备，所述载体或赋形剂包括粘合剂、崩解剂、控制释放聚合物、润滑剂、稀释剂和/或着色剂。调味剂和甜味剂特别地用于形成咀嚼片和锭剂。
本发明提供的药物组合物可以以软胶囊或硬胶囊提供，所述胶囊可以由明胶、甲基纤维素、淀粉或海藻酸钙制备。硬明胶胶囊也称为干填充的胶囊(DFC)，其由两部分组成，一部分套在另一部分上，从而完全包围了活性成分。软弹性胶囊(SEC)是一种软的、小球状壳，例如明胶壳，其中通过加入甘油、山梨醇或类似多元醇来增塑。所述软明胶壳可以包含防腐剂来防止微生物生长。合适的防腐剂为如本发明描述的那些，包括对羟基苯甲酸甲酯和丙酯，及山梨酸。本发明提供的液体、半固体和固体剂型可以包囊在胶囊中。合适的液体和半固体剂型包括在碳酸丙烯酯、植物油或甘油三酯中的溶液剂和混悬剂。包含这样的溶液的胶囊可以如在美国专利号4,328,245；4,409,239；和4,410,545中描述的制备。所述胶囊也可以如本领域技术人员已知的进行包衣，以改善或延缓活性成分的溶出。
本发明提供的药物组合物可以以液体和半固体剂型提供，所述剂型包括乳剂、溶液剂、混悬剂、酏剂和糖浆剂。乳剂为其中一种液体以小球形式分散在另一种液体中的二相系统，其可以是水包油型或油包水型。乳剂可以包括药学上可接受的非水液体或溶剂、乳化剂和防腐剂。混悬剂可以包括药学上可接受的悬浮剂和防腐剂。含水醇溶液可以包括药学上可接受的缩醛，例如低级烷基醛的二(低级烷基)缩醛(术语“低级”指具有1至6个碳原子的烷基)，例如乙醛二乙基缩醛；和具有一个或多个羟基的水可混溶溶剂，例如丙二醇和乙醇。酏剂是澄清的、甜味的含水醇溶液。糖浆剂为糖例如蔗糖的浓的水溶液，并且可以包含防腐剂。对于液体剂型，例如。在聚乙二醇中的溶液剂可以用足量的药学上可接受的液体载体例如水稀释，以方便地测量用于给药。
其它有用的液体和半固体剂型包括但不限于：包含本发明提供的活性成分和二烃基化单-或聚-烷撑二醇的那些剂型，所述单-或聚-烷撑二醇包括1，2-二甲氧基甲烷、二甘醇二甲醚、三甘醇二甲醚、四乙醇二甘醚、聚乙二醇-350-二甲醚、聚乙二醇-550-二甲醚、聚乙二醇-750-二甲醚，其中350、550和750指聚乙二醇的近似平均分子量。这些制剂可以进一步包含一种或多种抗氧剂，例如丁基化羟基甲苯(BHT)、丁羟茴醚(BHA)、没食子酸丙酯、维生素E、氢醌、羟基香豆素、乙醇胺、卵磷脂、脑磷脂、抗坏血酸、苹果酸、山梨醇、磷酸、亚硫酸氢盐、焦亚硫酸钠、硫代二丙酸及其酯、和二硫代氨基甲酸盐。
本发明提供的用于口服施用的药物组合物还可以以脂质体、胶束、微球或纳米系统的形式提供。Miccellar剂型可以如在美国专利号6,350,458中描述的制备。
本发明提供的药物组合物可以以非泡腾的或泡腾的颗粒剂和粉剂提供，其可重构形成液体剂型。在非泡腾颗粒剂或粉剂中使用的药学上可接受的载体和赋形剂可以包括稀释剂、甜味剂和润湿剂。在泡腾颗粒剂或粉剂中使用的药学上可接受的载体和赋形剂可以包括有机酸和二氧化碳源。
在所有上述剂型中可以使用着色剂和调味剂。
本发明提供的药物组合物可以配制成立即释放或改性释放剂型，包括延迟-、缓释-、脉冲-、控制-、靶向-和程序化-释放形式。
本发明提供的药物组合物可以与不会损害期望的治疗作用的其它活性成分共同配制，或者与补充期望作用的物质，例如抗酸剂、质子泵抑制剂和H2-受体拮抗剂共同配制。
B.肠胃外给药
本发明提供的药物组合物可以通过注射、输注或植入肠胃外施用，用于局部或全身施用。如本发明使用的肠胃外施用包括静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、尿道内、胸骨内、颅内、肌内、滑膜内和皮下施用。
本发明提供的药物组合物可以配制成适于肠胃外施用的任何剂型，包括溶液剂、混悬剂、乳剂、胶束、脂质体、微球、纳米系统和适于在注射剂前在液体中制成溶液或悬浮液的固体形式。这样的剂型可以以药物科学领域的技术人员已知的常规方法制备(参见Remington：The Science andPractice of Pharmacy，同上)。
预期用于肠胃外施用的药物组合物可以包含一种或多种药学上可接受的载体和赋形剂，包括但不限于：水性赋形剂、水可溶混赋形剂、非水性赋形剂、抗微生物剂或抗微生物生长的防腐剂、稳定剂、溶解增强剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧剂、局部麻醉剂、助悬剂和分散剂、湿润剂或乳化剂、络合剂、多价螯合剂(sequestering agent)或螯合剂、防冻剂、冷冻保护剂、增稠剂、pH调节剂和惰性气体。
合适的水性赋形剂包括但不限于：水、盐水、生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)、氯化钠注射液、Ringers注射液、等渗葡萄糖注射液、无菌水注射液、葡萄糖和乳酸化的Ringers注射液。非水性赋形剂包括但不限于：植物来源的非挥发油、蓖麻油、玉米油、棉籽油、橄榄油、花生油、薄荷油、红花油、芝麻油、豆油、氢化植物油、氢化豆油和椰子油的中链甘油三酯、及棕榈种子油。水可溶混赋形剂包括但不限于：乙醇、1，3-丁二醇、液体聚乙二醇(例如聚乙二醇300和聚乙二醇400)、丙二醇、甘油、N-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基乙酰胺和二甲亚砜。
合适的抗微生物剂或防腐剂包括但不限于：苯酚、甲酚、汞剂、苯甲醇、氯代丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵、苄索氯铵、尼泊金甲酯和尼泊金丙酯及山梨酸。合适的等渗剂包括但不限于：氯化钠、甘油和葡萄糖。合适的缓冲剂包括但不限于：磷酸盐和柠檬酸盐。合适的抗氧剂为如本发明描述的那些，包括亚硫酸氢盐和焦亚硫酸钠。合适的局部麻醉剂包括但不限于：盐酸普鲁卡因。合适的助悬剂和分散剂为如本发明描述的那些，包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。合适的乳化剂包括本发明描述的那些，包括聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯80和油酸三乙醇胺酯。合适的多价螯合剂或螯合剂包括但不限于：EDTA。合适的pH调节剂包括但不限于：氢氧化钠、盐酸、柠檬酸和乳酸。合适的络合剂包括但不限于：环糊精，包括α-环糊精、β-环糊精、羟丙基-β-环糊精、磺基丁基醚-β-环糊精和磺基丁基醚7-β-环糊精(CyDex，Lenexa，KS)。
本发明提供的药物组合物可以配制用于单剂量或多剂量施用。所述单剂量制剂包装在安瓿、小瓶或注射器中。所述多剂量肠胃外制剂必须包含抑菌或抑真菌浓度的抗微生物剂。如本领域已知和实践的，所有的肠胃外制剂都必须是无菌的。
在一实施方案中，所述药物组合物以即用无菌溶液提供。在另一实施方案中，所述药物组合物以无菌无水可溶性产品提供，包括冷冻干燥粉末和皮下注射片剂，在使用前用赋形剂重构。在另一实施方案中，所述药物组合物以即用无菌混悬剂提供。在另一实施方案中，所述药物组合物以无菌无水不溶性产品提供，在使用前用赋形剂重构。在另一实施方案中，所述药物组合物以即用无菌乳剂提供。
本发明提供的药物组合物可以配制成立即释放或改性释放剂型，包括延迟-、缓释-、脉冲-、控制-、靶向-和程序化-释放形式。
所述药物组合物可以配制成混悬剂、固体、半固体或触变液体，用于作为植入的贮库施用。在一实施方案中，本发明提供的药物组合物分散在固体内部基质中，其被外部聚合膜所包围，所述外部聚合膜不溶于体液中，但是允许药物组合物中的活性成分扩散通过。
合适的内部基质包括聚甲基丙烯酸甲酯、聚丁基丙烯酸甲酯、增塑的或未增塑的聚氯乙烯、增塑的尼龙、增塑的聚对苯二甲酸乙酯、天然橡胶、聚异戊二烯、聚异丁烯、聚丁二烯、聚乙烯、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、硅酮橡胶、聚二甲硅氧烷、硅酮碳酸酯共聚物、亲水性聚合物例如丙烯酸和甲基丙烯酸的酯的水凝胶、胶原、交联聚乙烯醇及交联的部分水解的聚乙酸乙烯酯。
合适的外部聚合膜包括聚乙烯、聚丙烯、乙烯/丙烯共聚物、乙烯/丙烯酸乙酯共聚物、乙烯/乙烯基乙酸酯共聚物、硅酮橡胶、聚二甲基硅氧烷、氯丁橡胶、氯化聚乙烯、聚氯乙烯、氯化乙烯与乙酸乙烯酯的共聚物、偏二氯乙烯、乙烯和丙烯、离子交联聚合物聚对苯二甲酸乙二酯、丁基橡胶氯醇橡胶、乙烯/乙烯醇共聚物、乙烯/乙酸乙烯酯/乙烯醇三聚物和乙烯/乙烯氧基乙醇共聚物。
C.表面施用
本发明提供的药物组合物可以表面施用于皮肤、腔或粘膜。如本发明使用的表面施用包括皮肤(皮内)、结膜、角膜内、眼内、眼眶、耳、透皮、鼻腔、阴道、尿道、呼吸道和直肠施用。
本发明提供的药物组合物可以配制成适于表面施用以获得作用或全身作用的任何剂型，包括乳剂、溶液剂、混悬剂、乳膏剂、凝胶剂、水凝胶、软膏剂、扑粉、敷料、酏剂、洗剂、混悬剂、酊剂、糊剂、泡沫剂、膜剂、气雾剂、冲洗剂、喷雾剂、栓剂、绑带、皮肤贴剂。本发明提供的药物组合物的表面制剂还可以包括脂质体、胶束、微球、纳米系统及其混合物。
适用于本发明提供的表面制剂的药学上可接受的载体和赋形剂包括但不限于：水性赋形剂、水可溶混赋形剂、非水性赋形剂、抗微生物剂或抗微生物生长的防腐剂、稳定剂、溶解增强剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧剂、局部麻醉剂、助悬剂和分散剂、湿润剂或乳化剂、络合剂、多价螯合剂或螯合剂、渗透促进剂、低温保护剂(cryopretectants)、冷冻保护剂、增稠剂和惰性气体。
所述药物组合物也可以通过电穿孔、离子电渗疗法、超声透入疗法、超声促渗和显微针或无针注射表面施用，例如POWDERJECTTM(ChironCorp.，Emeryville，CA)，and BIOJECTTM(Bioject Medical Technologies Inc.，Tualatin，OR)。
本发明提供的药物组合物可以以软膏剂、乳膏剂和凝胶剂的形式提供。合适的软膏剂赋形剂包括油脂性基质或烃基基质，包括猪脂、安息香豚脂、橄榄油、棉籽油、白凡士林及液体石腊和聚乙烯的复合软膏基质(plastibase)；可乳化基质或可吸收基质，例如亲水性凡士林、硫酸羟基硬脂精和无水羊毛脂；水可除去性基质，例如亲水性软膏；水溶性软膏基质，包括不同分子量的聚乙二醇；乳剂基质，油包水(W/O)型乳剂或水包油型(O/W)乳剂，包括鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯、羊毛脂和硬脂酸(参见Remington：The Science and Practice of Pharmacy，同上)。这些赋形剂为软化剂，但通常需要加入抗氧剂和防腐剂。
合适的乳膏剂基质可以为水包油型或油包水型。乳膏剂赋形剂可以是水可洗除型，并且包含油相、乳化剂和水相。油相也称为“内”相，其通常由凡士林和脂肪醇例如鲸蜡醇或硬脂醇组成。尽管不一定，但水相的体积通常高于油相，并且通常包含湿润剂。在乳膏剂中的乳化剂可以是非离子的、阴离子的、阳离子的或两性的表面活性剂。
胶剂为半固体、悬浮类型的系统。单相凝胶剂包含基本上均匀分布在液体载体中的有机高分子。合适的胶凝剂包括交联丙烯酸聚合物，例如卡波姆、羧基聚亚烷基、Carbopol(R)；亲水性聚合物，例如聚氧化乙烯、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物和聚乙烯醇；纤维素聚合物，例如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯和甲基纤维素；树胶，例如西黄蓍胶和黄原胶；海藻酸钠；和明胶。为了制备均匀的凝胶剂，可以加入分散剂例如醇或甘油，或者可以通过研磨、机械搅拌和/或搅拌将胶凝剂分散在其中。
本发明提供的药物组合物可以以栓剂、阴道栓、杆剂(bougies)、泥敷剂或泥罨剂、糊剂、粉剂、敷料、乳膏剂、硬膏剂、避孕剂、软膏剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、卫生棉条、凝胶剂、泡沫剂、喷雾剂或灌肠剂提供，经直肠、尿道、阴道或阴道周围给药。这些剂型可以使用常规方法制备，所述方法如在Remington：The Science and Practice of Pharmacy(同上)中描述的。
直肠、尿道和阴道栓剂为用于插入人体腔孔(body orifices)中的固体，其在常温下是固体，但是在体温下熔融或软化将活性成分释放到腔孔内。在直肠和阴道栓剂中使用的药学上可接受的载体包括赋形剂，例如硬化剂，当与本发明提供的药物组合物配制时，其产生接近体温的熔点；和如本发明描述的抗氧剂，包括亚硫酸氢盐和焦亚硫酸钠。合适的赋形剂包括但不限于：可可脂(可可油)、甘油-明胶、聚乙二醇(聚氧乙二醇)、鲸蜡、石蜡、白蜡和黄蜡，和合适的脂肪酸的甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯的混合物、水凝胶例如聚乙烯醇、甲基丙烯酸羟乙酯、聚丙烯酸；甘油胶。可以使用多种赋形剂的组合。直肠和阴道栓剂可以通过压制方法或模压法制备。直肠和阴道栓剂的典型的重量为约2至3g。
本发明提供的药物组合物可以以溶液剂、混悬剂、软膏剂、乳剂、形成凝胶的溶液剂、形成溶液的粉剂、凝胶剂、眼用嵌入剂和植入物的形式眼内给药。
本发明提供的药物组合物可以经鼻内或吸入至呼吸道给药。所述药物组合物可以以单独的气雾剂或溶液剂或者与合适的推进剂的组合的形式提供，其使用加压容器、泵、喷雾器、雾化器例如使用电水动力产生微小烟雾的雾化器或喷洒器递送，所述推进剂例如1，1，1，2-四氟代乙烷或1，1，1，2，3，3，3-七氟代丙烷。所述药物组合物还可以以用于吹入的单独干粉剂或与惰性载体例如乳糖或磷脂的组合及滴鼻剂提供。对于鼻内使用，所述粉剂可以包含生物粘附剂，包括壳聚糖或环糊精。
在加压容器、泵、喷雾剂、雾化器或喷酒器中使用的溶液剂或混悬剂可以配制为包含乙醇、含水乙醇或用于分散、增溶或延长本发明提供的活性成分释放的合适的可代替试剂、推进剂如溶剂；和/或表面活性剂，例如脱水山梨糖醇三油酸酯、油酸或低聚乳酸(oligolactic acid)。
本发明提供的药物组合物可以微粉化至适于吸入递送的粒径，例如50微米或更小，或10微米或更小。这样粒径的颗粒可以使用本领域技术人员已知的粉末化方法制备，所述方法例如螺旋喷射研磨、流化床喷射研磨、形成纳米颗粒的超临界流体处理、高压匀浆化或喷雾干燥。
用于吸入器或吹入器的胶囊、泡罩和药筒可以配制成包含本发明提供的药物组合物的粉末混合物；合适的粉末状基质，例如乳糖或淀粉；和功能调节剂，例如1-亮氨酸、甘露醇或硬脂酸镁。乳糖可以是无水的或一水合物的形式。其它合适的赋形剂包括葡聚糖、葡萄糖、麦芽糖、山梨醇、木糖醇、果糖、蔗糖和海藻糖。本发明提供的用于吸入/鼻内给药的药物组合物可以进一步包括合适的调味剂，例如薄荷醇和左薄荷脑，或甜味剂，例如糖精或糖精钠。
本发明提供的用于表面施用的药物组合物可以配制成立即释放或改性释放形式，包括延迟-、缓释-、脉冲-、控制-、靶向-和程序化-释放形式。
D.改性释放
本发明提供的药物组合物可以配制成改性释放剂型。如本发明使用的术语“改性释放”指当通过相同的途径施用时，活性成分的释放速率和位点与立即释放剂型不同的剂型。改性释放剂型包括延迟-、延缓-、延长-缓释-、脉动-或脉冲-、控制-、促进-和快速-、靶向-、程序化-释放和胃滞留剂型。改性释放剂型中的药物组合物可以使用本领域技术人员多种改性释放装置和方法制备，所述装置和方法包括但不限于：基质控释装置、渗透控释装置、多颗粒控释装置、离子交换树脂、肠包衣、多层包衣、微球、脂质体及其组合。活性成分的释放速率也可以通过改变颗粒粒径和活性成分的多形性(polymorphorism)来调整。
改性释放的实例包括但不限于：，描述在美国专利号3,845,770、3,916,899、3,536,809、3,598,123、4,008,719、5,674,533、5,059,595、5,591,767、5,120,548、5,073,543、5,639,476、5,354,556、5,639,480、5,733,566、5,739,108、5,891,474、5,922,356、5,972,891、5,980,945、5,993,855、6,045,830、6,087,324、6,113,943、6,197,350、6,248,363、6,264,970、6,267,981、6,376,461、6,419,961、6,589,548、6,613,358；和6,699,500中的那些。
1.基质控释装置
本发明提供的改性释放剂型中的药物组合物可以使用本领域技术人员已知的基质控释装置制备(参见，Takada等人的“Encyclopedia of ControlledDrug Delivery，”第2卷，Mathiowitz编辑，Wiley，1999)。
在一实施方案中，本发明提供的改性释放剂型的药物组合物是使用可侵蚀性基质装置配制的，其为水可膨胀性、可侵蚀性或可溶性聚合物，包括天然存在的聚合物和衍生物，例如多糖和蛋白质。
用于形成可侵蚀性基质的物质包括但不限于：壳多糖、壳聚糖、葡聚糖和支链淀粉；琼脂胶(gum agar)、阿拉伯胶、梧桐胶、豆角胶、黄蓍树胶、角叉菜胶、印度胶、瓜尔胶、黄原胶和硬葡聚糖；淀粉，例如糊精和麦芽糖糊精；亲水胶体，例如果胶；磷脂，例如卵磷脂；海藻酸盐；藻酸丙二醇酯；明胶；胶原；和纤维素，例如乙基纤维素(EC)、甲基乙基纤维素(MEC)、羧甲基纤维素(CMC)、CMEC、羟乙基纤维素(HEC)、羟丙基纤维素(HPC)、醋酸纤维素(CA)、丙酸纤维素(CP)、丁酸纤维素(CB)、乙酸丁酸纤维素(CAB)、CAP、CAT、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、HPMCP、HPMCAS、羟丙基甲基纤维素乙酸偏苯三酸酯(HPMCAT)和乙基羟基乙基纤维素(EHEC)；聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯醇；聚乙酸乙烯酯；脂肪酸甘油酯；聚丙烯酰胺；聚丙烯酸；乙基丙烯酸或甲基丙烯酸的共聚物(Rohm America，Inc.，Piscataway，NJ)；聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)；聚交酯；L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸酯的共聚物；可降解的乳酸-乙醇酸共聚物；聚-D-(-)-3-羟基丁酸；及其它丙烯酸衍生物，例如甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、丙烯酸乙酯、(2-二甲基氨基乙基)甲基丙烯酸酯和(三甲基氨乙基)甲基丙烯酸酯氯化物的均聚物和共聚物。
在另一实施方案中，所述药物组合物用非可侵蚀性基质装置配制。活性成分溶解或分散在惰性的基质中，一旦施用，其主要通过扩散穿过惰性基质来释放。适于作为非可侵蚀性基质装置的物质包括但不限于：不溶性塑料，例如聚乙烯、聚丙烯、聚异戊二烯、聚异丁烯、聚丁二烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丁基丙烯酸甲酯、氯化聚乙烯、聚氯乙烯、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸甲酯共聚物、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、乙烯/丙烯共聚物、乙烯/丙烯酸乙酯共聚物、氯化乙烯与乙酸乙烯酯的共聚物、偏二氯乙烯、乙烯和丙烯、离子交联聚合物聚对苯二甲酸乙二醇酯、丁基橡胶氯醇橡胶、乙烯/乙烯醇共聚物、乙烯/乙酸乙烯酯/乙烯醇三元共聚物和乙烯/乙烯氧基乙醇共聚物、聚氯乙烯、增塑的尼龙、增塑的聚对苯二甲酸乙酯、天然橡胶、硅酮橡胶、聚二甲硅氧烷、硅氧烷碳酸酯共聚物，和；亲水性聚合物，例如乙基纤维素、醋酸纤维素、交聚维酮和交联的部分水解的聚乙酸乙烯酯；和脂肪族化合物，例如棕榈蜡(camauba wax)、微晶蜡和甘油三酯。
在基质控释系统中，例如，所期望的释放动力学可以通过以下因素来控制：所采用的聚合物类型、聚合物粘度、聚合物和/或活性成分的颗粒粒径、活性成分与聚合物的比例以及组合物中的其它赋形剂。
本发明提供的改性释放剂型的药物组合物可以通过本领域技术人员已知的方法制备，所述方法包括直接压片、干法制粒或湿法粒法之后压制、熔融制粒之后压制。
2.渗透控释装置
本发明提供的改性释放剂型的药物组合物可以使用渗透控释装置制备，所述渗透控释装置包括一室系统、两室系统、非对称膜技术(AMT)和挤压核芯系统(extruding core system)(ECS)。通常，这样的装置具有至少两个部分：(a)核芯，其包含活性成分；和(b)具有至少一个递送口(port)的半透薄膜，其包裹所述核芯。所述半透薄膜控制水从所用的水相环境中流入所述核芯，使得药物经挤压穿过递送口释放。
除了活性成分之外，所述渗透装置的核芯任选地包含渗透剂，其产生用于将水从应用环境中转运到装置核芯的驱动力。一种类型的渗透剂为水可膨胀的亲水性聚合物，其为称为“渗透性聚合物”和“水凝胶”，包括但不限于：亲水性乙烯和丙烯聚合物、多糖例如海藻酸钙、聚氧化乙烯(PEO)、聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、聚(2-甲基丙烯酸羟乙酯)、聚(丙烯)酸、聚(甲基丙烯)酸、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、交联PVP、聚乙烯醇(PVA)、PVA/PVP共聚物、PVA/PVP与疏水性单体例如甲基丙烯酸甲酯和乙酸乙烯酯的共聚物、包含大的PEO嵌段的亲水性聚氨酯、交联羧甲纤维素钠、角叉菜胶、羟乙基纤维素(HEC)、羟丙基纤维素(HPC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羧甲基纤维素(CMC)和羧乙基纤维素(CEC)、海藻酸钠、聚卡波非、明胶、黄原胶和淀粉羟乙酸钠。
另一种类型的渗透剂为osmogen，其能够吸收水而影响穿过周围包衣屏障的渗透压梯度。合适的osmogen包括但不限于：无机盐，例如硫酸镁、氯化镁、氯化钙、氯化钠、氯化锂、硫酸钾、磷酸钾、碳酸钠、亚硫酸钠、硫酸锂、氯化钾和硫酸钠；糖类，例如葡萄糖、果糖、葡萄糖、肌醇、乳糖、麦芽糖、甘露醇、棉子糖、山梨醇、蔗糖、海藻糖和木糖醇；有机酸，例如抗坏血酸、苯甲酸、富马酸、柠檬酸、马来酸、癸二酸、山梨酸、己二酸、乙二胺四乙酸、谷氨酸、对甲苯磺酸、琥珀酸和酒石酸；脲；及其混合物。
可以采用不同溶出速率的渗透剂以影响活性成分最初以什么速度从剂型中释放。例如非晶形糖，例如Mannogeme EZ(SPI Pharma，Lewes，DE)可用于提供在第一个小时期间更快地递送，以迅速地产生期望的治疗效果，和经长期的时间，逐渐连续地释放剩余量，以保持治疗或预防作用的期望水平。在这种情况下，活性成分按代替代谢和排泄的活性成分的量的速率释放。
所述核芯也可包括多种如本发明描述的其它赋形剂和载体，以增强所述剂型的性能或提高稳定性或易加工性。
用于形成半透膜的物质包括各种等级的丙烯、乙烯、醚、聚酰胺、聚酯和纤维素衍生物，所述纤维素衍生物在生理学相应pH下为水可渗透的和水不溶性的，或者可以通过化学改变例如交联成为水不溶性。用于形成所述包衣的合适的聚合物的实例包括增塑的、未增塑的和强化的醋酸纤维素(CA)、纤维素二醋酸酯、三醋酸纤维素、CA丙酸酯、硝酸纤维素、醋酸纤维素丁酸酯(CAB)、CA氨基甲酸乙酯、CAP、CA氨基甲酸甲酯、CA琥珀酸酯、醋酸纤维素偏苯三酸酯(CAT)、CA二甲基氨基醋酸酯、CA碳酸乙酯、CA氯乙酸酯、CA草酸乙酯、CA磺酸甲酯、CA磺酸丁酯、CA对-甲苯磺酸酯、琼脂乙酸酯、直链淀粉三醋酸酯、β葡聚糖乙酸酯、β葡聚糖三乙酸酯、乙醛二甲基乙酸酯、豆角胶的三乙酸酯、羟基化乙烯-乙烯基乙酸酯、EC、PEG、PPG、PEG/PPG共聚物、PVP、HEC、HPC、CMC、CMEC、HPMC、HPMCP、HPMCAS、HPMCAT、聚(丙烯)酸与聚(甲基丙烯)酸和酯的酯及其共聚物、淀粉、葡聚糖、糊精、壳聚糖、胶原、明胶、聚烯烃、聚醚、聚砜、聚醚砜、聚苯乙烯、聚乙烯卤化物、聚乙烯酯和醚、天然蜡和合成蜡。
半透膜也可以是疏水性微孔膜，其中孔基本上被气体充满，并且没有被水介质润湿，但是其是水蒸汽可渗透的，如在美国专利号5,798,119中公开的。这样的疏水但水蒸汽可渗透的膜典型地由疏水性聚合物组合，所述疏水性聚合物例如聚烯烃、聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯酸衍生物、聚醚、聚砜、聚醚砜、聚苯乙烯、聚乙烯卤化物、聚偏二氟乙烯、聚乙烯酯和醚、天然蜡和合成蜡。
半透膜上的递送口可以在完成包衣后通过机械打孔或激光打孔形成。递送口也可以通过水溶性物质填料的腐蚀，或者通过核芯凹陷较薄的膜部分裂开而原位形成。另外，递送口可以是在进行包衣过程中形成，如在美国专利号5,612,059和5,698,220中公开类型的不对称膜包衣的情况下形成。
释放的活性成分的总量和释放速率基本上可以经由半透膜的厚度和孔隙率、核芯的组分以及递送口的数量、尺寸和位置调节。
在渗透控释剂型中的药物组合物可以进一步包含另外的如本发明描述的常规赋形剂，以提高制剂的性能或加工性。
所述渗透控释剂型可以根据本领域技术人员已知的常规方法和技术制备(参见，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，同上；Santus和Baker，J.Controlled Release 1995，35，1-21；Verma等人，Drug Developmentand Industrial Pharmacy 2000，26，695-708；Verma等人，J.Controlled Release2002，79，7-27)。
在某些实施方案中，本发明提供的药物组合物被配制成AMT控释剂型，其包括包裹核芯的非对称渗透膜，所述核芯包含活性成分及其它药学上可接受的赋形剂。参见，美国专利号5,612,059和WO 2002/17918。所述AMT控释剂型可以根据本领域技术人员已知的常规方法和技术制备，所述常规方法和技术包括直接压片、干法制粒、湿法制粒和浸渍包衣方法。
在某些实施方案中，本发明提供的药物组合物被配制成ESC控释剂型，其包括包衣核芯的渗透膜，所述核芯包含活性成分、羟乙基纤维素及其它药学上可接受的赋形剂。
3.多颗粒控释装置
本发明提供的改性释放剂型中的药物组合物可以被制备成多颗粒控释装置，其包括大量微粒、颗粒或丸剂，直径为约10μm至约3mm、约50μm至约2.5mm或约100μm至1mm。这样的多颗粒可以通过本领域技术人员已知的加工方法制备，所述加工方法包括湿法制粒和干法制粒、挤压/滚圆成丸法、滚筒压缩、熔融凝固和喷雾包衣种子核芯(seed cores)。参见，例如Multiparticulate Oral Drug Delivery；Marcel Dekker：1994；和Pharmaceutical Pelletization Technology；Marcel Dekker：1989。
可以将如本发明描述的其它赋形剂与所述药物组合物混合，以帮助加工和形成所述多颗粒。得到的颗粒自身可以构成所述多颗粒状指，或者可以用多种成膜物质包衣，所述成膜物质是例如肠道聚合物、水可膨胀的和水溶性聚合物。所述多颗粒可以被进一步加工成胶囊或片剂。
4.靶向递送
本发明提供的药物组合物也可以被配制成靶至待治疗个体的特定组织、受体或身体其它区域的系统，包括脂质体-递送系统、再密封的红细胞-递送系统和抗体-基递送系统。实例包括但不限于：美国专利号6,316,652、6,274,552、6,271,359、6,253,872、6,139,865、6,131,570、6,120,751、6,071,495、6,060,082、6,048,736、6,039,975、6,004,534、5,985,307、5,972,366、5,900,252、5,840,674、5,759,542、和5,709,874。
使用方法
本发明提供一种用于治疗、预防或改善由病毒引起的疾病的方法，其包括向个体施用治疗有效量的光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。由病毒引起的疾病的实例包括但不限于：传染性软疣感染、HTLV感染、HTLV-1感染、HIV感染(AIDS)、人乳头瘤病毒感染、疱疹病毒感染、生殖器疱疹感染、病毒性痢疾、流行性感冒、麻疹、风疹、水痘、流行性腮腺炎、骨髓灰质炎、狂犬病、单核细胞增多症、埃博拉病毒感染、呼吸道合胞病毒感染、登革热、黄热病、拉沙热、沙粒体病毒感染、布尼亚病毒感染、纤丝病毒感染、黄病毒感染、汉坦病毒感染、轮状病毒感染、病毒性脑膜炎、西尼罗河热、虫媒病毒感染、副流行性感冒、天花、EB病毒感染、登革出血热、巨细胞病毒感染、婴儿巨细胞病毒感染、进行性多灶性白质脑病、病毒性胃肠炎、肝炎、感冒疮、眼部疱疹、脑膜炎、脑炎、带状疱疹、脑炎、加州血清群病毒感染、圣路易斯脑炎、裂谷热、手足口病、亨德拉病毒感染、肠道病毒感染、星状病毒、腺病毒感染、日本脑炎、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎、幼儿急疹、白蛉热、SARS、疣、猫抓病、传染性红斑综合征、羊痘、玫瑰糠疹、狂犬病毒感染、H5N1病毒感染(禽类流感)和人乳头瘤病毒感染。
本发明提供的治疗方法能够治疗的病毒的实例包括但不限于：腺病毒、虫媒病毒、沙粒病毒、星状病毒、布亚病毒、冠状病毒、柯萨奇病毒、巨细胞病毒、登革热病毒、埃博拉病毒、肠道病毒、EB病毒、黄病毒、线状病毒、H5N1病毒、亨德拉病毒、人T淋巴细胞病毒、人类免疫缺陷性病毒、人乳头瘤病毒、汉坦病毒、肝炎病毒、肝DNA病毒、疱疹病毒、单纯疱疹病毒-1、单纯疱疹病毒-2、婴儿巨细胞症病毒、流感病毒、日本脑炎病毒、JC病毒、拉沙病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、狂犬病毒(lyssavirus)、接触传染性软疣病毒、腮腺炎病毒、口疮病毒、副流感病毒、副粘病毒、副痘病毒、细小病毒、微小RNA病毒、脊髓灰质炎病毒、多瘤病毒、狂犬病毒(rabies virus)、裂谷热病毒、玫瑰疹病毒、轮状病毒、风疹病毒、天花病毒、圣路易斯脑炎病毒、水痘-带状疱疹病毒、西尼罗病毒和黄热病毒。
在一实施方案中，所述病毒为性传播的。在另一实施方案中，所述病毒为致癌病毒。在某些实施方案中，所述病毒为乳多空瘤病毒或单纯疱疹病毒。在某些实施方案中，所述乳多空瘤病毒为多形瘤病毒或乳头瘤病毒。在某些实施方案中，所述乳多空病毒为多形瘤病毒。在某些实施方案中，所述乳多空瘤病毒为乳头瘤病毒。在某些实施方案中，所述病毒为人乳头瘤病毒。在某些实施方案中，所述病毒为单纯疱疹病毒。
本发明还提供一种用于治疗、预防或改善由致癌病毒引起的疾病的一种或多种症状的方法，其包括向患有或怀疑患有这样的疾病的个体施用治疗有效量的光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。
在某些实施方案中，所述致癌病毒为性传播的。在某些实施方案中，所述致癌病毒为乳多空病毒。在某些实施方案中，所述致癌病毒为多形瘤病毒或乳头瘤病毒。在某些实施方案中，所述致癌病毒为多形瘤病毒。在某些实施方案中，所述致癌病毒为乳头瘤病毒。在某些实施方案中，所述致癌病毒为人或牛乳头瘤病毒。
在某些实施方案中，由致癌病毒引起的疾病为疣，包括但不限于：足底疣和生殖器疣；子宫颈非典型增生；复发性呼吸性乳头瘤病，包括但不限于：喉部乳头瘤；或与乳头瘤病毒感染相关的癌症，包括肛门生殖器癌，例如子宫颈癌、肛门癌和肛周癌、外阴癌、阴道癌和阴茎癌；头颈部癌，例如口腔咽部区域癌症和食道癌；和皮肤癌，例如基底细胞癌和鳞状细胞癌。
在某些实施方案中，在通过本领域已知的方法给药后第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第10天、第15天或第30天测定时，例如测定病毒滴度，相对于没有施用所述化合物的个体，施用治疗有效量光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药；或其药物组合物，使得病毒的复制减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多。
在某些实施方案中，在通过本领域已知的方法给药后第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第10天、第15天或第30天测定时，相对于没有施用所述化合物的个体，施用治疗有效量光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药；或其药物组合物，使得病毒的复制减少1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、75、100倍或更多。
在某些实施方案中，在通过本领域已知的方法给药后第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第10天、第15天或第30天测定时，相对于没有施用所述化合物的个体，施用治疗有效量光学活性(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药；或其药物组合物，使得病毒滴度降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多。
在某些实施方案中，在通过本领域已知的方法给药后第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第10天、第15天或第30天测定时，相对于没有施用所述化合物的个体，施用治疗有效量光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药；或其药物组合物，使得病毒滴度降低1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、75、100倍或更多倍。
本发明进一步提供一种用于抑制病毒复制的方法，其包括用有效量的光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药接触所述病毒。
在一实施方案中，所述病毒为性传播的。在另一实施方案中，所述病毒为致癌病毒。在某些实施方案中，所述病毒为乳多空瘤病毒或单纯疱疹病毒。在某些实施方案中，所述乳多空瘤病毒为多形瘤病毒或乳头瘤病毒。在某些实施方案中，所述乳多空瘤病毒为多形瘤病毒。在某些实施方案中，所述乳多空瘤病毒为乳头瘤病毒。在某些实施方案中，所述病毒为人乳头瘤病毒。在某些实施方案中，所述病毒为单纯疱疹病毒。
在某些实施方案中，在通过本领域已知的方法初次接触后第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第10天、第15天或第30天测定时，相对与没有这样接触的病毒，用治疗有效量的光学活性(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药；或其药物组合物接触病毒，使得病毒滴度降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多。
在某些实施方案中，在通过本领域已知的方法初次接触后第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第10天、第15天或第30天测定时，相对与没有这样接触的病毒，用治疗有效量的光学活性(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药；或其药物组合物接触病毒，使得病毒滴度降低1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、75、100倍或更多。
在某些实施方案中，在通过本领域已知的方法初次接触后第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第10天、第15天或第30天测定时，相对与没有这样接触的病毒，用治疗有效量的光学活性(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药；或其药物组合物接触病毒，使得病毒滴度降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多。
在某些实施方案中，在通过本领域已知的方法初次接触后第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第10天、第15天或第30天测定时，相对与没有这样接触的病毒，用治疗有效量光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药；或其药物组合物接触病毒，使得病毒滴度降低1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、75、100倍或更多。
本发明还提供一种用于治疗、预防或改善个体中疾病的一种或多种症状方法，其包括向患有或怀疑患有这样疾病的个体施用治疗有效量光学活性(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。
在一实施方案中，所述疾病为癌症，包括但不限于：乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、脑癌、肝癌、子宫颈癌、结肠癌、肾癌、皮肤癌、头颈部癌、骨癌、食管癌、膀胱癌、子宫癌、淋巴癌、白血病、胃癌、胰腺癌、睾丸淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
本发明提供一种抑制磷脂酶C活性的方法，其包括用光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药接触磷脂酶C。
根据待治疗的疾病和个体的状况，本发明提供的光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药可以经由口服、肠胃外(例如肌内、腹膜内、静脉内、ICV、脑池内注射或输注、皮下注射或植入)、吸入、鼻腔、阴道、直肠、舌下或表面(例如透皮或局部)施用途径给药，并且可以单独配制成合适的剂量单元，或者与适于每种施用途径的药学上可接受的载体、助剂和赋形剂一起配制。
所述剂量可以是一次、两次、三次、四次、五次、六次或更多的亚剂量，每天按合适的间隔给药。所述剂量或亚剂量可以以包含0.1至10毫克、0.1至5毫克或0.1至2毫克活性成分/剂量单元的剂量单元形式施用，或者，如果患者的病症需要，可以连续输注施用。
在某些实施方案中，合适的剂量水平为约0.001至约10mg/kg患者体重/天(mg/kg/天)、约0.01至约10mg/kg/天、约0.01至约1mg/kg/天或约0.05至约1mg/kg/天，其可以以单剂量或多剂量给药。合适的剂量水平可以为约0.001至25mg/kg/天、约0.001至10mg/kg/天、或约0.001至5mg/kg/天。在该范围内，所述剂量可以为0.001至0.005、0.005至0.05、0.05至0.5或0.5至5.0mg/kg/天。
在某些实施方案中，合适的剂量水平为约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10mg/kg/天。
试剂盒/制品
[所述光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药也可以使用本领域那些技术人员熟知的包装材料提供。参见，例如美国专利号5,323,907、5,052,558、和5,033,252。药用包装材料的实例包括但不限于：泡罩包装、瓶子、管、吸入器、泵、袋、小瓶、容器、注射器和适于选择制剂和预期给药和治疗方式的任何包装材料。
本发明还提供试剂盒，当医师使用时，其可以简化向个体施用合适量的活性成分。在某些实施方案中，本发明提供的试剂盒包括容器和光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药的剂型。
在某些实施方案中，所述光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A、或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药与如本发明描述的其它治疗剂组合给药。其它治疗剂可以或者不可以同时或按相同的施用途径给药至患者。
在某些实施方案中，所述试剂盒包括一个容器，该容器包含光学活性(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药的剂型，该容器中还包含一种或多种本发明描述的其它治疗剂。
本发明提供的试剂盒可以进一步包括用于施用活性成分的装置。这样的装置的实例包括但不限于：注射器、无针注射器滴注袋、贴剂和吸入器。本发明提供的试剂盒也可以包括给药所述活性成分的避孕套。
本发明提供的试剂盒可以进一步包括可用于施用一种或多种活性成分的药学上可接受的赋形剂。例如，如果活性成分以必须重构用于肠胃外施用的固体形式提供，则所述试剂盒可以包括合适赋形剂的密封容器，其中活性成分可以溶解形成适于肠胃外施用的无颗粒无菌溶液。药学上可接受的赋形剂的实例包括但不限于：含水赋形剂，包括但不限于：注射用水USP、氯化钠注射液、林格氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、和乳酸化林格氏注射液；水可溶混赋形剂，包括但不限于：乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇；和非含水赋形剂，包括但不限于：玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。
实施例
如本发明使用的，无论特定的缩写是否有特别的定义，在这些制备方法、方案和实施例中使用的符号和规则与在同期科学文献例如，Journal ofthe American Chemical Society或Journal of Biological Chemistry中使用的那些一致。特别地，但不限于，在实施例和整个说明书中可以使用下述缩写：g(克)；mg(毫克)；L(升)；mL(毫升)；μL(微升)；psi(磅/平方英寸)；M(摩尔浓度)；mM(毫克分子)；μM(微摩尔)；Hz(赫兹)；MHz(兆赫)；mol(摩尔)；mmol(毫摩尔)；RT(室温)；hr(小时)；min(分钟)；TLC(薄层色谱法)；mp(熔点)；RP(逆相)；T1-(保留时间)；TFA(三氟乙酸)；TEA(三乙胺)；THF(四氢呋喃)；TFAA(三氟醋酐)；CD3OD(氘代甲醇)；CDCl3(氘代氯仿)；DMSO(二甲亚砜)；SiO2(二氧化硅)；atm(大气压)；EtOAc(乙酸乙酯)；CHCl3(氯仿)；HCl(盐酸)；Ac(乙酰基)；DMF(N，N-二甲基甲酰胺)；Me(甲基)；Cs2CO3(碳酸铯)；EtOH(乙醇)；Et(乙基)；tBu(叔丁基)；MeOH(甲醇)。
对于所有下述实施例，可以使用本领域技术人员已知的标准检验和纯化方法。除非另有说明，所有的温度都以℃(摄氏度)表示。除非另有说明，所有的反应都在在室温下进行。在方案2至6中阐述的合成方法是通过具体实施例来举例说明可适用的化学方法，而并不表示本发明的范围。
实施例1
光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A的合成
光学活性(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A的钾盐的合成在方案4和5中阐述。
步骤1.在70℃下，搅拌双环戊二烯8(132.2g，1mol)和48％的氢溴酸(227mL)的混合物3小时。过滤沉淀物，并用己烷洗涤。分离有机层与水层，并用己烷进一步萃取水层。用水洗涤混合的有机层，经无水MgSO4干燥，并浓缩。在真空(12mmHg)下，于105-113℃蒸馏残余的油状物，得到呈无色油状的C-外溴代烯烃9(199.3g，93.5％)。
1H NMR(CDCl3)δ：1.30-1.65(2H，m)，1.75-2.15(5H，m)，2.25-2.35(1H，m)，2.40-2.70(2H，m)，3.95-4.05(1H，m)，5.60-5.75(1H，m)。
步骤2.向C-外-溴代烯烃9在乙酸乙酯(200mL)中的溶液中加入10％的Pd/C(2g)。在50psi氢化该混合物过夜。过滤除去催化剂，并浓缩反应溶液。在真空(12mmHg)下，于112-118℃蒸馏残余油状物，得到呈无色油状的C-外溴代烷10(196.53g，98％)。
1H NMR(CDCl3)δ：0.85-0.21(14H，m)，3.85-3.95(1H，m)。
步骤3.在室温下，向tBuOK(75.74g，0.675mol)在无水tBuOH(400mL)中的悬浮液中滴加C-外溴代烷10(96.81g，0.45mol)在无水THF(100mL)中的溶液，同时搅拌。在氩气下回流该混合物过夜。在冷却后，用水(800mL)稀释该反应混合物，并用己烷萃取。经无水MgSO4干燥混合的有机层，过滤并浓缩。在真空(15mmHg)下，于58-63℃蒸馏残余油状物，得到呈无色油状的C-外烯5(38.62，64％)。IR(纯)cm-1：2949，1471，1456，1325，693；MS(APCI)m/z：135(M+1)；1H NMR(CDCl3)δ：0.90-1.05(2H，m)，1.30-2.00(8H，m)，2.40-2.50(2H，m)，6.05-6.15(2H，m)。
步骤4.超声处理三-(双苯亚甲基丙酮)-二钯(0)(Pd2dba3)和CHCl3加合物(41mg，0.04mmol)、R-(+)-MOP(74mg，0.16mmol)和C-外烯5的混合物5分钟，接着在0℃的水浴温度，在氩气下，滴加三氯硅烷(1mL，9.6mmol)，同时搅拌。在该反应中使用的特定手性单齿膦配体具有R构型，R5为-OCH3，R6和R7为苯基。然后，在相同的温度下，搅拌该混合物过夜。通过滴加己烷稀释该反应混合物，过滤，并用己烷洗涤。浓缩混合的有机物，得到呈无色油状的粗光学活性的Si-外/C-外有机硅烷6，将其直接用于下一步中，无需进一步纯化。
步骤5.向用冰浴冷却的粗Si-外/C-外有机硅烷6、KHCO3(5.82g)和KF(2.25g)在THF(10mL)和MeOH(10mL)的混合物中滴加30％的含水H2O2(5.1mL)，同时搅拌。在搅拌过夜之后，用CHCl3萃取反应混合物。用水洗涤混合的有机层，经无水Mg2SO4干燥，过滤并浓缩。用二氧化硅层析纯化粗产物，得到呈无色油状的光学活性的(-)-O-外/C-外烷醇7(954mg，79％)。
IR(纯)cm-1：3347，2941，2861；MS(APCI)m/z：135(M+1-H2O)；HNMR(CDCl3)δ：0.85-1.05(2H，m)，1.15-1.40(5H，m)，1.50-2.00(8H，m)，3.70-3.75(1H，m)。
如下所述，通过将所述分子转化成氨基甲酸酯来测定光学活性的(-)-O-外/C-外烷醇7的对映体过量(e.e.)和外/内比例。向光学活性的(-)-O-外烷醇7(91mg，0.6mmol)在THF(5mL)中的溶液中加入3，5-二硝基苯基异氰酸酯(150mg，0.72mmol)。在室温下，搅拌该反应混合物3小时。在除去溶剂之后，用二氧化硅层析纯化残余物，得到呈浅黄色非晶形的相应氨基甲酸酯(84mg)。
HPLC(化学纯度)：99.2％；HPLC(化学纯度)：83％e.e.；MS(ESI)m/z：360(M-1)；外/内比例：大于99％。
也通过改变催化剂和其它反应条件来使非对称的氢化硅烷化反应最佳化。结果概括在表1中。
表1.非对称氢化硅烷化的最佳化
催化剂 mol％ 温度(℃) (5→6) 收率(％) (5→8) 7的光学纯度 (％e.e.) [PdCl(π-C3H5)]2 5 0 15 75 Pd2dba3·CHCl3 1 0 26 85 Pd2dba3·CHCl3 1 0 79a 83 Pd2dba3·CHCl3 1 0 31b 74 Pd2dba3·CHCl3 1 0 27c 80 Pd2dba3·CHCl3 1 20d 14a 58
催化剂 mol％ 温度(℃) (5→6) 收率(％) (5→8) 7的光学纯度 (％e.e.) Pd2dba3·CHCl3 1 -20 81a 87 Pd2dba3·CHCl3 1 -40 6a 74 Pd2dba3·CHCl3 0.5 0 16a 60
a.在加入三氯硅烷之前，超声处理Pd2dba3·CHCl3加合物、(R)-MOP和化合物5的混合物5分钟。
b.在加入化合物5之前，超声处理Pd2dba3·CHCl3加合物、(R)-MOP和三氯硅烷的混合物5分钟。
c.在加入化合物5和三氯硅烷之前，超声处理Pd2dba3·CHCl3加合物和(R)-MOP的混合物5分钟，并除去溶剂。
d.在加入三氯硅烷之后，内部温度上升至超过三氯硅烷的沸点。
步骤6.向冰浴冷却的光学活性的(-)-O-外/C-外烷醇7(79.5mg，0.52mmol，78％e.e.)在无水THF(2mL)中的溶液中加入tBuOK(53mg，0.47mmol)，同时搅拌，接着滴加CS2(40mg，0.53mmol)在无水THF(3mL)中的溶液。在室温下，搅拌该混合物过夜。在除去溶剂之后，将残余物与Et2O研磨，并干燥至得到呈浅黄色固体的光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A的钾盐(99mg，71％)。
MS(ESI)m/s：227(M-K)；1H NMR(CD3OD)δ：0.80-1.10(2H，m)，1.10-2.10(HH，m)，2.15-2.20(IH，m)，5.05-5.10(1H，m)；[α]D20：-12.5°(c1.04，H2O)。
实施例2
光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A的合成
光学活性的(+)-和(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A的钾盐的合成在方案6至8中阐述。
步骤1.在107℃，于氮气下，机械搅拌H2SO4(25％重量，150ml)中的环戊二烯8(50g)5小时。在冷却至室温之后，将该反应混合物分离成水层和有机层。将有机层与水层分离，用水洗涤，用叔丁基甲醚(250mL)稀释，真空浓缩，得到呈无色油状的烯醇12(55g，100％)。
步骤2.将烯醇12(200g)和Pd/C(3.75％重量，7.5g)在乙醇(600mL)中的混合物加入高压灭菌器中。在室温下，在氢气(5bar)下，搅拌该混合物过夜。用1H NMR监测该反应。在反应完成之后，过滤该反应混合物穿过Celite(400g)，并真空浓缩，得到呈无色油状的烷醇7(200g，100％)。
步骤3.在氮气下，向烷醇7(2g)在吡啶(8mL)中的溶液中加入乙酸酐(1.35mL)和二甲基氨基吡啶(290mg)。在50℃下，搅拌该混合物3.5小时。在用盐酸(2M，30mL)中和之后，用CH2Cl2萃取该反应混合物。经无水Na2SO4干燥混合的有机层，并真空浓缩，得到呈浅黄色油状的酯13(2g)。
步骤4.在表2中所列的三种酶之一(2mg)存在下，在搅拌器上搅拌在叔丁基甲醚(0.2mL)和pH 7的0.1M KH2PO4缓冲溶液(1mL)混合物中的酯13(20mg)过夜。所有三种酶都得自Mann Associates(London，UK)。这些酶选择性地水解(+)酯13，从而得到光学活性的(+)烷醇7和(-)酯13。如Holscher等人描述的(HeIv.Chim.Acta 2004，87，1666-1680)，通过手性GC分析它们的光学纯度，并将结果概括在表2中。
表2.酯13的酶拆分
酶 来源 光学纯度 肽酶 霉菌(Rhizopus oryae) 925％e.e. 脂酶 荧光假单胞菌 40％e.e. 脂酶A 南极假丝酵母 40％e.e.
步骤5.将(-)-酯13(25g)溶于甲醇(150mL)中。加入NaOH水溶液(4M，65mL)，并在22℃搅拌该混合物60分钟。在减压下，浓缩该反应混合物，并将残余物分配在水(100mL)和甲基叔丁基醚(100mL)中。用甲基叔丁基醚(100mL)萃取水层，并经Na2SO4干燥混合的有机萃取物。在减压下除去溶剂，得到(-)烷醇7(19.9g)。
步骤6.向叔丁醇钠(1.6g)在THF(10mL)的溶液中加入光学活性的(-)-烷醇7，接着滴加二硫化碳(1.5g)。然后，在室温下，静置该反应混合物过夜。过滤该反应混合物，并用乙醚洗涤，得到光学活性的(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A的钾盐。
使用相同的方法，将光学活性的(+)-烷醇7转变成光学活性的(+)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A的钾盐。
实施例3
光学活性的O-外/C-外三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A的合成
光学活性的(+)-和(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A的钾盐的合成阐述在方案6和7中。
步骤1.在氮气下，向烯醇12(2g)在吡啶(8mL)的溶液中加入乙酸酐(1.35mL)和二甲基氨基吡啶(290mg)。在50℃下，搅拌该混合物3.5小时。在用盐酸(2M，30mL)中和之后，用CH2Cl2萃取该反应混合物。经无水Na2SO4干燥混合的有机层，并真空浓缩，得到呈浅黄色油状的不饱和的酯11(2g)。
步骤2.在表2中列出的水解酶之一(2mg)的存在下，在搅拌器上搅拌叔丁基甲醚(0.2mL)和pH 7的0.1M KH2PO4缓冲溶液(1mL)的混合物中的酯11(20mg)过夜。所有的三种酶都得自Mann Associates(London，UK)。这些酶选择性地水解(+)-酯11，从而得到光学活性的(+)烯醇12和光学活性的(-)酯11。通过如Holscher等人描述的手性GC(HeIv.Chim.Acta2004，87，1666-1680)分析它们的光学纯度，并将结果概括在表3中。
步骤3.在氮气下，将碳酸钾(21.6g)加入(-)酯11(10g))的甲醇(50mL)溶液中。室温下，搅拌该混合物过夜，并通过TLC(CH2Cl2，PMA染色剂)监测，直到乙酸酯消失。加入水(30mL)和甲基叔丁基醚(30mL)。用甲基叔丁基醚(3×20mL)萃取水层，并经Na2SO4干燥混合有机层，蒸干，得到(-)烯醇12(7.6g，98％)。
步骤4.将(-)12(7.6g)在乙醇(40mL)中的溶液装入到高压灭菌器中。加入Pd/C(3.75％w/w，285mg)，并在H2(5bars)下，在室温下搅拌该混合物过夜。通过1H NMR监测反应直到完成，然后过滤通过Celite(5g)，并浓缩，得到呈深色油状的(-)7(7.8g)。
步骤5.使用本发明描述的方法，将光学活性的(+)-烷醇7和(-)-烷醇7转变成光学活性的(+)-和(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A的钾盐。
表3.不饱和的酯11的酶拆分
酶 来源 光学纯度 肽酶 霉菌(Rhizopus oryae) 100％e.e. 脂酶B 南极假丝酵母 100％e.e. 脂酶B(固定的) 南极假丝酵母 100％e.e.
实施例4
光学活性的O-外/C-外三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A的合成
步骤1.醇+/-12的合成。在氮气下，在107℃加热25％w/w H2SO4(150mL)中的环戊二烯8(50g)5小时。冷却该反应，并分离各层。用水洗涤有机层，用叔丁基甲醚(250mL)稀释。然后，在真空中除去所述叔丁基甲醚，得到醇+/-12(55g，100％)。
步骤2.乙酸酯+/-11(R9＝Me)的合成。向烯醇+/-12(537g)中加入乙酸酐(340mL)、三乙胺(490mL)和N-甲基咪唑(2.5mL)。在50℃下，搅拌该混合物2.5小时，然后，加入叔丁基甲醚(540mL)和2M HCl(490mL)。分离各层，并进一步用叔丁基甲醚(540mL)萃取水层两次。用5％的NaHCO3(270mL)、盐水(540mL)洗涤混合的有机相，并浓缩，得到乙酸酯+/-11(R9＝Me)(590g，96％)。
步骤3.乙酸酯+/-13(R9＝Me)的合成。在25℃下，在3bar下，使用Pd/C(20g)氢化乙醇(1500mL)中的乙酸酯+/-11(R9＝Me)(600g)2小时。当完成(如通过GC判断)时，将反应介质过滤通过Celite，并浓缩，得到乙酸酯+/-13(R9＝Me)(606g)。
步骤4.乙酸酯+/-13(R9＝Me)的生物拆分(Bioresolution)。将磷酸氢二钾(82.5g)加入到水(6L)中，搅拌30分钟，然后用2M NaOH调节pH至pH 7。将该溶液加热至35℃，并一次性加入+/-13(R9＝Me)(500g)，接着加入酶AE015(300g)和0.1M的磷酸氢二钾缓冲液(1L)。当根据GC判断反应完成时，加入氯化钠(50g)和甲苯(2.5L)。搅拌该混合物5分钟，使其分离，将含水物萃取到甲苯(2×2.5L)中。用盐水(2.5L)洗涤混合的有机层，然后过滤通过Celite(400g)。浓缩有机层，得到包含乙酸酯-13(R9＝Me)(96g)和烷醇+7(197g)的粗物质(480g)。
步骤5.邻苯二甲酸酯+14的形成和乙酸酯-13(R9＝Me)的分离。向吡啶(107mL)中加入不需要的醇+7和来自生物拆分步骤的期望的乙酸酯-13(R9＝Me)的混合物(107)。然后，加入邻苯二甲酸酐(65g)和N，N-二甲基氨基吡啶(4.3g)，并在60℃加热该反应5小时。当冷却至10℃时，滴加2M HCl(214mL)以保持内部温度低于20℃。加入叔丁基甲醚(214mL)，并搅拌5分钟。分离有机层，并用2M HCl(214mL)洗涤。将混合的含水成分萃取到叔丁基甲醚(214mL)中。用1M NaOH(2×214mL)、盐水(214mL)洗涤有机部分，并浓缩至干，得到乙酸酯-13(R9＝Me)(49.1g)。
步骤6.包含同分异构杂质的烷醇-7的合成。在氮气氛下，将氢氧化钠(11.8g)加入甲醇(260mL)中的乙酸酯-13(R9＝Me)(52g)中。在25℃下，搅拌该反应2小时，从该反应中蒸馏出甲醇，然后加入叔丁基甲醚(75mL)和水(75mL)。搅拌该混合物5分钟。分离各层，并进一步加入水(2×75mL)。加入盐水(75mL)，并搅拌该混合物5分钟，然后加入氯化铵(75mL)，搅拌5分钟。分离各层，并浓缩有机层，得到烷醇-7(37.1g)。
步骤7.对硝基苯甲酸酯-15的合成。将烷醇-7(39.8g，被副产物和异构体污染)溶于130mL的吡啶(130mL)中。滴加二氯甲烷中的对硝基苯甲酰氯(231g)25％w/w溶液，同时在冰浴中冷却该混合物。在22℃下，继续搅拌18小时。在加入水(130mL)之后，搅拌该混合物60分钟。加入甲基叔丁基醚(1L)，并用2M HCl水溶液(1L)洗涤该混合物。用NaHCO3(aq.)和盐水洗涤有机相，并干燥(Na2SO4)。减压蒸发溶剂，得到呈褐色固体的粗对-硝基苯甲酸酯-15(84.4g)。在异丙醇(400mL)中加热回流粗的对硝基苯甲酸酯-15(84.4g)。在5小时内，将该混合物冷却到22℃，并在45℃接种(seeded)。置于22℃下另外2小时之后，过滤该混合物。先用异丙醇(50mL)洗涤湿滤饼，接着用己烷(50mL)洗涤。在风干之后，获得化学非对映体-和对映体-纯的-15(43.4g)。按照相同的方法，从异丙醇(190mL)中再次再结晶母液残余物，得到第二次收获的纯-15(13.1g)。
步骤8.纯-7的合成。将纯化的对-硝基苯甲酸酯-15(142g)在甲醇(1.4L)中加热至60℃。加入4M NaOH水溶液(360mL)，并在22℃搅拌该混合物60分钟。然后，减压蒸馏出大部分甲醇。将残余物在水(250mL)和甲基叔丁基醚(250mL)中分配。再次用甲基叔丁基醚(150mL)萃取水层。经Na2SO4干燥混合的有机萃取物。在减压下除去溶剂，得到呈无色油状的烷醇-7(57.4g)。
步骤9.使用本发明描述的方法，将光学活性的(+)-和(-)-烷醇7转变成光学活性的(+)-和(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A的钾盐。
实施例5
磷脂酰胆碱-特异性磷脂酶C的抑制
使用Amplex Red磷脂酰胆碱-特异性磷脂酶C(PC-PLC)检测试剂盒，其从Invitrogen(Calsbad，CA)获得，评价光学活性的(+)-和(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A((+)-和(-)-对映异构体1A)的钾盐、以及D609和外消旋的O-外/C-外黄原酸1A(外消旋的1A)抗磷脂酰胆碱-特异性磷脂酶C的抑制活性。D609是从Sigma Aldrich获得。
根据检测试剂盒的说明，制备Amplex Red储备溶液(-20mM)、工作反应缓冲液和辣根过氧化酶储备溶液(200U/mL)、H2O2工作溶液(20mM)、胆碱氧化储备溶液(20U/mL)、碱性磷酸酶储备溶液(400U/mL)和B.cereusPC-PLC储备溶液(10U/mL)。在试验开始之前2小时，将每种试验化合物溶于水中制备其储备溶液(100mg/mL)。
Amplex Red/HRP/卵磷脂工作溶液通过将200μL的Amplex Red试剂储备溶液、100μl的HRP储备溶液、200μl的碱性磷酸酶储备溶液、100μl的胆碱氧化酶储备溶液和78μl的卵磷脂溶液加入到9.32μL的工作反应缓冲液中制备的。PC-PLC溶液(0.2LVmL)通过用工作反应缓冲液稀释PC-PLC储备溶液至期望的浓度制备的。
将系列浓度的试验化合物(25μL)移液到96孔板中。对于未抑制的PC-PLC对照和非PC-PLC对照，加入25μl的水。加入50μL的AmplexRed/HRP/卵磷脂工作溶液之后，向各个孔中加入25μL的PC-PLC溶液引发反应。向非-PC-PLC对照中，加入25μL的水代替PC-PLC溶液。进行试验，一式三份。保护该反应使其避光。在37℃下培养30分钟之后，用荧光全自动定量绘图酶标仪，使用550nm的检测激发波长和590nm的检测发射波长来测定反应。通过从本底荧光减去从非-PC-PLC对照获得的值来校正获得的荧光数据。然后，计算各个试验化合物的IC50值，并将结果概括在表4中。
表4PC-磷脂酶C的抑制
化合物 IC50(μg/mL) D609 20.49±1.99 外消旋的1A 10.05±0.77 (+)-对映异构体1A 13.88±0.85 (-)-对映异构体1A 3.62±0.17
实施例6
牛乳头瘤病毒(BPV)的抑制
使用如描述的(Amtmann等人，Exp.Cell.Res.1985，161，541-550)体外BPV-感染的仓鼠胚胎成纤维细胞(HEF)细胞增殖测定，来评价光学活性的(+)-和(-)-对映异构体1A以及D609和外消旋的1A的钾盐抗牛类乳头瘤病毒的抑制活性。将结果概括在表5中。
简而言之，在伊格尔基础培养基中生长仓鼠胚胎成纤维细胞和1型牛乳头瘤病毒(BPV-1)-转变的HEF(HEF-BPV)。将BPB-HEP和HEF细胞以pH 6.8的包含10％胎牛血清的DMEM细胞培养中0.5×106细胞/板接种在96-孔板中。然后，在37℃和100％湿度下，在5％的CO2存在下，培养所述板。在6小时之后，用包含一系列浓度试验化合物的新制DMEM细胞培养基交换在所述板中的细胞培养基。在37℃下，再培养所述板72小时。然后，用PBS洗涤所述板中的细胞，用包含0.9％NaCl的3％甲醛溶液固定1分钟，用水洗涤10秒，并干燥过夜。对于测定，在室温下，用结晶紫溶液染色所述板5分钟，用水洗涤5次，并在室温下干燥过夜。在向各孔加入乙醇/乙酸(99∶1，v/v，100mL)之后，使用ELISA读数器在595nm测量所述板。
表5.牛乳头瘤病毒的抑制
化合物 IC50(μg/mL) D609 21.64±1.85 外消旋的1A 14.55±0.07 (+)-对映异构体1A 19.89±2.52 (-)-对映异构体1A 11.07±0.18
实施例7
人乳头瘤病毒(BPV)的抑制
使用HPV-31感染的CIN6129E角质形成细胞评价光学活性的(-)-对映异构体1A抗人乳头瘤病毒的抑制活性(Meyers等人，Science 1992，257，971-973)。
a.短期研究
对细胞增殖的作用。将感染了HPV-31的细胞在E培养基中以0.5×106细胞/板(0.5×104细胞/孔)的密度接种在含1×106丝裂霉素C处理的3T3细胞(1×104细胞/孔)的96孔板中。在CO2恒温箱中，在100％湿度中，5％的CO2和37℃下，培养所述板6小时之后，去除细胞培养基，加入含0.85g/LNaHCO3和一系列浓度(0、0.5、1、2、4、8、16、32、64和128μg/mL)的试验化合物的新制E培养基或阳性对照(200IU/mL的干扰素γ)。在测定之前不早于1小时，制备100mg/mL的光学活性的(-)-对映异构体1A在重蒸馏H2O中的储备溶液，并在使用之前保存在冰上。试验每种浓度的所有样品，一式四份。在与试验化合物或对照处理细胞的同时时间点，固定含有未处理细胞的一个96孔板。在CO2恒温箱中，在37℃下，再培养所述板72小时。通过倾倒除去细胞培养基之后，用PBS中的0.5mM EDTA溶液(100μL/孔)和PBS(100μL/孔)洗涤两次。向所述板中加入甲醛(3％，100μL/孔)。在5分钟之后，倾倒出甲醛，在室温下，将所述板倒置在吸水纸上干燥。通过向每孔中加入0.1mL的结晶紫溶液染色所述细胞。在室温下培养5分钟之后，倾倒出结晶紫溶液，并通过将所述板浸在3L新鲜水中洗涤5次。所使用的结晶紫溶液是通过如下步骤制备的：首先，将结晶紫溶解在乙醇中至10％的浓度，然后用重蒸馏的H2O稀释该乙醇溶液(1∶20)。在将所述板倒置在吸水纸上过夜干燥之后，向各孔中加入0.1mL的乙醇/乙酸(99∶1)，并在ELISA读数器中测定在595nm的光密度。
通过绘制生长对试验化合物的浓度图或对照曲线图建立剂量响应曲线。结果显示在图1和2中。根据该剂量响应曲线，从该剂量响应曲线与平行于X轴且对应于50％未抑制生长的线的交叉点处确定IC50值。光学活性的(-)-对映异构体1A显示出的EC50为16μg/mL，而阳性对照(INF-γ)显示出在200UI/mL抑制约50％的HPV-31感染的CIN6129E角质形成细胞的生长。
对HPV-31特异性DNA和RNA的作用。将感染了HPV-31的细胞(3×106)分配到14.5cm的平皿中，所述平皿包含新制E培养介质和1×106丝裂霉素C-处理的J23T3成纤维喂养细胞。在6小时之后，加入包含0.85g/l NaHCO3和一系列浓度(0、0.5、1、2、4、8、16和32μg/mL)的试验化合物的新制培养基。试验每种浓度的所有样品，一式两份。在37℃培养72小时之后，用4mM EDTA除去喂养细胞，然后分离DNA和RNA。在Southern和Northern Blot凝胶中分析分离的DNA和RNA的HPV-31特异性序列。使用人A431上皮癌细胞作为HPV-未感染的阴性对照。扫描X射线底片，并对HPV-31特异性DNA和主要mRNA种类的光密度进行累积。
通过绘制累积值对试验化合物的浓度的曲线图建立剂量响应曲线。将结果显示在图2中。根据该剂量响应曲线，从该剂量响应曲线与平行于X轴的对应于50％未抑制的累积的线的交叉点来确定IC50值。光学活性的(-)-对映异构体1A显示出抑制HPV-31特异性RNA表达的IC50为10.7μg/mL。对照RNA(肌动蛋白特异性RNA)的表达仅仅在光学活性的(-)-对映异构体1A的最高浓度32μg/mL时受影响。在抑制HPV-31特异性DNA方面，光学活性的(-)-对映异构体1A在32μg/mL显示出37.5％抑制。
b.长期研究
将感染了HPV-31的细胞(3×106)铺在14.5cm平皿中，该平皿包含新鲜的E培养基和1×106细胞的丝裂霉素C-处理的3T3成纤维喂养细胞。在CO2恒温箱中，37℃和5％CO2中，在100％的湿度中培养所述平皿。使用人A431上皮癌细胞作为HPV-未感染的阴性对照。在培养6小时之后，除去细胞培养基，并加入包含0.85g/L NaHCO3和浓度为10μg/mL和3.3μg/mL的化合物、或对照(200ILVmL的干扰素γ)的新鲜E培养基。对于每个浓度，制备4个平皿。在CO2恒温箱中，在37℃培养所述平皿。每72小时，将所述培养介质替换为包含各种浓度的试验化合物或对照的新鲜E培养基。在七天之后，或者当未处理的细胞开始融合时，收获每组的一个平皿用于DNA/RNA萃取，接着进行Southern/Northern Blot分析；用胰蛋白酶处理一个平皿，测定细胞数量，将细胞接种在三个新的平皿中，如上所述处理和培养。重复该方法传代9次。在这些传代期间，监测细胞形态学和细胞密度。
对细胞增殖的作用。在Neubauer血细胞计数器中测定收获的平皿中的细胞数量。测定每个传代步骤的倍增因数。用传代结束时每个培养物的细胞数量除以在每次传代开始时接种细胞的数量。当用试验化合物处理的角质形成细胞停止生长时，达到终点。将细胞生长停止定义为倍增因数不大于1。
在整个9次传代期间，未处理的CIN612 9E细胞生长保持恒定。倍增因子的变化为2.7至3.9。在观察期间，生存力没有明显损失。相反，用所有试验化合物处理都影响细胞生长(图3)。
在第一次细胞传代期间，用INF-γ处理导致细胞快速死亡，导致倍增因数低于1(0.8)。然而，在第二次传代中，倍增因数激增(2.4)，之后的3次传代保持该水平，在最后的四次传代期间，倍增因数有些降低至1.9至1.5之间。然而，减少不是累积的。
用3.3μg/mL浓度的光学活性的(-)-对映异构体1A处理CIN612 9E细胞导致生长率降低。倍增因数从2.9(1代)降至1.1(9代)，即，在9次传代后，所述细胞几乎停止生长。
用10μg/mL浓度的光学活性的(-)-对映异构体1A处理CIN612 9E细胞导致细胞增殖明显减少。倍增因数从未处理细胞的3降低至第一个5次传代期间的值2-2.5。在5次传代之后，观察到倍增因数的急剧和累积降低(5代：2.4，6代：1.3，9代：0.1)。从7代开始，倍增因数＜1，表明细胞正在死亡。
与整个9次传代过程中CIN 9E细胞的相比，对照A431细胞(上皮癌细胞)的生长恒定或小幅度减少(图4)。既没有用光学活性的(-)-对映异构体1A处理，也没有用IFN-γ处理的对照A431的倍增因数为3.5至4.7。用200IU/mL的INF-γ处理A431细胞对细胞生长没有显著影响。在整个9次传代过程中，倍增因数为3.7至4.6。用光学活性的(-)-对映异构体1A处理细胞对细胞生长仅仅有很小的影响。用3.3μg/mL浓度的光学活性的(-)-对映异构体1A处理引起细胞生长的轻微抑制。倍增因数的变化为3.1至4.2。不存在累积效应。用10μg/mL浓度的光学活性的(-)-对映异构体1A处理也引起细胞生长的轻微抑制。倍增因数的变化为2.8至3.5。不存在累积效应。
在5次传代之后，观察到用10μg/mL的光学活性的(-)-对映异构体1A处理的CIN 612 9E细胞的形态有显著变化(图5A和5B)。细胞生长的更有像未转变的角质形成细胞，而不是未处理的CIN 612 9E细胞的十字形模式。当培养物生长融合时，用光学活性的(-)-对映异构体1A处理的CIN 6129E细胞开始被抑制，而未处理的CIN 612 9E细胞堆积(piling up)并且在达到融合之后不会停止其生长。另外，用光学活性的(-)-对映异构体1A处理的CIN 612 9E细胞获得扁球形，而未处理的CIN 612 9E细胞保持纺锤形。
对HPV-31特异性DNA和RNA的作用：在SouthernBlot和Northern Blot凝胶中分析DNA和RNA的HPV-31特异性序列。扫描X射线底片，并累积HPV-31特异性DNA和主要mRNA种类的光密度。通过绘制累积值对每次处理剂量的传代次数的曲线图建立时间曲线。根据该时间曲线，从该时间曲线与平行于X轴且对应于未处理的对照样品的50％累积的线的交叉点确定T50(减低至对照水平的50所需的时间)。
将结果显示在图6和7中，并概括在表6中。所有用3.3μg/mL或10μg/mL的光学活性的(-)-对映异构体1A或200IU/mL的INF-γ处理的细胞都显示出HPV-31特异性DNA和RNA含量的连续降低(表6)。最有效的处理是用10μg/mL的光学活性的(-)-对映异构体1A。在单次传代之后，病毒基因组/细胞的数量降低超过50％(T50DNA＜1和T50RNA＜1)，在6次传代之后为＜5％。在9次传代之后，几乎检测不到病毒DNA和RNA(低于1％)。
表6.HPV-31特异性DNA和RNA表达的抑制
处理 T50DNA1 T50DNA2 对照(没有化合物或对照) 没有影响 没有影响 10μg/mL的化合物1A ＜1 ＜ 3.3μg/mL的化合物1A 2.23 3.28 200IU/mL的INF-γ(对照) 2.7 3.36
1HPV-31特异性RNA的含量减少50％所需要的传代次数
2HPV-31特异性DNA的含量减少50％所需要的传代次数
实施例8
2型单纯疱疹病毒(HS V-2)的抑制
用D609、外消旋的1A的钾盐和阿昔洛韦一起评价光学活性的(+)-和(-)-对映异构体1A的钾盐对2型单纯疱疹病毒的抑制活性和细胞毒性。将结果概括在表6中。
在100％湿度的CO2恒温箱中，在5％CO2和37℃下，在DMEM细胞培养基中培养Calu-6细胞和RITA细胞。
对于细胞毒性测定，将Calu-6细胞在DMEM细胞培养基中以3×106细胞/板的密度接种在96孔板中。在37℃下，在5％的CO2存在下，培养所述板24小时。用包含一系列浓度试验化合物的新鲜DMEM细胞培养基交换所述板中的DMEM细胞培养基。在37℃下，在5％的CO2存在下，培养所述板48小时。然后，用PBS洗涤所述板，用包含0.9％NaCl的3％甲醛溶液固定1分钟，用水洗涤10秒并干燥过夜。对于测定，在室温下，用结晶紫溶液染色所述板5分钟，用水洗涤5次，并在室温下干燥过夜。在向各孔加入乙醇/乙酸(99∶1，v/v，100mL)之后，使用ELISA读数器在595nm测量所述板。通过绘制光密度平均值对化合物浓度的曲线图获得每种化合物的剂量响应曲线。将根据剂量响应曲线获得的LD50值概括在表5中。
对于HSV-2抑制，将Calu-6细胞以在DMEM细胞培养基中3×106细胞/板的密度接种在96孔板中。在5％的CO2存在下，在37℃下，培养该板24小时。除去所述板中的DMEM细胞培养基，并用2型单纯疱疹病毒以50个噬斑形成单位/孔感染细胞。在37℃培养60分钟之后，加入DMEM细胞培养基中的一系列浓度的试验化合物。在5％的CO2存在下，在37℃培养该板48小时。将该板冷冻在-20℃，之后进一步分析。在室温下解冻之后，在4℃以18,000g从各孔中离心上清液5分钟以制备包含有传染性的病毒颗粒的上清液。在试验期前，进一步稀释所述上清液。
将RITA细胞在2mL的DMEM细胞培养基中以4×106细胞/板的密度接种在24孔Linbra板中。在5％的CO2存在下，在37℃培养所述板24小时。在除去细胞培养基之后，加入0.1mL的稀释的上清液，并在37℃培养所述板1小时。加入包含10％胎牛血清和0.5％甲基纤维素的DMEM细胞培养基，并在37℃培养所述板48小时。然后，用PBS洗涤所述板，用包含0.9％NaCl的3％甲醛溶液固定1分钟，用水洗涤10秒，并干燥过夜。为了检测，接着在室温下，用结晶紫溶液染色所述板5分钟，用水洗涤5次，并在室温下干燥过夜。目测确定噬斑数量。然后，用每孔噬斑的数量乘以稀释系数。通过绘制噬斑数目/0.1mL对化合物浓度的曲线图获得剂量响应曲线。通过LD50除以IC50计算每种化合物的治疗指数。
表7.HSV-2的抑制
化合物 IC50(μg/mL) LD50(μg/mL) 治疗指数 D609 30.25±6.77 105.18±21.97 3.5 外消旋的1A 17.18±5.95 96.93±7.12 5.6 (+)-对映异构体1A 20.97±4.06 81.29±4.53 3.9 (-)-对映异构体1A 9.08±3.40 94.32±7.33 10.4 阿昔洛韦 1.21±0.81 65.45±6.21 54.1
实施例9
表面制剂
软膏剂：
将活性成分(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A或其药学上可接受的盐、溶剂化物和凡士林混合，直到混合均匀。
实施例10
表面制剂
软膏剂：
将活性成分(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A或其药学上可接受的盐、溶剂化物和凡士林以及胆固醇混合，直到混合均匀。
实施例11
表面制剂
软膏剂：
将活性成分(-)-O-外/C-外-三环[5.2.1.02.6]-癸-9-基-黄原酸1A和阿昔洛韦、或其药学上可接受的盐、溶剂化物和凡士林混合，直到混合均匀。
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