半月板移植用组织的制备.pdf

本发明涉及一种制备组织基质的方法，及其在受损或有缺陷半月板的置换和/或修补中的后继应用。本发明还提供了基本上脱细胞化的半月板组织。

1.  一种制备用于后继植入受体中的供体半月板组织的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)冻融组织；
(ii)在低渗溶液中孵育所述组织；
(iii)在含有阴离子去污剂的低渗溶液中孵育所述组织；
(iv)重复步骤(ii)和(iii)；
(v)在含有至少一种核酸酶的溶液中孵育所述组织；以及
(vi)用氧化剂洗涤所述组织。

2.  如权利要求1所述的方法，其还包括在缓冲液中对组织进行超声处理的步骤。

4.  如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述半月板是通过从同种或异种供体的膝关节中取出整个或部分内侧或外侧半月板而获得的。

5.  如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所制得半月板的接纳者或受体是人类。

6.  如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，供体组织是人或猪来源的。

7.  如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述冻融步骤包括在-10～-80℃冷冻组织。

8.  如权利要求7所述的方法，其特征在于，在-20℃冷冻所述组织。

9.  如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，冷冻步骤进行2-24小时，随后的融解步骤进行2、3或4小时，直至组织解冻。

10.  如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，在不含低渗缓冲液的情况下，实施所述冻融步骤处理至少一次或多次，当组织浸泡于低渗缓冲液中时，重复冻融步骤一次或多次。

11.  如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述低渗缓冲液是pH 8.0的10mMTris溶液，其中包含EDTA和抑肽酶。

12.  如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述步骤(ii)在低渗溶液中孵育的步骤包括在增量升温条件下进行两阶段低渗洗涤。

13.  如权利要求12所述的方法，其特征在于，第一阶段孵育在低于室温但高于冷冻温度的温度下进行12-48小时。

14.  如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述第一阶段孵育的时间为在4℃下24小时。

15.  如权利要求12所述的方法，其特征在于，第二阶段孵育在高于室温的温度下进行12-48小时。

16.  如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述第二阶段孵育在37℃进行24小时。

17.  如权利要求12所述的方法，其还包括第三阶段孵育步骤，该步骤包括在额外包含阴离子去污剂的低渗溶液中孵育所述组织。

18.  如权利要求17所述的方法，其特征在于，使用阴离子去污剂的所述第三阶段孵育步骤为1-3天，且孵育温度高于第二阶段孵育步骤的温度。

19.  如权利要求18所述的方法，其特征在于，在55℃的孵育时间为48小时。

20.  如权利要求17-19中任一项所述的方法，其特征在于，所述阴离子去污剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。

21.  如权利要求20所述的方法，其特征在于，SDS的浓度为0.03-0.3％(v/v)。

22.  如权利要求21所述的方法，其特征在于，SDS的浓度为0.15％(v/v)。

23.  如权利要求12-22中任一项所述的方法，其特征在于，重复所述孵育步骤至少三次。

24.  如前述任一项权利要求所述的方法，其还包括在孵育步骤之后，在含螯合剂的缓冲液中洗涤所述组织的步骤。

25.  如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述缓冲液是PBS，所述螯合剂是EDTA。

26.  如权利要求24或25所述的方法，其特征在于，所述组织的洗涤包括在40-60℃下重复孵育1、2或3小时。

27.  如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，在重复的孵育步骤之后，进行用含一种或多种核酸酶的溶液孵育所述组织的步骤。

28.  如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述含核酸酶的溶液是pH 7.5的50mM Tris溶液，10mM MgCl₂，牛血清白蛋白(50μg/ml)，其含有RNase(1 U.Iml^-1)和DNase(50 U.I ml^-1)。

29.  如权利要求27或28所述的方法，其特征在于，所述组织在含核酸酶的溶液中，于7℃孵育2、3或4小时。

30.  如前述任一项权利要求所述的方法，其还包括在用含核酸酶的溶液孵育之后，于30-50℃，用含EDTA的高渗溶液孵育组织12-48小时的步骤。

31.  如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，在用含核酸酶的溶液孵育和随后在高渗溶液中孵育之后，在含PBS和EDTA的溶液中洗涤所述组织12-24小时。

32.  如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，在用氧化剂洗涤所述组织的步骤中所用的氧化剂是过氧乙酸(C₂H₄O₃)或过乙酸(PAA)。

33.  如权利要求32所述的方法，其特征在于，PAA的浓度为0.01-0.5％v/v。

34.  如权利要求33所述的方法，其特征在于，PAA的浓度为0.1％(v/v)。

35.  如前述任一项权利要求所述的方法，其还包括在氧化剂存在下洗涤所述组织之后，在降低温度下在PBS中进行的多阶段孵育洗涤步骤。

36.  如权利要求36所述的方法，其特征在于，第一洗涤是在35-50℃，用PBS洗涤12-48小时，第二孵育洗涤是在较低的温度下洗涤12-48小时，最后的孵育洗涤是在0-10℃洗涤12-48小时。

37.  如权利要求35或36所述的方法，其特征在于，再重复所述多阶段孵育洗涤步骤一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次或八次。

38.  如前述任一项权利要求所述的方法，其还包括保存制得的组织备用的步骤。

39.  如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述保存步骤为低温储藏或冷冻处理。

40.  如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，超声处理步骤在步骤(i)之前或之后进行。

41.  如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述超声处理步骤在组织浸泡于磷酸盐缓冲盐酸(PBS)或任何其它生理学上可接受的缓冲液中时进行。

42.  如权利要求40或41所述的方法，其特征在于，超声功率是脉冲的。

43.  如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述脉冲的方案是1、2、3、4、5、6、7或8秒开，0.5、1或2秒关。

44.  如权利要求40-43中任一项所述的方法，其特征在于，所述超声功率为100-700瓦。

45.  如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述超声功率为400瓦。

46.  如权利要求40-45中任一项所述的方法，其特征在于，所述超声处理步骤在低于室温的温度下进行10-40分钟。

47.  如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述超声处理步骤在约4℃进行20分钟。

48.  一种制备用于后继植入受体中的供体半月板组织的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)在缓冲液中对组织进行超声；
(ii)冻融所述组织；
(iii)在低渗溶液中孵育所述组织；
(iv)在含有阴离子去污剂的低渗溶液中孵育所述组织；
(v)重复步骤(iii)和(iv)；
(vi)在含有至少一种核酸酶的溶液中孵育所述组织；以及
(vii)用氧化剂洗涤所述组织。

49.  如权利要求48所述的方法，其还包括权利要求2-47中任一项所述的任何一种或多种特征。

50.  一种用前述权利要求中任一项所述的方法制得的半月板移植用产品。

51.  一种产品，其包含用作移植组织的用权利要求1-49中任一项所述的方法获得的半月板组织。

52.  用权利要求1-49中任一项所述的方法获得的半月板组织在用作移植用组织中的用途。

53.  如权利要求50-52中任一项所述的半月板产品，其特征在于，在所述半月板组织的中央区域不含(100％)或基本不含(90％)细胞。

54.  如权利要求50-52中任一项所述的半月板产品，其特征在于，其基因组DNA(gDNA)含量为0-20ng/mg。

55.  如权利要求54所述的半月板产品，其特征在于，gDNA含量为0-10ng/mg。

56.  如权利要求54所述的半月板产品，其特征在于，gDNA含量为0-5ng/mg。

57.  一种试剂盒，其包含前述的溶液和任选包含一套指导其使用的书面说明书。

58.  一种治疗需要半月板移植的个体的方法，所述方法包括如下步骤：根据权利要求1-50中任一项所述的方法制备脱细胞化的供体半月板组织，和用脱细胞化的半月板替代有缺陷或受损的半月板。

半月板移植用组织的制备
本发明涉及一种制备用于受损或有缺陷半月板的置换和/或修补的组织基质(尤其是软组织基质)的方法。本发明还提供了用于后继移植/植入的基本上脱细胞化的半月板组织。
背景技术
人类的膝盖是一种重要而复杂的关节，其包括三块在空间上相互联系的骨头(股骨、胫骨和髌骨)、韧带和软骨结构，所有这些(构造)的相互作用产生了各种动作。该关节中的多种膝盖骨的表面被关节软骨所覆盖。该重要的表面使骨之间得以彼此顺畅滑动，而不会造成骨损伤。半月板是一种位于骨的关节软骨表面的C型软骨垫，其通过分散重量而起到减震器的作用，并由此改善了膝关节的整体稳定性。每个膝关节有内侧和外侧半月板，其由纤维软骨细胞、蛋白聚糖以及胞外基质组成，其中胞外基质含有胶原和弹性纤维。当半月板通过伤害、疾病或炎症而受到损伤时，在受到影响的个体的膝关节中会产生伴有肿胀、疼痛和/或膝关节功能丧失的关节炎性变化。虽然撕裂的半月板具有修复的可能性，但是却不得不去除严重受损或具有大面积撕裂的半月板。
由于成人的关节软骨一旦受损后在很大程度上就不能自然再生，过去采用各种外科手术法来治疗受伤的成人半月板，这些手术包括去除并用假体设备来进行置换。对于年长患者，膝关节置换常常是优选的选项。然而，对于较年轻的个体(年龄低于50或55岁的个体)而言，作为替代全关节置换的选择是使用假体关节或供体(donor)组织来置换受损半月板的半月板移植法。
与使用供体组织进行的半月板置换相关的问题是：半月板是一种到处充满纤维软骨细胞的致密纤维软骨性组织，所述的纤维软骨细胞是负责合成、维持和修复胞外基质的细胞。人类内侧半月板长约4.5mm，外侧半月板长约3.5mm，它们各自的厚度为25至35mm(猪半月板的数值与人半月板的数值相似)。由于半月板是充满细胞(尤其是在微脉管系统周围)的厚而致密的组织，极难使其脱细胞化(尤其是在其中央区域)，这由此说明了很难制备用于移植的免疫惰性或脱细胞化组织，因此存在排斥的可能性。换言之，其生物相容性低，且移植受体发生因异源移植(heterograft)或异种移植(xenograft)引起的免疫学反应的风险较高。
为了提供非细胞的生物相容性半月板移植物，已开发了人造半月板假体。然而，与人造半月板假体相关的问题是其不如天然的半月板组织那样坚固，且其缺乏天然半月板的弹性特性，因此，该假体对震动的吸收不如天然材料有效。
可有效使供体半月板组织脱细胞化的方法能为需要半月板移植/植入的个体的治疗提供直接的益处。
发明概述
根据本发明的第一方面，提供了一种制备后继用于移植入受体的供体半月板组织的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)在缓冲液中对组织进行超声；
(ii)冻融所述组织；
(iii)在低渗溶液中孵育所述组织；
(iv)在含有阴离子去污剂的低渗溶液中孵育所述组织；
(v)重复步骤(iii)和(iv)；
(vi)在含有至少一种核酸酶的溶液中孵育所述组织；以及
(vii)用氧化剂洗涤所述组织。
优选地，可在步骤(i)之前进行步骤(ii)，也就是说可在超声处理之前对供体半月板组织进行冷冻/融解处理，这两个步骤的顺序不对本发明的范围构成限制。
贯穿说明书和本说明书的权利要求书，词语“包括”和“包含”以及这些词语的变化形式，例如“包括(分词)”和“包括(第三人称单数)”，是指“包括但不限于”，而不是排除其它的部分、添加剂、组分、整数或步骤。
贯穿说明书和本说明书的权利要求书，除非另有要求，单数包括复数。具体而言，在使用不确定的项目时，除非另有要求，说明书应理解为包括复数以及单数。
与本发明的具体方面、实施方式或实施例相关的特征、整数、特性、化合物、化学部分或基团应理解为可应用于本文的任何其它方面、实施方式或实施例，除非与之相矛盾。
在本发明的一个实施方式中，所述方法包括制备后续用于植入受体的供体半月板组织的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)冻融组织；
(ii)在低渗溶液中孵育所述组织；
(iii)在含有阴离子去污剂的低渗溶液中孵育所述组织；
(iv)重复步骤(ii)和(iii)；
(v)在含有至少一种核酸酶的溶液中孵育所述组织；以及
(v)用氧化剂洗涤所述组织。
在本发明的该实施方式中，省略了在缓冲液中对组织进行超声的步骤。已发现本发明的方法无需超声步骤即可成功完成，但是一旦半月板组织受到脱细胞化，据信这一步骤可改善植入物上的重细胞化。因此，该步骤是本发明中任选但优选的步骤，可提高后继重细胞化，从而在某些情况下可以作为本发明方法的一部分。
应理解，可通过从异源或异种供体的膝关节上去除整个或部分内侧或外侧半月板来获得半月板。
优选所制备的半月板的受体为人类，或者受体可为由于半月板损伤或恶化而需要半月板移植的其它物种。
异种植入或异种移植是将来自一个物种供体的组织移植入另一物种的受体。有时还会使用术语异源植入和异源移植，而术语同源移植或同种异体移植是指相同物种的移植。
在本发明中，当受体为人类时，供体优选为人类或具有大致相当的生理特性(例如厚度和强度)的半月板的任何其它哺乳动物。
优选半月板供体组织来自于人类或猪。
如前所述，可不进行超声而实现脱细胞化，然而当超声步骤包含于本发明的方法中时，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)或其它任何生理学上可接受的缓冲液中进行该步骤。
优选超声能量为脉冲能量，代表性的方案是1、2、3、4、5、6、7或8秒为开(on)，0.5、1或2秒为关(off)，然而应理解本发明范围中不限制确切的脉冲定时。
优选超声能量为100-700瓦，更优选约400瓦。
优选进行10-40分钟，理想地约为20分钟的超声处理步骤，并优选在低于室温下进行。理想的超声处理是在约4℃的冰上进行。
冷冻/融解处理优选包括在例如-10～-80℃，通常为-20℃的温度下冷冻组织2-24小时，然后对该组织进行约2、3或4小时的解冻，直至其达到室温。在不存在低渗缓冲液的情况下，进行至少一次，优选两次该处理，然后在将组织浸泡在低渗缓冲液的情况下，重复(冻融)至少一次，优选两次。应理解存在或不存在低渗缓冲液时的冷冻/融解可相反和任选交替。低渗溶液是电解质浓度低于细胞的溶液。在这种情况下，渗透压使得水移入细胞中，从而使得细胞壁内部和外部的电解质浓度趋于相同。
优选低渗缓冲液pH约8.0的10mM Tris溶液，其包含约0.1％(w/v)EDTA和抑肽酶(浓度约10KIU.ml^-1)。
优选地，用低渗溶液进行孵育的步骤包括在增量升温下进行两阶段的低渗洗涤。第一阶段是在低于室温但高于冷冻的温度(例如4℃左右)下，孵育约12-48小时，通常约24小时，而第二阶段则是在高于室温(例如约37℃)进行相同时间的孵育，第三阶段(在进行超声处理的实施方式的步骤(iv)和省略超声处理的实施方式中的步骤(iii))通过在额外含有阴离子去污剂的低渗溶液中孵育组织来进行的。使用阴离子去污剂的第三洗涤步骤包括在高于第二洗涤温度但低于沸腾温度(例如约55℃)的温度下，进行1-3天，优选约48小时的孵育。
在前文所述的孵育步骤中的前述孵育温度和时间是本发明方法适当方案的例证，而不是对本发明范围的限定。
优选阴离子去污剂为十二烷基硫酸钠(SDS)。优选其在低渗洗涤液中的浓度为0.03-0.3％(v/v)，更优选约0.15％(v/v)。
优选重复进行超声处理时的步骤(iii)和(iv)和省略超声处理时的步骤(ii)和(iii)的三阶段孵育步骤最少三个循环。
优选在本发明的一个实施方式中，在进行超声处理时在步骤(v)之后和在省略超声处理步骤的步骤(iv)之后，重复含或不含阴离子去污剂的低渗洗涤，该方法还包括在缓冲液中洗涤组织的步骤。
优选缓冲液为PBS。洗涤处理可包括在40-60℃，理想约为55℃的温度下重复孵育约1、2或3小时。优选进一步重复该步骤1、2或3次。
优选本方法包括用含有一种或多种核酸酶的溶液孵育(步骤(v)或采用超声处理步骤的步骤(vi))。
核酸酶用于消化任何残留的已显示作为钙化部位起作用的核酸物质。
一种代表性但非限制性的核酸酶孵育溶液是pH7.5的50mM Tris溶液，10mM MgCl₂，牛血清白蛋白(50μg/ml)，含RNase(1U.I ml^-1)和DNase(50U.ml^-1)。
优选地，通常在约37℃温度下，用核酸酶溶液孵育组织约2、3或4小时，并同时轻柔搅拌。
用核酸酶溶液孵育之后，优选将组织进一步于30-50℃，通常约为37℃的温度下，在高渗溶液中孵育约12-48小时。
优选该高渗溶液是pH 7.6的Tris溶液(0.05M)，其中加入了1.5M NaCl和EDTA(0.1％w/v)。
然后，优选在含有PBS和螯合剂的缓冲液中洗涤所述组织12-24小时。
优选所述螯合剂是EDTA，浓度为0.1％(w/v)。
优选本发明方法最后步骤中的氧化剂是过氧乙酸(C₂H₄O₃)，其也称为过乙酸，并通常缩写为PAA。
优选PAA的浓度为0.01-0.5％v/v，更优选约为0.1％PAA(v/v)。
优选该方法还包括于降温下在PBS中进行多阶段孵育洗涤。该最后阶段洗涤的代表性方案是：在35-50℃，理想为45℃的温度下，用PBS进行12-48小时、通常为24小时的第一阶段洗涤；在30-40℃，理想为37℃的温度下，进行类似时间的第二孵育洗涤；在0-10℃，理想为4℃的温度下，进行类似时间的最终孵育洗涤。
优选再重复多阶段孵育洗涤一次、二次、三次、四次、五次、六次、七次或八次。
应理解在本发明方法的通篇描述中，所述给出的时间、温度和浓度仅是示例，而不对本发明范围的限制。
优选所述方法还包括保存制得的组织备用的步骤。
该步骤的示例为例如低温储藏或冷冻处理。
根据本发明的另一方面，提供了一种通过本发明方法生产的移植产品。
根据本发明的又一方面，提供了用本发明方法获得的用作移植组织的半月板组织。
根据本发明的又一方面，提供了用本发明方法获得的半月板组织在作为移植组织中的用途。
优选由本发明生产的产品的特征为：在半月板组织的中央区域不含(100％)或基本不含(90％)细胞。
本发明的方法提供了一种制备基本上不含细胞(例如纤维软骨细胞)的半月板组织的方法。
优选通过本发明生产的产品的特征为：基因组DNA(gDNA)的含量为0-20ng/mg，更优选gDNA含量为0-10ng/mg，进一步优选gDNA含量为0-5ng/mg。
因此，本发明的产品实际上不含诸如纤维软骨细胞的细胞，且可忽略不计gDNA的含量，由此是用于后继移植的最适材料。
据信，受益于改进的脱细胞化方法，本发明的方法和产品有利地提供了与受体真正生物相容的、被受体排斥风险最小化的天然半月板组织。
本发明的方法已成功用于在半月板外部区域和中央区域中，尤其是微脉管化区域周围和位于组织中央深处的区域，对存在脱细胞问题的区域进行半月板组织脱细胞化。
根据本发明的另一方面，提供了一种试剂盒，其包含如前所述的溶液，并任选包括一套指导使用的书面说明书。
根据本发明的另一方面，提供了一种治疗需要半月板移植的个体的方法，该方法包括以下步骤：根据本发明第一方面的方法制备脱细胞化的供体半月板组织；以及，用该脱细胞化的半月板替换有缺陷或受损的半月板。

附图简述
现参考以下附图，以示例方式对本发明进行描述，其中：
图1显示了根据本发明方法的代表性逐步处理的流程图。
图2显示了用各种方案进行脱细胞化后的猪内侧半月板的DNA含量以及组织学(观察)。图2A所示为新鲜半月板；图2B所示为基本脱细胞化处理后的半月板；图2C所示为经脱细胞化和超声处理后的半月板；图2D所示为在55℃脱细胞化和超声处理后的半月板；图2E所示为在55℃脱细胞化、超声处理和冻融的半月板；图2F所示为在55℃脱细胞化(×2)、超声处理和冻融的半月板；图2G所示为在55℃脱细胞化(×3-4)、超声处理、冻融和PAA处理后的半月板。
图3A显示了新鲜猪半月板的组织学观察，图3B显示了根据本发明方法脱细胞化后的可比区域的组织学。
图4显示了新鲜和脱细胞化组织的生物力学数据。
图5显示了新鲜和脱细胞化半月板组织中α-半乳糖的免疫过氧化物酶染色。
发明详述
材料和方法
半月板组织的制备
在动物屠宰的24小时内，从地方屠宰场获得猪半月板。通过如下方法从膝关节剥离半月板：轻轻切除膝关节囊(knee capsule)，然后切割前十字韧带和后十字韧带以暴露半月板。然后，在半月板角附件(mcniscal horn attachment)上制造垂直切口以释放出半月板。然后，用剪刀从膝囊和半月板附件中去除多余的组织。然后，取出半月板，用PBS(Oxoid)洗涤以去除多余的血液。然后将样品置于用PBS润湿的滤纸上于-40℃保存备用。
组织/组织学制品
在10％(v/v)中性缓冲的福尔马林中固定组织样品(n＝3)48小时，然后脱水并包埋在石蜡中。切取6μm厚的连续切片，使用其中的1/10切片。用标准苏木精和伊红(H&E)(生物欧洲有限公司(Bios Europe Ltd)，斯凯墨斯道尔(Skelmersdale)，UK)染色，以评估组织的组织结构。用烟酸己可碱染料(五水合双苯酰亚胺H33258；分子探针公司(Molecular Probes)，尤金(Eugene)，OR)对核酸进行染色。抗α-Gal的单克隆抗体获自爱力克斯生物化学公司(Alexisbiochemicals，圣地亚哥，USA)。
超声处理
用4-0聚丙烯缝线(购自Southern Syringes Ltd，南方注射器有限公司)将组织样品(2cm厚)缝合在铝网上。将其置于装有冰冷的PBS的250ml玻璃烧杯中，置冰上。如下对组织样品施加不同的超声处理方案(高强度超声粉碎处理器，600瓦，601型，普罗根科技公司(Progen Scientific)，麦克斯堡(Mexborough)，南约克郡)：将组织样品直接置于探头下，在每次处理后更换PBS。完成后，取出组织，对其进行其余的脱细胞化处理。脉冲方案为：1秒开，1秒关，进行10分钟，然后更换PBS并重复。
半月板压痕(Indentation)
用压痕仪来分析新鲜和脱细胞化的猪半月板在负荷下的变形情况。该装备由一端带有可拆卸的3mm圆柱形硬质扁平压头，另一段与线性可变差接变压器(LVDT)相连的杆体(shaft)，该LVDT用于监测杆体的移动。在LVDT下放置砝码，用手动释放机械装置起始杆体的移动。用陡度定标LVDT，获得标定因素。该LVDT的分辨率为0.001英寸。用油浸式减震器控制杆体的速度。先用6mm直径的切割器切割样品(n＝3)以去除圆柱形塞状物(plug)。从原始栓塞的中央去除测量值为3mm的切片。用双面胶(3M；劳恩堡(Loughborough)，UK)和一滴氰基丙烯酸酯胶将样品固定在样品架的基座上。通过黏稠减震器施加约2N的负荷。将样品浸泡于PBS中。测试进行1小时以上。LVDT使得结果以时间对电压的形式产生。用Lab View 8(National instruments，国家仪器公司，奥斯丁，U.S.A)并使用标定因素获取数据，将结果转化为时间对变形(mm)。
羟脯氨酸的测定
在进行羟脯氨酸测定之前，将样品(n＝3)冷冻干燥至恒重，然后用6M盐酸(HCl)在120℃孵育4小时进行水解，用氢氧化钠(NaOH)中和。所采用的方法基于Edwards和O’Brien[29]所描述的方法。标准定标溶液为反式-4-羟基-L-脯氨酸(西格马，Sigma)。将测试溶液(50μl)加入平底96孔板的孔中，在其中加入100μl氧化溶液(水合氯胺T；西格马)，轻轻晃动下保持5分钟。然后，在各孔中加入艾氏试剂(Ehrlich’s reagent，100μl)。盖上该板，在60℃的水浴中孵育45分钟，然后在570nm处读取吸光值。然后，通过在羟脯氨酸标准曲线上内插确定羟脯氨酸的浓度。
硫酸化糖(sulphated sugar)的测定
在进行硫酸化糖测定之前，冷冻干燥样品(n＝3)至恒重，然后在番木瓜蛋白酶缓冲液(1mg.ml^-1的番木瓜蛋白酶，西格马，溶于pH 6.0含5mM半胱氨酸-HCl(西格马)和5mM Na₂EDTA(VWR)的PBS溶液中)中于60℃酶解消化48小时。所用方法来自Farndale等[30]。简而言之，标准定标溶液为硫酸软骨素(西格马)。将标准或测试溶液(40μl)加入位于平底96孔板孔中的250μl 1，9-二亚甲基蓝溶液中。然后，在1分钟后于525nm读取吸光度。然后通过在标准曲线上内插确定代表了葡糖胺聚糖(GAG)的硫酸化糖所得浓度。
gDNA的提取和存在分析
用组织用DNA分离试剂盒(罗氏应用科学公司，Roche Applied Sciences，印第安纳波利斯，USA)提取基因组DNA(gDNA)。简而言之，用蛋白酶K溶液消化200mg新鲜和脱细胞化的猪半月板组织(n＝3)。随后，施用核糖核酸酶溶液来消化样品中存在的RNA。然后加入蛋白质沉淀溶液，并对样品进行离心(15,000g，20℃，20分钟)。然后在沉淀物中加入异丙醇(0.7体积，VWR)以回收任何存在的DNA。然后在用冰冷的70％(v/v)乙醇中洗涤分离的DNA沉淀物，静置风干，然后重悬浮于tris-EDTA缓冲液中(西格马)。
采用E-胶动力基质系统(E-gel PowerBase system，英维巧根(Invitrogen)，佩思利，UK)对gDNA的存在定性。将干的2％(w/v)琼脂糖E-胶(英维巧根)插入基质，然后加入样品。通过加入加样缓冲液(2μl，英维巧根)制备重悬浮样品(4μl)，以使加样更为方便。然后，将总体积加样到E-胶的各个泳道，随后进行电泳。平行跑出1kb的DNA梯形(福曼塔斯有限公司(Fermentas Inc)，哈顿郡(SheriffHutton)，UK)，以评估分离DNA的大小。用溴化乙啶染色，使其可在柯达胶逻辑1500系统(Kodak Gel Logic 1500 system，东人柯达公司(Eastman KodakCompany)，哈罗(Harrow)，UK)上视觉检查。通过在纳滴分光光度计(Nanodropspectrophotometer，实验室技术国际公司(Labtech Int)，林墨(Ringmer)，UK)中于260-280nm测定吸光度对DNA进行定量。
实施例1
参考图1，其中所示为本发明方法的一种实施方式的代表性流程图。关于图1的方案，超声处理和冻融的次序可相反，但是如下文中所述超声处理、冻融以及用PAA处理对于实现半月板组织完全脱细胞化是必需的。
实施例2
参考图2A-G，其中所示为用直角三角形至接近整个半月板横切面形状表示的半月板图示，以及显示细胞DNA含量的烟酸己可碱染色，其指示了细胞密度。此外，右侧提供了组织切片。图2A-G显示采用不同方案进行脱细胞处理后的猪内侧半月板的DNA含量和组织学(特征)。
图2A显示了新鲜猪内侧半月板和整个组织中细胞的存在，从半月板外部区域到内部区域的细胞DNA含量分布或细胞密度分布是均一的。
用于图2B中的猪内侧半月板脱细胞化方案记载于Booth，C等的“Tissueengineering of cardiac valve prostheses I：Development and histologicalcharacterisation of an accellular porcine scaffold”(心脏瓣膜假体I的组织工程学：无细胞猪支架的开发和组织学特征，Journal of Heart Valve Disease，11，pp.457-462，(2002)。该过程不涉及超声处理或冻融，但其采用了SDS室温孵育步骤。该过程所得的DNA含量结果显示仅去除了半月板外周区域的细胞，而内部区域的细胞仍然存在。图2C中所用的方案是如Booth等所述的方案加上额外的超声处理步骤。结果显示虽然一些内部区域的细胞已随外周细胞一起被去除，半月板的绝大部分中仍然存在细胞。采用与图2C中相同的方案但在升温下(55℃)用阴离子去污剂(SDS)进行脱细胞化处理，结果(图2D)显示虽然大部分的半月板中已完全去除了细胞，但它们仍然存在于半月板的中央部位，虽然其密度有所下降。关于图2E中所用的方案，其显示了在55℃脱细胞化、超声处理和冻融后的半月板。结果显示在中央区域中有低密度的细胞，在维脉管周围集中了绝大多数的细胞。图2F所用的方案中，在55℃(×2)进行脱细胞化、超声处理和冻融，其结果更佳，达到仅残留极少量细胞且细胞被溶解并随机位于半月板的中央的程度。再来看图2G的结果，其中使用了如图1所示的本发明方法：在55℃(×3)进行脱细胞化、超声处理、冻融和PAA处理，可观察到细胞已完全去除。由于细胞的完全去除，烟酸己可碱染色显示完全不存在DNA。
通过各种脱细胞化方案所获得的结果显示：使用本发明的方法可实现完全的脱细胞化，而用任何所测试的不完全方案或其它现有技术方法则无法实现。
实施例3
参考图3A，其中显示了新鲜猪内侧半月板中的细胞分布。半月板的横切面接近于直角三角形(参见图2A-G)，且显示存在脱细胞化问题的区域包括半月板的外部和中央区域，尤其是在位于组织中央深处的微脉管化区域周围。如实施例2A-E所示，可用不完整的本发明的方法脱细胞化的区域是半月板的上方外周和下方外周以及半月板的内侧。参考图3B，其中显示了根据本发明方法脱细胞化的猪内侧半月板的相应切面，其中包括问题性外侧和中央区域在内的半月板完全不含细胞，换言之，该半月板已完全脱细胞化，提供了适于移植入受体的组织。
实施例4
图4所示为新鲜和用本发明的方法脱细胞的脱细胞化半月板随时间的变形图。数据提供了采用压痕法的生物力学测试的例证。结果显示：与新鲜组织相比，脱细胞化半月板具有相似的压缩的生物力学特性，由此具有同样的生理特性，并适于植入受体中。
实施例5
已知异种Gal α 1-3 Gal β 1-4 Glc NAc-R或α-Gal表位引起异种移植中的超急性排斥反应。在组织工程中，残留的α-Gal表位可在人体诱导严重的炎症，并可导致移植失败。图5A显示了由于在新鲜猪内侧半月板中存在α-Gal表位，使用抗α-Gal单克隆抗体的免疫过氧化物酶染色呈阳性。与用本发明方法脱细胞化的半月板相比，图5B中的阴性染色显示不存在该表位。这些结果显示用本发明方法制备的半月板不含α-Gal表位，因此适于植入人类受体中。
实施例6
新鲜猪半月板组织中，每毫克干重组织的羟脯氨酸浓度为143.3(±23.29)μg.mg^-1。脱细胞化处理后，羟脯氨酸的浓度为123.96(±36.3)μg.mg^-1。与脱细胞化组织相比，新鲜组织中的羟脯氨酸含量并不存在显著的差异(ANOVA，p＞0.05)。
实施例7
新鲜猪半月板组织中，每毫克干重组织的硫酸化糖浓度为30.3(±3.9)μg.mg^-1。脱细胞化处理后，硫酸化糖的浓度为12.3(±1.6)μg.mg^-1，表明失重59.4％。与脱细胞化组织相比，新鲜组织中的硫酸化糖含量存在显著的差异(ANOVA，p＜0.05)，指示了GAG的损失。
实施例8
处理脱细胞化半月板组织以提取基因组DNA(gDNA)，琼脂糖凝胶上的上样和电泳证实了：与显示了10,000bp左右的清晰条带(未示出)的新鲜半月板组织相比，脱细胞化半月板组织中不存在gDNA。用分光光度法对结果进行定量验证，其中新鲜组织样品在260-280nm具有吸收峰，指示了gDNA的存在。该峰对应于40(±9.7)ng.mg^-1。对脱细胞化组织，也记录到了对应于2(±0.5)ng.mg^-1的小峰。
综上所述，本发明的方法显示：其可提供完全脱细胞化且呈免疫惰性但保留其物理特性的猪或人供体半月板组织。这样的半月板可用于后继植入受体中，以避免移植排斥或将移植排斥的可能性降至最低，并同时提供与健康半月板相同的强度和功能能力。