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1、10申请公布号CN102004152A43申请公布日20110406CN102004152ACN102004152A21申请号200910189771922申请日20090828G01N33/577200601C07K14/765200601C07K14/77200601C07D251/7020060171申请人深圳市三方圆生物科技有限公司地址518102广东省深圳市宝安区西乡街道桃花源科技创新园B30572发明人钟松清谭攀李细清张世伟54发明名称三聚氰胺胶体金检测卡及其生产和使用方法57摘要本发明涉及一种三聚氰胺体金检测卡及其生产和使用方法，属于免疫学技术领域。该快速诊断卡包括外壳和试纸条，。
2、其特征在于所述外壳壳体开有加样孔和观察窗，所述试纸条安放于外壳内，在PVC衬板的中部叠置硝酸纤维素膜，两端分别叠置吸水垫和样品垫，硝酸纤维素膜和吸水垫、样品垫相搭连，在样品区附置一段含有三聚氰胺单克隆抗体免疫胶体金复合物的膜，在硝酸纤维素膜上有一条含三聚氰胺包被抗原的检测带和一条含羊抗鼠IGG的质控带。本发明是一种快速、准确、灵敏的诊断卡，无需专门仪器，操作简单，能满足食品安全、畜牧业、检测机构的检测要求。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书6页附图1页CN102004165A1/2页21三聚氰胺胶体金检测卡，其特征在于其包括试纸条和外壳两部分，试。
3、纸条置于外壳内。2根据权利要求1所述的三聚氰胺抗体胶体金检测卡，其特征在于所述的试纸条用PVB作为背衬，在PVC衬板的中部叠置硝酸纤维素膜，两端分别叠置吸水垫和样品垫，硝酸纤维素膜和吸水垫、样品垫相搭连，在样品区附置一段含有三聚氰胺单克隆抗体的膜，在硝酸纤维素膜上有一条含三聚氰胺抗原的检测带和一条含羊抗兔IGG的质控带。3三聚氰胺胶体金检测卡的生产方法，其特征在于由下列过程与步骤组成1三聚氰胺免疫半抗原的合成2三聚氰胺免疫抗原的合成；3三聚氰胺单克隆抗体的制备；4胶体金颗粒的制备；5胶体金标记三聚氰胺单克隆抗体；6样品垫的制备，该垫附置一段胶体金标记三聚氰胺单克隆抗体的膜；7三聚氰胺包被抗原的。
4、合成；8三聚氰胺固相硝酸纤维素膜的制备，该膜包被一条含三聚氰胺包被抗原的检测带和一条包被羊抗鼠IGG的质控带；9样品垫的处理选择适当的封闭试剂、表面活性剂和或非离子型去污剂单独或以适当比例组合后均匀浸于玻璃纤维素膜，室温干燥备用；10组装三聚氰胺胶体金检测卡，该检测卡用PVB作为背衬，在PVC衬板的中部叠置硝酸纤维素膜，两端分别叠置吸水垫和样品垫，硝酸纤维素膜和吸水垫、样品垫相搭连。4根据权利要求4所述的三聚氰胺胶体金检测卡的生产方法，其特征在于所述的半抗原具有式I所示结构。5根据权利要求4所述的三聚氰胺胶体金检测卡的生产方法，其特征在于所述的免疫抗原具有式II所示结构。6根据权利要求4所述的。
5、三聚氰胺胶体金检测卡的生产方法，其特征在于所述的包被抗原具有式III所示结构。权利要求书CN102004152ACN102004165A2/2页37三聚氰胺胶体金检测卡的使用方法，其特征在于将30L待检液加入到加样孔中，并充分吹打混匀，放置510分钟内观察结果。权利要求书CN102004152ACN102004165A1/6页4三聚氰胺胶体金检测卡及其生产和使用方法技术领域0001本发明涉及一种三聚氰胺胶体金检测卡，属于免疫学技术领域。背景技术0002三聚氰胺英文名MELAMINE，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，重要的氮杂环有机化工原料。由于食品和饲料工业蛋白质含量测试方法的缺陷，三聚氰胺也。
6、常被不法商人用作食品添加剂，以提升食品检测中的蛋白质含量指标，因此三聚氰胺也被人称为“蛋白精”。0003蛋白质主要由氨基酸组成。蛋白质平均含氮量为16左右，而三聚氰胺的含氮量为66左右。常用的蛋白质测试方法“凯氏定氮法”是通过测出含氮量乘以625来估算蛋白质含量，因此，添加三聚氰胺会使得食品的蛋白质测试含量虚高，从而使劣质食品和饲料在检验机构只做粗蛋白质简易测试时蒙混过关。有人估算在植物蛋白粉和饲料中使测试蛋白质含量增加一个百分点，用三聚氰胺的花费只有真实蛋白原料的1/5。三聚氰胺作为一种白色结晶粉末，没有什么气味和味道，所以掺杂后不易被发现。0004三聚氰胺进入人体后，发生取代反应水解，生成。
7、三聚氰酸，三聚氰酸和三聚氰胺形成大的网状结构，动物长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾部结石，并可进一步诱发膀胱癌。2008年9月，中国爆发三鹿婴幼儿奶粉受污染事件，导致食用了受污染奶粉的婴幼儿产生肾结石病症，其原因正是奶粉中含有三聚氰胺。0005三聚氰胺是小分子化合物，常用的检测方法有高效液相色谱分析法HPLC和气相色谱/质谱联用分析法GC/MS或液相色谱/质谱联用分析法LC/MS。这些方法普遍存在着仪器昂贵，方法复杂，操作烦琐，试剂消耗量大的局限性。20世纪80年代兴起的胶体金免疫层析检测，基于免疫学检测原理，操作简单快捷、结果清晰易于判断、无需复杂的实验技能和设备，特别适。
8、于现场检测。而国内外尚无该技术监控三聚氰胺的报道。发明内容0006针对上诉问题，本发明提供了一种三聚氰胺胶体金检测卡，该快速诊断卡检测快速、准确、稳定。0007本发明的另一个目的是提供该胶体金检测卡的应用。0008上述三聚氰胺胶体金检测卡的制备包括以下步骤00091三聚氰胺半抗原的合成00102三聚氰胺免疫抗原的合成；00113三聚氰胺单克隆抗体的制备；00124胶体金颗粒的制备；00135胶体金标记三聚氰胺单克隆抗体；00146样品垫的制备，该垫附置一段胶体金标记三聚氰胺单克隆抗体的膜；00157三聚氰胺包被抗原的合成；说明书CN102004152ACN102004165A2/6页50016。
9、8三聚氰胺固相硝酸纤维素膜的制备，该膜包被一条含三聚氰胺包被抗原的检测带和一条包被羊抗鼠IGG的质控带；00179样品垫的处理选择适当的封闭试剂、表面活性剂和或非离子型去污剂单独或以适当比例组合后均匀浸于玻璃纤维素膜，室温干燥备用；001810组装三聚氰胺胶体金检测卡，该检测卡用PVB作为背衬，在PVC衬板的中部叠置硝酸纤维素膜，两端分别叠置吸水垫和样品垫，硝酸纤维素膜和吸水垫、样品垫相搭连。0019所述的半抗原具有式I所示结构00200021所述的免疫抗原具有式II所示结构00220023所述的包被抗原具有式III所示结构00240025发明通过以下操作步骤进行牛奶中三聚氰胺检测将30L液态。
10、奶加入到加样孔中，放置510分钟内观察结果。0026发明通过以下操作步骤进行饲料中三聚氰胺检测00271称取待测样品25G放入50ML带盖离心管中，然后加入提取液75ML盖紧盖子充分混匀3MIN。002823000转/分离心5分钟，或用滤纸过滤上清到滤瓶中待检。00293用移液器取样品液30L滴入加样孔中，放置510分钟内观察结果。0030与现有技术相比，本发明具有如下有益效果价格便宜，检测费用低廉，检测速度快，整个检测过程只需要1015分钟，操作简单，无需专门仪器，肉眼观测结果，结果稳定，能满足食品安全、屠宰、饲料、检测机构的检测要求，更方便于现场检测。说明书CN102004152ACN10。
11、2004165A3/6页6附图说明0031图1三聚氰胺胶体金检测卡检测示意图0032其中00331为观测窗00342为加样孔00353为质控带00364为检测带0037图2三聚氰胺胶体金检测卡结构图0038其中00395为样品垫00406为胶体金标记三聚氰胺单克隆抗体玻璃纤维膜00417为吸水膜00428为纤维素膜具体实施方式0043实施例1三聚氰胺半抗原的合成0044称取4氨基丁酸060G，04GNAOH，溶解于20ML水中，室温条件下缓慢加入等量的6氯2，4二氨基1，3，5三嗪。逐步升温至回流状态，反应4H。调节PH6，有沉淀析出。过滤沉淀并用蒸馏水洗涤2遍，得三聚氰胺半抗原05G。004。
12、5制备的半抗原结构为00460047实施例2三聚氰胺免疫抗原的合成0048取三聚氰胺半抗原01MMOL溶于2MLDMF中，搅拌加入275MGDCC和144MGNHS。4下磁力搅拌反应过夜，离心后上清夜为A液，称取BSA140MG溶于10ML浓度为01MOL/L的PBSPH80中。加入DMF1ML，搅拌溶解制备B液，磁力搅拌下，A液逐渐滴入B液中，4下反应12H。离心后，取上清夜，4下用生理盐水透析3D，每天更换3次透析液。得到的全抗原以1MG/ML的浓度分装于05ML离心管中。冻存于20冰箱中。0049制备的免疫抗原结构为0050说明书CN102004152ACN102004165A4/6页7。
13、0051实施例3实验动物免疫0052用半抗原三聚氰胺免疫抗原分别免疫6周雌性BALB/C鼠，每组3只。首次免疫注射时，分别100G/ML的免疫抗原100L，与等量弗氏完全佐剂充分乳化，腹腔直接注射。间隔两周后，取用样的抗原，与100L不完全佐剂乳化，同样方法注射。0053实施例4细胞融合0054在细胞融合前1D或当天拉颈处死昆明鼠，浸泡在70酒精中，体表消毒。用大头针固定昆明鼠在蜡板上，超净工作台上剪开腹部，用小镊子挑起腹膜，注入5MLRPMI1640完全培养液，用手轻轻揉动腹腔，将其体内液体用无菌吸管移入75MLHAT完全培养液75MLRPMI1640完全培养液中加入075ML100HAT液。
14、中，反复23次。用吸管混匀，铺24孔板，每孔加05ML，置于37CO2培养箱中。0055小鼠眼眶放血，收集血清，拉颈处死，70酒精浸泡消毒体表，无菌取出脾脏，放入RPMI1640基础培养液中，并小心剔除筋膜及脂肪，剪碎，置于不锈钢筛100目内，无菌研磨，释放出单个脾细胞，吸取含有脾细胞的液体置于50ML无菌离心管中，离心。0056将骨髓瘤细胞和上述制备好的脾细胞以个数51的比例加入同一50ML的离心管中，加入37温浴的RPMI1640不完全培养液20ML，混合均匀，离心1500R/MIN，6MIN。除上清，用手指轻击离心管底部，使沉淀混匀如糊状。用移液管取37预热的PEG1ML，滴入离心管，静。
15、置1MIN后，于37水浴中在2MIN内滴加RPMI1640完全培养液10ML。1000R/MIN离心6MIN，弃去上清，加75MLHAT培养液，轻轻混匀，将混匀悬液分装于有饲养细胞的24孔板中，每孔05ML，于37、5CO2饱和湿度的培养箱中孵育。0057实施例5杂交瘤细胞的培养和筛选0058融合后69D，用HT培养液半量换液1次，在1214D后根据增殖情况改用完全培养液。待细胞贴壁至占板孔1/3时，计杂交瘤细胞生长的孔数及细胞总数。取上清液，间接ELISA选择效价高和间接竞争ELISA选择药物抑制强的阳性杂交瘤细胞。0059采用间接ELISA和间接竞争ELISA法进行阳性杂交瘤细胞筛选，显示。
16、阳性并出现竞争抑制反应的孔为产三聚氰胺抗体的孔，并可用于进一步的亚克隆。0060无菌条件下，洗脱阳性孔内的细胞，用弯头吸管将细胞转移至预先以饲养细胞铺板的96孔培养板中，每个原始孔克隆成8孔，待细胞贴壁长满1/21/3孔底后，取上清液，间接ELISA检测。取呈阳性强的亚克隆，如此反复25次，待所克隆的8个孔上清液中抗体阳性率为100时，挑取单细胞克隆，检测为全阳性者转移至24孔细胞培养板或25ML细胞培养瓶扩大培养，建株并以分装、冻存。提前一周注射05ML降植烷至BALB/C小鼠腹腔。取冻存细胞株，复苏后，经大量培养繁殖，收集细胞，用不完全培养基洗涤二次后，再用10ML不完全培养基悬浮，计数。。
17、将细胞每只小鼠1ML，含31107个细胞腹腔注射小鼠腹部，1015D后，待小鼠腹部明显膨大时用16号注射器无菌采集腹水。2000R/MIN离心10MIN，去除上层脂肪和下层纤维蛋白及细胞，收集中层，取部分ELISA法测定其效价，其余分装70冻存备用。0061实施例6三聚氰胺单克隆抗体的制备和纯化0062取腹水约3ML，加入2倍体积的006MOL/L、PH45醋酸钠缓冲液。将正辛酸33G/ML腹水逐滴慢慢加入样品中，边加边搅拌，加完后继续搅拌30MIN，4下10000R/MIN离心30MIN，去沉淀白蛋白和其它非IGG蛋白。取上清经045M微孔膜过滤，与说明书CN102004152ACN1020。
18、04165A5/6页81/10体积10PBS混合10PBS80GNACL、2GKCL、115GNA2HPO4、2GKH2PO4、05845GEDTA、1000ML蒸馏水，PH74，用1MOL/LNAOH溶液调PH值到74。上清冷却到4，加硫酸铵0277G/ML，使最终饱和度为45。搅拌30MIN，4下10000R/MIN离心30MIN，弃上清。用少量PBS溶液溶解沉淀，用50100倍体积的PBS透析过夜，换液3次。透析后的溶液用PEG6000适当浓缩，4下贮藏备用。0063实施例7三聚氰胺包被抗原的制备0064取三聚氰胺半抗原01MMOL溶于2MLDMF中，搅拌加入275MGDCC和144MG。
19、NHS。4下磁力搅拌反应过夜，离心后上清夜为A液，称取BSA140MG溶于10ML浓度为01MOL/L的PBSPH80中。加入DMF1ML，搅拌溶解制备B液，磁力搅拌下，A液逐渐滴入B液中，4下反应12H。离心后，取上清夜，4下用生理盐水透析3D，每天更换3次透析液。得到的全抗原以1MG/ML的浓度分装于05ML离心管中。冻存于20冰箱中。0065制备的包被抗原结构为00660067实施例8胶体金颗粒的制备0068取1氯金酸溶液1ML，加99ML超纯水成终浓度001的氯金酸溶液，加热沸腾后，取1柠檬酸三钠16ML一次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，。
20、颜色稳定后继续加热5MIN，室温冷却，补充失水至原体积。0069实施例9胶体金标记三聚氰胺单克隆抗体复合物的制备0070当蛋白质的最适稳定量及标记的最佳PH值被确定以后便可进行标记。具体步骤如下按最低稳定量的120计算出所需待标记蛋白质的总量。在磁力搅拌下，将蛋白质溶液加入胶体金溶液中PH已调至5962，加入蛋白质时应逐滴加入，1MG的蛋白质大约5MIN加完。分别取1ML胶体金葡萄球菌A蛋白结合物液实验组和1ML胶体金原液对照组于试管中加10氯化钠溶液01ML，室温静置1H，观察结果如果对照组试管溶液由红色转为蓝色，甚至可以看到聚合物沉淀，而实验组溶液仍保持红色，无沉淀，方可继续下一步实验，否。
21、则需补加标记用蛋白葡萄球菌A蛋白。最后加入终浓度为02的聚乙二醇PEGMW20000，继续搅拌30MIN。0071实施例10样品垫的制备0072保存液稀释胶体金标记单克隆三聚氰胺抗体复合物原液至工作浓度，按比例均匀浸于玻璃纤维素膜，20冻存，冷冻真空干燥后，密封保存。0073实施例11三聚氰胺包被抗原固相硝酸纤维素膜的制备0074取三聚氰胺包被抗原2MG/ML用001MOL/L的PB缓冲液PH72以250G/ML间隔，经BIODOT型XYZ3000点样仪DISPENSER线形包被于硝酸纤维素膜的观察结果的测试反应区，定义为检测带，距离检测带5MM远的质控带用DISPENSER线形包被正常兔IG。
22、G2MG/ML。37干燥2H，4密封保存见图2。说明书CN102004152ACN102004165A6/6页90075实施例12试纸条组装0076用PVB作为背衬，在PVC衬板的中部叠置硝酸纤维素膜，两端分别叠置吸水垫和样品垫，硝酸纤维素膜和吸水垫、样品垫相搭连见图2。0077实施例13检测卡的使用0078称取饲料待测样品25G放入50ML带盖离心管中，然后加入提取液75ML盖紧盖子充分混匀3MIN。3000转/分离心5分钟，或用滤纸过滤上清到滤瓶中待检。用移液器取样品液80L或用滴管取34滴滴入样品孔中，并充分吹打混匀，将试纸条插入到微孔中，放置510分钟内观察结果。参看图1，如质控线编号3位置处出现红色条带，检测线编号4位置处不显色则样品为阳性；如质控线和检测线均出现红色条带，则样品为阴性；如质控线不显色则检测结果无效。说明书CN102004152ACN102004165A1/1页10图1图2说明书附图CN102004152A。