鱼类生理活性剂和养鱼用饲料添加剂 本发明涉及鱼类生理活性剂和养鱼用饲料添加剂。
通常，虾青素等类胡萝卜素色素或其组合物作为饲料添加剂被用于鳗鱼、泥鳅、香鱼、比目鱼、真鲷和对虾等鱼类、尤其是它们的幼苗的养殖。这些饲料添加剂已被证明在改善鱼类体色和提高养殖产量等方面是有效的。参见日本发明公开公报No.4-349856(1992)、No.4-63551(1992)、No.4-63552(1992)、No.4-158749(1992)和No.4-53455(1992)。
另一方面，含大量类胡萝卜素色素的光合细菌已被用于渔业生产。例如，日本发明公告公报No.44-1353(1969)公开了一种使用紫色硫细菌或紫色非硫细菌作为饲料进行小甲壳动物类、鱼类和有壳的水生动物的养殖的方法，日本发明公开公报1983年第175451号公开了一种通过将这些细菌添加在商品化的配合饲料中来进行虾蟹类养殖的方法。这些细菌已被证明能够提高鱼类等的产量、促进其生长。使用添加在商品化的配合饲料中的紫色非硫细菌进行的海洋鱼类养殖的方法已被应用于实际生产。
因此，类胡萝卜素色素类已经被证明是有效的。然而，从自然界分离类胡萝卜素色素和进行光合成，成本很高，因此，这些色素价格昂贵。而且，尽管紫色硫细菌和紫色非硫细菌的体内含有大量类胡萝卜素色素，但其大量培养比较困难，因为即使在光、温度和培养基等培养条件得到改善的情况下，仍需要5天以上。为了获得满意的产量，不得不在饲料中以相当于饲料干重的0.1％以上的比例来添加含有大量类胡萝卜素色素的紫色硫细菌和/或紫色非硫细菌，以致饲料效率降低。因此，有必要发现其他种类地能提高饲料效率的光合细菌。
本发明的目的在于提供一种鱼类生理活性剂和一种能容易地大量生产并且具有优异的饲料添加剂效率，因而是经济的养鱼用饲料添加剂。
为解决上述问题，本发明者对各种光合细菌进行了细致的调查，结果发现，绿色硫细菌具有下述优点。
与紫色硫细菌和紫色非硫细菌同样，用作鱼类生理活性剂的绿色硫细菌在其体内含有大量类胡萝卜素色素。而在预定条件下培养绿色硫细菌所需要的时间远较培养紫色硫细菌和紫色非硫细菌所需的时间少。一般地，绿色硫细菌在24小时内能增殖至109/ml以上的高浓度。培养绿色硫细菌所需的培养基成本低廉，因此，其大量培养容易和经济。绿色硫细菌可稳定地培养，即使在继代培养阶段省略灭菌和无菌操作，也不用担心不良微生物的繁殖。而且，绿色硫细菌不会使鱼厌食或产生毒性，相反，与紫色硫细菌和紫色非硫细菌比较，它能显著促进鱼类的摄食和生长。
基于上述发现，本发明者认为绿色硫细菌最适于用作鱼的饲料添加剂，并由此完成了本发明。
综上所述，本发明提供了一种含有有效成分绿色硫细菌的鱼类生理活性剂。
本发明还提供了一种含用上述生理活性剂的养鱼用饲料添加剂。
大体上，光合细菌可分为紫色硫细菌(红螺菌科)、紫色非硫细菌(着色菌科)绿色硫细菌(绿色硫菌科)等。已经知道，紫色硫细菌和紫色非硫细菌具有生理活性，例如促进鱼类生长，而绿色硫细菌具有同样活性则迄今尚未为人们所了解。绿色硫细菌是一种利用硫化氢、胶态硫、硫代硫酸盐和作为电子供体的分子氢进行厌氧性光合作用的绿色光合细菌，可仅靠光合作用生存而不需要任何生长因子。与紫色硫细菌明显地不同，绿色硫细菌在其各细胞中具有独立的、囊状结构的光合作用体系，该系统含少量的细菌叶绿素和绿菌属叶绿素。能量能够在这二种色素之间进行转移。属于绿菌属的绿色硫细菌在有少量的乙酸与H2S(硫化氢)共存的情况下发生同化作用。
迄今为止，绿色硫细菌未被认为是有效的鱼类生理活性剂和养鱼用饲料添加剂，其原因可能是由于人们以为其大量培养比较困难。本发明揭示了在较短时间内进行绿色硫细菌的大量培养所需的最佳条件，同时显示，将绿色硫细菌用作生理活性剂，可明显地有助于改善鱼类的摄食能力，从而提高饲料效率。
可用于本发明的代表性绿色硫细菌包括泥生绿菌(ATCC17092，DSM245)、弧形绿菌属(DSM260)、褐杆状绿菌(DSM266)、褐弧状绿菌(DSM269)、Chlorobium chlorovibrioides(DSM1377)、江口突柄绿菌属(DSM271)、Prosthecochloris phaeoast-eroides(DSM1378)、Chlorobium tepidurr(ATCC49652)、乙基绿假单胞菌、格形暗网菌、微黄暗网菌(DSM273)、Pelodictyonphaeum(DSM728)、硫格状绿菌、Ancalochloris perfilievii和其他可人工培养的绿色硫细菌。其中尤以绿菌属的绿色硫细菌为宜，因为它们易于得到并且适于大量培养。
培养所需的温度、pH等条件系根据绿色硫细菌的种类及其适宜的增殖条件而有所不同。作为较理想的培养绿色硫细菌所需要的基本条件，制备略呈酸性的培养基(一般地，在约6.5至7.5的pH范围内)，添加硫化钠和硫代硫酸钠，使它们的浓度比培养紫色硫细菌时高，另外，调节培养容器表面上的照明强度至不低于2000勒克司。培养以在完全无氧的条件下、于约20～30℃的温度、使用含约0.05％浓度的、作为有机成份添加的乙酸钠的培养基进行为优选。
养鱼用的饲料的例子包括鲸食等原料、以及含鱼粉、作为主要成份的淀粉等、和作为添加剂的增稠剂、维生素、矿物质等的配合饲料。饲料通常是以糊团或颗粒形式供给。当在饲料中添加绿色硫细菌作为鱼饲料添加剂时，将含绿色硫细菌的培养基或细菌本身用水稀释或不加稀释，然后添加并混合于饲料颗粒中。也可以用培养基浸渗饲料颗粒。
绿色硫细菌在本发明中的应用并不仅限于养鱼饲料添加剂。例如，含维生素、矿物质、氨基酸等的绿色硫细菌也可以用作营养素。总之，绿色硫细菌可有效地用作鱼类生理活性剂。
添加于饲料中的绿色硫细菌的比例以干物计，以约0.1％(重量)为宜。如果使用含绿色硫细菌的培养基，则根据培养液中细菌的浓度，以在饲料中添加约1至50％的比例的培养液为宜。细菌比例若小于上述数值，则改善鱼类摄食效果不明显。但若细菌比例高于上述数值，也不会获得任何额外效果。
如上所述，本发明的生理活性剂含有作为有效成分的绿色硫细菌。由于绿色硫细菌与传统使用的紫色硫细菌和紫色非硫细菌同样，在其体内含有大量的类胡萝卜素色素，因此，作为生理活性剂，可有效地改善鱼类体色和产量。而且，与紫色硫细菌和紫色非硫细菌不同，培养绿色硫细菌所需时间明显较少。一般地，绿色硫细菌在24小时内即可增殖至大于109/ml的高浓度。绿色硫细菌的培养基成本低廉，因此，其大量培养容易而且经济。绿色硫细菌可稳定地培养，即使在继代倍养阶段省略灭菌和无菌操作，也不用担心不良微生物的繁殖。最值得注意的是，含绿色硫细菌的生理活性剂不会使鱼类厌食和产生任何毒性，相反，能改善鱼类的摄食，从而促进鱼类生长。
实施例1
在35cm×35cm×40cm的容器的底部铺垫直径约10mm的砂砾至约3cm厚，然后，在容器中加入35升水。再将200克约10cm长的泥鳅放入容器中，在下述条件下室外培养43日，进行养殖试验。
水温：26±2℃。使用一带传感器的150瓦加热器。
通气：约5升/分。使用一专用滤器进行微泡通气。
饲料：往养殖试验组的容器中加入用5ml含光合细菌的培养基浸渗过的约5克养殖泥鳅用的饲料糊团(中等规格)(从中部饲料公司购得)，在对照试验组中，往容器中加入用水渍浸过的饲料糊团。
为避免阳光的直射，用板将容器的一半盖住。
试验分成三部分：(a)一部分系加入含绿色硫细菌的饲料(为实施例1)；(b)另一部分系加入含紫色非硫细菌的饲料(为参照例)；(c)还有一部分系加入不含光合细菌的饲料(为对照例)。
下表1显示其饲料效率。
表1
a.绿色硫细菌 b.紫色非硫细菌 c.对照初始重量(g) 200 200 200试验后重量(g) 361 342 338重量增加(g) 161 142 138饲料量(g) 210 210 210饲料效率(％) 76.6 67.6 67.5重量增加比率(％) 180.5 171.0 169.0
在表1中，“初始重量”表示在实验开始时的泥鳅的总重量(g)，“试验后重量”表示在试验结束时的泥鳅的总重量(g)，“重量增加”表示[(试验后重量)－(初始重量)](g)，“饲料量”表示在试验过程中加入的饲料总量(g)，“饲料效率”表示[(重量增加)/(饲料量)×100](％)，“重量增加比率”表示[(试验后重量)/(初始重量)×100](％)。
由表1可知，与参照例和对照例相比，本实施例的含绿色硫细菌的饲料提高了饲料效率和重量增加比率。
在评定饲料效率之前，先对培养绿色硫细菌(为本实施例)、紫色非硫细菌和紫色硫细菌(为参照例)所需要的时间互相进行了比较。
将属于绿色硫菌属的绿色硫细菌在30℃的温度和5000勒克司的光照下培养1天，使用的培养基的pH为6.8±0.2，含0.5克磷酸二钾、0.5克硫酸铵、0.2克硫酸镁、0.05克氯化钙、0.1克氯化钠、1.0克碳酸氢钠、1.0克硫化钠、1.0克硫代硫酸钠、微量的EDTA、微量的EDTA-铁盐、微量的EDTA-钴盐、微量的硼酸、微量的硫酸铜、微量的硫酸锌、微量的钼酸钠、微量的氯化镍、微量的氯化镁、和1000毫升水。
将属于红螺菌属的紫色非硫细菌在30℃的温度和5000勒克司的光照下培养6天，使用的培养基的pH为7.0±0.2，含0.5克磷酸二钾、0.5克硫酸铵、0.2克硫酸镁、0.05克氯化钙、0.5克碳酸氢钠、0.5克酵母抽提物、0.5克丙酸钠、微量的EDTA、微量的EDTA-铁盐、微量的EDTA-钴盐、微量的硼酸、微量的硫酸铜、微量的硫酸锌、微量的钼酸钠、微量的氯化镍、微量的氯化镁、和1000毫升水。
将属于着色菌属的紫色硫细菌在30℃的温度和5000勒克司的光照下培养6天，使用的培养基的pH为8.2±0.2，含0.5克磷酸二钾、0.5克硫酸铵、0.2克硫酸镁、0.05克氯化钙、1.0克碳酸氢钠、1.0克丁二酸、1.0克苹果酸、0.5克硫化钠、0.5克硫代硫酸钠、微量的EDTA、微量的EDTA-铁盐、微量的EDTA-钴盐、微量的硼酸、微量的硫酸铜、微量的硫酸锌、微量的钼酸钠、微量的氯化镍、微量的氯化镁、和1000毫升水。
然后，用比色计测定这些细菌的浓度。结果，用作参照的紫色非硫细菌和紫色硫细菌在6天的培养期内增殖至109/ml的浓度，而本实施例的绿色硫细菌在3.5小时内增殖至108/ml的浓度，在20小时内增殖至9×108/ml的浓度，在24小时内增殖至109/ml以上的浓度。
如上所述，绿色硫细菌已被确认具有优良的饲料添加剂效率和极短的培养期。这表明，绿色硫细菌可被容易并且经济地大量培养。实施例2
在30cm×30cm×40cm的容器的底部铺垫海砂至约3cm厚，然后，在容器中加入35升水。再往容器中放入49克约10cm长的小鳗鱼，在下述条件下室内培养28天，进行养殖试验。
水温：28±2℃。使用一带传感器的150瓦加热器。
通气：约4升/分。使用一专用滤器进行微泡通气。
饲料：在养殖试验组中，用网眼供料箱(7毫米网眼)往容器中加入用6毫升含光合细菌的培养基捏和的约4克养殖幼鱼用的饲料糊团(从中部饲料公司购得)用与上述相同的方法往对照组的容器中加入用6毫升的水捏和的饲料。
与实施例1同样，试验分成三部分：(a)一部分系加入含绿色硫细菌的饲料(为实施例2)；(b)另一部分系加入含紫色非硫细菌的饲料(为参照实施例)；(c)还有一部分系加入不含光合细菌的饲料(为对照例)。
下表2显示其饲料效率。
表2
a.绿色硫细菌 b.紫色非硫细菌 c.对照初始重量(g) 49 49 49试验后重量(g) 66 60 58重量增加(g) 17 11 9饲料量(g) 69 69 69饲料效率(％) 24.6 15.9 13.0重量增加比率(％) 134.7 122.4 118.4
在表2中，“初始重量”、“试验后重量”、“重量增加”、“饲料量”、“饲料效率”和“重量增加比率”与表1中的意义相同。
由表2可见，与参照例和空白组相比，本实施例的含绿色硫细菌的饲料提高了饲料效率和幼鱼的重量增加比率。
在本发明的上述实施例中，使用了泥鳅和鳗鱼幼鱼，但并不仅限于此，绿色硫细菌不会使鱼类厌食和产生任何毒性，相反，有改善摄食，从而促进鱼类的生长。此外，在预定条件下培养绿色硫细菌所需要的时间比培养紫色硫细菌或紫色非硫细菌所需的时间少。而且，绿色硫细菌所需的培养基成本低廉，因此，可容易且经济地进行细菌的大量培养。还有，绿色硫细菌可稳定地培养，即使在继代培养阶段省略灭菌和无菌操作，也不用担心不良微生物的繁殖。本发明的目的正在于利用这些优点。因此，本发明可普遍地适用于各种鱼类，即，不仅是淡水鱼，而且包括海水鱼。实施例3
将两组60条平均体重0.2克的鲷鱼幼鱼放入两只75cm×45cm×45cm的容器中养殖一个月。
在对照组中，加入养殖鲷鱼用的配合饲料，在试验组中，加入含2％比例的绿色硫细菌培养基的相同饲料。
表3
试验组 对照组初始重量(g) 12.0 12.0试验后重量(g) 300.0 264.0重量增加(g) 288.0 252.0饲料量(g) 239.0 239.0饲料效率(％) 120.5 105.4重量增加比率(％) 2500 2200
结果，加入含绿色硫细菌的培养基的试验组的鲷鱼生长情况优于对照组。
在试验过程中，试验组的鲷鱼幼苗的生存率为98.3％，而对照组的鲷鱼幼苗的生存率为90.0％。因此，含有绿色硫细菌的培养基使鲷鱼幼苗的存活情况得到了改善。
综上所述，本发明提供了一种含有有效成份绿色硫细菌的鱼类生理活性剂。含作为饲料添加剂的生理活性剂的饲料可有效地改善鱼类的体色和产量，具有与传统上使用的紫色硫细菌和紫色非硫细菌同样的效果。而且，与传统上使用的紫色硫细菌和紫色非硫细菌不同，绿色硫细菌的培养期非常短，即，绿色硫细菌可在短时间内增殖至高浓度，所要求的培养基成本低廉。因此，包含绿色硫细菌的生理活性剂非常适于大量生产。此外，与传统上使用的紫色硫细菌和紫色非硫细菌相比，本发明的生理活性剂不会使鱼类厌食和产生任何毒性，相反，能改善鱼类的摄食，从而作为一种饲料添加剂，产生了非常高的效率。