含银猪无细胞真皮及其制备方法 【技术领域】
本发明涉及组织工程领域，特别是涉及一种含银猪无细胞真皮及其制备方法。
背景技术
在救治大面积烧伤患者过程中，如何利用有限的皮源尽早封闭创面是较难解决的问题之一。临床上有时采用微粒皮或表皮细胞培养移植的方法来扩大皮源的覆盖面积，以使创面尽快封闭。虽然这些皮源可以封闭创面，但是由于缺乏真皮成分的支持，致使愈合率低，甚至出现严重的水疱、破溃及瘢痕挛缩等附加病症。
目前大量研究人员在为表皮细胞提供支持、提高创面愈合质量等方面展开了多方面的研究工作。经过多年研究发现，猪皮来源广泛，生物性状与人皮相近，经过一系列处理去除表皮及真皮内可诱发宿主排斥反应的细胞成分，保留完整的纤维组织及基底膜等细胞外间质成分后制成的无细胞真皮既无免疫原性，又提供了近似于正常结构的真皮支架，可以促进表皮细胞的生长分化和表皮-真皮交界区正常结构的形成。猪无细胞真皮作为皮源的优点在于为成纤维细胞提供良好的支架，有利于成纤维细胞对无细胞真皮胶原成分的改建，并形成形态结构及排列分布正常的胶原纤维，促进创面的高质量愈合。但是在临床应用方面猪无细胞真皮也存在以下不足之处：无细胞真皮本身无抗感染能力，对创面的清洁程度要求较高，而重度烧伤、创伤创面本身感染一般比较严重，因此移植猪无细胞真皮后经常出现感染的情况，影响移植的效果。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种含银猪无细胞真皮及其制备方法，有效解决现有猪无细胞真皮移植后感染发生率高等缺陷。
为实现上述目的，本发明提供了一种含银猪无细胞真皮的制备方法，包括：
猪皮预处理；
猪皮剖层；
皮片灭菌；
皮片去细胞处理；
皮片活性银溶液处理。
所述猪皮为4-6月龄的巴马香猪皮肤。
在上述技术方案中，所述猪皮预处理具体为：
原料猪皮外观检查；
刷洗所述猪皮；
将刷洗后的猪皮刮毛。
所述刷洗所述猪皮具体为：用皂粉水多次刷洗所述猪皮的正反两面直至洁净，再用重量百分比为3-8％碘伏刷洗所述猪皮。
所述猪皮剖层具体为：将预处理后的猪皮剖去表皮和皮下组织层，得到厚度为0.1-1.0毫米的皮片。
所述皮片灭菌具体为：将皮片用重量百分比为0.05-0.2％新洁而灭漂洗12-18分钟。
所述皮片去细胞处理具体为：将皮片用重量百分比为0.1-0.2％曲通X-100溶液于温度22-28℃下处理22-26小时。
所述皮片活性银溶液处理具体为：将皮片于温度35-40℃下在重量百分比为0.02-0.1％活性银溶液中浸泡12-18分钟。
为实现上述目的，本发明还提供了一种采用所述含银猪无细胞真皮的制备方法制备的含银猪无细胞真皮。
本发明提供了一种含银猪无细胞真皮及其制备方法，具有以下优点：
1、由于本发明含银猪无细胞真皮经过活性银离子溶液的处理，因此猪无细胞真皮具有主动抑菌的作用，降低了其移植后的感染发生率。
2、本发明含银猪无细胞真皮在脱除了基质中原有的免疫原性细胞成分的同时，还保留了皮肤组织的基本结构和完整的胶原纤维支架。
3、本发明含银猪无细胞真皮含有具有抑菌作用的银离子，为临床应用提供了一种具有主动抑菌功能的良好的真皮替代物。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
【附图说明】
图1为本发明含银猪无细胞真皮及其制备方法中含银猪无细胞真皮的制备方法流程图；
图2为本发明含银猪无细胞真皮及其制备方法中猪皮预处理流程图。
【具体实施方式】
图1为本发明含银猪无细胞真皮及其制备方法中含银猪无细胞真皮的制备方法流程图，具体为：
步骤1、猪皮预处理；
步骤2、猪皮剖层；
步骤3、皮片灭菌；
步骤4、皮片去细胞处理；
步骤5、皮片活性银溶液处理。
图2为本发明含银猪无细胞真皮及其制备方法中猪皮预处理流程图，在图1所示技术方案中，步骤1具体为：
步骤11、原料猪皮外观检查；
步骤12、刷洗所述猪皮；
步骤13、将刷洗后的猪皮刮毛。
下面通过具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
第一实施例
步骤101、选择4月龄的巴马香猪皮肤作为原料猪皮，对原料猪皮进行外观检查，原料猪皮呈现正常的白色，皮肤表面光滑平整，毛皮无瘀血、无常见皮肤病，猪毛细而少，毛孔小；
步骤102、用皂粉水刷洗检查后的猪皮正反两面三次直至洁净，去除边角废料及大块脂肪等不洁净部分，再用重量百分比为3％碘伏刷洗猪皮，最后用大量清水洗净；
步骤103、将刷洗后的猪皮先用磨刀粗刮毛，用清水将猪皮冲洗干净，再用小剃刀细刮毛，用清水搓洗干净；
步骤104、将刮毛后的猪皮打薄，去除皮下脂肪，得到皮片，用鼓式取皮机将皮片剖去表皮和皮下组织后，只剩下真皮部分，厚度为0.1毫米，将皮片裁剪成所需的规格尺寸，用清水搓洗干净，并清洗毛孔中的毛根；
步骤105、将剖层后的皮片用重量百分比为0.05％新洁而灭漂洗18分钟进行灭菌，再用大量清水清洗3次，直至水澄清、无杂质；
步骤106、将灭菌后的皮片进行去细胞处理，用重量百分比为0.1％曲通X-100(TritonX-100)溶液于温度22℃下振荡处理皮片26小时，再用大量灭菌水清洗3次，每次清洗15分钟，直至水澄清、无杂质；
步骤107、将经去细胞处理后的猪无细胞皮片进行活性银溶液处理，将皮片于温度35℃下在重量百分比为0.02％活性银溶液中浸泡18分钟，取出，即为含银猪无细胞真皮。
一种采用上述含银猪无细胞真皮的制备方法制备的含银猪无细胞真皮。
第二实施例
步骤201、选择5月龄的巴马香猪皮肤作为原料猪皮，对原料猪皮进行外观检查，原料猪皮呈现正常的白色，皮肤表面光滑平整，毛皮无瘀血、无常见皮肤病，猪毛细而少，毛孔小；
步骤202、用皂粉水刷洗检查后的猪皮正反两面四次直至洁净，去除边角废料及大块脂肪等不洁净部分，再用重量百分比为5％碘伏刷洗猪皮，最后用大量清水洗净；
步骤203、将刷洗后地猪皮先用磨刀粗刮毛，用清水将猪皮冲洗干净，再用小剃刀细刮毛，用清水搓洗干净；
步骤204、将刮毛后的猪皮打薄，去除皮下脂肪，得到皮片，用鼓式取皮机将皮片剖去表皮和皮下组织后，只剩下真皮部分，厚度为0.5毫米，将皮片裁剪成所需的规格尺寸，用清水搓洗干净，并清洗毛孔中的毛根；
步骤205、将剖层后的皮片用重量百分比为0.1％新洁而灭漂洗15分钟进行灭菌，再用大量清水清洗4次，直至水澄清、无杂质；
步骤206、将灭菌后的皮片进行去细胞处理，用重量百分比为0.15％曲通X-100(TritonX-100)溶液于温度25℃下振荡处理皮片24小时，再用大量灭菌水清洗4次，每次清洗15分钟，直至水澄清、无杂质；
步骤207、将经去细胞处理后的猪无细胞皮片进行活性银溶液处理，将皮片于温度37℃下在重量百分比为0.05％活性银溶液中浸泡15分钟，取出，即为含银猪无细胞真皮。
一种采用上述含银猪无细胞真皮的制备方法制备的含银猪无细胞真皮。
第三实施例
步骤301、选择6月龄的巴马香猪皮肤作为原料猪皮，对原料猪皮进行外观检查，原料猪皮呈现正常的白色，皮肤表面光滑平整，毛皮无瘀血、无常见皮肤病，猪毛细而少，毛孔小；
步骤302、用皂粉水刷洗检查后的猪皮正反两面五次直至洁净，去除边角废料及大块脂肪等不洁净部分，再用重量百分比为8％碘伏刷洗猪皮，最后用大量清水洗净；
步骤303、将刷洗后的猪皮先用磨刀粗刮毛，用清水将猪皮冲洗干净，再用小剃刀细刮毛，用清水搓洗干净；
步骤304、将刮毛后的猪皮打薄，去除皮下脂肪，得到皮片，用鼓式取皮机将皮片剖去表皮和皮下组织后，只剩下真皮部分，厚度为1.0毫米，将皮片裁剪成所需的规格尺寸，用清水搓洗干净，并清洗毛孔中的毛根；
步骤305、将剖层后的皮片用重量百分比为0.2％新洁而灭漂洗12分钟进行灭菌，再用大量清水清洗5次，直至水澄清、无杂质；
步骤306、将灭菌后的皮片进行去细胞处理，用重量百分比为0.2％曲通X-100(TritonX-100)溶液于温度28℃下振荡处理皮片22小时，再用大量灭菌水清洗5次，每次清洗15分钟，直至水澄清、无杂质；
步骤307、将经去细胞处理后的猪无细胞皮片进行活性银溶液处理，将皮片于温度40℃下在重量百分比为0.1％活性银溶液中浸泡12分钟，取出，即为含银猪无细胞真皮。
一种采用上述含银猪无细胞真皮的制备方法制备的含银猪无细胞真皮。
下面通过具体的抑菌实验比较了含银猪无细胞真皮和猪无细胞真皮的抑菌效果。
菌种选用创伤科病人创面常见的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、阴沟杆菌、肺炎克雷伯氏杆菌和绿脓杆菌，将上述的纯菌移入肉汤或生理盐水分别配制成浓度为1.5×108pfu/ml的菌液，制备好的菌液分别均匀地涂布于琼脂平皿(直径90毫米)。实验选用的皮片为含银猪无细胞真皮和普通猪无细胞真皮，将两种皮片均用灭菌处理过的空心冲在无菌条件下冲成直径为6毫米的圆形皮片。将制备好的两种圆形皮片同时置于上述各菌种的培养皿中，每种菌的培养皿分为两个小区，分别放置两种皮片，然后将各菌种的培养皿均放入温度为35℃温箱进行培养。培养24小时后，将各培养皿取出，观察各菌种的抑菌圈，准确测量抑菌圈的直径，并用数码相机于0.5米的高度垂直拍照，每种菌重复处理20次，各项结果取平均值。实验结果显示：含银猪无细胞真皮在金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、阴沟杆菌、肺炎克雷伯氏杆菌和绿脓杆菌的抑菌圈直径分别为19毫米，24毫米，25毫米，28毫米，24毫米，而普通猪无细胞真皮在各菌种的抑菌圈直径分别为6毫米，7毫米，6毫米，8毫米，7毫米。这一实验结果充分表明含银猪无细胞真皮的抑菌效果明显高于普通猪无细胞真皮。
因此，本发明含银猪无细胞真皮由于经过活性银离子溶液的处理，具有主动抑菌的作用，降低了其移植后的感染发生率；同时，本发明含银猪无细胞真皮不仅脱除了基质中原有的免疫原性细胞成分，还保留了皮肤组织的基本结构和完整的胶原纤维支架，同时本发明含有具有抑菌作用的银离子，为临床应用提供了一种具有主动抑菌功能的良好的真皮替代物。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。