制备微粒的方法.pdf

本发明公开了制备微粒的方法，特别是制备壳多糖微粒(CMP)的方法，其包括用(高剪切)微流化仪器减小(较大)颗粒的尺寸。

1.  通过降低颗粒尺寸而制备微粒聚集体的方法，其包括：
(a)制备颗粒聚集体的悬浮液；
(b)使所述悬浮液通过微流化仪器以使所述颗粒聚集体中所述颗粒的平均直径降低至期望的平均值；
其中，所述颗粒是不溶性多糖颗粒。

2.  如权利要求1所述的方法，其中所述不溶性多糖颗粒是壳多糖颗粒或脱乙酰壳多糖颗粒。

3.  如权利要求1所述的方法，其中所述不溶性多糖颗粒为壳多糖颗粒。

4.  如权利要求1至3中任一权利要求所述的方法，其中所述期望的平均直径小于等于50μm。

5.  如权利要求1至3中任一权利要求所述的方法，其中所述期望的平均直径为1至20μm。

6.  如权利要求1至3中任一权利要求所述的方法，其中所述期望的平均直径为1至15μm。

7.  如权利要求1至3中任一权利要求所述的方法，其中所述期望的平均直径为可吞噬的尺寸。

8.  如权利要求1至7中任一权利要求所述的方法，其中所述微粒聚集体中至少50％的所述微粒的直径为1至20μm。

9.  如权利要求1至7中任一权利要求所述的方法，其中所述微粒聚集体中至少80％的所述微粒的直径为1至20μm。

10.  如前述任一权利要求所述的方法，所述方法包括使所述悬浮液通过所述微流化仪器至少7次。

11.  如权利要求1至9中任一权利要求所述的方法，所述方法包括使所述悬浮液通过所述微流化仪器至少9次。

12.  如前述任一权利要求所述的方法，所述方法包括在使所述悬浮液通过所述微流化仪器前对所述颗粒进行筛选。

13.  如权利要求12所述的方法，其中所述筛的孔径小于等于200μm。

14.  如权利要求12所述的方法，其中所述筛的孔径为126μm。

15.  如前述任一权利要求所述的方法，其中在制备所述悬浮液的步骤(a)前所述颗粒聚集体中所述颗粒的平均直径为100至200μm。

16.  如权利要求15所述的方法，其中在制备所述悬浮液的步骤(a)前碾磨所述颗粒。

17.  制备药物组合物的方法，所述方法包括根据权利要求1至16中任一权利要求所述的方法制备微粒，将所述微粒与一种或多种药物可接受的赋形剂、载体、抛射剂、缓冲剂、稳定剂、等张剂、防腐剂或抗氧化剂配制的步骤。

18.  制备药物组合物的方法，所述方法包括按照权利要求1至16中任一权利要求所述的方法制备微粒，将所述微粒与变应原配制的步骤。

19.  如权利要求18所述的方法，所述方法还包括将所述微粒与一种或多种药物可接受的赋形剂、载体、抛射剂、缓冲剂、稳定剂、等张剂、防腐剂或抗氧化剂配制。

20.  制备试剂盒的方法，所述方法包括按照权利要求1至16中任一权利要求所述的方法制备微粒，将变应原和所述微粒放入所述试剂盒的步骤。

21.  如权利要求18至20中任一权利要求所述的方法，其中所述变应原为食物变应原。

22.  如权利要求21所述的方法，其中所述食物变应原存在于乳，小麦，麸质或蛋中。

23.  制备药物组合物的方法，该方法包括按照权利要求1至16中任一权利要求所述的方法制备微粒，将所述微粒与抗原配制的步骤。

24.  如权利要求23所述的方法，所述方法还包括将所述微粒与一种或多种药物可接受的赋形剂、载体、抛射剂、缓冲剂、稳定剂、等张剂、防腐剂或抗氧化剂配制。

25.  如权利要求23或24所述的方法，其中所述药物组合物是疫苗组合物。

26.  制备试剂盒的方法，所述方法包括按照权利要求1至16中任一权利要求所述的方法制备微粒，将抗原和所述微粒放入所述试剂盒的步骤。

27.  如权利要求23至26中任一权利要求所述的方法，其中所述抗原为来自传染原的抗原。

28.  如权利要求27所述的方法，其中所述传染原介导细菌感染、真菌感染、病毒感染或寄生感染。

29.  制备具有微粒贮器的递送装置的方法，所述方法包括按照权利要求1至16中任一权利要求所述的方法制备微粒，将所述微粒装载至递送装置中的步骤。

30.  如权利要求29所述的方法，所述递送装置允许将所述微粒进行鼻内或吸入给药。

31.  如权利要求29或30所述的方法，所述递送装置包括：
(a)所述微粒的贮器；
(b)适合于在患者的口或鼻定位的递送口；和
(c)所述贮器和所述递送口之间的阀，使得所述阀能够被操纵以控制所述微粒的递送。

32.  壳多糖微粒聚集体在制备用于治疗选自变态反应，由细胞介导的免疫系统的上调引起的疾病状态，以及由NK细胞活性和/或由免疫系统细胞IFN-γ的分泌的上调引起的疾病状态的药物中的用途，其中所述聚集体中至少80％的所述壳多糖微粒在5至20μm的范围。

33.  包含壳多糖微粒聚集体和传染原的组合物在制备用于预防或治疗所述传染原介导的疾病状态的药物中的用途，其中所述聚集体中至少80％的所述壳多糖微粒在5至20μm的范围。

34.  壳多糖微粒聚集体，其中所述聚集体中至少80％的所述壳多糖微粒在5至20μm的范围。

35.  用于给予壳多糖微粒聚集体的递送装置，其包括：
(a)所述微粒的贮器；
(b)适合于在患者的口或鼻定位的递送口；和
(c)所述贮器和所述递送口之间的阀，使得所述阀能够被操纵以控制所述微粒的递送；
其中，所述聚集体中至少80％的所述壳多糖微粒在5至20μm的范围。

36.  用于同时或相继向患者给药的试剂盒，其包含：
(a)壳多糖微粒聚集体；
(b)来自传染原的变应原或抗原；
其中，所述聚集体中至少80％的所述壳多糖微粒在5至20μm的范围。

37.  壳多糖微粒聚集体在制备用于治疗选自变态反应，治疗由细胞介导的免疫系统的上调引起的疾病状态，以及由NK细胞活性和/或由免疫系统细胞IFN-γ的分泌的上调引起的疾病状态的药物中的用途，其中所述微粒聚集体是通过权利要求1至16中任一权利要求所定义的方法制备的。

38.  包含壳多糖微粒聚集体和传染原的组合物在制备用于预防或治疗所述传染原介导的疾病状态的药物中的用途，其中所述壳多糖微粒聚集体是通过权利要求1至16中任一权利要求所定义的方法制备的。

39.  壳多糖微粒聚集体，其通过权利要求1至16中任一权利要求所定义的方法而制备。

40.  用于给予壳多糖微粒聚集体的递送装置，其包括：
(a)所述微粒的贮器；
(b)适合于在患者的口或鼻定位的递送口；和
(c)所述贮器和所述递送口之间的阀，使得所述阀能够被操纵以控制所述微粒的递送；
其中所述壳多糖微粒聚集体是通过权利要求1至16中任一权利要求所定义的方法制备的。

41.  用于同时或相继向患者给药的试剂盒，其包含：
(a)壳多糖微粒聚集体；
(b)来自传染原的变应原或抗原；
其中所述壳多糖微粒聚集体是通过权利要求1至16中任一权利要求所定义的方法制备的。

42.  如权利要求17至28、32至34、36、37、或39至41中任一权利要求所述的方法、药物组合物、用途、聚集体或者试剂盒，其中所述药物组合物、药物、聚集体或者试剂盒通过粘膜或非粘膜的递送途径进行给药。

43.  如权利要求42中所述的方法、药物组合物、用途、聚集体或试剂盒，其中所述粘膜递送途径为鼻内递送、舌下递送、口服递送、滴眼剂递送或吸入递送。

44.  如权利要求42中所述的方法、药物组合物、用途、聚集体或试剂盒，其中所述非粘膜递送途径为注射递送。

45.  如前述任一权利要求所述的方法、药物组合物、用途、聚集体、试剂盒或递送装置，其中所述壳多糖颗粒或脱乙酰壳多糖颗粒来源于蟹、虾、龙虾、乌贼或昆虫的外骨骼，或来源于真菌。

46.  如前述任一权利要求所述的方法、药物组合物、用途、聚集体、试剂盒或递送装置，其中所述不溶性多糖颗粒为合成的壳多糖颗粒。

制备微粒的方法
技术领域
本发明涉及制备微粒的方法，特别是制备壳多糖微粒(CMP)的方法。本发明还涉及在药物组合物中配制微粒的方法，以及制备包含微粒的试剂盒的方法。
介绍
Shibata等人的研究(1-4)已经表明，口服递送1μm至10μm的可吞噬壳多糖颗粒引起小鼠脾细胞培养物中Th1细胞因子的增多。这种效果对于该微粒是特异性的，因为可溶性壳多糖不产生增多。这还能够使用壳多糖的主要成分N-乙酰基-D-葡糖胺包被的1μm聚苯乙烯微球再现。还证实了在豚草变态反应的鼠科模型中口服给予壳多糖下调血清IgE和肺嗜曙红性(1)。
Shibata等人还开发了过敏性气道炎症的小鼠模型并向小鼠口服给予壳多糖制剂(Shibata 2000)。在向豚草致敏小鼠日口服给予壳多糖之后，免疫接种之前和期间，豚草特异性IgE水平显著下降。
当预防性地给予小鼠壳多糖，然后给予豚草时，IL-4，IL-5和IL-10的产生显著减少而且量低，但是检测到了显著的IFN-γ水平。
壳多糖在给予C57BL6小鼠时还具有预防作用，与BALB/c小鼠相比，所述C57BL6小鼠是细胞介导的免疫/Th1反应的较高应答者，但是其是过敏反应的较低应答者。当用豚草和壳多糖同时处理豚草致敏小鼠时，IL-4，IL-5和IL-10的产生水平与仅有豚草刺激的那些相比显著下降。
在我们早前的专利申请WO 03/015744中，我们描述了一些小鼠实验。这些实验证明鼻给药的CMP盐水悬浮液具有有益的免疫调节性质，这些性质能够应用在治疗过敏性疾病上，且能通过先天免疫机理的上调提高对滤过性毒菌和细菌引起的呼吸道感染的保护。这些有益的免疫调节性质还能够应用于从自然杀伤(NK)细胞活性和/或干扰素-γ分泌的上调引起的疾病状态，如癌症的治疗。
在我们早前的专利申请US 60/815074中，我们描述了CMP在疫苗组合物中作为佐剂的应用。特别地，当CMP组合物与另一种佐剂例如霍乱毒素B亚单位(CTB)结合的时候，CMP组合物还被发现具有协同提高对来自于传染性试剂的抗原的保护的能力。
目前的证据表明要使CMP达到最优的效用，颗粒应当微粉化且其粒径在1至20μm的范围。CMP的主要作用机制取决于巨噬细胞和其它吞噬细胞的吞噬作用，因此，CMP必须在一般认为的1至20μm可吞噬的范围。
壳多糖的生产来源是河虾处理工业的副产物河虾壳废料。河虾壳用酸和碱处理以除去矿物质和蛋白污染物。然后将纯化的壳多糖絮片体用标准碾磨法碾碎以制备粒径范围在100至200μm的粉末。这是CMP生产的起始原料。
在Shibata和Strong描述的方法中(3，5)，壳多糖粉末是用实验室里的声波降解法微粉化的。然而，这种方法具有不能放大至工业生产需要的缺点。并且，对于不溶性多糖例如壳多糖的微粉化，也没有建立合适的货物生产质量管理规范实践(GMP)协议的建立。还存在另一问题在于通常使用的声波降解法是用于团块的分解和细胞的剪切，该声波降解法不能生产均一粒径的CMP微粒。
发明概述
鉴于上述缺陷，我们研究了其它能够减小粒径的方法，例如空气喷射碾磨法和干粉球磨法，这更适用于工业放大。空气喷射碾磨法是制药工业中将均一的药物粉末生产成片剂的选择的方法。然而，当我们将空气喷射碾磨法作为生产CMP的方法时，我们发现经过三次过辊压炼后平均粒径仍然大于100μm，这表明此种方法对于生产CMP完全无效。我们还发现干粉球磨法是不能令人满意的生产CMP的方法，因为要生产接近于可吞噬尺寸的微粒所需要的时间过多，即天的量级，且尽管如此，平均尺寸在约50μm而不是期望的10μm。此外，过多的碾磨时间有可能从器皿到金属球产生金属污染。
微流化仪器(微流化仪)以前用于涂料和墨水的生产。然而，我们现在惊讶地发现微流化仪器也可用于生产可吞噬尺寸的CMP，也因此由微流化仪器生产出来的CMP适合于作为药物使用和药物组合物的配制。特别地，我们发现用微流化仪器生产CMP的优点包括具有处理大体积的能力以及放大至工业生产需要的简单性；GMP协议已被提出；与其它方法相比，它更好地控制微粒尺寸以生产均一产物；以及与其它方法相比，它的CMP产率更高。
因此，本发明主要涉及通过用(高剪切)微流化仪器减小(较大)颗粒的尺寸而生产微粒如CMP的方法。
适合在本发明中使用的微流化仪器主要通过在如20000至30000psi的高压、如高于500ms^-1的高速下推进产品(如悬浮液)通过几何固定的微通道来减小颗粒尺寸。这提供了一个非常集中的作用区域。随着产品通过微通道，高压产生的力作用在产品上以减小产品中颗粒的尺寸，所述力包括由于与微通道壁接触而使产品流变形所产生的剪切力，由于高速产品流自身撞击所产生的冲击力，以及在产品流中气穴的形成和崩塌所产生的气穴力。
适合在本发明中使用的微流化仪器的实例包括来自于MicrojetTechnology的Microjet Laboratory Processor Model 100和来自于Microfluidics^TM的Processors。
我们也认识到用微流化仪器生产CMP的优点还可用于任何其它不溶性多糖微粒的生产。特别地，微流化仪器可以方便地用来生产具有可吞噬尺寸的和/或在医疗方法中有用的和/或可以包含在药物组合物中的不溶性多糖微粒。
例如，脱乙酰壳多糖是壳多糖脱去酰基的衍生物，且为不溶性多糖。Danbiosyst已经提交了专利申请，其中脱乙酰壳多糖被用作药物递送系统，特别以患者的粘膜为靶向，参见US 5,690,954，其中描述了脱乙酰壳多糖微球可以为10至100μm的药物递送系统。
因此，本发明的一方面提供了通过减小颗粒尺寸来制备微粒聚集体的方法，其包括：
(a)制备颗粒聚集体的悬浮液；
(b)使悬浮液通过微流化仪器以使颗粒聚集体中颗粒的平均尺寸降低至期望的平均值；
其中所述颗粒是不溶性多糖颗粒。
微流化仪器(微流化仪)优选为高剪切的微流化仪器(高剪切微流化仪)，例如高压微流化仪器(高压微流化仪)或高剪切微粒分解装置。例如，微流化仪器优选为能够在至少10000psi压力下操作，更优选为至少15000psi，甚至更优选为至少20000psi。特别地，微流化仪器优选为能够在10000至30000psi的范围内操作，更优选为15000至30000psi，甚至更优选为20000至30000psi，最优选为20000至23000psi。
此方法优选用于生产壳多糖和/或脱乙酰壳多糖微粒聚集体，例如壳多糖微粒制剂或脱乙酰壳多糖微粒制剂，这种情况下要减小尺寸的颗粒是壳多糖和/或脱乙酰壳多糖颗粒。如果需要，步骤(a)的颗粒聚集体可以包含壳多糖和脱乙酰壳多糖的混合物。此方法更优选用于生产CMP，这种情况下要减小尺寸的颗粒是壳多糖颗粒。
壳多糖是N-乙酰基-D-葡糖胺的聚合物且其具有与纤维素相似的结构。它是自然界中产量丰富的多糖，包括螃蟹、河虾、龙虾、乌贼或昆虫的外骨骼中的角状物质。它在真菌里也有被发现。
本领域技术人员应该明白，由于角多糖取自自然物质，其成分有一定的变化且可能存在低水平的自然发生于壳多糖聚合物里的脱乙酰组分。然而，当本方法用于生产CMP时，壳多糖颗粒聚集体中所含脱乙酰基组分优选为小于总组分的20％，更优选为小于总组分的15％，甚至更优选为小于总组分的10％，以及最优选为小于总组分的5％。
此外，本方法也可用于生产合成的CMP。这种情况下，要减小尺寸的不溶性多糖颗粒是合成的壳多糖颗粒。
合成的壳多糖颗粒可以是载体颗粒，例如从生物相容性物质，如用N-乙酰基-D-葡糖胺、壳多糖、或壳多糖碎片包被的聚苯乙烯或乳胶，形成的颗粒。或者，合成的壳多糖可通过化学或酶技术合成。例如，壳多糖颗粒可通过乙酰葡糖胺，如N-乙酰基-D-葡糖胺，的聚合而制备。
由于CMP所产生的药物作用被发现具有尺寸依赖性，因此本方法生产的微粒优选为具有能够产生药物作用的直径。因此本方法生产的微粒聚集体优选为包含具有可吞噬尺寸如1至20μm范围内的微粒。例如，微粒聚集体中微粒的平均直径期望值为小于等于50μm、小于等于40μm、小于等于30μm、小于等于20μm、小于等于15μm、小于等于10μm、或小于等于5μm。平均直径期望值优选为可吞噬尺寸，如在1至20μm、1至15μm、或1至10μm的范围。例如，平均直径期望值可以在5至15μm、6至14μm、7至13μm、8至12μm、9至11μm或甚至9至10μm的范围。微粒直径优选为至少1μm。微粒聚集体中微粒的标准偏差优选为小于等于10μm、小于等于8μm、小于等于5μm、或小于等于3μm。微粒聚集体中微粒的平均直径最优选在1至15μm的范围，且聚集体中颗粒的标准偏差为小于等于5μm。
术语“微粒”表示直径为小于等于100μm的颗粒。因此，“微粒聚集体”表示颗粒聚集体中全部或基本上全部，如聚集体中至少90％、优化至少95％、更优化至少99％颗粒的直径为小于等于100μm的颗粒聚集体。“颗粒”可以是微粒，“颗粒聚集体”可以包含微粒，且/或可以基本上或全部由微粒组成。
术语“平均直径”表示直径的平均值。为了避免疑惑，术语“颗粒直径”和术语“颗粒尺寸”是可互换的，反之亦然。
直径在1至20μm范围的微粒被认为具有最佳的药物作用。因此，微粒聚集体中微粒的粒径分布为至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或基本上全部的微粒的直径优选小于20μm，和/或在1至20μm的范围。例如，微粒聚集体中至少50％的微粒的直径可以小于20μm，和/或在1至20μm、5至20μm、5至15μm、6至14μm、7至13μm、8至12μm、9至11μm、或9至10μm的范围。优选地，微粒聚集体中至少70％微粒的直径小于20μm，和/或在1至20μm、5至20μm、5至15μm、6至14μm、7至13μm、8至12μm、9至11μm，或9至10μm的范围。更优选地，微粒聚集体中至少80％微粒的直径小于20μm，和/或在1至20μm、5至20μm、5至15μm、6至14μm、7至13μm、8至12μm、9至11μm、或9至10μm的范围。更优选地，微粒聚集体中至少90％微粒的直径小于20μm，和/或在1至20μm、5至20μm、5至15μm、6至14μm、7至13μm、8至12μm、9至11μm、或9至10μm的范围。
为了避免疑惑，术语“在...的范围”包含指定的范围边界。例如，直径在1至20μm范围的颗粒聚集体包含直径为1μm和20μm的颗粒。
颗粒尺寸和粒径分布可以用但单颗粒光学传感(SPOS)，也被称为光学颗粒计数的方法来测确定。这在本领域是众所周知的。使颗粒在激光束和检测器之间逐个通过来测定颗粒尺寸。当颗粒在激光束和检测器之间通过时，它引起了从激光束到检测器的光量的变化。通过被测颗粒和参考颗粒引起的光量变化的比较来测定颗粒的尺寸，所述参考颗粒例如已知尺寸(如已知直径)的基本上均匀的颗粒。这可能还要参考用这种已知尺寸的颗粒形成的标定曲线。
一般地，颗粒在激光束和检测器之间的通过引起检测器上光量的变化会产生电信号。然后通过比较被测颗粒与参考颗粒形成的信号幅度来测定颗粒的尺寸，所述参考颗粒例如已知尺寸(如已知直径)的充分均匀的颗粒。
因此，术语“颗粒直径”表示用单颗粒光学传感方法测出与被测颗粒产生相同信号的参考颗粒(如已知尺寸的基本上均匀的颗粒)的直径。
因此，具有特定范围(如1至20μm)直径的聚集体中的粒径分布，如颗粒(如微粒)的百分比值，可以通过单颗粒光学传感的方法测量聚集体中颗粒的直径而测定。这可以包括测量从聚集体中取出的样品中的颗粒的直径，并将所得的数据外推，使得样品中粒径分布可以看作是聚集体中粒径分布的代表。或者，聚集体中全部或基本上全部颗粒的直径可以被测量以确定聚集体中颗粒的尺寸分布。
我们发现用微流化仪器生产的微粒的直径是由，至少部分是由颗粒聚集体的悬浮液通过，即反复通过微流化仪器的次数决定的。因此，本方法优选包括使悬浮液通过微流化仪器充分多的次数以将聚集体中颗粒的平均尺寸降低至期望值。优选地，本方法包括使悬浮液通过微流化仪器至少7次或更多，更优选为至少9次或更多。
升高微流化仪器的操作压力，即悬浮液通过微流化仪器时的压力，和/或调节尺寸如直径，和/或微通道的几何构造可以影响(如降低)悬浮液必须通过微流化仪器的次数，以使聚集体中颗粒的平均直径降低至期望值。我们发现操作压力、尺寸和几何构造的使用使悬浮液通过微流化仪器至少7次或更多，更优选为至少9次或更多对于减少过热和/或微流化仪器的阻塞是最理想的。本领域技术人员能够选择这样合适的操作压力、尺寸和微通道的几何构造。
操作压力优选为至少10000psi或更多，更优选为至少15000psi或更多，甚至更优选为20000psi或更多。操作压力优选在20000至30000psi的范围，更优选在20000至23000psi的范围。
本方法还可以包括在使颗粒通过微流化仪器前对颗粒聚集体进行筛选。颗粒聚集体可以包括足够大至的颗粒，如直径为50μm或更大的颗粒，因此在使颗粒通过微流化仪器前对颗粒聚集体进行筛选将会降低颗粒阻塞微通道的可能性。筛选还保证了颗粒的起始尺寸得以减小。由于我们发现微粒的收率随着起始颗粒尺寸的降低而增加，所以这点是有利的。因此，本方法优选包括在制备悬浮液前和/或使颗粒聚集体通过微流化仪器前对颗粒聚集体进行筛选。优选地，筛的孔径为小于等于200μm、小于等于150μm、小于等于100μm。更优选地，筛的孔径为126μm。
筛选颗粒的方法在本领域是众所周知的。颗粒聚集体可以在制备悬浮液的步骤(a)前进行筛选，如通过使用电子振动筛；或者在制备悬浮液的步骤(a)后但在使该悬浮液通过微流化仪器前进行筛选，如通过使悬浮液通过过滤器，如滤纸。
在制备悬浮液的步骤(a)和/或在对颗粒聚集体进行筛选前颗粒聚集体的平均直径优选大于100μm，更优选在100至200μm的范围。在制备悬浮液的步骤(a)和/或在对聚集体颗粒进行筛选前颗粒聚集体的直径优选小于约300μm。优选地，在制备悬浮液的步骤(a)前，不溶性多糖颗粒已经碾磨。该碾磨可以用任何合适的标准碾磨程序进行。术语“壳多糖粉末”表示壳多糖原材料，如平均直径大于100μm的颗粒，优选在100至200μm的范围，优选小于约300μm。
在另一方面，本发明提供了通过减小壳多糖和/或脱乙酰壳多糖颗粒的尺寸来制备壳多糖和/或脱乙酰壳多糖微粒的方法，其包括：
(a)制备壳多糖和/或脱乙酰壳多糖颗粒聚集体的悬浮液；
(b)使悬浮液通过微流化仪器，如9次或更多，以将颗粒聚集体中的壳多糖和/或脱乙酰壳多糖颗粒的平均直径降低至期望值，其中所述平均直径的期望值在1至15μm的范围，其中微粒聚集体中至少80％的微粒的直径为小于等于20μm。
在另一方面，本发明提供了制备组合物如药物组合物的方法，该方法包括根据上述方法制备微粒如CMP，将所述微粒与一种或多种药物可接受的赋形剂、载体、抛射剂、缓冲剂、稳定剂、等张剂、防腐剂、抗氧化剂或其它本领域技术人员公知的原料配制的步骤。这些原料应当是无毒且不抵消活性成分功效的。
在另一方面，本发明提供了制备组合物如药物组合物的方法，该方法包括根据上述方法制备微粒如CMP，将所述微粒与变应原配制的步骤。
在另一方面，本发明提供了制备试剂盒的方法，该方法包括根据上述方法制备微粒如CMP，将变应原和所述微粒放入试剂盒的步骤。
在另一方面，本发明提供了制备组合物如药物组合物的方法，该方法包括根据上述方法制备微粒如CMP，将所述微粒与抗原配制的步骤。
在另一方面，本发明提供了制备试剂盒的方法，该方法包括根据上述方法制备微粒如CMP，将抗原和微粒放入试剂盒的步骤。
包含微粒和抗原的(药物)组合物和试剂盒可以还包含另外的佐剂。在US 60/815074中，我们证明了在相同的疫苗配方中当CMP与其它佐剂一起给药时，其具有增效作用。
在另一方面，本发明提供了制作具有微粒贮器的递送装置的方法，该方法包括根据上述方法制备微粒如CMP，将所述微粒装载至递送装置中的步骤。微粒可以通过吸入和/或抛射剂从鼻吸入至鼻窦和上呼吸道或者经口腔吸入至肺泡的巨噬细胞。递送装置可以包括(a)微粒的贮器；(b)适合于在患者的口或鼻定位的递送口；以及(c)贮器和递送口之间的阀，使得所述阀能够被操纵以控制微粒的递送。装置形式特别优选为含有CMP制剂和任选载体的鼻喷雾瓶，所述喷雾瓶具有适合鼻递送的颈。
在另一方面，本发明提供了壳多糖微粒聚集体在制备用于治疗选自变态反应，由细胞介导的免疫系统的上调引起的疾病状态，以及由NK细胞活性和/或免疫系统细胞IFN-γ的分泌的上调引起的疾病状态的方法中的药物的用途。微粒聚集体和/或聚集体中微粒的粒径分布优选如上所述。例如，至少80％的壳多糖微粒的直径在5至20μm的范围。优选用上述定义的方法制备壳多糖微粒聚集体。
如上所述，尽管CMP的治疗用途先前已经被公开，但是制备CMP的已知方法如声波降解法却不能进行工业放大。我们认为可能适合工业放大制备CMP的方法是干粉球磨法。我们发现这种方法比医药工业上用于生产制片所需的均匀药物粉末所选的空气喷射碾磨法在生产CMP时更有效。
我们也比较了用干粉球磨法生产的CMP和用微流化仪器生产的CMP的医疗功效。然而，我们发现在处理小鼠哮喘时用微流化仪器生产的CMP比用干粉球磨法生产的CMP更有效。特别地，我们发现用微流化仪器生产的CMP导致肺泡嗜曙红细胞更多的下降，表明治疗降低了哮喘的水平；用微流化仪器生产的CMP还导致肺部细胞炎症更多的下降。此外，我们也证明了用微流化仪器生产的CMP提供了免受病毒感染的保护。
这些结果表明按照本发明制备的CMP在医疗上是有效的，且比其它适合于工业放大的方法制备的CMP具有更好的功效。因此，本发明方法能够制备具有医疗功效的粒径分布的CMP聚集体。
在另一方面，本发明提供了包含壳多糖微粒聚集体和传染原的组合物在制备用于预防或治疗由该传染原介导的疾病状态的药物中的用途。微粒聚集体和/或聚集体中微粒的粒径分布优选如上所述。例如，至少80％的壳多糖微粒的直径在5至20μm的范围。优选用上述定义的方法制备壳多糖微粒聚集体。
在另一方面，本发明提供了壳多糖微粒聚集体。优选地，该聚集体被配制为组合物，例如药物组合物，如包含治疗有效量的壳多糖微粒。微粒聚集体和/或聚集体中微粒的粒径分布优选如上所述。例如，至少80％的壳多糖微粒的直径可以在5至20μm的范围。优选用上述定义的方法制备壳多糖微粒聚集体。
在另一方面，本发明提供了用于给予壳多糖微粒聚集体的递送装置，其包括：
(a)微粒贮器；
(b)适合于在患者的口或鼻定位的递送口；和
(c)贮器和递送口之间的阀，使得所述阀能够被操纵以控制微粒的递送。微粒聚集体和/或聚集体中微粒的粒径分布优选如上所述。例如，至少80％的壳多糖微粒的直径可以在5至20μm的范围。优选用上述定义的方法制备壳多糖微粒聚集体。
在另一方面，本发明提供了用于同时或相继向患者给药的试剂盒，其包含：
(a)如上定义的壳多糖微粒聚集体；
(b)来自传染原的变应原或抗原。
微粒聚集体和/或聚集体中微粒的粒径分布优选如上所述。例如，至少80％的壳多糖微粒的直径可以在5至20μm的范围。优选用上述定义的方法制备壳多糖微粒聚集体。
现通过实施例而不限于结合附图来进一步描述本发明的实施方案。

附图简述
图1示出壳多糖生产商生产的壳多糖粉末(即生产CMP的原材料)的典型的粒径分布。
图2示出通过球磨壳多糖粉末所生产的壳多糖颗粒的粒径分布。
图3示出筛选对壳多糖生产商所生产的壳多糖粉末的粒径分布的作用。圆圈表示筛选后的壳多糖粉末，方块表示未筛选的壳多糖粉末。
图4示出使壳多糖粉末悬浮液通过微流化仪器后CMP的粒径分布；(a)三次通过后的粒径分布；(b)九次通过后的粒径分布；(c)十二次通过后的粒径分布。粒径分布的测量重复四次。
图5示出通过预筛选壳多糖粉末和九次通过微流化仪器的最适宜规格生产的CMP。
图6示出用CMP预先处理、卵清蛋白激发的小鼠的支气管肺灌洗中的嗜曙红细胞计数。CMP000表示用球磨法生产的CMP，CMP001表示用微流化仪器生产的CMP。
图7示出用CMP预先处理、卵清蛋白激发的小鼠对照未处理的哮喘组的肺部炎症的降低。PBI＝支气管周炎症，PVI＝血管周炎症，AI＝肺泡炎症。CMP000表示用球磨法生产的CMP，CMP001表示用微流化仪器生产的CMP。
图8示出用CMP(用微流化仪器生产)预先处理、H5N1病毒感染(0天)的小鼠的存活。菱形表示经CMP处理，方块表示未处理。
药物组成
CMP的药物组合物和治疗用途在我们早先的申请WO 03/015744和US 60/815074中已有描述，在此引入作为参考。
包含微粒(如CMP)的药物组合物和药物可用于治疗患有变态反应的患者的方法中。能够用所述药物组合物治疗的变态反应的实例包括季节性呼吸道变态反应，通常被称作干草热；对包括房屋微尘在内的气源性致敏原、真菌孢子、草花粉、树花粉和动物毛屑的变态反应；通过降低血清IgE和嗜曙红细胞过多而可治疗的变态反应；哮喘；湿疹和食物变态反应；皮炎，如遗传性过敏性皮炎。
一个更具体的治疗变态反应的实施方案是马的治疗，特别是纯种马的治疗，它们有患变态反应疾病状态如哮喘或复发的肺部感染的倾向。
包含微粒(如CMP)的药物组合物和药物也可用于治疗患有因细胞介导的免疫系统的上调引起的疾病状态的患者的方法中。因此微粒可以用来增强个体的免疫系统。由细胞介导的免疫系统的上调引起的疾病状态包括微生物感染，包括细菌感染、真菌感染和病毒感染的治疗，特别在易感染患者群，如老年人、早产儿、婴幼儿、移植患者、诸如化疗患者的免疫抑制患者、有一定感染风险的医院患者、戴呼吸器的患者、胆囊纤维化的患者和艾滋病患者。微粒和包含微粒的药物组合物特别适用于耳、鼻、喉和肺部感染的治疗。
细菌感染的特例包括诸如绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的微生物感染，诸如肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的链球菌属(Streptococcus)，化脓性链球菌(Streptococcus pyrogenes)，无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)，克雷白氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)，小肠结肠炎耶尔森菌(Yersiniaenteocolitica)，沙门氏菌属(Salmonella)，李斯特菌属(Listeria)，包括结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和麻风分支杆菌(Mycobacterium leprae)在内的分支杆菌感染，包括利什曼原虫属(Leishmania species)和血吸虫属(Schistosoma species)在内的寄生虫感染。
由微生物感染，典型地由肺炎链球菌引起的一种疾病状态是再发性耳部感染如中耳炎。这些疾病状态发生在儿童和成人身上，目前使用抗生素治疗。用壳多糖微粒组合物和本发明的药物治疗这些疾病状态是有利的，它减少了对抗生素的需求。
本发明的制剂能够用于治疗肺结核，或现有的感染，或保护易感染的患者远离感染。微生物感染的其它实例包括细菌性肺炎，如呼吸器相关的肺炎和胆囊纤维化相关感染。
真菌感染的实例包括诸如侵袭性肺部曲霉病和侵袭性肺部念珠菌病的真菌感染，卡氏肺孢子虫肺炎(Pneumocystis carinii pneumonia)，球孢子菌属(Coccidioides)和隐球菌属(Crytococcus)感染，例如在免疫抑制患者中。
病毒引起的疾病状态的实例包括肺部病毒病毒感染如特别发生于婴幼儿和老年人中的呼吸道合胞体病毒细支气管炎，或包括H5N1在内的流行性感冒病毒，或鼻病毒。大量研究表明在艾滋病的发展过程中，单核细胞失去了分泌IL-2，IL-12和IFN-γ的能力并产生增加的IL-4水平，这使HIV病毒增殖。因此用本发明的药物组合物通过恢复IL-12和IFN-γ水平来降低HIV病毒感染的发展过程的治疗是有用的。
包含微粒(如CMP)的药物组合物和药物也可用于由NK细胞的活性和/或免疫系统细胞IFN-γ的分泌的上调引起的可治疗的疾病状态的治疗。这种疾病状态的一个实例是癌症，特别是肺肿瘤，肺癌或鼻咽癌。
包含微粒和变应原的药物组合物和试剂盒
包含微粒(如CMP)和变应原的药物组合物，或包含微粒(如CMP)和变应原的试剂盒能够用于变态反应和变应性症状如与传统脱敏治疗相关的过敏性休克的治疗中。变应原能够容易地从食物中提取而且市场上有售，因其要用在变态反应的诊断和治疗上。特别地，药物组合物和试剂盒可用于治疗食物变态反应。常见食物变态反应的实例包括牛奶、小麦、麸质、鸡蛋、坚果或贝类。这些药物组合物和试剂盒也可用于治疗马。
包含微粒和抗原的药物组合物和试剂盒
包含微粒(如CMP)和抗原的药物组合物或包含微粒(如CMP)和抗原的试剂盒可以用于预防和治疗感染及相关症状，以及由传染原引起的疾病状态。抗原可以是来自于传染原的抗原。抗原也可以是天然的，合成的或者是由重组DNA技术衍生的。药物组合物可以是疫苗组合物。因此，它们可以包含由灭活的或削弱的完整有机体或这样的有机体的部分构成的抗原，其用于赋予针对该有机体引起的疾病状态的免疫。以实例来说，传染原可以造成和/或介导细菌感染，真菌感染，病毒感染或者寄生感染。
因此，在另一方面，本发明提供了给患者接种疫苗以防止传染原介导的疾病状态的方法，此方法包括将包含本文所定义的CMP和抗原的组合物给予需要该方法的患者，其中CMP和抗原以治疗或预防有效量存在于所述组合物中。
在US 60/815074中，我们发现每周至少二次，更优选每周至少三次给予包含CMP和抗原的的组合物的给药模式比通常的给药模式，即初次免疫后若干星期再进行二次给药，提高了对传染原的保护性应答。
包含微粒(如CMP)和抗原的药物组合物或包含微粒(如CMP)和抗原的试剂盒可以用于治疗或预防疟疾，流行性感冒或艾滋病。依据本发明能够使用的抗原的实例包括由灭活病毒如H5N1，H1N1，H3N2制备的流感病毒血凝素(HA)疫苗，包含HIV-DNA或HIV抗原的HIV疫苗，诸如含有重组保护抗原(PA)的疫苗等炭疽疫苗，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)抗原和诸如E7蛋白的人乳头瘤病毒抗原。和许多传染原一样，适合包含在用于防止疟疾的接种疫苗的药物组合物中的抗原在本领域是众所周知的。
包含微粒(如CMP)和抗原的药物组合物和试剂盒也可以包含另外的佐剂。可以用于药物组合物和试剂盒中的其它佐剂的实例包括基于霍乱毒素如霍乱全毒素(CT)或霍乱毒素B亚单元(CTB)、合成CpGDNA的佐剂和基于细菌细胞壁产物的佐剂。F.Vogel，M.Powell和C.Irving在NIH网站可得到的“A Compendium of Vaccine Adjuvants andExcipients(疫苗佐剂和赋形剂手册)(第2版)”中综述了佐剂的应用(http://www.niaid.nih.gov/daids/vaccine/pdf/compendiura.pdf)。
霍乱毒素B亚单位(CTB)是有效的粘膜佐剂，尽管它能产生不想要的副作用。能够通过添加少量(0.1-2％)的霍乱全毒素来降低副作用。CTB刺激局部粘膜细胞免疫应答和全身IgG应答并通常用于试验性的鼻疫苗(Vadolas等人，1995，European journal of Immunology 25，969)。
细菌衍生的佐剂包括肽聚糖或脂多糖衍生物如胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酸盐(MDP)、单磷酰类脂A(MPL)、海藻糖二分枝酸酯(TDM)、霍乱毒素B亚单位(CTB)、CpG DNA、包括IL-12和IFN和GM-CSF在内的免疫激活细胞因子。
递送途径
多种递送途径可以用来向需要该递送的个体递送微粒(如CMP)和包含微粒(如CMP)的药物组合物和药物。优选地，这些途径包括舌下或口服途径的递送，诸如皮下注射和肌内注射的注射递送，以及鼻内递送微粒(例如用鼻内喷雾器递送至鼻窦和上呼吸道)，或者通过如靶向肺中肺泡巨噬细胞的吸入。微粒、药物组合物和药物可以通过粘膜或非粘膜的递送途径想患者给药。粘膜递送途径包括鼻内递送、舌下递送、口服递送、滴眼剂递送及吸入递送。粘膜递送途径可以包括舌下递送至例如颊粘膜；口服递送至例如肠粘膜；滴眼剂递送至例如眼粘膜；鼻内递送至例如鼻粘膜和上呼吸道粘膜；吸入递送至例如上呼吸道和诸如肺粘膜的下呼吸道粘膜。在本发明的某些方面，粘膜递送途径是优选的，因为它们与非粘膜途径相比可以提供下列一项或几项优点，即安全、由于它们通常像注射的通常情况那样需要临床医生来进行疫苗接种而容易给药、容易分布、生产成本降低、以及由于粘膜递送可以激活细胞和体液免疫应答而使免疫学应答改善。
非粘膜递送途径包括注射递送，例如皮下注射递送或肌肉注射递送。
给药
优选地，微粒(如CMP)和包含微粒(如CMP)的药物组合物和药物以“预防有效量”或“治疗有效量”给予个体(随病情而定，虽然预防也被认为是治疗)，这已足够对个体展示其好处，例如减轻变态反应或另一种疾病状态，或者在可接受的时期内有预防作用。通常，这会引起对个体有益的治疗上有用的活性。所给予化合物的实际量，以及给药速率和时间进程取决于待治疗疾病状态的性质和严重程度。治疗处方，如剂量的决定等等属于全科医生和其它医生的职责，病通常考虑待治疗的病症、个体患者的疾病状态、递送的部位、给药方法和医生熟知的其它因素。上述技术和方案的实例能够在Remington’sPharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)，第16版，Osol，-A.(ed)，1980和Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)，第19版，Mack出版公司，1995年中找到。该组合物的给药剂量优选为每kg体重约0.01至100mg的活性化合物，更优选约0.5至10mg/kg体重。例如，这能够通过鼻递送瓶递送4-8剂量的约0.25ml的5mg/ml的微粒溶液来实现。
上述药物和组合物优选向人类给药。用CMP鼻内治疗的优选患者群包括那些患有季节性变应性鼻炎和窦炎的人，或患有慢性呼吸变态反应如房屋微尘变态反应的人和正服用类固醇或抗组胺剂的人。其它人群包括正在就医接受包括感染和肺癌在内的慢性肺紊乱的治疗的患者。
药物组合物和药物还可以包含一种或多种药物可接受的赋形剂，载体、抛射剂、缓冲剂、稳定剂、等张剂、防腐剂、抗氧化剂或者本领域技术人员熟知的其它原料。这些原料应当是无毒且不抵消活性成分功效的。
防腐剂通常包含在药物组合物中以阻碍微生物生长，延长组合物的贮存期限并允许多用途包装。防腐剂的实例包括苯酚、间甲酚、苯甲醇、对羟苯甲酸及其酯、羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸丙酯、苯扎氯铵和苯索氯铵。防腐剂的用量通常为约0.1％至1.0％(w/v)。
实施例
1.生产CMP方法的评估
按照生产CMP的方法来评估各种生产颗粒的方法。
用Particle Sizing Systems生产的AccuSizer 780光学粒径仪来确定颗粒尺寸和粒径分布。
图1示出由生产商得到的标准碾磨壳多糖粉末的典型的尺寸分布图。
用干式球磨法生产的CMP
按照生产CMP的方法来评估干粉球磨法。通过使用长条顶球碾磨的Heppe GmbH来进行碾磨。图2示出最终的粒径分布。然而，这种方法由于几种原因而不能令人满意：
1.球磨法需要的时间过多，以天为量级连续碾磨。这在工业放大上是不现实的。
2.延长的碾磨时间可能产生来自于从碾磨中所用的器皿到金属球的重金属污染。
3.球磨法生产出的颗粒的平均尺寸在约50μm，而不是优选的约10μm。
4.球磨法生产出非均相的颗粒群，其中很大一部分是50μm+的较大颗粒。这些大颗粒并不是所期望的，因为它们会导致临床应用CMP的鼻递送装置的阻塞，也可能因太大而不能发生吞噬作用而导致可能没有药物活性。
用空气喷射碾磨法生产的CMP
降低颗粒尺寸的标准工业方法为空气喷射碾磨法，这也是制药工业生产用于制片等的均一药物粉末的选择方法。此方法依赖于高压空气喷射下颗粒之间的高速碰撞引起的粉碎。空气喷射碾磨(空气喷射微粉化)是由Micron技术有限公司推出的。在Micron技术有限公司的网站上空气喷射微粉化被描述为“已经很好被证明的持续生产1至30μm范围颗粒的技术”。表1示出了100g图1所示的壳多糖粉末的空气喷射碾磨法的结果。
表1