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高血压易感基因组的鉴定
    技术领域 本发明涉及包含能够用于判定高血压发病风险的 SNP 的遗传标记、能够作为用 于检测该遗传标记的引物或探针使用的高血压发病风险判定用多核苷酸、使用该 SNP 的 高血压发病风险判定方法、用于该 SNP 的分型的高血压发病风险判定用微阵列、及用于 该高血压发病风险判定方法的试剂盒等。
     本申请要求 2008 年 2 月 21 日在日本申请的日本特愿 2008-040208 号的优先权， 并将其内容援引于此。
     背景技术
     高血压是例如冠状动脉疾病、脑中风、慢性肾病等的主要发病原因，高血压的 预防在社会和公共卫生上是很重要的。 高血压是通过很多原因而诱发发病的多因素疾 病，将这些诱发高血压的原因称作危险因素 ( 风险因素，risk factor)。 高血压的危险因素 主要大致分为环境因素和遗传因素，认为它们的相互作用发挥着重要的作用。 危险因素中，作为环境因素，例如可列举出年龄的增长、肥胖、压力、过量摄 取盐分等。 另一方面，作为遗传因素，已知有各种高血压易感基因。 这里，“高血压易 感基因” 是指，由于具有所述基因而引发高血压的危险率上升的基因。 也就是说，可判 断的是，具有高血压易感基因的人与不具有高血压易感基因的人相比，更容易罹患高血 压。 并且认为，在高血压那样的多因素疾病中，其易感基因很多是表现为单核苷酸多态 性 (SNP) 等多态性的等位基因 ( 等位基因 )。
     迄今为止，作为含有基因多态性的高血压易感基因，报告有血管紧张素原、 α- 内收蛋白、 β2 肾上腺素受体、糖蛋白 Ia(GPIa)、趋化因子受体 2(CCR2)、载脂蛋 白 C(ApoC-III)、 G- 蛋白 β3 亚基 (GPβ3)、肿瘤坏死因子 α(TNFα)、胰岛素受体底 物 1(IRS-1)、糖蛋白 Ibα(GPIbα)、C- 型利钠肽 (CNP)、血红素氧合酶 1(HMOX-1)、 SCNN1A 等各种基因 ( 例如参照专利文献 1 ～ 4。 )。 此外，近年来，报告了 CYP17 基 因 (rs6162) 多 态 性、 EXOSC3 基 因 (rs7158) 多 态 性、 ACCN1 基 因 (rs28933) 多 态 性、 KCNMB4 基因 (rs710652) 多态性、 KCNIP2 基因 (rs755381) 多态性、 ATP2A3 基 因 (rs887387) 多态性、 RAC2 基因 (rs929023) 多态性、 CD3EAP 基因 (rs967591) 多态 性、 CALCR 基因 (rs1042138) 多态性、 ATP10D 基因 (rs1058793) 多态性、 GNA14 基因 (rs1801258) 多态性、 PTHR1 基因 (rs1869872) 多态性、 ATP2B1 基因 (rs2070759) 多态 性、HLA-DMB 基因 (rs2071556) 多态性、SLC13A1 基因 (rs2140516) 多态性、SLC2A11 基因 (rs2236620) 多态性、GNAI2 基因 (rs2236943) 多态性、CACNA2D2 基因 (rs2236957) 多 态 性、 PRKWNK1 基 因 (rs2255390) 多 态 性、 SLC22A7 基 因 (rs2270860) 多 态 性、 KCNN1 基因 (rs2278993) 多态性、 SLC21A6 基因 (rs2291075) 多态性、 CACNA1E 基因 (rs2293990) 多态性、 SLC26A8 基因 (rs2295852) 多态性、 ERCC1 基因 (rs2298881) 多态 性、 DLGAP2 基因 (rs2301963) 多态性、 COL4A1 基因 (rs2305080) 多态性、 GUCA1C 基因 (rs2715709) 多态性、 ATP10C 基因 (rs3736186) 多态性、 HCN4 基因 (rs3743496)
     多态性、 PTPRT 基因 (rs3746539) 多态性、 FGF2 基因 (rs3747676) 多态性、 CHGA 基因 (rs3759717) 多态性、 PPP1R1B 基因 (rs3764352) 多态性、 ADORA1 基因 (rs3766554) 多 态性、 RGS19IP1 基因 (rs3815715) 多态性、 RGS20 基因 (rs3816772) 多态性有望作为高 血压易感基因多态性 ( 例如参照专利文献 5。 )。
     高血压的治疗是为了防止由高血压诱发的冠状动脉疾病等的发病而以降低血压 为目的。 治疗方法主要大致分为通过改善饮食生活等生活习惯来减轻高血压的危险因 素、和降压治疗剂的给药疗法。 通常，判断各患者的风险，根据该判定结果和实际的 血压，决定降压目标和治疗方法。 例如，首先，将收缩期血压 / 舒张期血压为 140 ～ 159/90 ～ 99mmHg 分类为轻症高血压，将 160 ～ 179/100 ～ 109mmHg 分类为中症高血 压，将 ≥180/≥110mmHg 分类为重症高血压后，考虑除血压以外的危险因素而判断风险。 例如，将为轻症高血压且不具有其他危险因素的患者判断为低风险组，将为轻症高血压 且具有一些危险因素的患者判断为中等风险组，将为轻症高血压但具有糖尿病等危险性 高的危险因素的患者判断为高风险组。 通常，为低风险组和中等风险组时，首先，进行 一定时期的生活习惯的改正，其后在血压没有充分降低的情况下进行给药疗法，但对于 高风险组的患者，与一定时期的生活习惯的改正同时进行给药疗法。 即，即使血压为相 同程度，也未必是相同的治疗方法，根据各患者的风险而适当选择治疗方法。 因此，正 确评价高血压发病的风险是非常重要的。 大部分的危险因素各自单独未必是高血压发病的诱因。 特别是作为遗传因素的 高血压易感基因的情况下，认为是所具有的多个高血压易感基因相互影响，结果诱发了 高血压。 因此，在高血压发病的风险评价中，所具有的高血压易感基因的数量越多，则 判断为越高风险组。 因此认为，通过调查尽可能多的高血压易感基因的有无，从而能够 更准确地评价高血压发病的风险，但已报告有很多高血压易感基因，对它们全部进行检 查从评价的迅速性及经济性的观点出发并不优选。 另外，该基因存在与否和高血压发病 的相关性因高血压易感基因的不同而不同，因此，以相关性比较低的高血压易感基因作 为风险评价的判断资料时，无法得到可靠性高的评价。
     专利文献 1 ：日本特开 2004-222503 号公报
     专利文献 2 ：日本特开 2004-113094 号公报
     专利文献 3 ：日本特开 2004-33051 号公报
     专利文献 4 ：日本特开 2004-24125 号公报
     专利文献 5 ：日本特开 2007-143504 号公报
     发明内容 发明要解决的问题
     即，为了准确地评价高血压发病的风险，优选使用与高血压易感基因高血压发 病的相关性高的有用的高血压易感基因作为遗传标记，更优选组合使用现实中临床上能 够测定的范围内的数个有用的高血压易感基因作为遗传标记。 然而，对于迄今为止报告 的高血压易感基因，虽然观察到了存在与否和高血压发病具有相关性，但相关的程度不 充分，另外，几乎不存在能够进一步提高风险评价的可靠性的高血压易感基因的组合。
     本发明的目的在于提供 ：包含存在与否和高血压发病的相关性充分高且能够用
     于高血压发病的风险判定的 SNP 的遗传标记、能够作为用于检测该 SNP 的引物或探针使 用的高血压发病风险判定用多核苷酸、使用该 SNP 的高血压发病风险判定方法、用于该 SNP 的分型的高血压发病风险判定用微阵列、及用于该 SNP 的分型的高血压发病风险判 定用试剂盒等。
     用于解决问题的方案
     本发明人等为了解决上述问题而进行了深入研究，结果发现，以从 8924 人采集 的基因组 DNA 为对象，调查病例 ( 高血压 ) 组和对照 ( 正常血压 ) 组中的 SNP 的频率差并 进行病例对照相关分析，结果是，ATP2B1 基因和 CYP11B2 基因的 SNP、特别是 ATP2B1 基 因 的 SNP(rs11105378)、 SNP(rs2681472)、 SNP(rs1401982)、 SNP(rs11105364)、 CYP11B2 基因的 SNP(rs1799998) 作为高血压的遗传标记是非常有用的，进而，通过将选 自由这些 SNP、及 AGT 基因的 SNP(rs699) 所组成的组中的 2 种以上 SNP 组合，与各种 SNP 单独相比，能够更准确地判断高血压发病风险，从而完成了本发明。
     即，本发明的第一方案提供一种高血压的遗传标记，其特征在于，由与包含 ATP2B1 基因的 SNP( 单核苷酸多态性 ) 的 ATP2B1 基因的部分碱基序列或全部碱基序 列相同或互补的序列构成，所述 SNP 为选自由 SNP(rs11105378)、 SNP(rs2681472)、 SNP(rs1401982)、及 SNP(rs11105364) 所组成的组中的 1 种以上。 另外，本发明的第二方案提供一种高血压发病风险判定用多核苷酸，其特征在 于，其具有下述的 (a) ～ (f) 中任一碱基序列，且能够作为用于检测 SNP(rs11105378) 的引物或探针使用 ；(a) 序列号 5 所示的碱基序列、或序列号 5 所示的碱基序列的包含 SNP(rs11105378) 的部分序列 ；(b) 与所述 (a) 的碱基序列互补的碱基序列 ；(c) 在所述 (a) 或 (b) 的碱基序列中除 SNP(rs11105378) 以外的 1 ～数个碱基缺失、置换或添加而得 到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述 (a) 或 (b) 的碱基序列构成 的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列 ；(d) 序列号 6 所示的碱基序列、或序列号 6 所示的碱基序列的包含 SNP(rs11105378) 的部分序列 ；(e) 与所述 (d) 的碱基序列互补的 碱基序列 ；(f) 在所述 (d) 或 (e) 的碱基序列中除 SNP(rs11105378) 以外的 1 ～数个碱基 缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述 (d) 或 (e) 的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
     另外，本发明的第三方案提供一种高血压发病风险判定用多核苷酸，其特征在 于，其具有下述的 (a) ～ (f) 中的任一碱基序列，且能够作为用于检测 SNP(rs2681472) 的引物或探针使用 ；(a) 序列号 12 所示的碱基序列、或序列号 12 所示的碱基序列的包含 SNP(rs2681472) 的部分序列 ；(b) 与所述 (a) 的碱基序列互补的碱基序列 ；(c) 在所述 (a) 或 (b) 的碱基序列中除 SNP(rs2681472) 以外的 1 ～数个碱基缺失、置换或添加而得 到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述 (a) 或 (b) 的碱基序列构成 的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列 ；(d) 序列号 13 所示的碱基序列、或序列号 13 所示的碱基序列的包含 SNP(rs2681472) 的部分序列 ；(e) 与所述 (d) 的碱基序列互补 的碱基序列 ；(f) 在所述 (d) 或 (e) 的碱基序列中除 SNP(rs2681472) 以外的 1 ～数个碱基 缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述 (d) 或 (e) 的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
     另外，本发明的第四方案提供一种高血压发病风险判定用多核苷酸，其特征在
     于，其具有下述的 (a) ～ (f) 中的任一碱基序列，且能够作为用于检测 SNP(rs1401982) 的引物或探针使用 ；(a) 序列号 19 所示的碱基序列、或序列号 19 所示的碱基序列的包含 SNP(rs1401982) 的部分序列 ；(b) 与所述 (a) 的碱基序列互补的碱基序列 ；(c) 在所述 (a) 或 (b) 的碱基序列中除 SNP(rs1401982) 以外的 1 ～数个碱基缺失、置换或添加而得 到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述 (a) 或 (b) 的碱基序列构成 的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列 ；(d) 序列号 20 所示的碱基序列、或序列号 20 所示的碱基序列的包含 SNP(rs1401982) 的部分序列 ；(e) 与所述 (d) 的碱基序列互补 的碱基序列 ；(f) 在所述 (d) 或 (e) 的碱基序列中除 SNP(rs1401982) 以外的 1 ～数个碱基 缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述 (d) 或 (e) 的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
     另外，本发明的第五方案提供一种高血压的遗传标记，其特征在于，其由与包 含 CYP11B2 基因的 SNP 即 SNP(rs1799998) 的 CYP11B2 基因的部分碱基序列或全部碱基 序列相同或互补的碱基序列构成。
     另外，本发明的第六方案提供一种高血压发病风险判定用多核苷酸，其特征在 于，其具有下述的 (a) ～ (f) 中的任一碱基序列，且能够作为用于检测 SNP(rs1799998) 的引物或探针使用 ；(a) 序列号 26 所示的碱基序列、或序列号 26 所示的碱基序列的包含 SNP(rs1799998) 的部分序列 ；(b) 与所述 (a) 的碱基序列互补的碱基序列 ；(c) 所述 (a) 或 (b) 的碱基序列中除 SNP(rs1799998) 以外的 1 ～数个碱基缺失、置换或添加而得到的 碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述 (a) 或 (b) 的碱基序列构成的 多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列 ；(d) 序列号 27 所示的碱基序列、或序列号 27 所示的碱基序列的包含 SNP(rs1799998) 的部分序列 ；(e) 与所述 (d) 的碱基序列互补的 碱基序列 ；(f) 在所述 (d) 或 (e) 的碱基序列中除 SNP(rs1799998) 以外的 1 ～数个碱基 缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述 (d) 或 (e) 的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
     另外，本发明的第七方案提供一种高血压发病风险判定方法，其特征在于， 其是使用遗传标记来判断高血压发病风险的方法，其具有以下工序 ：(a) 对由人个 体 采 集 的 核 酸 的、 选 自 由 SNP(rs11105378)、 SNP(rs2681472)、 SNP(rs1401982)、 SNP(rs11105364)、及 SNP(rs1799998) 所组成的组中的 1 种以上进行分型的工序 ；(b) 根 据由所述工序 (a) 得到的分型结果来判断所述人个体的高血压发病风险的工序。
     本 发 明 的 第 七 方 案 中， 所 述 工 序 (a) 进 一 步 优 选 为 对 AGT 基 因 的 SNP 即 SNP(rs699) 进行分型的工序。
     另外，本发明的第八方案提供一种高血压发病风险判定用微阵列，其特征在 于，在固相载体上固定有选自由本发明的第二、第三、第四、及第六方案的高血压发病 风险判定用多核苷酸所组成的组中的 1 种以上。
     本发明的第八方案中，优选进一步在所述固相载体上固定具有下述的 (a) ～ (f) 中的任一碱基序列、且能够作为用于检测 SNP(rs699) 的引物或探针使用的多核苷酸 ； (a) 序列号 33 所示的碱基序列、或序列号 33 所示的碱基序列的包含 SNP(rs699) 的部分 序列 ；(b) 与所述 (a) 的碱基序列互补的碱基序列 ；(c) 所述 (a) 或 (b) 的碱基序列中 除 SNP(rs699) 以外的 1 ～数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述 (a) 或 (b) 的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下 杂交的碱基序列 ；(d) 序列号 34 所示的碱基序列、或序列号 34 所示的碱基序列的包含 SNP(rs699) 的部分序列 ；(e) 与所述 (d) 的碱基序列互补的碱基序列 ；(f) 所述 (d) 或 (e) 的碱基序列中除 SNP(rs699) 以外的 1 ～数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列， 且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由该所述 (d) 或 (e) 的碱基序列构成的多核苷酸在 严格的条件下杂交的碱基序列。
     另外，本发明的第九方案提供一种高血压发病风险判定用 SNP 分型试剂盒，其 特征在于，其包含选自由本发明的第二方案的高血压发病风险判定用多核苷酸、本发明 的第三方案的高血压发病风险判定用多核苷酸、本发明的第四方案的高血压发病风险判 定用多核苷酸、本发明的第六方案的高血压发病风险判定用多核苷酸、及本发明的第八 方案的高血压发病风险判定用微阵列所组成的组中的 1 种以上。
     另外，本发明的第十方案提供一种高血压发病风险判定用 SNP 分型试剂盒， 其特征在于，其包含选自由本发明的第二方案的高血压发病风险判定用多核苷酸、本发 明的第三方案的高血压发病风险判定用多核苷酸、本发明的第四方案的高血压发病风险 判定用多核苷酸、本发明的第六方案的高血压发病风险判定用多核苷酸、本发明的第八 方案的高血压发病风险判定用微阵列、及具有下述的 (a) ～ (f) 中的任一碱基序列且能 够作为用于检测 SNP(rs699) 的引物及探针使用的多核苷酸所组成的组中的 1 种以上 ； (a) 序列号 33 所示的碱基序列、或序列号 33 所示的碱基序列的包含 SNP(rs699) 的部分 序列 ；(b) 与所述 (a) 的碱基序列互补的碱基序列 ；(c) 所述 (a) 或 (b) 的碱基序列中 除 SNP(rs699) 以外的 1 ～数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序 列构成的多核苷酸能够与由所述 (a) 或 (b) 的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下 杂交的碱基序列 ；(d) 序列号 34 所示的碱基序列、或序列号 34 所示的碱基序列的包含 SNP(rs699) 的部分序列 ；(e) 与所述 (d) 的碱基序列互补的碱基序列 ；(f) 所述 (d) 或 (e) 的碱基序列中除 SNP(rs699) 以外的 1 ～数个碱基缺失、置换或添加而得到的碱基序列， 且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述 (d) 或 (e) 的碱基序列构成的多核苷酸在严 格的条件下杂交的碱基序列。
     另外，本发明的第十一方案提供一种 ATP2B1 基因局部缺失小动物制作用 loxP 重组载体，其特征在于，其包含用 loxP 序列夹持 ATP2B1 基因的碱基序列的全部或一部 分而成的碱基序列。
     另外，本发明的第十二方案提供一种 ATP2B1 基因局部缺失小动物制作用 loxP 重组小动物，其特征在于，使用本发明的第十一方案的载体制作得到。
     另外，本发明的第十三方案提供一种 ATP2B1 基因局部缺失小动物，其特征在 于，其通过使选择性 Cre 表达转基因小动物与作为本发明的第十二方案的 ATP2B1 基因 局部缺失小动物制作用 loxP 重组小动物交配而制得，所述选择性 Cre 表达转基因小动物 以选自由下述启动子所组成的组中的一种启动子作为 Cre 重组酶 (Cre Recombinase) 的表 达启动子 ：Tie-2 启动子、 Tie-1 启动子、 F1k-1 启动子、 SM22 启动子、 SM-MHC 启动 子、Wt1 启动子、P0 启动子、Pax3 启动子、αMHC 启动子、Nkx2.5 启动子、Tbx1 启动 子、四环素诱导 (tetracycline-inducible) 启动子、及 CMV 增强子 - 鸡 β- 肌动蛋白 (CMV enhancer-chickenβ-actin) 启动子。另外，本发明的第十四方案提供一种 ATP2B1 基因的局部缺失小动物的使用方 法，其特征在于，使用作为本发明的第十三方案的 ATP2B1 基因局部缺失小动物作为用于 筛选钙拮抗药的试验动物。
     发明的效果
     作为本发明的第一方案和 / 或第五方案的高血压的遗传标记是包含存在与否和 高血压发病的相关性充分高的 SNP 的遗传标记。 因此，通过利用使用了本发明的高血压 的遗传标记的本发明的第七方案即高血压发病风险判定方法，能够得到可靠性更高的判 定结果。
     另外，通过利用作为本发明的第二～第四方案及第六方案的高血压发病风险判 定用多核苷酸、固定有该高血压发病风险判定用多核苷酸的作为本发明的第八方案的高 血压发病风险判定用微阵列、具有该高血压发病风险判定用多核苷酸或该高血压发病风 险判定用微阵列的作为本发明的第九方案和 / 或第十方案的高血压发病风险判定用 SNP 分型试剂盒中的任一者，从而能够准确且简便地检测作为本发明的高血压的遗传标记的 SNP，能够高精度且有效地判定高血压发病风险。 具体实施方式 本发明中， “高血压” 是指，全身的动脉压一过性或持续地高达可能诱发心血 管系统障碍等障碍的水平的状态。 高血压的具体的定义没有特别限定，例如根据日本高 血压学会制定的 《高血压治疗准则 2004》 (JSH2004) 是指收缩期血压 / 舒张期血压为 140/90mmHg 以上的状态。 除了在没有服用降压药等的状态下收缩期血压为 140mmHg 以上、舒张期血压为 90mmHg 以上的情况以外，还包括收缩期血压不到 140mmHg、但 舒张期血压为 90mmHg 以上的情况，以及舒张期血压不到 90mmHg、但收缩期血压为 140mmHg 以上的情况。 另外，高血压主要大致分为原发性高血压和继发性高血压，90％ 以上被分类为原发性高血压，本发明中，优选原发性高血压。
     本发明中， “高血压的遗传标记” 是指成为高血压的遗传因素的标记的基因。 本发明的高血压的遗传标记包含 SNP，作为其等位基因 ( 等位基因 )，包含高血压易感基 因。
     本发明中， “高血压发病风险” 是指高血压的易罹患性 ( 容易患高血压的程 度 )。即，本发明中，某些人个体为高风险组是指推测该人个体诱发高血压的危险率高， 为低风险组是指推测该人个体诱发高血压的危险率低。
     本发明中， SNP 优选注册于公共数据库的 SNP，能够从其参考号 (reference number) 确定的 SNP。 例如有通过 NCBI(National center for Biotechnology Information) 的 SNP 数据库 (dbSNP BUILD124) 的参考号即 rs 号确定的 SNP、通过东京大学医科学研 究所整理的日本人的 SNP 的数据库 JSNP( 注册商标 )(http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp/index_ ja.html) 的参考号即 IMS-JST 号确定的 SNP 等。
     作为本发明的第一方案的高血压的遗传标记包含 SNP，作为等位基因，包含 ATP2B1(ATPase， Ca2+ 运输，质膜 1) 基因。 具体而言，其特征在于，作为 ATP2B 基 因 的 SNP， 由 与 包 含 选 自 由 SNP(rs11105378)、 SNP(rs2681472)、 SNP(rs1401982)、 SNP(rs11105364) 所组成的组中的 1 种以上的 ATP2B1 基因的部分碱基序列或全部碱基
     序列相同或互补的序列构成。 该遗传标记所包含的 ATP2B 基因的 SNP 可以为 1 种，也 可以为 2 种以上。 例如，可以仅为 SNP(rs11105378)，可以仅为 SNP(rs2681472)，可以 仅为 SNP(rs1401982)，也可以仅为 SNP(rs11105364)。 另外，可以为 SNP(rs11105378) 与 SNP(rs2681472) 的 组 合， 可 以 为 SNP(rs11105378) 与 SNP(rs1401982) 的 组 合， 可 以 为 SNP(rs2681472) 与 SNP(rs1401982) 的 组 合， 也 可 以 为 SNP(rs11105378)、 SNP(rs2681472)、 SNP(rs1401982) 与 SNP(rs11105364) 的组合。
     ATP2B1 是在正常血压组和高血压组中表达量显著增大的酶， ATP2B1 基因是公 知的高血压易感基因。 据报道，人的 ATP2B1 基因 (NCBI 登录号 ：NC_000012) 中， 例如，启动子区域存在的 SNP(rs2070759) 在各多态性的高血压发病风险中存在显著差异 ( 例如，参照专利文献 5。 ) 等，但该结果的显著性并不足以用于诊断。 另一方面，据报 道，在原发性高血压患者 44 名 ( 病例组 ) 和正常血压者 40 名 ( 对照组 ) 中，对于 ATP2B1 基因的所有 22 个外显子进行了 SSCP(Single StrandConformation Polymorphism，单链构象 多态性 ) 分析和 HTX(Heteroduplex，异质性双链构象多态性 ) 分析，结果尽管灵敏度为 100％，但在病例组和对照组中并没有观察到显著差异 ( 例如，参照 G.R.Monteith et al.、 Biochemical and biophysicalresearch communications、1997 年、第 230 卷第 2 号、第 344 ～ 346 页。 )。 即，本发明人等首次发现如下见解 ：ATP2B1 基因为公知的高血压易感基 因，认为 ATP2B1 的表达量的多少对于高血压发病风险很重要，高血压发病风险根据启动 子区域以外的 SNP 等基因多态性的不同而不同。
     这里，SNP(rs11105378) 为 T/C 多态性，由后述实施例 3 的结果可知，与正常血 压组相比较的情况下，高血压组中，C 等位基因的频率显著高于 T 等位基因，作为高血压 的遗传标记是有用的。
     另外，SNP(rs2681472) 为 G/A 多态性，由后述实施例 9 的结果可知，与正常血 压组相比较的情况下，高血压组中， A 等位基因的频率显著高于 G 等位基因，作为高血 压的遗传标记是有用的。
     另外， SNP(rs1401982) 为 A/G 多态性，由后述实施例 15 的结果可知，与正常 血压组相比较的情况下，高血压组中， G 等位基因的频率显著高于 A 等位基因，作为高 血压的遗传标记是有用的。
     进而， SNP(rs11105364) 为 G/T 多态性，由后述实施例 21 的结果可知，与正常 血压组相比较的情况下，高血压组中，T 等位基因的频率显著高于 G 等位基因，作为高血 压的遗传标记是有用的。
     作为本发明的第五方案的高血压的遗传标记包含 SNP，作为等位基因，包含 CYP11B2( 细胞色素 P450，亚家族 XIB2) 基因。 具体而言，其特征在于，由与包含 CYP11B2 基因的 SNP 即 SNP(rs1799998) 的 CYP11B2 基因的部分碱基序列或全部碱基序 列相同或互补的碱基序列构成。 SNP(rs1799998) 为 C/T 多态性，由后述实施例 28 的结 果可知，与正常血压组相比较的情况下，高血压组中， T 等位基因的频率显著高于 C 等 位基因，作为高血压的遗传标记是有用的。 另外，未有报道指出 CYP11B2 基因特别地显 示出与高血压相关的见解， CYP11B2 基因为高血压易感基因是本发明人等首次发现的见 解。
     作为本发明的第七方案的高血压发病风险判定方法是利用作为本发明的第一方案和 / 或第五方案的高血压的遗传标记 ( 以下有时也称为 “本发明的高血压的遗传 标记”。 ) 来判定高血压发病的风险的方法。 具体而言，其特征在于，其包括以下 工 序 ：(a) 对 由 人 个 体 采 集 的 核 酸 的、 选 自 由 SNP(rs11105378)、 SNP(rs2681472)、 SNP(rs1401982)、 SNP(rs11105364)、 及 SNP(rs1799998) 所 组 成 的 组 中 的 1 种 以 上 进行分型的工序 ；和 (b) 根据通过所述工序 (a) 获得的分型结果来判定所述人个体的 高 血 压 发 病 风 险 的 工 序。 SNP(rs11105378)、 SNP(rs2681472)、 SNP(rs1401982)、 SNP(rs11105364)、SNP(rs1799998) 中的任意一种的多态性之间，在高血压的易发病性方 面统计学上都显著不同，因此能够由所鉴定的 SNP 的基因型判定高血压发病风险。
     首先，作为工序 (a)，对由人个体采集的核酸的、选自由 SNP(rs11105378)、 SNP(rs2681472)、 SNP(rs1401982)、 SNP(rs11105364)、及 SNP(rs1799998) 所组成的组 中的 1 种以上进行分型。
     本发明中， “对 SNP 进行分型” 意味着，测定核酸的碱基序列，检测 SNP，从 而鉴定多态性。 例如，鉴定作为判定对象的核酸的 SNP(rs11105378) 为 TT 型、TC 型、 CC 型中的哪一者。
     供于 SNP 分型的核酸只要是从人个体采集的，则没有特别限定，可以是血液、 体液等生物试样 ( 待测物 ) 中所含有的核酸、或者从这些生物试样等提取的核酸，也可以 是以这些核酸为模板扩增得到的核酸。 另外，也可以是利用逆转录酶由生物试样中所含 有的 RNA 合成的 cDNA。
     SNP 的分型方法只要是通常用于 SNP 的检测的方法，则没有特别限定。 例 如，可列举出 Invader( 商标、 Third WaveTechnologies 公司 ) 法、 TaqMan( 商标、 Applied Biosystems 公司 ) 法、 MALDI-TOF 质谱法、微阵列法、测序法、利用 PCR( 聚合酶链反 应 ) 等碱基序列扩增法的检测法等。 特别是优选像 TaqMan 法、 PCR 法、微阵列法等那 样的使用与各多态性特异性杂交的引物或探针来检测 SNP 的方法。 例如，在 PCR 法中， 以仅与野生型等位基因完全互补的多核苷酸作为野生型引物，以仅与突变型等位基因完 全互补的多核苷酸作为突变型引物的情况下，以包含 SNP 的核酸作为模板利用各引物进 行 PCR，通过是否能够得到 PCR 产物，能够鉴定 SNP 的基因型。 同样地，以仅与野生 型等位基因完全互补的多核苷酸作为野生型探针，以仅与突变型等位基因完全互补的多 核苷酸作为突变型探针的情况下，通过使用固定有包含 SNP 的核酸的微阵列并利用各探 针时能否杂交，能够鉴定 SNP 的基因型。 这些使用对各 SNP 特异性的探针或引物的方法 与测序法等不同，由于可直接识别 SNP，因此可靠性更高，另外， SNP 分型所需要的时 间短，且简便。
     另外，使用对各 SNP 特异性的引物进行 PCR 时获得的 PCR 产物的检测可通过通 常用于检测和定量 PCR 产物时的任意方法来进行。 例如，可通过电泳来检测，可以通过 使用 SYBR Green 等荧光嵌入剂的实时 PCR 来检测，也可以通过单分子荧光分析法 (single molecule fluorescence analysis) 来检测。
     能够作为用于检测 SNP 的引物或探针使用的高血压发病风险判定用多核苷酸， 只要是能够与包含该 SNP 的基因的包含该 SNP 在内的部分区域或其互补链杂交的多核苷 酸，则没有特别限定。 另外，高血压发病风险判定用多核苷酸的碱基长度、 Tm 值等可 考虑分型方法、反应条件等适当决定，但作为高血压发病风险判定用多核苷酸的碱基长度，优选为 10 ～ 60 个碱基长度，更优选为 15 ～ 50 个碱基长度。
     这种高血压发病风险判定用多核苷酸的设计可采用该技术领域中众所周知的方 法中的任一者来进行。 例如，利用公知的基因组序列数据和通用的引物设计工具，能够 简便地设计。 作为该引物设计工具，例如有网络上能够利用的 Primer3 等。 另外，公知的 基因组序列数据通常能够在作为国际性的碱基序列数据库的 NCBI、或 DDBJ(DNA Data Bank of Japan) 等中获得。
     这样设计的高血压发病风险判定用多核苷酸可采用该技术领域中众所周知的方 法中的任一者来合成。 例如，可依赖于合成公司来合成，也可以使用市售的合成机独自 合成。
     作为用于检测 ATP2B1 基因上的 SNP(rs11105378) 的引物或探针，特别优选使用 具有下述的 (a) ～ (f) 中任一碱基序列的、作为本发明的第二方案的高血压发病风险判定 用多核苷酸 ( 以下称为 “SNP(rs11105378) 检测用多核苷酸”。 )。
     (a) 序 列 号 5 所 示 的 碱 基 序 列、 或 序 列 号 5 所 示 的 碱 基 序 列 的 包 含 SNP(rs11105378) 的部分序列。
     (b) 与所述 (a) 的碱基序列互补的碱基序列。
     (c) 所述 (a) 或 (b) 的碱基序列中除 SNP(rs11105378) 以外的 1 ～数个碱基缺失、 置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述 (a) 或 (b) 的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
     (d) 序 列 号 6 所 示 的 碱 基 序 列、 或 序 列 号 6 所 示 的 碱 基 序 列 的 包 含 SNP(rs11105378) 的部分序列。
     (e) 与所述 (d) 的碱基序列互补的碱基序列。
     (f) 所述 (d) 或 (e) 的碱基序列中除 SNP(rs11105378) 以外的 1 ～数个碱基缺失、 置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述 (d) 或 (e) 的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
     另外，具有上述 (a) ～ (c) 中的任一碱基序列的 SNP(rs11105378) 检测用多核苷 酸是能够检测 SNP(rs11105378) 的 C 等位基因 (C allele) 的多核苷酸，具有上述 (d) ～ (f) 中的任一碱基序列的 SNP(rs11105378) 检测用多核苷酸是能够检测 SNP(rs11105378) 的 T 等位基因 (T allele) 的多核苷酸。
     作为用于检测 ATP2B1 基因上的 SNP(rs2681472) 的引物或探针，特别优选使用 具有下述的 (a) ～ (f) 中的任一碱基序列的、作为本发明的第三方案的高血压发病风险判 定用多核苷酸 ( 以下称为 “SNP(rs2681472) 检测用多核苷酸”。 )。
     (a) 序 列 号 12 所 示 的 碱 基 序 列、 或 序 列 号 12 所 示 的 碱 基 序 列 的 包 含 SNP(rs2681472) 的部分序列。
     (b) 与所述 (a) 的碱基序列互补的碱基序列。
     (c) 所述 (a) 或 (b) 的碱基序列中除 SNP(rs2681472) 以外的 1 ～数个碱基缺失、 置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述 (a) 或 (b) 的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
     (d) 序 列 号 13 所 示 的 碱 基 序 列、 或 序 列 号 13 所 示 的 碱 基 序 列 的 包 含 SNP(rs2681472) 的部分序列。(e) 与所述 (d) 的碱基序列互补的碱基序列。
     (f) 所述 (d) 或 (e) 的碱基序列中除 SNP(rs2681472) 以外的 1 ～数个碱基缺失、 置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述 (d) 或 (e) 的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
     另外，具有上述 (a) ～ (c) 中的任一碱基序列的 SNP(rs2681472) 检测用多核苷 酸是能够检测 SNP(rs2681472) 的 A 等位基因 (A allele) 的多核苷酸，具有上述 (d) ～ (f) 中的任一碱基序列的 SNP(rs2681472) 检测用多核苷酸是能够检测 SNP(rs2681472) 的 G 等 位基因 (G allele) 的多核苷酸。
     作为用于检测 ATP2B1 基因上的 SNP(rs1401982) 的引物或探针，特别优选使用 具有下述的 (a) ～ (f) 中的任一碱基序列的、本发明的第四方案即高血压发病风险判定用 多核苷酸 ( 以下称为 “SNP(rs1401982) 检测用多核苷酸”。 )。
     (a) 序 列 号 19 所 示 的 碱 基 序 列、 或 序 列 号 19 所 示 的 碱 基 序 列 的 包 含 SNP(rs1401982) 的部分序列。
     (b) 与所述 (a) 的碱基序列互补的碱基序列。
     (c) 所述 (a) 或 (b) 的碱基序列中除 SNP(rs1401982) 以外的 1 ～数个碱基缺失、 置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述 (a) 或 (b) 的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
     (d) 序 列 号 20 所 示 的 碱 基 序 列、 或 序 列 号 20 所 示 的 碱 基 序 列 的 包 含 SNP(rs1401982) 的部分序列。
     (e) 与所述 (d) 的碱基序列互补的碱基序列。
     (f) 所述 (d) 或 (e) 的碱基序列中除 SNP(rs1401982) 以外的 1 ～数个碱基缺失、 置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述 (d) 或 (e) 的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
     另外，具有上述 (a) ～ (c) 中的任一碱基序列的 SNP(rs1401982) 检测用多核苷 酸是能够检测 SNP(rs1401982) 的 G 等位基因的多核苷酸，具有上述 (d) ～ (f) 中的任一 碱基序列的 SNP(rs1401982) 检测用多核苷酸是能够检测 SNP(rs1401982) 的 A 等位基因 的多核苷酸。
     另外，作为用于检测 CYP11B2 基因上的 SNP(rs1799998) 的引物或探针，特别优 选具有下述的 (a) ～ (f) 中的任一碱基序列的、作为本发明的第五方案的高血压发病风险 判定用多核苷酸 ( 以下称为 “SNP(rs1799998) 检测用多核苷酸”。 )。
     (a) 序 列 号 26 所 示 的 碱 基 序 列、 或 序 列 号 26 所 示 的 碱 基 序 列 的 包 含 SNP(rs1799998) 的部分序列。
     (b) 与所述 (a) 的碱基序列互补的碱基序列。
     (c) 所述 (a) 或 (b) 的碱基序列中除 SNP(rs1799998) 以外的 1 ～数个碱基缺失、 置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述 (a) 或 (b) 的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
     (d) 序 列 号 27 所 示 的 碱 基 序 列、 或 序 列 号 27 所 示 的 碱 基 序 列 的 包 含 SNP(rs1799998) 的部分序列。
     (e) 与所述 (d) 的碱基序列互补的碱基序列。(f) 所述 (d) 或 (e) 的碱基序列中除 SNP(rs1799998) 以外的 1 ～数个碱基缺失、 置换或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述 (d) 或 (e) 的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
     另外，具有上述 (a) ～ (c) 中的任一碱基序列的 SNP(rs1799998) 检测用多核苷 酸是能够检测 SNP(rs1799998) 的 T 等位基因的多核苷酸，具有上述 (d) ～ (f) 中的任一 碱基序列的 SNP(rs1799998) 检测用多核苷酸是能够检测 SNP(rs1799998) 的 C 等位基因的 多核苷酸。
     另外，本发明中， “严格的条件下” 例如可列举出 ：在 5×SSC(150mM 氯化 钠、15mM 柠檬酸钠、 pH7.4)+0.3 ％ SDS( 十二烷基硫酸钠 ) 中热变性后，在 65 ℃下 杂交 4 ～ 16 小时，分别用常温的 2×SSC+0.1 ％ SDS、及 2×SSC 各洗涤 5 分钟，并用 0.05×SSC 冲洗等。
     此外，工序 (a) 中使用的高血压发病风险判定用多核苷酸中，除与检测对象的 基因的碱基序列互补或相同的序列以外，还能够以不阻碍 SNP 分型的程度具有附加的序 列。 作为该附加的序列，例如有限制酶识别序列、提供核酸标记的序列等。 另外，为了 易于检测和分析 SNP 分型结果，各高血压发病风险判定用多核苷酸中能够以不阻碍 SNP 分型的程度添加标记物。 该标记物只要是通常用于标记多核苷酸的化合物，则没有特别 限定。 作为该标记物，例如有放射性同位素、荧光物质、化学发光物质、生物素等低分 子化合物等。
     另外，由人个体采集的核酸、高血压发病风险判定用多核苷酸等在 SNP 分型中 的用量没有特别限定，能够以通常的用量使用。 另外，聚合酶等酶、核苷酸、反应用缓 冲液等没有特别限定，能够以通常的用量使用通常进行 SNP 分型时使用的物质。
     接下来，作为工序 (b)，根据通过工序 (a) 获得的分型结果来判定所述人个体的 高血压发病风险。 例如，高血压发病风险可利用下述表 2、8、14、20、25 等的比值比 (odds ratio) 来判定。 此外，可以利用对本发明的高血压的遗传标记进行荟萃分析 (Meta analysis) 而得到的比值比来判定，可以利用对本发明的高血压的遗传标记进行队列研究 而得到的相对危险度 ( 风险比 ) 来判定，也可以采用其他现有公知的统计方法并利用经统 计学处理的值来判定。
     具体而言，利用 SNP(rs11105378) 的分型结果时，可按照 CC 型、TC 型、TT 型 的顺序判定风险由高到低。 此外，SNP(rs11105378) 为 TT 型时，可判定为低风险组 ；为 TC 型或 CC 型时，可判定为高风险组。
     利用 SNP(rs2681472) 的分型结果时，可按照 AA 型、 AG 型、 GG 型的顺序判 定风险由高到低。 此外，SNP(rs2681472) 为 GG 型或 AG 型时，可判定为低风险组 ；为 AA 型时，可判定为高风险组。
     利用 SNP(rs1401982) 的分型结果时，可按照 GG 型、 AG 型、 AA 型的顺序判 定风险由高到低。 此外，SNP(rs1401982) 为 AA 型时，可判定为低风险组 ；为 AG 型或 GG 型时，可判定为高风险组。
     利用 SNP(rs11105364) 的分型结果时，可按照 TT 型、 TG 型、 GG 型的顺序判 定风险由高到低。 此外，SNP(rs11105364) 为 GG 型时，可判定为低风险组 ；为 TT 型或 TG 型时，可判定为高风险组。另一方面，利用 SNP(rs1799998) 的分型结果时，可按照 TT 型、 CT 型、 CC 型 的顺序判定风险由高到低。 此外， SNP(rs1799998) 为 CC 型或 CT 型时，可判定为低风 险组 ；为 TT 型时，可判定为高风险组。
     另外，组合本发明的遗传标记时，与单独时相比，能够更准确地判定高血压发 病风险。 例如，SNP(rs11105378) 为 TT 型，SNP(rs1799998) 为 CC 型或 CT 型时，可判 定为低风险组 ；SNP(rs11105378) 为 TC 型或 CC 型， SNP(rs1799998) 为 TT 型时，可判 定为高风险组。 另外，SNP(rs2681472) 为 GG 型或 AG 型，SNP(rs1799998) 为 CC 型或 CT 型时，可判定为低风险组 ；SNP(rs2681472) 为 AA 型，SNP(rs1799998) 为 TT 型时， 可判定为高风险组。 SNP(rs1401982) 为 AA 型， SNP(rs1799998) 为 CC 型或 CT 型时， 可判定为低风险组 ；SNP(rs1401982) 为 AG 型或 GG 型， SNP(rs1799998) 为 TT 型时， 可判定为高风险组。 SNP(rs11105364) 为 GG 型，SNP(rs1799998) 为 CC 型或 CT 型时， 可判定为低风险组 ；SNP(rs11105364) 为 TT 型或 TG 型， SNP(rs1799998) 为 TT 型时， 也可判定为高风险组。
     此外，本发明的遗传标记也能够与其他高血压的遗传标记组合使用。 组合 的遗传标记没有特别限定，也可以组合公知的高血压的遗传标记。 特别优选与具有 如下特征的高血压的遗传标记组合，所述高血压的遗传标记的特征在于，其由与包含 AGT(encoding Angiotensinogen，血管紧张肽原 ) 基因的 SNP 即 SNP(rs699) 的 AGT 基因 的部分碱基序列或全部碱基序列相同或互补的序列构成。
     AGT 基因是具有多个 SNP 的公知的高血压易感基因。 SNP(rs699) 为 M/T 多 态性，由后述实施例 28 的结果可知，与正常血压组相比较的情况下，高血压组中， T 等 位基因的频率显著高于 M 等位基因，作为高血压的遗传标记是有用的。 因此，例如， SNP(rs699) 为 MM 型或 MT 型时，可判定为低风险组 ；为 TT 型时，可判定为高风险组。 另外，本申请说明书中， M 为蛋氨酸 (Met)， T 表示苏氨酸 (Thr)。 这里，作为碱基序 列， MM 型为 TT 型所表现出的多态性， MT 型为 TC 型所表现出的多态性， TT 型为 CC 型所表现出的多态性。
     SNP(rs699) 的分型能够与 SNP(rs11105378)、 SNP(rs1799998) 同样地使用公知 的 SNP 分型法来进行，优选的是，使用由与包含 SNP(rs699) 的 AGT 基因的部分碱基序列 或全部碱基序列相同或互补的序列构成的多核苷酸作为引物或探针，通过 SNP 分型法来 鉴定 SNP。 作为能够作为用于检测 AGT 基因上的 SNP(rs699) 的引物或探针使用的多核 苷酸，优选具有下述的 (a) ～ (f) 中的任一碱基序列的多核苷酸 ( 以下称为 “SNP(rs699) 检测用多核苷酸”。 )。
     (a) 序列号 33 所示的碱基序列、或序列号 33 所示的碱基序列的包含 SNP(rs699) 的部分序列。
     (b) 与所述 (a) 的碱基序列互补的碱基序列。
     (c) 所述 (a) 或 (b) 的碱基序列中除 SNP(rs699) 以外的 1 ～数个碱基缺失、置换 或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述 (a) 或 (b) 的碱 基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
     (d) 序列号 34 所示的碱基序列、或序列号 34 所示的碱基序列的包含 SNP(rs699) 的部分序列。(e) 与所述 (d) 的碱基序列互补的碱基序列。
     (f) 所述 (d) 或 (e) 的碱基序列中除 SNP(rs699) 以外的 1 ～数个碱基缺失、置换 或添加而得到的碱基序列，且由该碱基序列构成的多核苷酸能够与由所述 (d) 或 (e) 的碱 基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的碱基序列。
     另外，具有上述 (a) ～ (c) 中的任一碱基序列的 SNP(rs699) 检测用多核苷酸为 能够检测 SNP(rs699) 的 T 等位基因的多核苷酸，具有上述 (d) ～ (f) 中的任一碱基序列 的 SNP(rs699) 检测用多核苷酸为能够检测 SNP(rs699) 的 M 等位基因的多核苷酸。
     例如，根据 SNP(rs11105378) 和 SNP(rs699) 的分型结果， SNP(rs11105378) 为 TT 型， SNP(rs699) 为 MM 型或 MT 型时，可判定为低风险组 ；SNP(rs11105378) 为 TC 型或 CC 型， SNP(rs699) 为 TT 型时，可判定为高风险组。 另外，根据 SNP(rs2681472) 和 SNP(rs699) 的分型结果，SNP(rs2681472) 为 GG 型或 AG 型，SNP(rs699) 为 MM 型或 MT 型时，可判定为低风险组 ；SNP(rs2681472) 为 AA 型，SNP(rs699) 为 TT 型时，可判 定为高风险组。另外，根据 SNP(rs1401982) 和 SNP(rs699) 的分型结果，SNP(rs1401982) 为 AA 型，SNP(rs699) 为 MM 型或 MT 型时，可判定为低风险组 ；SNP(rs1401982) 为 AG 型或 GG 型，SNP(rs699) 为 TT 型时，可判定为高风险组。 进而，根据 SNP(rs11105364) 和 SNP(rs699) 的分型结果， SNP(rs11105364) 为 GG 型， SNP(rs699) 为 MM 型或 MT 型时，可判定为低风险组 ；SNP(rs11105364) 为 TT 型或 TG 型， SNP(rs699) 为 TT 型 时， 可 判 定 为 高 风 险 组。 此 外， 根 据 SNP(rs1799998) 和 SNP(rs699) 的 分 型 结 果， SNP(rs1799998) 为 CC 型或 CT 型， SNP(rs699) 为 MM 型或 MT 型时，可判定为低风险 组 ；SNP(rs1799998) 为 TT 型， SNP(rs699) 为 TT 型时，可判定为高风险组。
     进而，通过组合作为本发明的第一方案的高血压的遗传标记、作为本发明的第 五方案的高血压的遗传标记、以及由包含 SNP(rs699) 的 AGT 基因构成的高血压的遗传标 记这 3 种遗传标记，从而能够获得可靠性非常高的风险评价。 例如， SNP(rs11105378) 为 TT 型， SNP(rs1799998) 为 CC 型 或 CT 型， SNP(rs699) 为 MM 型 或 MT 型 时， 可 判 定 为 低 风 险 组 ；SNP(rs11105378) 为 TC 型 或 CC 型， SNP(rs1799998) 为 TT 型， SNP(rs699) 为 TT 型时，可判定为高风险组。 另外，SNP(rs2681472) 为 GG 型或 AG 型， SNP(rs1799998) 为 CC 型或 CT 型， SNP(rs699) 为 MM 型或 MT 型时，可判定为低风险 组 ；SNP(rs2681472) 为 AA 型，SNP(rs1799998) 为 TT 型，SNP(rs699) 为 TT 型时，可判 定为高风险组。 进而， SNP(rs1401982) 为 AA 型， SNP(rs1799998) 为 CC 型或 CT 型， SNP(rs699) 为 MM 型或 MT 型时，可判定为低风险组 ；SNP(rs1401982) 为 AG 型或 GG 型， SNP(rs1799998) 为 TT 型， SNP(rs699) 为 TT 型时，可判定为高风险组。
     另外，组合这 3 种遗传标记，根据高风险多态性的数目、低风险多态性的数目 等，也能够进行更精细的风险评价。 例如，高风险多态性的数目越多，则能够判定高血 压发病风险越高。 另外，低风险多态性的数目越少，则能够判定高血压发病风险越高。 此外，高风险多态性的数目越少，则也能够判定高血压发病风险越低，低风险多态性的 数目越多，则也能够判定高血压发病风险越低。
     具 体 而 言， 以 SNP(rs11105378) 的 CC 型、 SNP(rs1799998) 的 TT 型、 SNP(rs699) 的 TT 型分别作为高风险多态性，能够按照这些高风险多态性的个数为 3 个、 2 个、1 个、0 个的顺序来判定风险由高到低。 另外，以 SNP(rs2681472) 的 AA 型、SNP(rs1799998) 的 TT 型、 SNP(rs699) 的 TT 型分别为高风险多态性，能够按照这些 高风险多态性的个数为 3 个、2 个、1 个、0 个的顺序来判定风险由高到低。 进而，以 SNP(rs1401982) 的 GG 型、 SNP(rs1799998) 的 TT 型、 SNP(rs699) 的 TT 型分别作为高 风险多态性，能够按照这些高风险多态性的个数为 3 个、2 个、1 个、0 个的顺序来判定风 险由高到低。
     另外，以 SNP(rs11105378) 的 TT 型、SNP(rs1799998) 的 CC 型、SNP(rs699) 的 MM 型分别作为低风险多态性，能够按照这些低风险多态性的个数为 0 个、1 个、2 个、 3 个的顺序来判定风险由高到低。 另外，以 SNP(rs2681472) 的 GG 型、SNP(rs1799998) 的 CC 型、 SNP(rs699) 的 MM 型分别作为低风险多态性，能够按照这些低风险多态性的 个数为 0 个、1 个、2 个、3 个的顺序来判定风险由高到低。 进而，以 SNP(rs1401982) 的 AA 型、 SNP(rs1799998) 的 CC 型、 SNP(rs699) 的 MM 型分别作为低风险多态性，也能 够按照这些低风险多态性的个数为 0 个、1 个、2 个、3 个的顺序来判定风险由高到低。
     此 外， 例 如， 以 SNP(rs11105378) 为 TT 型， SNP(rs1799998) 为 CC 型 或 CT 型， SNP(rs699) 为 MM 型或 MT 型的情况作为第一组 ；以 SNP(rs11105378) 为 TC 型 或 CC 型、 SNP(rs1799998) 为 CC 型或 CT 型、 SNP(rs699) 为 MM 型或 MT 型的情况， SNP(rs11105378) 为 TT 型、 SNP(rs1799998) 为 CC 型或 CT 型、 SNP(rs699) 为 TT 型的 情况，或者，SNP(rs11105378) 为 TT 型、SNP(rs1799998) 为 TT 型、SNP(rs699) 为 MM 型或 MT 型的情况作为第二组 ；以 SNP(rs11105378) 为 TC 型或 CC 型、SNP(rs1799998) 为 CC 型或 CT 型、 SNP(rs699) 为 TT 型的情况， SNP(rs11105378) 为 TC 型或 CC 型、 SNP(rs1799998) 为 TT 型、SNP(rs699) 为 MM 型或 MT 型的情况，或者 SNP(rs11105378) 为 TT 型、 SNP(rs1799998) 为 TT 型、 SNP(rs699) 为 TT 型 的 情 况 作 为 第 三 组 ；以 SNP(rs11105378) 为 TC 型或 CC 型、SNP(rs1799998) 为 TT 型、SNP(rs699) 为 TT 型的情 况作为第四组 ；在所述工序 (b) 中，能够按照所述第四组、所述第三组、所述第二组、 所述第一组的顺序判定风险由高到低。
     另 外， 以 SNP(rs2681472) 为 GG 型 或 AG 型、 SNP(rs1799998) 为 CC 型 或 CT 型、 SNP(rs699) 为 MM 型 或 MT 型 的 情 况 作 为 第 一 组 ；以 SNP(rs2681472) 为 AA 型、 SNP(rs1799998) 为 CC 型 或 CT 型、 SNP(rs699) 为 MM 型 或 MT 型 的 情 况， SNP(rs2681472) 为 GG 型 或 AG 型、 SNP(rs1799998) 为 CC 型 或 CT 型、 SNP(rs699) 为 TT 型的情况，或者 SNP(rs2681472) 为 GG 型或 AG 型、 SNP(rs1799998) 为 TT 型、 SNP(rs699) 为 MM 型 或 MT 型 的 情 况 作 为 第 二 组 ；以 SNP(rs2681472) 为 AA 型、 SNP(rs1799998) 为 CC 型 或 CT 型、 SNP(rs699) 为 TT 型 的 情 况， SNP(rs2681472) 为 AA 型、 SNP(rs1799998) 为 TT 型、 SNP(rs699) 为 MM 型 或 MT 型 的 情 况， 或 者 SNP(rs2681472) 为 GG 型或 AG 型、 SNP(rs1799998) 为 TT 型、 SNP(rs699) 为 TT 型的 情况作为第三组 ；以 SNP(rs2681472) 为 AA 型、SNP(rs1799998) 为 TT 型、SNP(rs699) 为 TT 型的情况作为第四组 ；所述工序 (b) 中，能够按照所述第四组、所述第三组、所述 第二组、所述第一组的顺序判定风险由高到低。
     进 而， 以 SNP(rs1401982) 为 AA 型、 SNP(rs1799998) 为 CC 型 或 CT 型、 SNP(rs699) 为 MM 型 或 MT 型 的 情 况 作 为 第 一 组 ；以 SNP(rs1401982) 为 AG 型 或 GG 型、 SNP(rs1799998) 为 CC 型 或 CT 型、 SNP(rs699) 为 MM 型 或 MT 型 的 情 况，SNP(rs1401982) 为 AA 型、 SNP(rs1799998) 为 CC 型或 CT 型、 SNP(rs699) 为 TT 型的 情况，或者 SNP(rs1401982) 为 AA 型、 SNP(rs1799998) 为 TT 型、 SNP(rs699) 为 MM 型或 MT 型的情况作为第二组 ；以 SNP(rs1401982) 为 AG 型或 GG 型、 SNP(rs1799998) 为 CC 型 或 CT 型、 SNP(rs699) 为 TT 型 的 情 况， SNP(rs1401982) 为 AG 型 或 GG 型、 SNP(rs1799998) 为 TT 型、 SNP(rs699) 为 MM 型 或 MT 型 的 情 况、 或 者 以 SNP(rs1401982) 为 AA 型、 SNP(rs1799998) 为 TT 型、 SNP(rs699) 为 TT 型的情况作为 第三组 ；以 SNP(rs1401982) 为 AG 型或 GG 型、 SNP(rs1799998) 为 TT 型、 SNP(rs699) 为 TT 型的情况作为第四组 ；在所述工序 (b) 中，也能够按照所述第四组、所述第三组、 所述第二组、所述第一组的顺序判定风险由高到低。
     此外，工序 (b) 中的高血压发病风险的判定也可以组合通过工序 (a) 得到的分型 结果、和除遗传标记以外的 1 个以上高血压的危险因素来进行。 作为除遗传标记以外的 危险因素，例如有人个体的性别、年龄、 BMI 值、脑血管疾病的有无、心脏病的有无、 吸烟的有无、饮酒量、总胆固醇值、 HDL 胆固醇值、中性脂肪值、空腹时血糖值等。
     利用微阵列法来进行工序 (a) 中的 SNP 分型时，优选采用作为本发明的第八方 案的高血压发病风险判定用微阵列，即优选的是，在固相载体上固定有 SNP(rs11105378) 检测用多核苷酸、 SNP(rs2681472) 检测用多核苷酸、 SNP(rs1401982) 检测用多核苷酸、 SNP(rs11105364) 检测用多核苷酸和 SNP(rs1799998) 检测用多核苷酸中的至少 1 种。 作 为本发明的第八方案的高血压发病风险判定用微阵列，优选为固定有 SNP(rs11105378) 检 测 用 多 核 苷 酸、 SNP(rs2681472) 检 测 用 多 核 苷 酸 和 SNP(rs1401982) 检 测 用 多 核 苷 酸 中 的 至 少 1 种 以 及 SNP(rs1799998) 检 测 用 多 核 苷 酸 的 微 阵 列 ；更 优 选 固 定 有 SNP(rs11105378) 检测用多核苷酸、 SNP(rs2681472) 检测用多核苷酸、 SNP(rs1401982) 检测用多核苷酸和 SNP(rs1799998) 检测用多核苷酸中的任一者的微阵列。
     另外，作为本发明的第八方案的高血压发病风险判定用微阵列，进一步优 选 在 固 相 载 体 上 固 定 有 SNP(rs11105378) 检 测 用 多 核 苷 酸、 SNP(rs2681472) 检 测 用 多 核 苷 酸、 SNP(rs1401982) 检 测 用 多 核 苷 酸、 SNP(rs11105364) 检 测 用 多 核 苷 酸、 SNP(rs1799998) 检测用多核苷酸和 SNP(rs699) 检测用多核苷酸中的至少 1 种的微阵列 ； 更优选固定有 SNP(rs11105378) 检测用多核苷酸、 SNP(rs2681472) 检测用多核苷酸、 SNP(rs1401982) 检测用多核苷酸和 SNP(rs1799998) 检测用多核苷酸中的至少 1 种以及 SNP(rs699) 检测用多核苷酸的微阵列。 进一步优选固定有 SNP(rs11105378) 检测用多 核苷酸、 SNP(rs2681472) 检测用多核苷酸和 SNP(rs1401982) 检测用多核苷酸中的至少 1 种、以及 SNP(rs1799998) 检测用多核苷酸和 SNP(rs699) 检测用多核苷酸的微阵列 ； 特别优选固定有 SNP(rs11105378) 检测用多核苷酸、 SNP(rs2681472) 检测用多核苷酸、 SNP(rs1401982) 检测用多核苷酸、 SNP(rs1799998) 检测用多核苷酸和 SNP(rs699) 检测 用多核苷酸中的任一者的微阵列。
     另外，本发明中，微阵列是指在固相载体上按照能够确定位置的方式固定有作 为探针的多核苷酸的检测装置，固定化有探针 ( 多核苷酸 ) 的载体自身可以为分散性，只 要是能够按照检测时能确定位置的方式固定在 2 维的固相载体上的状态即可。
     另外，通过将用于工序 (a) 中的 SNP 分型的高血压发病风险判定用多核苷 酸 等 制 成 试 剂 盒， 从 而 能 够 更 简 便 地 进 行 工 序 (a) 的 SNP 分 型。 例 如， 作 为 用 于选 自 由 SNP(rs11105378)、 SNP(rs2681472)、 SNP(rs1401982)、 SNP(rs11105364) 及 SNP(rs1799998) 所 组 成 的 组 中 的 1 种 以 上 SNP 的 分 型 的 SNP 分 型 试 剂 盒， 优 选 像作为本发明的第九方案的高血压发病风险判定用 SNP 分型试剂盒那样包含选自由 SNP(rs11105378) 检测用多核苷酸、 SNP(rs2681472) 检测用多核苷酸、 SNP(rs1401982) 检 测 用 多 核 苷 酸、 SNP(rs11105364) 检 测 用 多 核 苷 酸、 SNP(rs1799998) 检 测 用 多 核 苷 酸 及 在 固 相 载 体 上 固 定 有 SNP(rs11105378) 检 测 用 多 核 苷 酸、 SNP(rs2681472) 检 测 用 多 核 苷 酸、 SNP(rs1401982) 检 测 用 多 核 苷 酸、 SNP(rs11105364) 检 测 用 多 核 苷 酸和 SNP(rs1799998) 检测用多核苷酸中 的至少 1 种的微阵列所组成的组中的 1 种以 上。 此 外， 作 为 在 选 自 由 SNP(rs11105378)、 SNP(rs2681472)、 SNP(rs1401982)、 及 SNP(rs1799998) 所组成的组中的 1 种以上 SNP 和 SNP(rs699) 的分型中使用的 SNP 分型试剂盒，优选像作为本发明的第十方案的 SNP 分型试剂盒那样，包含选自由下 述多核苷酸和微阵列所组成的组中的 1 个以上 ：SNP(rs11105378) 检测用多核苷酸， SNP(rs2681472) 检测用多核苷酸， SNP(rs1401982) 检测用多核苷酸， SNP(rs11105364) 检测用多核苷酸， SNP(rs1799998) 检测用多核苷酸， SNP(rs699) 检测用多核苷酸， 在 固 相 载 体 上 固 定 有 SNP(rs11105378) 检 测 用 多 核 苷 酸、 SNP(rs2681472) 检 测 用 多 核 苷 酸、 SNP(rs1401982) 检 测 用 多 核 苷 酸、 SNP(rs11105364) 检 测 用 多 核 苷 酸、 SNP(rs1799998) 检测用多核苷酸的微阵列，以及在固相载体上固定有 SNP(rs11105378) 检测用多核苷酸、 SNP(rs2681472) 检测用多核苷酸、 SNP(rs1401982) 检测用多核苷酸、 SNP(rs11105364) 检测用多核苷酸、 SNP(rs1799998) 检测用多核苷酸以及 SNP(rs699) 检 测用多核苷酸的微阵列。
     此外，使用特征在于包含用 loxP 序列夹持 ATP2B1 基因的碱基序列的全部或 一部分而成的碱基序列的 ATP2B1 基因局部缺失小动物制作用 loxP 重组载体，能够制 作 ATP2B1 基因局部缺失小动物制作用 loxP 重组小动物。 特别优选使用包含下述碱基 序列的 ATP2B1 基因局部缺失小动物制作用 loxP 重组载体，来制作 ATP2B1 基因局部 缺失小动物制作用 loxP 重组小动物，所述碱基序列中，包含选自由 SNP(rs11105378)、 SNP(rs2681472)、 SNP(1401982)、 SNP(rs11105364) 所组成的组中的 1 个以上 SNP 的 ATP2B1 基因区域被 loxP 序列夹持。
     进而，通过使该 ATP2B1 基因局部缺失小动物制作用 loxP 重组小动物与以适当 的启动子作为 Cre 重组酶的表达启动子的选择性 Cre 表达转基因小动物交配，从而能够 制作 ATP2B1 基因局部缺失小动物。 作为 Cre 重组酶的表达启动子，例如优选为选自由 Tie-2 启动子、Tie-1 启动子、Flk-1 启动子、SM22 启动子、SM-MHC 启动子、Wt1 启动 子、P0 启动子、Pax3 启动子、αMHC 启动子、Nkx2.5 启动子、Tbx1 启动子、四环素诱 导启动子 (tetracycline-inducible promoter) 及 CMV 增强子 - 鸡 β- 肌动蛋白启动子 (CMV enhancer-chickenβ-actin promoter) 所组成的组中的一个启动子。
     这样制作的 ATP2B1 基因局部缺失小动物优选呈现出高血压症状。 另外，该 ATP2B1 基因局部缺失小动物能够优选作为用于筛选钙拮抗药的试验动物使用，也能够作 为具有 ATP2B1 基因的基因多态性及表达异常的疾病的模型小动物使用。实施例
     下面示出实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不限定于以下的实施例。 [ 实施例 1] 用于 SNP 分型的核酸的调制
     以 8924 个一般地区居民作为对象，为了调查 SNP 的基因型与高血压的关系而进 行了回顾性队列研究。 这些对象者从横浜 (1811 人 )、滋贺 (3730 人 )、爱媛 (3383 人 ) 召集。
     首 先， 使 用 作 为 DNA 提 取 试 剂 盒 的 QIAamp DNA Blood Kit(QIAGEN GmbH 制 )，从由对象者采集的末梢血中的白细胞提取各人的基因组 DNA。 将所得基因组 DNA 用 GenomiPhi DNAAmplification Kit(GE HEALTHCARE JAPAN CORPORATION 制 ) 进行 扩增。 将扩增获得的 DNA 用 buffer AE(QIAGEN GmbH 制 ) 稀释至 50 倍，供于 SNP 分型。
     [ 实施例 2]ATP2B1 基因上的 SNP(rs11105378) 的分型
     以 各 对象 者的完成 扩增后 的基因组 DNA 作 为 模板， 通过 TaqMan 探针法 对 ATP2B1 基因上的 SNP(rs11105378) 进行分析。 具体而言，在实施例 1 中得到的 DNA 溶 液 2.0μL 中 添 加 2.5μL 的 TaqMan Universal Master Mix(Applied Biosystems Inc. 制 )、 0.05μL 对 rs11105378 的各多态性特异性的 TaqMan Pre-DesignedSNP 基因分型分析 (Assay ID ；C__32174448_10、 AppliedBiosystems Inc. 制 )、0.45μL 的蒸馏水，调制反应溶液 后，供于利用 PCR 法的延伸反应。 延伸反应中，在 52℃下加热 2 分钟，接着在 95℃下加 热 10 分钟后，重复 60 次下述过程 ：在 95℃下加热 15 秒钟、在 60℃下加热 1 分钟。 延 伸反应后，用 7900HT Fast 实时 PCR 系统 (Applied Biosystems Inc. 制 ) 测定荧光强度，从 而对基因多态性进行分型。
     [ 实施例 3]rs11105378 多态性与高血压的相关性
     以一般地区居民为对象，通过相关分析 ( 关联方法 (association method)) 对实施 例 2 中鉴定的 SNP 的基因型与高血压的相关性进行分析。
     [ 表 1]
     年龄 ( 岁 ) 性别 ( 男 / 女 ) 体重指数 (kg/m2) 收缩期血压 (mmHg) 舒张期血压 (mmHg) 降压药 ( 有 / 无 ) 高血压 ( 有 / 无 ) 总胆固醇 (mg/dL)2657±14 4616/4308 23±3 132±21 79±12 1684/7240 3828/5096 202±35CN 102016031 A CN 102016041 A说HDL 胆固醇 (mg/dL) 中性脂肪 (mg/dL) 血糖 (mg/dL) 饮酒量 ( 总 ) 吸烟 ( 有 / 无 )明书60±15 117±82 101±27 0.7±1.0 2177/6747 580/834418/44 页心血管疾病史 ( 有 / 无 )
     表 1 表示作为分析对象的 8924 人的临床背景。 将这些对象者分类成高血压组 ( 收缩期血压 140mmHg 以上、和 / 或舒张期血压 90mmHg 以上、和 / 或服用降压药 ) 和 正常血压组 ( 高血压组以外 )，分析实施例 2 中鉴定的多态性的频率。 作为统计学上的分 析手法，采用卡方检验。 分析结果示于表 2 中。
     [ 表 2]
     表 2 的结果显示，高血压组和正常血压组中，实施例 2 中鉴定的 rs11105378 多态 性中的各基因型的频率在统计学上显著不同。 具体而言，由比值比获知，与正常血压组 比较时，高血压组中， C 等位基因的频率显著高于 T 等位基因。
     由该结果可知，通过调查 SNP(rs11105378) 的基因型，能够判定诱发基因多态 性高血压的相对危险度。
     [ 实施例 4]rs11105378 多态性与高血压的相关性的逻辑回归分析
     通过包含其他有关的环境因素的回归分析对实施例 2 中鉴定的 rs11105378 多态性 与高血压的相关性进行分析。
     将表 1 所示的对象者与实施例 3 同样地分类成高血压组和正常血压组。 除了实 施例 2 中鉴定的 rs11105378 多态性以外，以性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸 烟、饮酒量、 HDL 胆固醇、中性脂肪、血糖为自变量，以这里所分类的高血压的有无为 因变量，实施逻辑回归分析。 分析结果示于表 3 中。
     [ 表 3]
     表 3 的结果显示，在调整了性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、 饮 酒 量、 HDL 胆 固 醇、 中 性 脂 肪、 血 糖 等 环 境 因 素 的 基 础 上， 实 施 例 2 中 鉴 定 的 rs11105378 多态性也是高血压的独立的危险因素。 另外，其相对危险度 ( 比值比 ) 与该 基因型为 TT 型时相比， TC 型时为 1.244 倍， CC 型时为 1.404 倍。
     由该结果可知，通过调查 rs11105378 多态性，从而能够在调整其他环境因素的 影响的基础上判定诱发高血压的相对危险度。 进而，由该结果获知， SNP(rs11105378) 为 TT 型时，可判定为低风险组 ；为 TC 型或 CC 型时，可判定为高风险组。
     [ 实施例 5] 各 rs11105378 多态性的粗略平均血压值的计算
     求出实施例 2 中鉴定的各多态性的收缩期血压和舒张期血压的粗略平均值，通 过单因素方差分析在统计学上分析其差异。 分析结果示于表 4 中。
     [ 表 4]
     表 4 的结果显示，各 rs11105378 多态性的收缩期血压和舒张期血压中任一者的粗 略平均血压值在统计学上都显著不同。
     由该结果可知，通过调查 rs11105378 多态性，能够推测各基因多态性的血压上 升的程度。
     [ 实施例 6]rs11105378 多态性与血压值的相关性的多元回归分析
     通过包含其他有关的环境因素的回归分析对实施例 2 中鉴定的 rs11105378 多态性 与血压值的相关性进行分析。
     除了实施例 2 中鉴定的 rs11105378 多态性以外，以性别、年龄、体重指数、心 血管疾病史、吸烟、饮酒量、降压药的有无、 HDL 胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量 为自变量，以收缩期血压或舒张期血压为因变量，实施多元回归分析。 分析结果示于表 5 中。
     [ 表 5]
     表 5 的结果显示，在调整性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、饮酒 量、降压药的有无、 HDL 胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量等环境因素的基础上，实
     施例 2 中鉴定的 rs11105378 多态性也是收缩期血压、舒张期血压的独立的危险因素。
     由该结果可知，通过调查 rs11105378 多态性，在调整其他环境因素的影响的基 础上，也能够推测各基因多态性的血压上升的程度。
     [ 实施例 7] 各 rs11105378 多态性的完成调整后的平均血压值的计算
     由实施例 6 中所示的、实施例 2 中鉴定的 rs11105378 多态性与血压值的回归分 析，计算出调整了性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、饮酒量、降压药的有 无、 HDL 胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量的基础上的各 rs11105378 多态性的平均收 缩期血压和舒张期血压 ( 完成调整后的平均血压值 )。 分析结果示于表 6 中。
     [ 表 6]
     表 6 的结果显示，各 rs11105378 多态性的完成调整后的平均收缩期血压、舒张期 血压在统计学上显著不同。
     由该结果可知，通过调查 rs11105378 多态性，在调整其他环境因素的影响的基 础上，也能够推测各基因多态性的血压上升的程度。
     [ 实施例 8]ATP2B1 基因上的 SNP(rs2681472) 的分型
     以 9452 个一般地区居民为对象，为了调查 SNP 的基因型与高血压的关联性，进 行回顾性队列研究。 这些对象者从横浜 (1871 人 )、滋贺 (4021 人 )、爱媛 (3560 人 ) 召 集。
     首先，从由对象者采集的末梢血中的白细胞与实施例 1 同样地提取各人的基因 组 DNA，通过扩增，得到供于 SNP 分型的 DNA 溶液。
     以这样得到的各对象者的完成扩增后的基因组 DNA 为模板，通过 TaqMan 探 针法分析 ATP2B1 基因上的 SNP(rs2681472)。 具体而言，代替对 rs11105378 的各多态 性特异性的 TaqManPre-Designed SNP 基因分型分析，使用对 rs2681472 的各多态性特 异性的 TaqMan Pre-Designed SNP 基因分型分析 (Assay ID ；C__16057071_10、 Applied Biosystems Inc. 制 )，除此以外，与实施例 2 同样地对基因多态性进行分型。
     [ 实施例 9]rs2681472 多态性与高血压的相关性
     以一般地区居民为对象，通过相关性分析 ( 关联方法 ) 对实施例 8 中鉴定的 SNP 的基因型与高血压的相关性进行分析。
     [ 表 7]
     年龄 ( 岁 ) 性别 ( 男 / 女 )57±14 4859/459330CN 102016031 A CN 102016041 A说体重指数 (kg/m2) 收缩期血压 (mmHg) 舒张期血压 (mmHg) 降压药 ( 有 / 无 ) 高血压 ( 有 / 无 ) 总胆固醇 (mg/dL) HDL 胆固醇 (mg/dL) 中性脂肪 (mg/dL) 血糖 (mg/dL) 饮酒量 ( 总 ) 吸烟 ( 有 / 无 )明书23±3 132±21 79±12 1780/7672 4067/5385 202±35 60±15 117±83 101±27 0.7±1.0 2293/7159 621/883122/44 页心血管疾病史 ( 有 / 无 )
     表 7 表示作为分析对象的 9452 人的临床背景。 将这些对象者分类成高血压组 ( 收缩期血压 140mmHg 以上、和 / 或舒张期血压 90mmHg 以上、和 / 或服用降压药 ) 和 正常血压组 ( 高血压组以外 )，分析实施例 8 中鉴定的多态性的频率。 作为统计学上的分 析手法，采用卡方检验。 分析结果示于表 8 中。
     [ 表 8]
     表 8 的结果显示，高血压组和正常血压组中，实施例 8 中鉴定的 rs2681472 多态 性中的各基因型的频率在统计学上显著不同。 具体而言，由比值比获知，与正常血压组 相比较时，高血压组中， A 等位基因的频率显著高于 G 等位基因。
     由该结果可知，通过调查 SNP(rs2681472) 的基因型，从而能够判定诱发基因多 态性高血压的相对危险度。
     [ 实施例 10]rs2681472 多态性与高血压的相关性的逻辑回归分析
     通过包含其他有关的环境因素的回归分析对实施例 8 中鉴定的 rs2681472 多态性 与高血压的相关性进行分析。
     将表 7 所示的对象者与实施例 9 同样地分类成高血压组和正常血压组。 除了实施 例 8 中鉴定的 rs2681472 多态性以外，以性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、 饮酒量、 HDL 胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量为自变量，以这里所分类的高血压的 有无为因变量，实施逻辑回归分析。 分析结果示于表 9 中。
     [ 表 9]
     表 9 的结果显示，在调整性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、饮酒 量、 HDL 胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量等环境因素的基础上，实施例 8 中鉴定的 rs2681472 多态性也是高血压的独立的危险因素。 另外，其相对危险度 ( 比值比 ) 与该基 因型为 GG 型时相比， AG 型时为 1.179 倍， AA 型时为 1.348 倍。
     由该结果可知，通过调查 rs2681472 多态性，能够在调整其它环境因素的影响的 基础上判定诱发高血压的相对危险度。 进而由该结果还可知，SNP(rs2681472) 为 GG 型 或 AG 型时，可判定为低风险组 ；为 AA 型时，可判定为高风险组。
     [ 实施例 11] 各 rs2681472 多态性的粗略平均血压值的计算
     求出实施例 8 中鉴定的各多态性的收缩期血压和舒张期血压的粗略平均值，通 过单因素方差分析在统计学上分析其差异。 分析结果示于表 10 中。
     [ 表 10]
     表 10 的结果显示，各 rs2681472 多态性的收缩期血压和舒张期血压中任一者的粗 略平均血压值在统计学上都显著不同。
     由该结果可知，通过调查 rs2681472 多态性，能够推测各基因多态性的血压上升 的程度。
     [ 实施例 12]rs2681472 多态性与血压值的相关性的多元回归分析
     通过包含其他有关的环境因素的回归分析对实施例 8 中鉴定的 rs2681472 多态性 与血压值的相关性进行分析。
     除实施例 8 中鉴定的 rs2681472 多态性以外，以性别、年龄、体重指数、心血管 疾病史、吸烟、饮酒量、降压药的有无、 HDL 胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量为自 变量，以收缩期血压或舒张期血压为因变量，实施多元回归分析。 分析结果示于表 11 中。
     [ 表 11]表 11 的结果显示，在调整性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、饮酒 量、降压药的有无、 HDL 胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量等环境因素的基础上，实 施例 8 中鉴定的 rs2681472 多态性也是收缩期血压、舒张期血压的独立的危险因素。
     由该结果可知，通过调查 rs2681472 多态性，在调整其他环境因素的影响的基础
     上，也能推测各基因多态性的血压上升的程度。
     [ 实施例 13] 各 rs2681472 多态性的完成调整后的平均血压值的计算
     由实施例 12 中所示的、实施例 8 中鉴定的 rs2681472 多态性与血压值的回归分 析，计算出调整了性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、饮酒量、降压药的有 无、HDL 胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量的基础上的各 rs2681472 多态性的平均收缩 期血压和舒张期血压 ( 完成调整后的平均血压值 )。 分析结果示于表 12 中。
     [ 表 12]
     表 12 的结果显示，各 rs2681472 多态性完成调整后的平均收缩期血压、舒张期血 压在统计学上显著不同。
     由该结果可知，通过调查 rsrs2681472 多态性，在调整其他环境因素的影响的基 础上，也能够推测各基因多态性的血压上升的程度。
     [ 实施例 14]ATP2B1 基因上的 SNP(rs1401982) 的分型
     以 9388 个一般地区居民作为对象，为了调查 SNP 的基因型与高血压的关联性而 进行了回顾性队列研究。 这些对象者从横浜 (1869 人 )、滋贺 (3950 人 )、爱媛 (3569 人 ) 召集。
     首先，从由对象者采集的末梢血中的白细胞与实施例 1 同样地提取各人的基因 组 DNA，进行扩增，得到供于 SNP 分型的 DNA 溶液。
     以这样得到的各对象者的完成扩增后的基因组 DNA 作为模板，用 TaqMan 探针 法分析 ATP2B1 基因上的 SNP(rs1401982)。 具体而言，代替对 rs11105378 的各多态性特 异性的 TaqManPre-Designed SNP 基因分型分析，使用对 rs1401982 的各多态性特异性的 TaqMan Pre-Designed SNP 基因分型分析 (Assay ID ；C__2775503_10、Applied Biosystems Inc. 制 )，除此以外，与实施例 2 同样地对基因多态性进行分型。
     [ 实施例 15]rs1401982 多态性与高血压的相关性
     以一般地区居民为对象，通过相关性分析 ( 关联方法 ) 对实施例 14 中鉴定的 SNP 的基因型与高血压的相关性进行分析。
     [ 表 13]
     年龄 ( 岁 ) 性别 ( 男 / 女 )57±14 4839/454934CN 102016031 A CN 102016041 A说体重指数 (kg/m2) 收缩期血压 (mmHg) 舒张期血压 (mmHg) 降压药 ( 有 / 无 ) 高血压 ( 有 / 无 ) 总胆固醇 (mg/dL) HDL 胆固醇 (mg/dL) 中性脂肪 (mg/dL) 血糖 (mg/dL) 饮酒量 ( 总 ) 吸烟 ( 有 / 无 )明书26/44 页23±3 132±21 79±12 1769/7619 4029/5359 202±35 60±15 117±83 101±27 0.7±1.0 2284/7104 609/8779心血管疾病史 ( 有 / 无 )
     表 13 表示作为分析对象的 9388 人的临床背景。 将这些对象者分类成高血压组 ( 收缩期血压 140mmHg 以上、和 / 或舒张期血压 90mmHg 以上、和 / 或服用降压药 ) 和 正常血压组 ( 高血压组以外 )，分析实施例 14 中鉴定的多态性的频率。 作为统计学上的 分析手法，采用卡方检验。 分析结果示于表 14 中。
     [ 表 14]
     表 14 的结果显示，高血压组和正常血压组中，实施例 14 中鉴定的 rs1401982 多 态性中的各基因型的频率在统计学上显著不同。 具体而言，由比值比获知，与正常血压 组相比较时，高血压组中， G 等位基因的频率显著高于 A 等位基因。
     由该结果可知，通过调查 SNP(rs1401982) 的基因型，能够判定诱发基因多态性
     高血压的相对危险度。
     [ 实施例 16]rs1401982 多态性与高血压的相关性的逻辑回归分析
     通过包含其他有关的环境因素的回归分析对实施例 14 中鉴定的 rs1401982 多态性 与高血压的相关性进行分析。
     将表 13 所示的对象者与实施例 15 同样地分类成高血压组和正常血压组。 除了 实施例 14 中鉴定的 rs1401982 多态性，以性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、 饮酒量、 HDL 胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量作为自变量，以这里所分类的高血压 的有无为因变量，实施逻辑回归分析。 分析结果示于表 15 中。
     [ 表 15]
     表 15 的结果显示，在调整了性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、饮 酒量、HDL 胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量等环境因素的基础上，实施例 14 中鉴定 的 rs1401982 多态性也是高血压的独立的危险因素。 另外，其相对危险度 ( 比值比 ) 与该 基因型为 GG 型时相比， AG 型时为 1.179 倍， AA 型时为 1.348 倍。
     由该结果可知，通过调查 rs1401982 多态性，能够在调整其他环境因素的影响的 基础上判定诱发高血压的相对危险度。 进而，由该结果还可知， SNP(rs1401982) 为 GG 型或 AG 型时，可判定为低风险组 ；为 AA 型时，可判定为高风险组。
     [ 实施例 17] 各 rs1401982 多态性的粗略平均血压值的计算
     求出实施例 14 中鉴定的各多态性的收缩期血压和舒张期血压的粗略平均值，通 过单因素方差分析在统计学上分析其差异。 分析结果示于表 16 中。
     [ 表 16]
     表 16 的结果显示，各 rs1401982 多态性的收缩期血压和舒张期血压中中任一者的 粗略平均血压值在统计学上都显著不同。
     由该结果可知，通过调查 rs1401982 多态性，能够推测各基因多态性的血压上升 的程度。
     [ 实施例 18]rs1401982 多态性与血压值的相关性的多元回归分析
     通过包含其他有关的环境因素的回归分析对实施例 14 中鉴定的 rs1401982 多态性 与血压值的相关性进行分析。
     除了实施例 14 中鉴定的 rs1401982 多态性以外，以性别、年龄、体重指数、心血 管疾病史、吸烟、饮酒量、降压药的有无、 HDL 胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量为 自变量，以收缩期血压或舒张期血压为因变量，实施多元回归分析。 分析结果示于表 17 中。
     [ 表 17]
     表 17 的结果显示，在调整了性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、饮 酒量、降压药的有无、 HDL 胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量等环境因素的基础上， 实施例 14 中鉴定的 rs1401982 多态性也是收缩期血压、舒张期血压的独立的危险因素。
     根据该结果可知，通过调查 rs1401982 多态性，在调整其他环境因素的影响的基 础上，也能够推测各基因多态性的血压上升的程度。
     [ 实施例 19] 各 rs1401982 多态性的完成调整后的平均血压值的计算
     由实施例 18 中所示的、实施例 14 中鉴定的 rs1401982 多态性与血压值的回归分 析，计算出调整了性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、饮酒量、降压药的有 无、HDL 胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量的基础上的各 rs1401982 多态性的平均收缩 期血压和舒张期血压 ( 完成调整后的平均血压值 )。 分析结果示于表 18 中。
     [ 表 18]
     表 18 的结果显示，各 rs1401982 多态性的完成调整后的平均收缩期血压、舒张期 血压在统计学上显著不同。
     由该结果可知，通过调查 rsrs1401982 多态性，在调整其他环境因素的影响的基 础上，也能够推测各基因多态性的血压上升的程度。
     [ 实施例 20]ATP2B1 基因上的 SNP(rs11105364) 的分型
     以实施例 1 中得到的各对象者的完成扩增后的基因组 DNA 作为模板，通过 TaqMan 探针法分析 ATP2B1 基因上的多态性部位 (rs11105364)。具体而言，在实施例 1 中 得到的 DNA 溶液 2.0μl 中，添加 2.5μl 的 TaqMan Universal Master Mix(AppliedBiosystems Inc. 制 )、0.05μl 的对 rs11105364 多态性特异性的 TaqMan Pre-Designed SNP 基因分型分 析 (Assay ID ；C__32174448_10、Applied Biosystems Inc. 制 )、0.45μl 的蒸馏水，调制反 应溶液后，供于利用聚合酶链反应法的延伸反应。 延伸反应中，在 52℃下加热 2 分钟， 接着在 95℃下加热 10 分钟后，重复 60 次如下过程 ：在 95℃下加热 15 秒钟，在 60℃下加 热 1 分钟。 延伸反应后，通过用 7900HT Fast 实时 PCR 系统 (AppliedBiosystems Inc. 制 ) 测定荧光强度，对基因多态性进行分型。
     [ 实施例 21]rs11105364 多态性与高血压的相关性
     以一般地区居民为对象，通过相关性分析 ( 关联方法 ) 对实施例 20 中鉴定的多 态性与高血压的相关性进行分析。 将作为分析对象的 8924 人的临床背景示于表 19 中。 这些样品从横浜 (1860 人 )、滋贺 (3953 人 )、爱媛 (3539 人 ) 召集。
     [ 表 19]
     年龄 ( 岁 ) 性别 ( 男 / 女 ) 体重指数 (kg/m2) 收缩期血压 (mmHg)57±14 4828/4524 23±3 132±2038CN 102016031 A CN 102016041 A说舒张期血压 (mmHg) 降压药 ( 有 / 无 ) 高血压 ( 有 / 无 ) 总胆固醇 (mg/dL) HDL 胆固醇 (mg/dL) 中性脂肪 (mg/dL) 血糖 (mg/dL) 饮酒量 ( 总 ) 吸烟 ( 有 / 无 )明书79±12 1756/7594 4014/5338 202±35 60±15 117±83 101±27 0.7±1.0 3287/6065 610/874230/44 页心血管疾病史 ( 有 / 无 )
     将表 19 所示的对象者分类成高血压组 ( 收缩期血压 140mmHg 以上、和 / 或舒 张期血压 90mmHg 以上、和 / 或服用降压药 ) 和正常血压组 ( 高血压组以外 )，分析实施 例 20 中鉴定的多态性的频率。 作为统计学上的分析手法，采用卡方检验。 分析结果示 于表 20 中。
     [ 表 20]
     表 20 的结果显示，高血压者和正常血压者中，实施例 20 中鉴定的 rs11105364 多 态性中的各基因型的频率在统计学上显著不同。 这也表示，通过调查该基因多态性，能 够判定诱发高血压的相对危险度。
     [ 实施例 22]rs11105364 多态性与高血压的相关性的逻辑回归分析
     以一般地区居民为对象，通过包含其他有关的环境因素的回归分析对实施例 20 中鉴定的多态性与高血压的相关性进行分析。
     将表 19 所示的对象者分类成高血压组 ( 收缩期血压 140mmHg 以上、和 / 或舒张 期血压 90mmHg 以上、和 / 或服用降压药 ) 和正常血压组 ( 高血压组以外 )。 除了实施例 20 中鉴定的多态性以外，以性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、饮酒量、 HDL 胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量作为自变量，以这里所分类的高血压的有无为 因变量，实施逻辑回归分析。 分析结果示于表 21 中。
     [ 表 21]
     表 21 的结果显示，在调整了性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、饮 酒量、 HDL 胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量等环境因素的基础上，实施例 3 中鉴定 的基因多态性也是高血压的独立的危险因素。 另外，其相对危险度 ( 比值比 ) 与该基因 型为 GG 时相比，TG 型时为 1.189 倍，TT 型时为 1.341 倍。 这也表示，通过调查该基因 多态性，能够在调整其他环境因素的影响的基础上判定诱发高血压的相对危险度。
     [ 实施例 23] 各 rs11105364 多态性的粗略平均血压值的计算
     求出实施例 20 中鉴定的各多态性的收缩期血压和舒张期血压的粗略平均值，通 过单因素方差分析在统计学上分析其差异。 分析结果示于表 22 中。
     [ 表 22]
     表 22 的结果显示，该各基因多态性的粗略平均收缩期血压、舒张期血压显著不 同。 这也表示，通过调查该基因多态性，能够推测各基因多态性的血压上升的程度。
     [ 实施例 24]rs11105364 多态性与血压值的相关性的多元回归分析
     以一般地区居民为对象，通过包含其他有关的环境因素的回归分析对实施例 20 中鉴定的多态性与血压值的相关性进行分析。
     除了实施例 20 中鉴定的多态性以外，以性别、年龄、体重指数、心血管疾病 史、吸烟、饮酒量、降压药的有无、 HDL 胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量作为自变 量，以收缩期血压或舒张期血压作为因变量，实施多元回归分析。 分析结果示于表 23 中。
     [ 表 23]
     表 23 的结果显示，在调整了性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、饮 酒量、降压药的有无、 HDL 胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量等环境因素的基础上， 实施例 20 中鉴定的基因多态性也是收缩期血压、舒张期血压的独立的危险因素。
     这表示，通过调查该基因多态性，在调整了表 23 所示的有关的环境因素的基础 上，也能够推测各基因多态性的血压上升的程度。
     [ 实施例 25] 各 rs11105364 多态性的完成调整后的平均血压值的计算
     由实施例 24 所示的实施例 20 中鉴定的多态性与血压值的回归分析，计算出调 整了性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、饮酒量、降压药的有无、 HDL 胆固 醇、中性脂肪、血糖、队列变量的基础上的各基因多态性的平均收缩期血压和舒张期血 压 ( 完成调整后的平均血压值 )。 分析结果示于表 24 中。
     [ 表 24]
     表 24 的结果显示，该各基因多态性的完成调整后的平均收缩期血压、舒张期血 压显著不同。
     这表示，通过调查该基因多态性，在调整表 23 所示的有关的环境因素的基础 上，也能够推测各基因多态性的血压上升的程度。
     [ 实施例 26]CYP11B2 基因上的 SNP(rs1799998) 的分型
     以各对象者的完成扩增后的基因组 DNA 作为模板，通过 TaqMan 探针法分析 CYP11B2 基因上的 SNP(rs1799998)。 具体而言，在实施例 1 中得到的 DNA 溶液 2.0μL 中，添加 2.5μL 的 TaqMan Universal Master Mix(Applied Biosystems Inc. 制 )、0.05μL 的 对 rs1799998 的各多态性特异性的 TaqManPre-Designed SNP 基因分型分析 (Assay ID ； C__8896484_10、 Applied Biosystems Inc. 制 )、0.45μL 的蒸馏水，调制反应溶液后，供 于利用 PCR 法的延伸反应。 延伸反应中，在 52℃下加热 2 分钟，接着在 95℃下加热 10 分钟后，重复 60 次下述过程 ：在 95℃下加热 15 秒钟，在 60℃下加热 1 分钟。 延伸反应 后，用 7900HT Fast 实时 PCR 系统 (Applied Biosystems Inc. 制 ) 测定荧光强度，从而对基 因多态性进行分型。
     [ 实施例 27]AGT 基因上的 SNP(rs699) 的分型
     以各对象者的完成扩增后的基因组 DNA 作为模板，通过 TaqMan 探针法分析 AGT 基因上的 SNP(rs699)。 具体而言，在实施例 1 中得到的 DNA 溶液 2.0μL 中，添加 2.5μL 的 TaqManUniversal Master Mix(Applied Biosystems Inc. 制 )、0.05μL 的对 rs699 的 各多态性特异性的 TaqMan Pre-Designed SNP 基因分型分析 (Assay ID ；C__1985481_20、 Applied Biosystems Inc. 制 )、0.45μL 的蒸馏水，调制反应溶液后，供于利用 PCR 法的延 伸反应。 延伸反应中，在 52℃下加热 2 分钟，接着在 95℃下加热 10 分钟后，重复 60 次 下述过程 ：在 95℃下加热 15 秒钟，在 60℃下加热 1 分钟。 延伸反应后，用 7900HT Fast 实时 PCR 系统 (AppliedBiosystems Inc. 制 ) 测定荧光强度，从而对基因多态性进行分型。
     [ 实施例 28]rs11105378 多态性、 rs1799998 多态性、及 rs699 多态性与高血压的 逻辑回归分析 1
     通过包含其他有关的环境因素的回归分析对实施例 2 中鉴定的 rs11105378 多态 性、实施例 26 中鉴定的 rs1799998 多态性和实施例 27 中鉴定的 rs699 多态性与高血压的 相关性进行分析。
     将表 1 所示的对象者与实施例 3 同样地分类成高血压组和正常血压组。 除实施 例 2、26 及 27 中鉴定的各基因多态性以外，以性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、 吸烟、饮酒量、 HDL 胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量作为自变量，以这里所分类的 高血压的有无为因变量，实施逻辑回归分析。 分析结果示于表 25 中。
     [ 表 25]
     表 25 的结果显示，在调整了性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、饮 酒量、HDL 胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量等环境因素的基础上，实施例 26 中鉴定 的 rs1799998 多态性及实施例 27 中鉴定的 rs699 多态性也是高血压的独立的危险因素。 另外，关于其相对危险度 ( 比值比 )， rs1799998 多态性的 TT 型与 CC 型相比，为 1.268 倍， rs699 多态性的 TT 型与 MM 型相比，为 1.372 倍。
     由该结果可知，通过调查 rs1799998 多态性或 rs699 多态性，能够在调整其他 环境因素的影响的基础上判定诱发高血压的相对危险度。 进而，由该结果还可知， SNP(rs1799998) 为 CC 型或 CT 型时，可判定为低风险组 ；为 TT 型时，可判定为高风险 组，及 SNP(rs699) 为 MM 型或 MT 型时，可判定为低风险组 ；为 TT 型时，可判定为高 风险组。
     [ 实施例 29]rs11105378 多态性、 rs1799998 多态性及 rs699 多态性与高血压的逻 辑回归分析 2
     以 rs11105378 多态性的 TC 型作为 1，以 CC 型作为 2，以 rs1799998 多态性的 TT 型作为 1，以 rs699 多态性的 TT 型作为 1，计算出各对象者的风险基因多态性的存在数， 通过包含其他有关的环境因素的回归分析对与高血压的相关性进行分析。
     具体而言，代替实施例 2、26、及 27 中鉴定的各基因多态性，采用所述风险基 因多态性的存在数作为因变量，除此以外，与实施例 28 同样地实施逻辑回归分析。 分析 结果示于表 26 中。
     [ 表 26]
     表 26 的结果可知，在调整了性别、年龄、体重指数、心血管疾病史、吸烟、饮 酒量、 HDL 胆固醇、中性脂肪、血糖、队列变量等环境因素的基础上，实施例 2、26、 及 27 中鉴定的各基因多态性的组合也是高血压的独立的危险因素，并且显示出比各基因 多态性分析更高的相对危险度 ( 比值比 )。
     由该结果可知，通过调查 rs11105378 多态性、 rs1799998 多态性及 rs699 多态性 的组合，能够比各个基因多态性单独的评价更准确地评价相对于调整了其他环境因素的 影响的基础上的高血压发病的相对危险度。
     [ 实施例 30] 使用 SNP(rs11105378) 检测用多核苷酸的 SNP 分型
     将由实施例 1 中从对象者采集的末梢血中的白细胞提取的基因组 DNA 扩增后的 产物作为模板，用具有表 27 所述的碱基序列的引物进行 SNP 分型。
     [ 表 27]
     引物 SNP(rs11105378)_1st_Fw SNP(rs11105378)_1st_Rv序列 GGCAGCTACACAGGTGTTCA CGGGAAAACAGCAGTCATTT序列 ID 1 2 3 4 5 6SNP(rs11105378)_SS Primer_Fw(C) GCTAGTCTGTTTTTCATGGC SNP(rs11105378)_SS Primer_Fw(T) GCTAGTCTGTTTTTCATGGTSNP(rs11105378)_AS Primer_Fw(C) GCTAGTCTGTTTTTCATGACA SNP(rs11105378)_AS Primer_Fw(T) GCTAGTCTGTTTTTCATGATA44CN 102016031 A CN 102016041 A说明书736/44 页SNP(rs11105378)_Rv
     CGGGAAAACAGCAGTCATTT首先，以从对象者提取的基因组 DNA 作为模板，用具有序列号 1 的碱基序 列的第一阶段扩增用正向引物 (SNP(rs11105378)_1st_Fw Primer) 和具有序列号 2 的碱 基序列的第一阶段扩增用反向引物 (SNP(rs11105378)_1st_Rv Primer)，将基因组 DNA 扩增。 接着，以所得完成扩增后的基因组 DNA 作为模板，用具有能够特异性检测 SNP(rs11105378) 的 C 等位基因的序列号 5 的碱基序列的正向引物 (SNP(rs11105378)_ ASPrimer_Fw(C)) 或具有能够特异性检测 SNP(rs11105378) 的 T 等位基因的序列号 6 的 碱基序列的正向引物 (SNP(rs11105378)_ASPrimer_Fw(T))、及具有序列号 7 的碱基序列 的反向引物 (SNP(rs11105378)_Rv) 进行 PCR，通过单分子荧光分析法调查 PCR 产物的 有无。 另外，SNP(rs11105378)_ASPrimer_Fw(C) 及 SNP(rs11105378)_ASPrimer_Fw(T) 是具有在从引物的 3’ 末端起第 2 位配置 SNP(rs11105378)、并在从 3’ 末端起第 3 位导 入了错配的碱基序列的多核苷酸。
     具 体 而 言， 在 10μL 的 2×AmpliTaq Gold Master Mix(AppliedBiosystems Inc. 制 ) 中， 分 别 添 加 2.0μL 的 SNP(rs11105378)_1st_Fw Primer(5μM)、2.0μL 的 SNP(rs11105378)_1st_RvPrimer(5μM)、1μL 的所提取的基因组 DNA(5ng/μL)、5μL 的灭菌水，调制 20μL 的一次 PCR 反应溶液。 其后，将该反应溶液在 95℃下处理 10 分 钟后，进行 40 个如下的热循环 ：95℃下 30 秒钟、57.5℃下 30 秒钟、72℃下 1 分钟 ；进 而在 72℃下处理 10 分钟，从而将基因组 DNA 扩增。
     然后，分别添加 2μL 的 10×Stoffel Buffer(AppliedBiosystems Inc. 制 )、1.6μL 的 dNTP(10mM)、2.0μL 的氯化镁溶液 (25mM)、1.0μL 的完成扩增后的基因组 DNA、 2.0μL 的 TAMRA 标记 SNP(rs11105378)_ASPrimer_Fw(C)(200nM)、2.0μL 的 Cy5 标记 SNP(rs11105378)_ASPrimer_Fw(T)(200nM)、2.0μL 的 SNP(rs11105378)_Rv(200nM)、 0.1μL 的 Stoffel fragment(10units/μL、 Applied Biosystems Inc. 制 ) 及适当量的灭菌水， 调制 20μL 的二次 PCR 反应溶液。 然后，将该反应溶液在 95℃下处理 2 分钟后，进行 40 个如下的热循环 ：95 ℃下 30 秒钟、63.2 ℃下 30 秒钟、72 ℃下 30 秒钟 ；进而在 72 ℃ 下 处 理 10 分 钟， 进 行 二 次 PCR。 另 外， PCR 装 置 使 用 原 MJ Research 公 司 ( 现 Bio RadLaboratories 公司 ) 的 Gradient Thermal Cycler PTC-200 进行。
     将二次 PCR 后的反应溶液分注到单分子荧光分析装置 MF20( 奥林巴斯株式会社 制 ) 专用的玻璃板上后，以 543nm 和 633nm 作为测定波长，进行双波长同时测定，测定 PCR 产物的有无，并进行 SNP 分型。 所得 SNP 分型结果为与实施例 3 相同的结果。
     另外，代替 SNP(rs11105378)_ASPrimer_Fw(C)，使用具有在引物的 3’ 末端配 置有 SNP(rs11105378) 的序列号 3 的碱基序列的正向引物 (SNP(rs11105378)_SSPrimer_ Fw(C))， 代 替 SNP(rs11105378)_ASPrimer_Fw(T)， 使 用 具 有 在 引 物 的 3’ 末 端 配 置 有 SNP(rs11105378) 的 序 列 号 4 的 碱 基 序 列 的 正 向 引 物 (SNP(rs11105378)_SSPrimer_ Fw(T))，同样地进行 SNP 分型，结果仍然与实施例 3 相同。
     由这些结果可知，通过使用作为本发明的第二方案的高血压发病风险判定用多 核苷酸，能够以高精度进行 SNP(rs11105378)SNP 分型。
     [ 实施例 31] 使用 SNP(rs2681472) 检测用多核苷酸的 SNP 分型将从实施例 8 中由对象者采集的末梢血中的白细胞提取的基因组 DNA 扩增后的 产物作为模板，用具有表 28 所述的碱基序列的引物进行 SNP 分型。
     [ 表 28]
     引物 SNP(rs2681472)_1st_Fw SNP(rs2681472)_1st_Rv SNP(rs2681472)_SS Primer_Fw(A) SNP(rs2681472)_SS Primer_Fw(G) SNP(rs2681472)_AS Primer_Fw(A) SNP(rs2681472)_AS Primer_Fw(G) SNP(rs2681472)_Rv
     序列 TCTGAGGATGTGGCATTTGA TAGCCACACTGGCCTCTTTT AGTGGGTCTGCCATGTAAAT AGTGGGTCTGCCATGTAAAC AGTGGGTCTGCCATGTAAGTA AGTGGGTCTGCCATGTAAGCA TAGCCACACTGGCCTCTTTT序列 ID 8 9 10 11 12 13 14首先，以从对象者提取的基因组 DNA 作为模板，用具有序列号 8 的碱基序列的 第一阶段扩增用正向引物 (SNP(rs2681472)_1st_Fw Primer)、和具有序列号 9 的碱基序列 的第一阶段扩增用反向引物 (SNP(rs2681472)_1st_Rv Primer)，与实施例 30 同样地将基因 组 DNA 扩增。 接着，以所得完成扩增后的基因组 DNA 作为模板，用具有能够特异性检 测 SNP(rs2681472) 的 A 等位基因的序列号 12 的碱基序列的正向引物 (SNP(rs2681472)_ ASPrimer_Fw(A)) 或具有能够特异性检测 SNP(rs2681472) 的 G 等位基因的序列号 13 的碱基序列的正向引物 (SNP(rs2681472)_ASPrimer_Fw(G)) 及具有序列号 14 的碱基序 列的反向引物 (SNP(rs2681472)_Rv)，与实施例 30 同样地进行 PCR，通过单分子荧光 分析法调查 PCR 产物的有无。 所得 SNP 分型结果为与实施例 8 相同的结果。 另外， SNP(rs2681472)_ASPrimer_Fw(A) 及 SNP(rs2681472)_ASPrimer_Fw(G) 是具有在从引物 的 3’ 末端起第 2 位配置有 SNP(rs2681472)、并在从 3’ 末端起第 3 位导入了错配的碱 基序列的多核苷酸。
     另 外， 代 替 SNP(rs2681472)_ASPrimer_Fw(A)， 使 用 具 有 在 引 物 的 3’ 末 端 配置有 SNP(rs2681472) 的序列号 10 的碱基序列的正向引物 (SNP(rs2681472)_SSPrimer _Fw(A))，代替 SNP(rs2681472)_ASPrimer_Fw(G)，使用具有在引物的 3’ 末端配置 有 SNP(rs2681472) 的 序 列 号 11 的 碱 基 序 列 的 正 向 引 物 (SNP(rs2681472)_SSPrimer_ Fw(G))，同样地进行 SNP 分型，结果仍然与实施例 8 相同。
     由这些结果可知，通过使用作为本发明的第三方案的高血压发病风险判定用多 核苷酸，能够以高精度进行 SNP(rs2681472)SNP 分型。
     [ 实施例 32] 使用 SNP(rs1401982) 检测用多核苷酸的 SNP 分型
     将由实施例 14 中从对象者采集的末梢血中的白细胞提取的基因组 DNA 扩增后的 产物作为模板，用具有表 29 所述的碱基序列的引物进行 SNP 分型。[ 表 29]引物 SNP(rs1401982)_1st_Fw SNP(rs1401982)_1st_Rv SNP(rs1401982)_SS Primer_Fw(G) SNP(rs1401982)_SS Primer_Fw(A) SNP(rs1401982)_AS Primer_Fw(G) SNP(rs1401982)_AS Primer_Fw(A) SNP(rs1401982)_Rv 序列 TGTGGCTAGGGGAGCAGATA AATGCTCCACCAACAAGGTT CCTATGTTCTTGGAGTTATC CCTATGTTCTTGGAGTTATT CCTATGTTCTTGGAGTTACCC CCTATGTTCTTGGAGTTACTC AATGCTCCACCAACAAGGTT 序列 ID 15 16 17 18 19 20 21首先，以从对象者提取的基因组 DNA 作为模板，用具有序列号 15 的碱基序列的 第一阶段扩增用正向引物 (SNP(rs1401982)_1st_Fw Primer)、和具有序列号 16 的碱基序 列的第一阶段扩增用反向引物 (SNP(rs1401982)_1st_Rv Primer)，与实施例 30 同样地将基 因组 DNA 扩增。 接着，以所得完成扩增后的基因组 DNA 作为模板，用具有能够特异性 检测 SNP(rs1401982) 的 G 等位基因的序列号 19 的碱基序列的正向引物 (SNP(rs1401982)_ ASPrimer_Fw(G)) 或具有能够特异性检测 SNP(rs1401982) 的 A 等位基因的序列号 20 的 碱基序列的正向引物 (SNP(rs1401982)_ASPrimer_Fw(A))、及具有序列号 21 的碱基序 列的反向引物 (SNP(rs1401982)_Rv)，与实施例 30 同样地进行 PCR，通过单分子荧光 分析法调查 PCR 产物的有无。 所得 SNP 分型结果是与实施例 14 相同的结果。 另外， SNP(rs1401982)_ASPrimer_Fw(G) 及 SNP(rs1401982)_ASPrimer_Fw(A) 是具有在从引物 的 3’ 末端起第 2 位配置 SNP(rs1401982)、并在从 3’ 末端起第 3 位导入了错配的碱基 序列的多核苷酸。
     另外，代替 SNP(rs1401982)_ASPrimer_Fw(G)，使用具有在引物的 3’ 末端配 置有 SNP(rs1401982) 的序列号 17 的碱基序列的正向引物 (SNP(rs1401982)_SSPrimer_ Fw(G))， 代 替 SNP(rs1401982)_ASPrimer_Fw(A)， 使 用 具 有 在 引 物 的 3’ 末 端 配 置 有 SNP(rs1401982) 的 序 列 号 18 的 碱 基 序 列 的 正 向 引 物 (SNP(rs1401982)_SSPrimer_ Fw(A))，同样地进行 SNP 分型，结果仍然与实施例 14 相同。
     由这些结果可知，通过使用作为本发明的第四方案的高血压发病风险判定用多 核苷酸，能够以高精度进行 SNP(rs1401982)SNP 分型。
     [ 实施例 33] 使用 SNP(rs1799998) 检测用多核苷酸的 SNP 分型
     将从实施例 2 中由对象者采集的末梢血中的白细胞提取的基因组 DNA 扩增后的 产物作为模板，用具有表 30 所述的碱基序列的引物进行 SNP 分型。
     [ 表 30]
     引物 SNP(rs1799998)_1st_Fw SNP(rs1799998)_1st_Rv SNP(rs1799998)_SS Primer_Fw(T) SNP(rs1799998)_SS Primer_Fw(C) SNP(rs1799998)_AS Primer_Fw(T) SNP(rs1799998)_AS Primer_Fw(C) SNP(rs1799998)_Rv
     序列 TGGAGGGTGTACCTGTGTCA TCCAGGGCTGAGAGGAGTAA TATTAAAAGAATCCAAGGCT TATTAAAAGAATCCAAGGCC TATTAAAAGAATCCAAGGTTC TATTAAAAGAATCCAAGGTCC TCCAGGGCTGAGAGGAGTAA序列 ID 22 23 24 25 26 27 28首先，以从对象者提取的基因组 DNA 作为模板，用具有序列号 22 的碱基序列的 第一阶段扩增用正向引物 (SNP(rs1799998)_1st_Fw Primer)、和具有序列号 23 的碱基序 列的第一阶段扩增用反向引物 (SNP(rs1799998)_1st_Rv Primer)，与实施例 30 同样地将基 因组 DNA 扩增。 接着，以所得完成扩增后的基因组 DNA 作为模板，用具有能够特异性 检测 SNP(rs1799998) 的 T 等位基因的序列号 26 的碱基序列的正向引物 (SNP(rs1799998)_ ASPrimer_Fw(T)) 或具有能够特异性检测 SNP(rs1799998) 的 C 等位基因的序列号 27 的 碱基序列的正向引物 (SNP(rs1799998)_ASPrimer_Fw(C)) 及具有序列号 28 的碱基序列 的反向引物 (SNP(rs1799998)_Rv)，与实施例 30 同样地进行 PCR，通过单分子荧光分 析法调查 PCR 产物的有无。 所得 SNP 分型结果是与实施例 26 相同的结果。 另外， SNP(rs1799998)_ASPrimer_Fw(T) 及 SNP(rs1799998)_ASPrimer_Fw(C) 是具有在从引物 的 3’ 末端起第 2 位配置 SNP(rs1799998)、并在从 3’ 末端起第 3 位导入了错配的碱基 序列的多核苷酸。
     另外，代替 SNP(rs1799998)_ASPrimer_Fw(T)，使用具有在引物的 3’ 末端配 置有 SNP(rs1799998) 的序列号 24 的碱基序列的正向引物 (SNP(rs1799998)_SSPrimer_ Fw(T))， 代 替 SNP(rs1799998)_ASPrimer_Fw(C)， 使 用 具 有 在 引 物 的 3’ 末 端 配 置 有 SNP(rs1799998) 的 序 列 号 25 的 碱 基 序 列 的 正 向 引 物 (SNP(rs1799998)_SSPrimer_ Fw(C))，同样地进行 SNP 分型，结果仍然与实施例 26 相同。
     由这些结果可知，通过使用作为本发明的第六方案的高血压发病风险判定用多 核苷酸，能够以高精度进行 SNP(rs1799998)SNP 分型。
     [ 实施例 34] 使用 SNP(rs699) 检测用多核苷酸的 SNP 分型
     将从实施例 2 中由对象者采集的末梢血中的白细胞提取的基因组 DNA 扩增后的 产物作为模板，用具有表 31 所述的碱基序列的引物进行 SNP 分型。
     [ 表 31]
     48CN 102016031 A CN 102016041 A说明序列书40/44 页引物 SNP(rs699)_1st_Fw SNP(rs699)_1st_Rv SNP(rs699)_SS Primer_Fw(T) SNP(rs699)_SS Primer_Fw(M) SNP(rs699)_AS Primer_Fw(T) SNP(rs699)_AS Primer_Fw(M) SNP(rs699)_Rv
     序列 ID 29 30 31 32 33 34 35GAACTGGATGTTGCTGCTGA AGAGCCAGCAGAGAGGTTTG AAGACTGGCTGCTCCCTGAT AAGACTGGCTGCTCCCTGAC AAGACTGGCTGCTCCCTGGTG AAGACTGGCTGCTCCCTGGCG AGAGCCAGCAGAGAGGTTTG首先，以从对象者提取的基因组 DNA 作为模板，用具有序列号 29 的碱基序列 的第一阶段扩增用正向引物 (SNP(rs699)_1st_Fw Primer)、和具有序列号 30 的碱基序列 的第一阶段扩增用反向引物 (SNP(rs699)_1st_Rv Primer)，与实施例 30 同样地将基因组 DNA 扩增。 接着，以所得完成扩增后的基因组 DNA 作为模板，用具有能够特异性检测 SNP(rs699) 的 T 等位基因的序列号 33 的碱基序列的正向引物 (SNP(rs699)_ASPrimer_ Fw(T)) 或具有能够特异性检测 SNP(rs699) 的 M 等位基因的序列号 34 的碱基序列的 正向引物 (SNP(rs699)_ASPrimer_Fw(M))、及具有序列号 35 的碱基序列的反向引物 (SNP(rs699)_Rv)，与实施例 30 同样地进行 PCR，通过单分子荧光分析法调查 PCR 产物 的有无。 所得 SNP 分型结果为与实施例 27 相同的结果。 另外，SNP(rs699)_ASPrimer_ Fw(T) 及 SNP(rs699)_ASPrimer_Fw(M) 是 具 有 在 从 引 物 的 3’ 末 端 起 第 2 位 配 置 有 SNP(rs699)、在从 3’ 末端起第 3 位导入了错配的碱基序列的多核苷酸。
     另外，代替 SNP(rs699)_ASPrimer_Fw(T)，使用具有在引物的 3’ 末端配置有 SNP(rs699) 的序列号 31 的碱基序列的正向引物 (SNP(rs699)_SSPrimer_Fw(T))，代替 SNP(rs699)_ASPrimer_Fw(M)，使用具有在引物的 3’ 末端配置有 SNP(rs699) 的序列号 32 的碱基序列的正向引物 (SNP(rs699)_SSPrimer_Fw(M))，同样地进行 SNP 分型，结果 仍然与实施例 27 相同。
     由这些结果可知，通过使用作为本发明的第六方案的高血压发病风险判定用多 核苷酸，能够以高精度进行 SNP(rs699)SNP 分型。
     [ 实施例 35] 其他 SNP 的评价方法
     除 了 与 高 血 压 的 相 关 性 高 的 所 述 ATP2B1 基 因 的 SNP(rs11105378)、 SNP ( rs 2681472) 、 SNP ( rs 1401982) 、 SNP ( rs 11105364) 、 CYP 11 B 2 基 因 的 SNP(rs1799998) 及 AGT 基因的 SNP(rs699) 以外，采集多种与高血压的相关性低的 SNP， 并对风险计分，从而分析高血压与得分的相关性，也能够进行高血压的风险判定。
     该方法如下所述。
     1. 对高血压风险 SNP 如下计分 ：风险型为 3 分，杂合型 (heterotype) 为 2 分，非 风险型为 1 分。2. 通过 1. 的方法对多种高血压风险 SNP 计分，相加并作为风险值。
     3. 对于样品组的每个人，求出 2. 的风险值，制成频率 × 风险值的直方图。
     4. 将直方图分成高风险组、中等风险组、低风险组。
     5. 检查待测者的 SNP，根据得分符合直方图中的何处，将待测者分成高风险 组、中等风险组、低风险组。
     本实施例中，作为与高血压的相关性低的 SNP，利用上述专利文献 5 中列举的 38 种 SNP 中 ATP2B1 基因的 SNP(rs2070759) 和 11 种其他基因的 SNP 进行评价。 12 种 SNP 示于表 32 中。
     [ 表 32]
     基因 ATP2B1 DLGAP2 RAC2 SLC22A7 HLADMB KCNN1 PRKWNK1 PTHR1 GUCA1C ACCN1 FGF2 ATP2A3
     SNP rs2070759 rs2301963 rs929023 rs2270860 rs2071556 rs2278993 rs2255390 rs1869872 rs2715709 rs28933 rs3747676 rs887387AA GG CC TT GG CC TT GG TT GG GG GG TTAa GT CA TC GA CA TC GA TC GA GA GA TCaa TT AA CC AA AA CC AA CC AA AA AA CC风险基因型 TT CC TT AA CC TT GG CC AA AA GG TT以 8467 人为对象，以风险型 ( 风险基因型 ) 为 3 分，以杂合型为 2 分，以非风 险型为 1 分，累计后示于表 33 的直方图中。表 33 中，以 26 分以上作为高风险组，以 20 分以下作为低风险组，以 21 ～ 25 分作为中等风险组。
     在上述对象者 8467 人中，在高血压组 (160/90mmHg 以上和 / 或服用降压药 ； 1655 人 ) 和正常血压组 ( 不到 120/90mmHg 和 / 或未服用降压药 ；1786 人 ) 这 2 组间比 较高风险组 / 中等风险组 / 低风险组的频率。 比较结果示于表 34 中。
     [ 表 34]
     表 34 中，对象者 ( 正常血压组 1786 人、高血压组 1655 人 ) 中，关于全部 SNP 能够分型的病例，正常血压组为 1497 人，高血压组为 1401 人。 这里，p ＝ 0.0002。 该 值的获得是建立于在高血压组和正常血压组中高风险组 / 中等风险组 / 低风险组的频率相 同这样的无效假设 (null hypothesis)，这意味着高血压组和正常血压组中低风险组 / 中等 风险组 / 高风险组的频率在 99.9998％的概率下是不同的。
     通过包含其他有关的环境因素的回归分析对所述 12 种 SNP 与高血压的相关性进 行分析。 将对象者分类成高风险组、中等风险组和低风险组。 以性别、年龄、体重指数 作为自变量，以这里所分类的风险的程度作为因变量，实施逻辑回归分析。 分析结果示 于表 35 中。
     [ 表 35]
     表 35 的结果显示，在调整了性别、年龄、体重指数等环境因素的基础上，通过 ATP2B1 基因的 SNP(rs2070759) 与其他 11 种基因的 SNP 的组合，也能够判定高血压的 风险。 另外，其相对危险度 ( 比值比 ) 与低风险组，中等风险组时为 1.275，高风险组时 为 1.675 倍。 除 ATP2B1 基因以外，由于与高血压相关性低，因此多态性的组合是很重要 的。 高血压组和正常血压组的对象者的类型示于表 36 中。
     [ 表 36]
     表 36 中， AA、 Aa、 aa 的值与表 32 相同。 另外， p 值是与表 34 同样地在高血 压组 / 正常血压组之间比较 AA、 Aa、 aa 的频率而得到的值。
     产业上的可利用性
     通过使用本发明的高血压的遗传标记，能够更准确地判定高血压发病的风险， 因此能够应用于医疗机构等中的待测物的基因分析等领域中。
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