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猪专用生物添加剂预混合饲料及其生物活性物质载体的制备方法
一、技术领域：
本发明涉及一种猪专用饲料，特别是涉及一种猪专用生物添加剂预混合饲料及其生物活性物质载体的制备方法。
二、背景技术：
将各种可供动物食用且具备生物安全性的物质，根据动物营养需求调配而成的组合性物质一般统称为饲料。为了满足特殊生理需求，多在饲料里额外添加同样具有生物安全性的添加剂。最基本的生理需求物质是胺基酸、维生素、矿物质、微量元素，除此之外，为了使所饲养动物出栏或贩卖后带来更大的经济利益而多会另外再添加酵素、免疫力提升剂等方面的物质，偶而会因为动物罹患疾病而在饲料里添加抗菌物质或抗生素。动物食用的全价配合饲料也称全日粮配合饲料，能直接喂饲动物，全面满足喂饲动物的营养需要。随着饲料工业的不断发展，进而产生一种所谓的添加剂预混合饲料，简称预混料，是全价配合饲料的一部份重要组成分，是一种将动物营养必需物质包括各种微量矿物元素、各种维生素、各种合成必需胺基酸、某些药物等添加剂与稀释剂或载体按动物营养需求配比后，均匀混合而集合于一体的中间型配合饲料产品，便于饲养者或动物饲养农民操作。中国大陆随着人口逐年增多及人民在饮食上对动物性食物消费量的不断增加，使国内对于动物饲料的需求量不断地提升。为了饲养动物在短期内获得较大效益，使动物饲养成绩突出，抗生素的滥用已经严重危害人类与动物甚至环境的健康，因为动物体内抗药性致病菌株的产生往往会引起动物更严重的二次性感染，这种二次性感染往往无法有效性地得到治疗，同时导致禽畜产品中残留药物，直接威胁到人体的健康；经过动物产生的抗药性致病菌株转移给人类，使人类的第一线医疗用药效果降低，延误治疗最佳时机，从而导致生命倍受威胁；在动物或人体内产生的抗药性致病菌株随着粪便排到环境，在适当的有机体内会再进行基因互换而产生另外致病性更强的菌株；有些药物通过动物或人体粪便排泄出来，将会造成环境污染。
目前，避免抗生素在食品中的残留已成为全球食品卫生组织关注而且密切监督的议题。世界各国研究机构甚至大型生技产业无不戮力以赴开发无副作用、无残留、无抗药性且无毒的新型取代抗生素制剂。欧盟从2006年1月起全面禁止在饲料中添加抗生素，进入无药物畜牧养殖世代，中国大陆农业部也跟进颁布了禁用药物的相关法令条文。
2000年世界科学杂志刊登标题指出，未来动物养殖业里在饲料中取代抗生素的添加剂有五大项，包括益生菌(指细菌类之原核生物)、酵母菌(属于真核生物的真菌类)、酸化剂、酵素与中草药制剂。除了中草药制剂，其它添加剂都可以用益生菌和(或)酵母菌在生物科技工程基础下进行科研并量产，所以研究开发并寻求应用各种益生菌与酵母菌是未来无药物养殖、生产绿色有机肉品的基础工作。另外，在欧洲先进国家已经积极开发出利用乳酸菌等益生菌进行中草药物的发酵作用，萃取浓缩许多在提升免疫力方面有帮助的物质，成绩颇受关注。益生菌就是微生物制剂，又可称为生菌剂，在国外已被广泛应用，1989年美国食品与药物管理局(FDA)公布了可以直接饲喂且一般认为是安全的微生物种名单，共有41种，包括地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、双歧乳酸杆菌、嗜热性链球菌、粪肠球菌、乳酸肠球菌、嗜酸性乳酸杆菌、干酪乳酸杆菌、乳酸乳杆菌、植物乳酸杆菌、酿酒酵母及其亚种或变异种等等。
适当地使用益生菌也是生产绿色饲料的最佳选择。利用中国大陆丰富的谷物当做特殊益生菌繁殖发酵的培养基，精密调配碳/氮比值、单位时间通气量、酸碱值、温度和特殊添加物质，籍菌种对有机质的转化作用除掉谷物本身隐藏的营养抑制因子或毒素，降解大分子成为小分子肽，使营养物质更利于被动物肠道吸收，大幅度提高饲料蛋白的转化率，菌种繁殖过程产生各种免疫力提升物质包括维生素B群、葡聚醣、甘露聚糖，另外还分泌或合成乳酸、醋酸等酸化剂、各种消化酵素，还有促进肠道正常菌丛平衡的果寡醣、丁酸盐，最特殊的就是产生直接抗致病菌的抗菌肽。积极努力开发绿色饲料与绿色添加剂是现代生物科技产业共同的目标，使成果转稼给广大养殖农民，为农户节省饲料成本，增加离乳仔猪投数，增加肥育后期猪出栏数，并缩短猪只饲养时间，改善屠体品质，增加农民养殖收入，增进农村福祉。
三、发明内容：
本发明要解决的技术问题是：提供一种猪专用生物添加剂预混合饲料及其生物活性物质载体的制备方法。利用本发明技术方案制备的猪专用生物添加剂预混合饲料是一种喂饲猪的绿色饲料，无副作用、无残留、无抗药性且无毒的新型饲料。
本发明的技术方案是：
一种生物活性物质载体的制备方法，所述生物活性物质载体是由枯草芽孢杆菌纳豆亚种(Bacillus subtilis var.natto)Chou007和芽孢乳酸杆菌(Lactobacillussporogenes)90CT172复合发酵含海藻粉的固态发酵活性物质，加上两种菌种液态发酵生物活性物质综合而制备的一种生物活性物质载体，该制备方法的详细步骤如下：
a、枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007液态生物活性物质的制备：先将糖蜜或豆浆以无菌水稀释至以糖度计测量浓度为2～20brix，在100℃条件下、灭菌处理15分钟后，取3500～4000L放入发酵罐，再将初期经常规方法培养的枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007菌液500L倒入发酵罐，然后再把已在灭菌罐内以1000L无菌水配制的浓度为10％的脱脂奶粉或5％的黄豆粉和1％的磷酸氢二纳营养源水溶液以100℃、15分钟灭菌处理后，取500～1000L放入发酵罐，使所述脱脂奶粉或黄豆粉和磷酸氢二钠相对于糖蜜或豆浆其浓度分别为1～2％或0.5～1％和0.1～0.2％，综合以上营养源制备液态底物进行发酵，在发酵罐中发酵温度为25～60℃，发酵时间为5～60小时，在发酵过程中每隔2小时补充加入以无菌水配制的浓度为0.2％的磷酸氢二钠75～85ml，在发酵终止时加入分解酶，其加入量为占步骤c中所述固态底物总量的0.01～0.5％，加入分解酶的同时，发酵罐夹套内以冰水循环将发酵菌液温度降至7～8℃即可；
b、芽孢乳酸杆菌90CT172液态生物活性物质的制备：先将糖蜜或豆浆以无菌水稀释至以糖度计测量浓度为2～20brix，在100℃条件下、灭菌处理15分钟后，取3500～4250L放入发酵罐，再将初期经常规方法培养的芽孢乳酸杆菌90CT172菌液500L倒入发酵罐，再把已在灭菌罐内以1000L无菌水配制的浓度为10％的脱脂奶粉或5％的黄豆粉、1％的无水磷酸二钾和0.5％的7倍水合硫酸镁营养源水溶液，以100℃、15分钟灭菌处理后取250～1000L放入发酵罐，所述脱脂奶粉或黄豆粉、无水磷酸二钾和7倍水合硫酸镁相对于糖蜜或豆浆其浓度分别为0.5～2％或0.25～1％、0.05～0.2％和0.025～0.1％，综合以上营养源制备液态底物进行发酵，发酵时发酵温度为30～50℃，发酵时间为12～72小时，在发酵过程中每隔2小时补充加入浓度为0.2％的无水磷酸二钾150～170ml，发酵终止时加入菠萝酶和α-半乳糖苷酶，所述菠萝酶的加入量占步骤c中所述固态底物总量的0.0005～0.01％，所述α-半乳糖苷酶的加入量占步骤c中所述固态底物总量的0.01～0.5％，加入酶的同时，发酵罐夹套内以冰水循环将发酵菌液温度降至7～8℃即可；
c、枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007和芽孢乳酸杆菌90CT172固态生物活性物质的制备：先将固态底物以蒸气调质5～30分钟，降温至42～45℃，然后将步骤a制备的枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007液态生物活性物质和步骤b制备的芽孢乳酸杆菌90CT172液态生物活性物质混合均匀，混合时枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007液态生物活性物质所占的重量百分含量为30～70％，将处理后的固态底物与混合后的液态生物活性物质进行混合发酵，固态底物与混合后的液态生物活性物质混合时，其中混合后的液态生物活性物质所占的重量百分含量为25～90％，发酵时发酵温度为25～60℃，发酵时间为5～72小时，在固态发酵结束前0～8小时加入海藻粉，所述海藻粉的加入量占固态底物总量的1～10％，发酵结束后将其物料在55～135℃的温度下烘干，烘干至发酵底物水分含量＜7％，最后粉碎，得到固态发酵生物活性物质；
d、生物活性物质载体的制备：将步骤a、b制备的枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007液态生物活性物质和芽孢乳酸杆菌90CT172液态生物活性物质分别浓缩成干物量为10～40％的液态发酵生物活性物质，将两种浓缩后的液态发酵生物活性物质进行混合，其中干物量为10～40％的枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou007液态生物活性物质所占得重量百分含量为20～80％，将混合后的液态发酵生物活性物质喷洒在步骤c中制备的固态发酵生物活性物质上，所述混合后的液态发酵生物活性物质喷洒量占固态发酵生物活性物质总量的0.1～2.0％，喷洒后即得生物活性物质载体。
根据上述生物活性物质载体的制备方法，步骤a中所述初期经常规方法培养的枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007菌液中菌数为≥1.2×10⁸CFU/ml、酸碱值pH为6.0～6.5；所述发酵后枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007菌液中菌数为≥3.8×10⁸CFU/ml、酸碱值pH为6.0～6.5。
根据上述生物活性物质载体的制备方法，步骤a中所述黄豆粉的粒度为全部通过20～80目筛分析筛；所述分解酶为酸性蛋白分解酶、菠萝酶、α-淀粉分解酶、纤维分解酶、半纤维分解酶、α-半乳糖苷酶、木聚醣酶、甘露聚醣酶中的至少一种(即凡是适合作用环境酸碱值在pH4.0～6.5、酶切适当作用温度在28～55℃的分解酶都可以采用)。
根据上述生物活性物质载体的制备方法，步骤b中所述初期经常规方法培养的芽孢乳酸杆菌90CT172菌液中菌数为≥1.2×10⁸CFU/ml、酸碱值pH为5.0～5.5；发酵后芽孢乳酸杆菌90CT172菌液中菌数为≥2.4×10⁸CFU/ml、酸碱值pH为5.0～5.5；所述黄豆粉的粒度为全部通过20～80目筛分析筛。
根据上述生物活性物质载体的制备方法，步骤c中所述固态底物为去皮黄豆粕、黄豆粉、黄豆渣、米糠、蚕豆粕、豌豆粕、棉籽粕、菜籽粕、小麦麸、大麦麸、啤酒糟、玉米酒糟、大米酒糟和玉米粉中的至少一种；所述物料粉碎后过40目筛。
一种猪专用生物添加剂预混合饲料，所述生物添加剂预混合饲料是以权利要求1所述的生物活性物质为载体，制备1000g预混合饲料所需的原料为：生物活性物质载体202.5g～295.0g、磷酸二氢钙247.5g～365.0g、碳酸钙235.0g～305.0g、维生素添加剂25.0g～37.5g、胺基酸添加剂47.5g～67.5g、矿物元素1.0g～25.0g、酶制剂15.0g～20.0g、霉菌毒素吸附剂12.5g～20.0g、乳糖80.0g～105.0g、干物量为10～40％的枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007液态生物活性物质0.830ml～2.065ml和干物量为10～40％的芽孢乳酸杆菌90CT172液态生物活性物质0.405ml～1.475ml。
根据上述猪专用生物添加剂预混合饲料，所述生物活性物质载体中枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007的含量为1.0×10⁷～8.0×10¹¹CFU/kg，芽孢乳酸杆菌90CT172的含量为1.0×10⁶～8.0×10¹⁰CFU/kg。
根据上述猪专用生物添加剂预混合饲料，所述猪专用生物添加剂预混合饲料中枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007的含量为1.0×10⁶～6.0×10¹¹CFU/kg，芽孢乳酸杆菌90CT172的含量为1.0×10⁵～6.0×10¹⁰CFU/kg。
根据上述猪专用生物添加剂预混合饲料，所述干物量为10～40％的枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007液态生物活性物质是将权利要求1步骤a中制备的枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007液态生物活性物质按照常规方法浓缩而成的；所述干物量为10～40％的芽孢乳酸杆菌90CT172液态生物活性物质是将权利要求1步骤b中制备的芽孢乳酸杆菌90CT172液态生物活性物质按照常规方法浓缩而成的。
根据上述猪专用生物添加剂预混合饲料，所述维生素添加剂、胺基酸添加剂、矿物元素、酶制剂和霉菌毒素吸附剂均为市场上销售的国家规范标准产品。
本发明采用的海藻粉中含有的营养成分见表一。
表一：海藻粉营养成分


本发明在固态生物活性物质制备过程中加入海藻粉，可以提供更多的微量元素和胺基酸。
本发明的积极有益效果：
1、本发明制备的猪专用生物添加剂预混合饲料具有纯天然、无毒、无抗药性、无残留、无副作用等优点，并且本发明猪专用生物添加剂预混合饲料中含有丰富的来自于有益菌种的生长代谢产物的特点；该预混合饲料可以以3-5％的比例常态添加于猪饲料，由此可以显著提升饲料中蛋白质与胺基酸的可消化率、饲料的可利用热能，并且能够促进肠绒毛上皮细胞增生、增长窝深度、促进猪只生长、减少营养性与病原性下痢发生、提高饲料转化率、增强免疫应激能力，尤其突出的是能够节省猪只饲养的成本。
2、本发明采用的枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007具有的优点：(1)、能够产生内生性孢子，耐高温、胃酸、胆盐；(2)、可以有效抑制病原菌的生长，因为营养源被纳豆菌利用完，而且生存空间也都被纳豆菌占满；(3)、分泌抗菌物质能力强，能够抑制梭菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等病原菌；(4)、分泌酶能力强，包括α-淀粉酶(液化酶)、γ-淀粉酶(糖化酶)、纤维酶、蛋白酶与纳豆激酶；(5)、能够清除及分解体内腐败物质，抑制肠道腐败菌，避免腐败菌在大肠内过度酸酵产生毒素而危害动物健康；(6)、能够利用饲料内的碳水化合物转化成有机酸，有效促进肠蠕动，预防便秘；(7)、其代谢物促进乳酸菌繁殖速度。
3、本发明采用的芽孢乳酸杆菌90CT172具有的优点：(1)、驯化形成内生性孢子能力强，耐高温、胃酸、胆盐；(2)、与枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007协同制造肠道有益菌占优势的平衡效果相当强烈，即充分利用枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007分解碳水化合物而产生的寡醣与丁酸，产生乙酸、乳酸除了制造病原菌不利生长的酸性环境外，还提供其它乳酸菌良好生长因子；(3)、增加淋巴球与吞噬细胞数量、干扰素产量，增强免疫力；(4)、具有合成高消化率蛋白肽、核酸、胺基酸、维他命B群等功能；(5)、在肠道能够制造酸性环境，使铜、铁、锌、镁、钙、磷的生物利用率提高。
4、本发明添加剂预混合饲料的配方具有独一性，其生物活性物质载体的制备工艺具有先进性、创新性。并且本发明添加剂预混合饲料的成本低，必能带动猪只养殖业迈向绿色、环保、有机，具有深远的开创价值和启发意义。
四、具体实施方式：
以下实施例仅对本发明作进一步的解释说明，并不限制本发明的内容。
首先说明一下枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007和芽孢乳酸杆菌90CT172这两种菌种的获得和有关性能以及两种菌液的初期常规培养方法的具体过程。
一、枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007和芽孢乳酸杆菌90CT172这两种菌种的获得：
(一)、枯草芽孢杆菌纳豆亚种(Bacillus subtilis var.natto)Chou 007的获得
1、枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007的获取方法：
(1)自台湾省南投县一酱油制造工厂取一克废弃物，加入10ml TrypticaseTMSoy Broth(胰酶大豆培养液，Difco，Sparks，U.S.A.：每升含胰蛋白胨20.0g，右旋糖1.0g，磷酸氢二钠2.0g，硝酸钾1.0g，将pH调至7.0，固态培养基加入1.5％琼脂)中震荡混合均匀后，以常规巴氏德消毒法消毒；
(2)、将TSB培养液进行10倍梯度稀释至10^-4，每个梯度稀释液于37℃温度培养24小时，进行芽孢化菌株的初步增菌筛选；
(3)、再自各稀释管取100μl至Nutrient Agar(营养琼脂，Difco，Sparks，U.S.A.)平板上，并以L型玻棒涂抹均匀，同样37℃培养24小时，再以随机选取方式挑取单一菌落至一个新的Nutrient Agar平板上，并以三步法划开，重复纯化继代三次以后，得到一株具有芽孢化特性和蛋白酶活性的菌株，将其命名为Chou007。
2、枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007菌种的特性：
(1)、形态特征：菌落表面粗糙不透明，有皱折而表面黯淡，为淡黄色或褐色，外观型态呈圆形或不规则状；在液体培养基中生长时，常形成皱醭。细胞大小约(0.5-0.9μm)×(1.5-3μm)，革兰氏染色阳性，着色均匀，无荚膜；内生型孢子大小约(0.4-0.9μm)×(1-1.5μm)，孢子呈椭圆形到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大；通常利用周生鞭毛移动。
(2)、生理特性：化学异营，有氧代谢，但是也能在有硝酸盐的环境中进行缓慢的厌氧性生长；能进行良好的糖解作用与TCA循环，接触酶(catalase)为阳性；具水解蛋白质、纤维、脂肪与淀粉的能力，能降解糖类产生丰富的酸；在26-60℃、酸碱值6.5-7.4时生长良好；具耐压、耐热、耐酸、耐碱特性；在缺乏碳、氮或磷的环境中会形成内生性孢子。
(3)、含有单股环形染色体，内有4,214,810对碱基，平均G+C碱基对含量是43.5％。
(4)、热稳定性：枯草芽孢杆菌纳豆亚种(Bacillus subtilis var.natto)Chou007的热稳定性见表1。
表1：枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007的热稳定性

注：测试样品之起始芽孢化菌数为2.7×10⁸CFU/ml。
(5)、耐酸碱性：
10ml枯草芽孢杆菌纳豆亚种(Bacillus subtilis var.natto)Chou 007菌液经离心去除上清液，测得的菌数为1.7×10⁸CFU/ml，分别在不同pH值的缓冲液中(pH2-7缓冲液为使用0.2M的磷酸氢二钠盐溶液与0.2M的盐酸溶液进行调剂，pH8-10缓冲液为使用0.2M的磷酸氢二钠盐溶液与0.2M的氢氧化钠溶液进行调剂)，静置三小时，然后统计菌数，结果见表2。
表2、枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007的耐酸碱性

  酸碱值pH  残余菌数  (CFU/ml)  酸碱值pH  残余菌数  (CFU/ml)  2  1.1×10⁸CFU/ml  7  1.7×10⁸CFU/ml  3  1.5×10⁸CFU/ml  8  1.7×10⁸CFU/ml  4  1.7×10⁸CFU/ml  9  1.7×10⁸CFU/ml  5  1.7×10⁸CFU/ml  10  1.7×10⁸CFU/ml  6  1.7×10⁸CFU/ml
注：测试样品之起始菌数为1.7×10⁸CFU/ml。
(6)、最适培养基成份：
Nutrient Broth营养培养液的组成为：牛肉膏提取物3.0g，蛋白胨5.0g，加蒸馏水配制成1升，调整pH7.0。
(7)、最适培养温度：最适培养温度为37℃。
(二)、芽孢乳酸杆菌90CT172的获得：
1、芽孢乳酸杆菌90CT172的获取方法：
(1)、自绿麦芽样品取一克，加入10ml GYE Broth(GYE培养液；含酵母提取物5.0g、葡萄糖2.0g、磷酸一钾0.5g、磷酸二钾0.5g、硫酸镁0.3g、氯化钠0.01g、硫酸锰0.01g、硫酸锌0.0016g、硫酸铜0.0016g、硫酸钴0.0016g、肉蛋白胨5g，将pH调至6.0-6.2，固态培养基加入1.5％琼脂)中震荡混合均匀后，以70℃恒温水浴30分钟后马上降温到45℃。
(2)、再以GYE培养液进行10倍梯度稀释至10^-6，将每个梯度稀释液培养于40℃温度培养48小时，进行芽孢化菌株的初步增菌筛选。
(3)、自各稀释管取100μl至Difco^TM Lactobacilli MRS平板培养基上，并以L型玻棒涂抹均匀，同样分别37℃培养24小时后，再以随机方式挑取约2.5mm大小、呈突起、表面平滑光亮的单一菌落至一新的MRS平板培养基上，并以三步法划开，重复纯化继代三次以后，得到一株具有产乳酸活性的菌株，将其命名为90CT172。
2、芽孢乳酸杆菌90CT172菌种的特性：
(1)、形态特征：菌落大小约2.5mm、呈突起、表面平滑光亮、不产生色素、乳白色至乳黄色。菌种纤细长杆状偶而稍弯曲、末端稍圆、宽0.9μm、长3-8μm、革兰氏染色阳性、产内生性椭圆形芽孢位在细胞末端、孢子大小约(0.9-1.2μm)×(1.0-1.7μm)，具周生鞭毛、有运动性。
(2)、生理特性：化学异营，好氧至微好氧代谢，酸性环境生长良好，行同质型酸酵并产L(+)型乳酸、能产生抗菌物质。会利用少数糖类而产酸，包括葡萄糖(Glucose)、半乳糖(Galactose)、木糖(Xylose)、阿拉伯糖(Arabinose)、麦芽糖(Maltose)、甘露糖(Mannose)、果糖(Fructose)、蔗糖(Sucrose)与海藻糖(Trehalose)。无法水解淀粉与酪蛋白。接触酶(Catalase)反应为阳性。引朵(Indole)反应为阴性、不产生硫化氢。无法降解硝酸盐成为亚硝酸盐。在30-37℃、酸碱值5.5-6.5时是生长良好条件。
(3)、热稳定性：
芽孢乳酸杆菌(Lactobacillus sporogenes)90CT172的热稳定性见表3。
表3、芽孢乳酸杆菌90CT172的热稳定性

注：测试样品之起始芽孢化菌数为3.8×10⁸CFU/ml。
(4)、耐酸碱性：
分别将芽孢乳酸杆菌(Lactobacillus sporogenes)90CT172在不同pH值的缓冲液中(pH2-7缓冲液为使用0.2M的磷酸氢二钠盐溶液与0.2M的盐酸溶液进行调剂，pH8-10缓冲液为使用0.2M的磷酸氢二钠盐溶液与0.2M的氢氧化钠溶液进行调剂)，静置三小时，然后统计菌数，结果见表4。
表4、芽孢乳酸杆菌90CT172的耐酸碱性
  酸碱值pH  残余菌数  (CFU/ml)  酸碱值pH  残余菌数  (CFU/ml)  2  8.08×10⁷CFU/ml  7  2.50×10⁸CFU/ml  3  1.67×10⁸CFU/ml  8  2.50×10⁸CFU/ml  4  2.45×10⁸CFU/ml  9  2.48×10⁸CFU/ml  5  2.48×10⁸CFU/ml  10  2.37×10⁸CFU/ml  6  2.50×10⁸CFU/ml
注：测试样品之起始菌数为2.5×10⁸CFU/ml。
(5)、最适培养基成份：
Lactobacilli MRS培养基的组成为：每升培养基中含有蛋白胨10.0g，牛肉膏提取物10.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖20.0g，柠檬酸铵2.0g，醋酸钠5.0g，7倍水合硫酸镁0.1g，水合硫酸锰0.05g，无水磷酸二钾2.0g，吐温-801.0g；蒸馏水配制，pH6.2。
(6)、最适培养温度：最适培养温度为37℃。
二、枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007菌液的初期常规培养方法的具体过程：
第一步：以250ml三角锥瓶装100ml营养培养液作为种瓶来培养枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007，进行种菌的准备，在37℃恒温震荡培养箱内，以150rpm震荡速率、时间24小时，使菌数达到1.0×10⁸CFU/ml以上。
第二步：将种瓶菌液倒入装有5公升营养培养液的搅拌式发酵槽，搅拌速度控制在150rpm，通气量0.5v/v.min，温度保持在37℃恒温，时间24小时，使菌数达到3.8×10⁸CFU/ml-7.0×10⁸CFU/ml，酸碱值pH6.2-6.6。
第三步：在种子罐中进行发酵
将经过5公升搅拌式发酵槽活化后的枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007的菌液接种到500L的种子罐进行发酵。发酵条件如下：
1-1培养基：
1-1-1、浓度以糖度计测量为8brix的糖蜜，脱脂奶粉0.8％；
1-1-2、或浓度以糖度计测量为8brix的糖蜜，黄豆粉1.5％；
1-1-3、或浓度以糖度计测量为5brix的豆浆。
以实际操作为例，采用8brix的糖蜜，黄豆粉1.5％、磷酸氢二钠0.1％为种子发酵罐培养基。
1-2、37℃恒温发酵24小时，搅拌速度控制在150rpm，通气量0.5v/v.min，以0.5M氢氧化钠调节发酵过程中的酸碱值。
1-3、发酵终点的菌数达到1.2×10⁸CFU/ml以上，酸碱值pH6.0-6.5。
三、芽孢乳酸杆菌90CT172菌液的初期常规培养方法的具体过程：
第一步：以250ml三角锥瓶装175ml MRS培养液作为种瓶来培养芽孢乳酸杆菌90CT172，进行种菌的准备，在37℃恒温震荡培养箱内，以100rpm震荡速率、时间24小时，使菌数达到1.0×10⁸CFU/ml以上。
第二步：将种瓶菌液倒入装有5公升MRS培养液的搅拌式发酵槽，搅拌速度控制在100rpm，通气量0.1v/v.min，温度保持在37℃恒温，时间24小时，以0.1M氢氧化钠馈料控制酸碱值，使菌数达到2.4×10⁸CFU/ml-6.0×10⁸CFU/ml，酸碱值pH5.4-5.8。
第三步：在种子罐中进行发酵
将经过5公升搅拌式发酵槽活化后的芽孢乳酸杆菌90CT172的菌液接种到500L的种子罐进行发酵。发酵条件如下：
1-1培养基：
1-1-1、浓度以糖度计测量为8brix的糖蜜，脱脂奶粉0.8％；
1-1-2、或浓度以糖度计测量为8brix的糖蜜，黄豆粉1.5％；
1-1-3、或浓度以糖度计测量为5brix的豆浆。
1-1-4、以实际操作为例，采用8brix的糖蜜，黄豆粉1.5％，无水磷酸二钾0.2％、7倍水合硫酸镁0.01％为种子发酵罐培养基。
1-2、37℃恒温发酵24小时，搅拌速度控制在100rpm，通气量0.1v/v.min，以0.5M氢氧化钠调节发酵过程中的酸碱值。
1-3、酸酵终点的菌数达到1.2×10⁸CFU/ml以上，酸碱值pH5.0-5.5。
实施例1：
本发明生物活性物质载体的制备方法，该制备方法的详细步骤如下：
a、枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007液态生物活性物质的制备：
先将糖蜜以无菌水稀释至以糖度计测量浓度为6.5brix，在100℃条件下、灭菌处理15分钟后，取4000L放入发酵罐，再将初期经常规方法培养的枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007菌液(该菌液中枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007菌数为≥1.2×10⁸CFU/ml、酸碱值pH为6.0～6.5)500L倒入发酵罐，然后再把已在灭菌罐内以1000L无菌水配制的浓度为10％的脱脂奶粉和1％的磷酸氢二纳营养源水溶液以100℃、15分钟灭菌处理后，取500L放入发酵罐，加入后使脱脂奶粉和磷酸氢二钠相对于糖蜜其浓度分别为1％和0.1％，综合以上营养源制备液态底物进行发酵，在发酵罐中发酵时发酵温度为37℃，发酵时间为24小时(发酵过程中搅拌速度控制在150rpm，通气量为0.5v/v.min，以0.5mol/L的氢氧化钠调节发酵过程中的酸碱值)，在发酵过程中每隔2小时补充加入以无菌水配制的浓度为0.2％的磷酸氢二钠80ml，在发酵终止时加入分解酶(分解酶采用的是纤维分解酶)，其加入量为占步骤c中所述固态底物总量的0.01％，加入分解酶的同时，发酵罐夹套内以冰水循环将发酵菌液温度降至7～8℃即可(发酵后枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007菌液中菌数为≥3.8×10⁸CFU/ml、酸碱值pH为6.0～6.5)；
b、芽孢乳酸杆菌90CT172液态生物活性物质的制备：
先将糖蜜以无菌水稀释至以糖度计测量浓度为6.5brix，在100℃条件下、灭菌处理15分钟后，取3500L放入发酵罐，再将初期经常规方法培养的芽孢乳酸杆菌90CT172菌液(该菌液中芽孢乳酸杆菌90CT172菌数为≥1.2×10⁸CFU/ml、酸碱值pH为5.0～5.5)500L倒入发酵罐，再把已在灭菌罐内以1000L无菌水配制的浓度为10％的脱脂奶粉、1％的无水磷酸二钾和0.5％的7倍水合硫酸镁营养源水溶液，以100℃、15分钟灭菌处理后取1000L放入发酵罐，加入后使脱脂奶粉、无水磷酸二钾和7倍水合硫酸镁相对于糖蜜其浓度分别达到2％、0.2％和0.025％，综合以上营养源制备液态底物进行发酵，发酵时发酵温度为37℃，发酵时间为24小时(发酵过程中搅拌速度控制在100rpm，通气量为0.1v/v.min，以0.5mol/L的氢氧化钠调节发酵过程中的酸碱值)，在发酵过程中每隔2小时补充加入浓度为0.2％的无水磷酸二钾160ml，发酵终止时加入菠萝酶与α-半乳糖苷酶，菠萝酶的加入量占步骤c中所述固态底物总量的0.0005％，所述α-半乳糖苷酶的加入量占步骤c中所述固态底物总量的0.5％，加入酶的同时，发酵罐夹套内以冰水循环将发酵菌液温度降至7～8℃即可(发酵后芽孢乳酸杆菌90CT172菌液中菌数为≥2.4×10⁸CFU/ml、酸碱值pH为5.0～5.5)；
c、枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007和芽孢乳酸杆菌90CT172固态生物活性物质的制备：
先将固态底物(所述固态底物为去皮黄豆粕和黄豆粉的混合物)以蒸气调质10～15分钟，降温至42～45℃，然后将步骤a制备的枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007液态生物活性物质和步骤b制备的芽孢乳酸杆菌90CT172液态生物活性物质混合均匀，混合时枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007液态生物活性物质所占的重量百分含量为70％，将处理后的固态底物与混合后的液态生物活性物质进行混合发酵，固态底物与混合后的液态生物活性物质混合时，其中混合后的液态生物活性物质所占的重量百分含量为90％，发酵时发酵温度为37℃，发酵时间为24小时，在固态发酵结束前6小时加入海藻粉，所述海藻粉的加入量占固态底物总量的7％，发酵结束后将其物料在80℃的温度下烘干，烘干至发酵底物水分含量＜7％，最后粉碎过40目筛，得到固态发酵生物活性物质；
d、生物活性物质载体的制备：将步骤a、b制备的枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007液态生物活性物质和芽孢乳酸杆菌90CT172液态生物活性物质分别浓缩成干物量为20％的液态发酵生物活性物质，将两种浓缩后的液态发酵生物活性物质进行混合，其中干物量为20％的枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007液态生物活性物质所占得重量百分含量为70％，将混合后的液态发酵生物活性物质喷洒在步骤c中制备的固态发酵生物活性物质上，所述混合后的液态发酵生物活性物质喷洒量占固态生物发酵活性物质总量的2.0％，喷洒后即得生物活性物质载体。
一种猪专用生物添加剂预混合饲料，该生物添加剂预混合饲料是以上述制备的生物活性物质为载体，制备1000g预混合饲料所需的原料为：生物活性物质载体250g、磷酸二氢钙267.5g、碳酸钙260g、维生素添加剂37.5g、胺基酸添加剂47.5g、矿物元素10g、酶制剂15g、霉菌毒素吸附剂12.5g、乳糖80g、干物量为20％的枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007液态生物活性物质0.83ml和干物量为20％的芽孢乳酸杆菌90CT172液态生物活性物质0.8ml。
猪专用生物添加剂预混合饲料中采用的维生素添加剂、胺基酸添加剂、矿物元素、酶制剂和霉菌毒素吸附剂均为市场上销售的国家规范标准产品。
实施例2：
本发明生物活性物质载体的制备方法与实施例一基本相同，不同之处在于：
步骤a：将糖蜜以无菌水稀释至浓度为10brix，稀释的糖蜜灭菌处理后取3500L放入发酵罐，取1000L灭菌处理后的脱脂奶粉、磷酸氢二钠营养源水溶液，加入后脱脂奶粉、磷酸氢二钠相对于糖蜜的浓度分别为2％和0.2％，发酵温度为25℃，发酵时间为60小时，加入的分解酶为α-淀粉分解酶，其加入量占步骤c所采用的固态底物总量的0.05％；
步骤b：先将糖蜜以无菌水稀释至浓度为10brix，稀释的糖蜜灭菌处理后取4250L放入发酵罐，取250L灭菌处理后的脱脂奶粉、无水磷酸二钾和7倍水合硫酸镁营养源水溶液，加入后脱脂奶粉、无水磷酸二钾和7倍水合硫酸相对于糖蜜的浓度分别为0.5％、0.05％和0.025％，发酵温度为37℃，发酵时间为24小时，菠萝酶的加入量占步骤c中所采用固态底物总量的0.001％，α-半乳糖苷酶的加入量占步骤c中所述固态底物总量的0.05％；
步骤c中：固态底物为黄豆粉、黄豆渣和蚕豆粕的混合物，将其固态底物以蒸气调质5～10分钟，两种液态生物活性物质混合时枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007液态生物活性物质所占的重量百分含量为50％，固态底物与混合后的液态生物活性物质混合时，混合后的液态生物活性物质所占的重量百分含量为70％，发酵温度为50℃，发酵时间为18小时，在固态发酵结束前4小时加入海藻粉，海藻粉的加入量占固态底物总量的6.5％，发酵结束后物料在100℃条件下烘干；
步骤d：将步骤a、b制备的两种液态生物活性物质分别浓缩成干物量为30％的液态发酵生物活性物质，两种浓缩后的液态发酵生物活性物质混合时，干物量为30％的枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007液态生物活性物质所占的重量百分含量为50％，混合后的液态发酵生物活性物质的喷洒量占固态发酵生物活性物质总量的0.5％。
一种猪专用生物添加剂预混合饲料，该生物添加剂预混合饲料是以上述制备的生物活性物质为载体，制备1000g预混合饲料所需的原料为：生物活性物质载体295g、磷酸二氢钙247.5g、碳酸钙235g、维生素添加剂25g、胺基酸添加剂50g、矿物元素5g、酶制剂20g、霉菌毒素吸附剂15g、乳糖85g、干物量为30％的枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007液态生物活性物质1.0ml和干物量为30％的芽孢乳酸杆菌90CT172液态生物活性物质0.6ml。
实施例3：
本发明生物活性物质载体的制备方法与实施例一基本相同，不同之处在于：
步骤a：将糖蜜以无菌水稀释至浓度为15brix，稀释的糖蜜灭菌处理后取3800L放入发酵罐，取700L灭菌处理后的脱脂奶粉、磷酸氢二钠营养源水溶液，加入后脱脂奶粉、磷酸氢二钠相对于糖蜜的浓度分别为1.5％和0.15％，发酵温度为60℃，发酵时间为5小时，加入的分解酶为半纤维分解酶，其加入量占步骤c所采用的固态底物总量的0.10％；
步骤b：先将糖蜜以无菌水稀释至浓度为15brix，稀释的糖蜜灭菌处理后取3800L放入发酵罐，取700L灭菌处理后的脱脂奶粉、无水磷酸二钾和7倍水合硫酸镁营养源水溶液，加入后脱脂奶粉、无水磷酸二钾和7倍水合硫酸相对于糖蜜的浓度分别为1％、0.15％和0.08％，发酵温度为30℃，发酵时间为72小时，菠萝酶的加入量占步骤c中所采用固态底物总量的0.005％，所述α-半乳糖苷酶的加入量占步骤c中所述固态底物总量的0.01％；
步骤c中：固态底物为黄豆粉，将其固态底物以蒸气调质15～20分钟，两种液态生物活性物质混合时枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007液态生物活性物质所占的重量百分含量为40％，固态底物与混合后的液态生物活性物质混合时，混合后的液态生物活性物质所占的重量百分含量为50％，发酵温度为25℃，发酵时间为72小时，在固态发酵结束前8小时加入海藻粉，海藻粉的加入量占固态底物总量的10％，发酵结束后物料在70℃条件下烘干；
步骤d：将步骤a、b制备的两种液态生物活性物质分别浓缩成干物量为40％的液态发酵生物活性物质，两种浓缩后的液态发酵生物活性物质混合时，干物量为40％的枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007液态生物活性物质所占的重量百分含量为30％，混合后的液态发酵生物活性物质的喷洒量占固态发酵生物活性物质总量的1.0％。
一种猪专用生物添加剂预混合饲料，该生物添加剂预混合饲料是以上述制备的生物活性物质为载体，制备1000g预混合饲料所需的原料为：生物活性物质载体202.5g、磷酸二氢钙280g、碳酸钙280g、维生素添加剂30g、胺基酸添加剂55g、矿物元素1g、酶制剂16g、霉菌毒素吸附剂20g、乳糖105g、干物量为10％的枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007液态生物活性物质1.805ml和干物量为10％的芽孢乳酸杆菌90CT172液态生物活性物质1.250ml。
实施例4：
本发明生物活性物质载体的制备方法与实施例一基本相同，不同之处在于：
步骤a：将糖蜜以无菌水稀释至浓度为20brix，稀释的糖蜜灭菌处理后取3600L放入发酵罐，取900L灭菌处理后的黄豆粉(黄豆粉的粒度为全部通过20～80目筛分析筛)、磷酸氢二钠营养源水溶液，加入后黄豆粉、磷酸氢二钠相对于糖蜜的浓度分别为1％和0.1％，发酵温度为30℃，发酵时间为30小时，加入的分解酶为木聚醣酶，加入量占步骤c所采用的固态底物总量的0.20％；
步骤b；先将糖蜜以无菌水稀释至浓度为20brix，稀释的糖蜜灭菌处理后取4000L放入发酵罐，取500L灭菌处理后的黄豆粉(黄豆粉的粒度为全部通过20～80目筛分析筛)、无水磷酸二钾和7倍水合硫酸镁营养源水溶液，加入后黄豆粉、无水磷酸二钾和7倍水合硫酸相对于糖蜜的浓度分别为0.5％、0.1％和0.05％，发酵温度为40℃，发酵时间为20小时，菠萝酶的加入量占步骤c中所采用固态底物总量的0.01％，所述α-半乳糖苷酶的加入量占步骤c中所述固态底物总量的0.01％；
步骤c中：固态底物为蚕豆粕和豌豆粕的混合物，将其固态底物以蒸气调质20～25分钟，两种液态生物活性物质混合时枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007液态生物活性物质所占的重量百分含量为30％，固态底物与混合后的液态生物活性物质混合时，混合后的液态生物活性物质所占的重量百分含量为35％，发酵温度为60℃，发酵时间为5小时，在固态发酵结束前2小时加入海藻粉，海藻粉的加入量占固态底物总量的4％，发酵结束后物料在55℃条件下烘干；
步骤d：将步骤a、b制备的两种液态生物活性物质分别浓缩成干物量为10％的液态发酵生物活性物质，两种浓缩后的液态发酵生物活性物质混合时，干物量为10％的枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007液态生物活性物质所占的重量百分含量为80％，混合后的液态发酵生物活性物质的喷洒量占固态发酵生物活性物质总量的1.5％。
一种猪专用生物添加剂预混合饲料，该生物添加剂预混合饲料是以上述制备的生物活性物质为载体，制备1000g预混合饲料所需的原料为：生物活性物质载体220g、磷酸二氢钙300g、碳酸钙240g、维生素添加剂35g、胺基酸添加剂60g、矿物元素15g、酶制剂15g、霉菌毒素吸附剂13g、乳糖90g、干物量为15％的枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007液态生物活性物质2.065ml和干物量为15％的芽孢乳酸杆菌90CT172液态生物活性物质1.050ml。
实施例5：
本发明生物活性物质载体的制备方法与实施例一基本相同，不同之处在于：
步骤a：将豆浆以无菌水稀释至浓度为2brix，稀释的豆浆灭菌处理后取3900L放入发酵罐，取600L灭菌处理后的黄豆粉(黄豆粉的粒度为全部通过20～80目筛分析筛)、磷酸氢二钠营养源水溶液，加入后黄豆粉、磷酸氢二钠相对于豆浆的浓度分别为0.8％和0.2％，发酵温度为35℃，发酵时间为28小时，加入的分解酶为甘露聚醣酶，其加入量占步骤c所采用的固态底物总量的0.30％；
步骤b：先将豆浆以无菌水稀释至浓度为2brix，稀释的豆浆灭菌处理后取3600L放入发酵罐，取900L灭菌处理后的脱脂奶粉、无水磷酸二钾和7倍水合硫酸镁营养源水溶液，加入后脱脂奶粉、无水磷酸二钾和7倍水合硫酸相对于豆浆的浓度分别为2％、0.2％和0.1％，发酵温度为50℃，发酵时间为12小时，菠萝酶的加入量占步骤c中所采用固态底物总量的0.001％，所述α-半乳糖苷酶的加入量占步骤c中所述固态底物总量的0.08％；
步骤c中：固态底物为蚕豆粕和豌豆粕的混合物，将其固态底物以蒸气调质25～30分钟，两种液态生物活性物质混合时枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007液态生物活性物质所占的重量百分含量为60％，固态底物与混合后的液态生物活性物质混合时，混合后的液态生物活性物质所占的重量百分含量为25％，发酵温度为35℃，发酵时间为60小时，在固态发酵结束前8小时加入海藻粉，海藻粉的加入量占固态底物总量的10％，发酵结束后物料在120℃条件下烘干；
步骤d：将步骤a、b制备的两种液态生物活性物质分别浓缩成干物量为15％的液态发酵生物活性物质，两种浓缩后的液态发酵生物活性物质混合时，干物量为15％的枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007液态生物活性物质所占的重量百分含量为60％，混合后的液态发酵生物活性物质的喷洒量占固态发酵生物活性物质总量的1.8％。
一种猪专用生物添加剂预混合饲料，该生物添加剂预混合饲料是以上述制备的生物活性物质为载体，制备1000g预混合饲料所需的原料为：生物活性物质载体205g、磷酸二氢钙330g、碳酸钙235g、维生素添加剂37.5g、胺基酸添加剂67.5g、矿物元素8g、酶制剂15g、霉菌毒素吸附剂12.5g、乳糖80g、干物量为25％的枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007液态生物活性物质0.83ml和干物量为25％的芽孢乳酸杆菌90CT172液态生物活性物质0.405ml。
实施例6：
本发明生物活性物质载体的制备方法与实施例一基本相同，不同之处在于：
步骤a：将豆浆以无菌水稀释至浓度为4brix，稀释的豆浆灭菌处理后取4000L放入发酵罐，取500L灭菌处理后的黄豆粉(黄豆粉的粒度为全部通过20～80目筛分析筛)、磷酸氢二钠营养源水溶液，加入后黄豆粉、磷酸氢二钠相对于豆浆的浓度分别为0.5％和0.2％，发酵温度为40℃，发酵时间为22小时，加入的分解酶为纤维分解酶和半纤维分解酶，其加入量占步骤c所采用的固态底物总量的0.40％；
步骤b：先将豆浆以无菌水稀释至浓度为4brix，稀释的豆浆灭菌处理后取3900L放入发酵罐，取600L灭菌处理后的脱脂奶粉、无水磷酸二钾和7倍水合硫酸镁营养源水溶液，加入后脱脂奶粉、无水磷酸二钾和7倍水合硫酸相对于豆浆的浓度分别为1％、0.1％和0.05％，发酵温度为37℃，发酵时间为24小时，菠萝酶的加入量占步骤c中所采用固态底物总量的0.005％，所述α-半乳糖苷酶的加入量占步骤c中所述固态底物总量的0.5％；
步骤c中：固态底物为去皮黄豆粕、黄豆粉、黄豆渣和小麦麸的混合物，将其固态底物以蒸气调质10～15分钟，两种液态生物活性物质混合时枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007液态生物活性物质所占的重量百分含量为55％，固态底物与混合后的液态生物活性物质混合时，混合后的液态生物活性物质所占的重量百分含量为65％，发酵温度为40℃，发酵时间为20小时，在固态发酵结束前5小时加入海藻粉，海藻粉的加入量占固态底物总量的2％，发酵结束后物料在135℃条件下烘干；
步骤d：将步骤a、b制备的两种液态生物活性物质分别浓缩成干物量为25％的液态发酵生物活性物质，两种浓缩后的液态发酵生物活性物质混合时，干物量为25％的枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007液态生物活性物质所占的重量百分含量为20％，混合后的液态发酵生物活性物质的喷洒量占固态发酵生物活性物质总量的0.1％。
一种猪专用生物添加剂预混合饲料，该生物添加剂预混合饲料是以上述制备的生物活性物质为载体，制备1000g预混合饲料所需的原料为：生物活性物质载体202.5g、磷酸二氢钙365g、碳酸钙235g、维生素添加剂25g、胺基酸添加剂47.5g、矿物元素7g、酶制剂15g、霉菌毒素吸附剂12.5g、乳糖80g、干物量为40％的枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007液态生物活性物质0.90ml和干物量为40％的芽孢乳酸杆菌90CT172液态生物活性物质0.520ml。
实施例7：
本发明生物活性物质载体的制备方法与实施例一基本相同，不同之处在于：
步骤a：将豆浆以无菌水稀释至浓度为8brix，稀释的豆浆灭菌处理后取3500L放入发酵罐，取1000L灭菌处理后的脱脂奶粉、磷酸氢二钠营养源水溶液，加入后脱脂奶粉、磷酸氢二钠相对于豆浆的浓度分别为2％和0.2％，发酵温度为50℃，发酵时间为10小时，加入的分解酶为纤维分解酶和木聚醣酶的混合物，混合酶的加入量占步骤c所采用的固态底物总量的0.50％；
步骤b：先将豆浆以无菌水稀释至浓度为8brix，稀释的豆浆灭菌处理后取4000L放入发酵罐，取500L灭菌处理后的黄豆粉(黄豆粉的粒度为全部通过20～80目筛分析筛)、无水磷酸二钾和7倍水合硫酸镁营养源水溶液，加入后黄豆粉、无水磷酸二钾和7倍水合硫酸相对于豆浆的浓度分别为1％、0.15％和0.08％，发酵温度为37℃，发酵时间为24小时，菠萝酶的加入量占步骤c中所采用固态底物总量的0.002％，所述α-半乳糖苷酶的加入量占步骤c中所述固态底物总量的0.3％；
步骤c中：固态底物为去皮黄豆粕、黄豆粉、黄豆渣和小麦麸的混合物，将其固态底物以蒸气调质10～15分钟，两种液态生物活性物质混合时枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007液态生物活性物质所占的重量百分含量为65％，固态底物与混合后的液态生物活性物质混合时，混合后的液态生物活性物质所占的重量百分含量为55％，发酵温度为45℃，发酵时间为15小时，在固态发酵结束前1小时加入海藻粉，海藻粉的加入量占固态底物总量的1％，发酵结束后物料在90℃条件下烘干；
步骤d：将步骤a、b制备的两种液态生物活性物质分别浓缩成干物量为35％的液态发酵生物活性物质，两种浓缩后的液态发酵生物活性物质混合时，干物量为35％的枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007液态生物活性物质所占的重量百分含量为40％，混合后的液态发酵生物活性物质的喷洒量占固态发酵生物活性物质总量的0.8％。
一种猪专用生物添加剂预混合饲料，该生物添加剂预混合饲料是以上述制备的生物活性物质为载体，制备1000g预混合饲料所需的原料为：生物活性物质载体206g、磷酸二氢钙250g、碳酸钙305g、维生素添加剂28g、胺基酸添加剂52g、矿物元素25g、酶制剂16g、霉菌毒素吸附剂16g、乳糖82g、干物量为40％的枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007液态生物活性物质0.90ml和干物量为15％的芽孢乳酸杆菌90CT172液态生物活性物质1.475ml。
实施例8：
本发明生物活性物质载体的制备方法与实施例一基本相同，不同之处在于：
步骤a：将豆浆以无菌水稀释至浓度为12brix，稀释的豆浆灭菌处理后取3800L放入发酵罐，取700L灭菌处理后的脱脂奶粉、磷酸氢二钠营养源水溶液，加入后脱脂奶粉、磷酸氢二钠相对于豆浆的浓度分别为1％和0.2％，发酵温度为37℃，发酵时间为24小时，加入的分解酶为纤维分解酶和甘露聚醣酶的混合物，混合酶加入量占步骤c所采用的固态底物总量的0.05％；
步骤b：先将豆浆以无菌水稀释至浓度为12brix，稀释的豆浆灭菌处理后取4250L放入发酵罐，取250L灭菌处理后的黄豆粉(黄豆粉的粒度为全部通过20～80目筛分析筛)、无水磷酸二钾和7倍水合硫酸镁营养源水溶液，加入后黄豆粉、无水磷酸二钾和7倍水合硫酸相对于豆浆的浓度分别为0.5％、0.05％和0.025％，发酵温度为37℃，发酵时间为24小时，菠萝酶的加入量占步骤c中所采用固态底物总量的0.008％，所述α-半乳糖苷酶的加入量占步骤c中所述固态底物总量的0.05％；
步骤c中：固态底物为去皮黄豆粕、黄豆粉、黄豆渣和米糠的混合物，将其固态底物以蒸气调质10～15分钟，两种液态生物活性物质混合时枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007液态生物活性物质所占的重量百分含量为35％，固态底物与混合后的液态生物活性物质混合时，混合后的液态生物活性物质所占的重量百分含量为30％，发酵温度为37℃，发酵时间为24小时，在固态发酵结束前6小时加入海藻粉，海藻粉的加入量占固态底物总量的8％，发酵结束后物料在70℃条件下烘干；
步骤d：将步骤a、b制备的两种液态生物活性物质分别浓缩成干物量为30％的液态发酵生物活性物质，两种浓缩后的液态发酵生物活性物质混合时，干物量为30％的枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007液态生物活性物质所占的重量百分含量为35％，混合后的液态发酵生物活性物质的喷洒量占固态发酵生物活性物质总量的1.2％。
一种猪专用生物添加剂预混合饲料，该生物添加剂预混合饲料是以上述制备的生物活性物质为载体，制备1000g预混合饲料所需的原料为：生物活性物质载体270g、磷酸二氢钙250g、碳酸钙245g、维生素添加剂26g、胺基酸添加剂50g、矿物元素12g、酶制剂18g、霉菌毒素吸附剂12.5g、乳糖95g、干物量为20％的枯草芽孢杆菌纳豆亚种Chou 007液态生物活性物质2.065ml和干物量为35％的芽孢乳酸杆菌90CT172液态生物活性物质0.645ml。