拟南芥细胞质型苹果酸脱氢酶基因的植物表达载体及其应用.pdf

本发明具体涉及一种提高植物耐铝毒能力的植物表达载体pH2-35S-PrbcS-AMDH，其构建方法与应用，属于植物基因工程领域。它提高植物耐铝毒能力的专用载体pH2-35S-PrbcS-AMDH，为含有1，5二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)小亚基基因的光诱导型启动子(PrbcS)和拟南芥细胞质苹果酸脱氢酶(Arabidopsis thaliana cytosolic malate dehydrogenase)基因AMDH的植物表达载体。从拟南芥中克隆出AMDH基因，用光诱导型启动子控制它在烟草中过量表达，合成苹果酸并分泌到细胞外，从而增强了植物在酸性土壤中对铝毒的耐受性。实验结果表明转AMDH基因烟草叶片的苹果酸脱氢酶活性是野生型烟草的1.4倍。在30μM的铝毒胁迫下，转AMDH基因烟草能分泌较多的有机酸，根系生长较好，铝毒胁迫下的生长情况显示出转AMDH基因烟草的株高和绿叶片数目高于野生型。

1、  一种重组植物表达载体，含有拟南芥细胞质型苹果酸脱氢酶基因即AMDH基因。

2、  权利要求1的重组载体，用于构建所述植物表达载体的起始载体为pH2GW7。

3、  权利要求1的重组载体，其中AMDH基因cDNA的上游添加有Rubisco小亚基的光诱导型启动子PrbcS。

4、  权利要求1的重组载体，为pH2-35S-PrbcS-AMDH，在起始载体pH2GW7上连有启动子PrbcS，其后紧接AMDH基因。

5、  权利要求1的重组载体，由下述方法构建而成：
(1)从GenBank中查找拟南芥细胞质型AMDH的全长基因cDNA序列，并设计序列如下的一对引物：
AMDH5：5’-CACCATGGCGAAGGAACCAGTTCGTG-3’
AMDH3：5’-CTCGAGTTAAGAGAGGCATGAGTAAGCG-3’
5’端引物AMDH5，5’端加CACC特征序列，并由此形成Nco I酶切位点；3’端引物AMDH3，末端加Xho I酶切位点；以拟南芥第一链cDNA为模版扩增，得到AMDH基因的全长cDNA；
(2)回收并纯化AMDH全长基因cDNA片段，并将其连接到pUCm-T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pUCm-AMDH；
(3)构建入门载体pENTR*-PrbcS-AMDH，用Nco I和Xho I切割pENTR*-PrbcS-*T-GFP(pENTR*-PrbcS-*T-GFP的构建见本申请人的另一项专利申请，申请号为200710066422.9)和pUCm-AMDH，回收载体pENTR*-PrbcS片段和AMDH基因cDNA片段，然后连接、转化、抽提质粒进行PCR检测和酶切检测，获得重组质粒pENTR*-PrbcS-AMDH；
(4)构建植物表达载体pH2-35S-PrbcS-AMDH，通过Gateway技术的LR反应把PrbcS-AMDH亚克隆到植物表达载体pH2GW7中，获得AMDH基因的植物表达载体pH2-35S-PrbcS-AMDH。

6、  权利要求1苹果酸脱氢酶基因AMDH的cDNA来源于拟南芥，来源于拟南芥的苹果酸脱氢酶基因AMDH的cDNA GenBank登录号为AY091220。

7、  权利要求1的重组植物表达载体的构建方法，其特征在于：
(1)从GenBank中查找拟南芥细胞质型AMDH的全长基因cDNA序列，并设计序列如下的一对引物：
AMDH5：5’-CACCATGGCGAAGGAACCAGTTCGTG-3’
AMDH3：5’-CTCGAGTTAAGAGAGGCATGAGTAAGCG-3’
5’端引物AMDH5，5’端加CACC特征序列，并由此形成Nco I酶切位点；3’端引物AMDH3，末端加Xho I酶切位点；以拟南芥第一链cDNA为模版扩增，得到AMDH基因的全长cDNA；
(2)回收并纯化AMDH全长基因cDNA片段，并将其连接到pUCm-T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pUCm-AMDH；
(3)构建入门载体pENTR*-PrbcS-AMDH，用Nco I和Xho I切割pENTR*-PrbcS-*T-GFP(pENTR*-PrbcS-*T-GFP的构建见本申请人的另一项专利申请，申请号为200710066422.9)和pUCm-AMDH，回收载体pENTR*-PrbcS片段和AMDH基因cDNA片段，然后连接、转化、抽提质粒进行PCR检测和酶切检测，获得重组质粒pENTR*-PrbcS-AMDH；
(4)构建植物表达载体pH2-35S-PrbcS-AMDH，通过Gateway技术的LR反应把PrbcS-AMDH亚克隆到植物表达载体pH2GW7中，获得AMDH基因的植物表达载体pH2-35S-PrbcS-AMDH。

8、  权利要求1-5之一的重组植物载体在制备耐受铝毒的转基因植株中的应用。

9、  权利要求1-5之一的重组植物载体在制备耐受铝毒的转基因烟草中的应用。

拟南芥细胞质型苹果酸脱氢酶基因的植物表达载体及其应用
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种提高植物耐铝毒能力的植物表达载体pH2-35S-PrbcS-AMDH，其构建方法与应用。
背景技术：
铝是地壳中含量最丰富的金属元素，其平均含量约占地壳的8％。有试验表明，适量的铝能促进茶树和野牡丹的生长发育，如铝在一定范围(≤400μmol/L。)增加茶树侧根数量和长度，低于50μmol/L的铝对水稻幼苗生长有促进作用，但大多数作物容易受到铝的毒害，通常毫微摩尔浓度水平的铝在短时间内即可影响许多作物根系的生长(MA J F，PETER R R，DELHAIZE.2001.Aluminum tolerance in plantsand the complexing role of organic acids[J].Trends in Plant Science，6(6)：273-278)。同时铝也是酸性土壤中限制作物生长的主要因素，并且Al的溶解度对pH值十分敏感，在酸性条件下，PH的微量变化就会大幅度影响Al³⁺的浓度，比如稀释营养液pH从4.5提高至4.6即可使Al³⁺浓度降低26％(BlameyF P C，Edwards D G，AsherC J.1983.Effects of aluminium，OH：Al and P：Al molar ratio，and iomic strengthon soybean root elongation in solution culture.Soil Science，136：197-207)PH每减少0.11个单位，土壤中Al的溶解度将增加2μmol(0.054mg/L)(孔繁翔，桑伟莲，蒋新，等.2000，铝对植物毒害及植物抗铝作用机理.生态学报，20(5)：856-858)。在酸性土壤中，铝主要是以Al(H₂O)₆³⁺形态存在的，即通常所说的Al³⁺，这种形态是目前公认的对植物毒害很强的一种形态。
植物受铝毒害最明显、最突出的特征是根的伸长生长受到抑制(L，HuttovJ，Mistrik I.2003，Inhibition of Al2induced root elongation and enhancementof Al2induced peroxidase activity in Al2sensitive and Al2resistance barleycultivars are positively correlated.Plant & Soil，250：193～200)，根尖的结构受到破坏。在铝胁迫下植物主根的伸长受到抑制，地上分蘖少，侧根少、短粗而脆，并且为棕褐色，根尖卷曲，呈鱼钩状，根毛减少，根冠脱落。铝对根的毒害作用部位是根尖，包括根冠与根分生区，故而植物发生铝毒害的最主要症状是其根生长的快速受阻；对铝毒机理研究结果表明铝可能通过一种未知的信号传导途径(包括根冠，根分生区，激素以及其他信号)间接抑制根的生长。此外，铝离子交换量占土壤中阳离子交换总量的20％～80％，容易导致土壤阳离子流失，如造成磷、钾、钙、镁、硼、钼等营养元素的缺乏。
目前农业生产中治理酸性土壤的方法主要是施用石灰，增加土壤有机质等。虽然施用有机肥料，可以明显降低土壤Al³⁺含量，增加土壤养分，保持作物的稳产和高产；也可以施用土壤改良剂来达到目的，如合成腐植酸、丙烯酰胺、丙烯酸共聚物作为土壤结构改良剂，共聚物可抑制土壤中铝的活性，改良后的土壤活性铝的存在形态有所改变，活性铝的含量减少，土壤的pH提高。但由于全球酸性土面积较大，这样成本高，操作起来也存在困难。尤其是施石灰不仅成本高，而且只改善土壤表面的状况，长期下去会破坏土壤结构和特性，破坏生态系统。从长远考虑，还需要提出更多更有效的方法措施。目前关于酸性土壤的铝毒问题研究很多，开发和利用耐铝植物资源来解决酸铝胁迫的难题是目前研究的热点之一。
对于植物耐铝的机制，目前提出了多种耐Al作用的生理生化机制。但普遍认为Al胁迫下植物耐Al基因型或品种通过根系大量分泌有机酸来解除或减轻Al的毒害，是植物的重要耐Al机理之一。有机酸，尤其是低分子有机酸可影响根尖的土壤环境，对植物根际营养具有重要作用.当根系处于高水平铝环境中时，一些植物根际的pH值上升，从而刺激根系分泌柠檬酸、苹果酸等，特别是耐铝品种(系)根系能大量分泌苹果酸或柠檬酸到质外体或根际溶液。研究表明，有机酸如柠檬酸盐，草酸盐，酒石酸苹果酸盐，丙二酸，琥珀酸盐和醋酸盐可以合土壤中的铝离子，降低铝对植物体的毒害作用。
苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase，MDH)是生物中广泛存在的一类蛋白，它以NADH或NADPH为还原剂，催化L-苹果酸与OAA的可逆反应。它在柠檬酸循环中催化苹果酸形成草酰乙酸，也可催化草酰乙酸形成苹果酸.而草酰乙酸是生物体内生化反应的一个非常重要的中间产物，连接多条重要的代谢途径，是氨基酸形成所必需的碳骨架的主要来源之一。在植物中，MDH参与了众多的发育进程：为C4代谢提供苹果酸，pH平衡的维持，气孔的运动，呼吸作用，脂肪酸的β-氧化以及豆科根瘤的形成等(Imsande，J.，Berkemeyer，M.，Scheibe，R.，et al.(2001)Asoybean plastid-targeted NADH-malate dehydrogenase：cloning and expressionanalyses.American J.Botany.88：2136-2142.)。除此以外，苹果酸脱氢酶还在细胞的多种生理活动中扮演着重要的角色，涉及线粒体的能量代谢、苹果酸一天冬氨酸穿梭系统、植物的抗病性(其酶活力的异常变动可作为植物对疾病易感性和抗病性早期鉴别的手段)以及植物抗病过程中的活性氧代谢等。
Tesfaye等(2001)利用35S启动子在苜蓿中过量表达根瘤特异型的MDH，得到的转基因苜蓿根尖MDH的活性提高1.6倍，根部有机酸的含量提高了4.2倍，增加了有机酸分泌量，当植物生长在含有铝的酸性培养液中时，转MDH的植株积累的生物量比未转基因的苜蓿高，在含有铝的水培液或土壤中栽培时，非转基因植物的生长困难，转基因植物生长情况良好，提高了转基因植物对铝的耐受性，取得明显效果(Tesfaye，M.，Temple，S.J.，Allan，D.L.，et al.2001，Overexpression of MalateDehydrogenase in Transgenic Alfalfa Enhances Organic Acid Synthesis andConfers Tolerance to Aluminum Plant Physiol.127：1836-1844)。罗小英等在苜蓿根瘤中分离出的根瘤型苹果酸脱氢酶(neMDH)，通过农杆菌介导的方法转染苜蓿胚性愈伤组织进行遗传转化，筛选的转化株在20μmol/L的AL³⁺溶液中处理24h后根部的伸长量比对照植株高3.6％-22.5％，由此表明在相同的铝毒条件下过量表达苹果酸脱氢酶的转基因苜蓿能够更好地生长(罗小英，崔衍波，邓伟，等.2004.超量表达苹果酸脱氢酶基因提高苜蓿对铝毒的抗受性.分子植物育种，2004，2(5)：621-626)。综上所述，通过遗传操作在植物中过量表达MDH可以提高植物中MDH的活性，增加其有机酸分泌量，从而提高植物对铝毒的耐受能力，使植物在有铝胁迫的情况下更好的生长，是提高植物对铝耐受性的有效方法。
已有的研究结果表明高等植物中至少有5种异构型的MDH(Ding and Ma，2004)，其中细胞质性型的MDH催化的反应向生成苹果酸的方向进行。未有含有拟南芥基因组中存在的细胞质型的MDH基因的植物表达载体的报道。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种提高植物对铝毒耐受能力的苹果酸脱氢酶基因的植物表达载体，该载体是含有拟南芥细胞质型苹果酸脱氢酶基因(即AMDH基因)的植物表达载体；同时提供该载体的构建方法，以及该载体在制备耐受铝毒的转基因植物中的应用。
本发明所提供的用于提高植物耐铝毒能力的载体，是具有光诱导启动子和苹果酸脱氢酶基因cDNA的植物表达载体。
上述载体中，所述的苹果酸脱氢酶基因AMDH的cDNA来源于拟南芥(Arabidopsisthaliana)。所述的来源于拟南芥的苹果酸脱氢酶基因AMDH的cDNA GenBank登录号为AY091220。
上述苹果酸脱氢酶基因cDNA的上游为Rubisco小亚基的光诱导型启动子。
上述载体中，用于构建所属植物表达载体的起始载体为pH2GW7(购自FlandersInteruniversity Institute for Biotechnology，VIB)。
本发明的上述植物表达载体pH2-35S-PrbcS-AMDH由下述方法构建而成：
(1)从GenBank中查找拟南芥细胞质型AMDH的全长基因cDNA序列，并设计序列如下的一对引物：
AMDH5：5’-CACCATGGCGAAGGAACCAGTTCGTG-3’
AMDH3：5’-CTCGAGTTAAGAGAGGCATGAGTAAGCG-3’
5’端引物AMDH5，5’端加CACC特征序列，并由此形成Nco I酶切位点；3’端引物AMDH3，末端加Xho I酶切位点；以拟南芥第一链cDNA为模版扩增，得到AMDH基因的全长cDNA。
(2)回收并纯化AMDH全长基因cDNA片段，并将其连接到pUCm-T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pUCm-AMDH；
(3)构建入门载体pENTR*-PrbcS-AMDH，用Nco I和Xho I切割pENTR*-PrbcS-*T-GFP(pENTR*-PrbcS-*T-GFP的构建方法见本申请人的另一项专利申请，申请号为200710066422.9)和pUCm-AMDH，回收载体pENTR*-PrbcS片段和AMDH基因cDNA片段，然后连接、转化、抽提质粒进行PCR检测和酶切检测，获得重组质粒pENTR*-PrbcS-AMDH。
(4)构建植物表达载体pH2-35S-PrbcS-AMDH，通过Gateway技术的LR反应把PrbcS-AMDH亚克隆到植物表达载体pH2GW7(Gateway的目的载体，比利时VIB/Gent公司)中，获得AMDH基因的植物表达载体pH2-35S-PrbcS-AMDH。
本发明利用光诱导型启动子PrbcS构建AMDH基因的植物表达载体，以便在转基因植物叶片的细胞质中过量表达MDH基因，直接利用光合作用产物产生的碳骨架合成苹果酸，使之分泌到细胞外，最后通过根系进入到土壤中，熬合土壤中的铝离子，解除酸性土壤中高浓度的铝对植物的毒害，提高转基因植物耐铝毒的能力。
附图说明：
图1中间载体pUCm-AMDH的构建策略
图2中间载体pUCm-AMDH的检测
(A)：重组质粒pUCm-AMDH的PCR检测。1：DNA Marker D2000；2-4：以pUCm-AMDH为模板，用引物AMDH5和AMDH3引物扩增到的PCR产物。(B)：Nco I & Xho I双酶切检验pUCm-AMDH。1：DNA Marker 500bp；2-3：Nco I和Xho I双酶切pUCm-AMDH重组质粒；4：pUCm-AMDH重组质粒。
图3 AMDH基因的Gateway入门克隆载体pENTR*-PrbcS-AMDH的构建策略
图4入门克隆载体pENTR*-PrbcS-AMDH的检测
(A)：重组质粒pENTR*-PrbcS-AMDH的PCR检测。1：DNAMarkerIII；2，4：以pENTR*-PrbcS-AMDH质粒为模板，利用PrbcS5和AMDH3引物扩增得到的PCR产物；3，5：以pENTR*-PrbcS-AMDH质粒为模板，利用AMDH5和AMDH3引物扩增得到的PCR产物。(B)用Nco1和Xho1酶切检验pENTR*-PrbcS-AMDH。1：pENTR*-PrbcS-AMDH质粒；2-3：Nco I和Xho I双酶切pENTR*-PrbcS-AMDH重组质粒；4：DNAMarkerIII
图5用Gateway的LR反应构建AMDH基因的植物表达载体
图6 AMDH植物表达载体pH2-35S-PrbcS-AMDH的检测和农杆菌的转化
(A)重组质粒pH2-35S-PrbcS-AMDH的PCR检测。1：DNAMarkerIII；2-4：以pH2-35S-PrbcS-AMDH质粒为模板，利用attB1和AMDH3引物扩增得到的PCR产物；5：以pH2GW7质粒为模板，利用attB1和AMDH3引物扩增得到的PCR产物。(B)用Pst I酶切检验pH2-35S-PrbcS-AMDH。1：DNA MarkerIII；2：用Pst I酶切pENTR*-PrbcS-AMDH质粒；3-5：用Pst I酶切pH2-35S-PrbcS-AMDH质粒；6：用Pst I酶切pH2GW7质粒。(C)转化pH2-35S-PrbcS-AMDH质粒的农杆菌PCR检测。1：以pH2-35S-PrbcS-AMDH质粒为模板，利用attB1和AMDH3引物扩增得到的PCR产物；2-4：以农杆菌菌落为模版，利用attB1和AMDH3引物扩增得到的PCR产物；5：以pH2GW7质粒为模板，利用attB1和AMDH3引物扩增得到的PCR产物。
图7 AMDH在转基因烟草中的插入情况以及转录水平检测
(A)烟草植物基因组的PCR检测。1：DNAMarkerIII；2：负对照(未转基因的野生型烟草基因组为模版)。3-7：以转基因烟草基因组为模板，利用AMDH5和AMDH3引物扩增得到的PCR产物。8：以pH2-35S-PrbcS-AMDH质粒为模板，利用AMDH5和AMDH3引物扩增得到的PCR产物。(B)1：DNAMarkerIII；2：负对照；3-5：转基因烟草的RT-PCR产物；6：正对照(以质粒pH2-35S-PrbcS-AMDH为模板，利用AMDH5和AMDH3引物扩增得到的PCR产物)。
图8 AMDH在转基因烟草中的酶活性测定
图9 AMDH转基因烟草苹果酸分泌量的测定
(A)AMDH转基因烟草在无铝胁迫的CaCl₂溶液中苹果酸分泌量。(B)AMDH转基因烟草在AlCl₃浓度为30μmol/L的CaCl₂溶液中苹果酸分泌量。
图10 AMDH转基因烟草在铝毒胁迫下根尖的染色情况
图11 AMDH转基因烟草在铝毒胁迫下根相对生长率的测定
图12 AMDH转基因烟草在有铝毒胁迫的基质中的生长情况
具体实施方式：
试剂与仪器：
试剂主要分为分子生物学实验试剂、植物遗传转化所需的培养基以及转基因植物鉴定和检测所需的各种试剂。各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP等为宝生物工程有限公司(大连)产品，质粒提取试剂盒购自博大泰克生物技术有限公司，TRIzoL Reagent RNA提取试剂盒、pENTR^TM DirectionalCloning Kits以及Gateway LR clonase Enzyme Mix kit购自invitrogen公司。
其余试剂均为国产分析纯。
仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。
所有引物序列均在大连宝生物公司合成。本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1：
AMDH基因cDNA扩增及TA克隆：
首先从GenBank中查找AMDH的全长基因序列，并设计一对引物，序列如下：
AMDH5：5’-CACCATGGCGAAGGAACCAGTTCGTG-3’
AMDH3：5’-CTCGAGTTAAGAGAGGCATGAGTAAGCG-3’
5’端引物AMDH5末端加CACC特征序列，并由此形成NcoI酶切位点；3’端引物EMDH3末端加XhoI酶切位点。
用TRIzoL Reagent(Invitrogen)从拟南芥(Arabidopsis thaliana)幼苗中提取总RNA，取植物嫩叶约0.1g，加入1ml的TRIzoL提取液在研钵中研磨，室温静置5min后移入离心管，再加入0.2ml氯仿，振荡混匀，离心15min(12000rpm)，转移上清液至新管，加入0.5ml异丙醇，混匀室温放置10min，4℃离心10min(12000rpm)，弃上清，沉淀用75％乙醇1ml清洗，4℃离心5min(7500rpm)，弃乙醇真空干燥沉淀或自然晾干，用20μl焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水溶解RNA。使用M-MuLV ReverseTranscriptase Kit(TaKaRa)进行cDNA的合成，取植物总RNA约0.1μg-5μg，oligo(dT)50ng，10mM dNTP mix 1μl，用DEPC处理水补足至10μl，混匀后，短暂离心将之收集于管底，置于65℃加热5min，冰浴10min，加入反应混合物9μl(5×reaction buffer 4μl，25mM MgCl₂ 4μl，0.1M DTT 2μl，RNA酶抑制剂1μl)，将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25℃保温2min，加入1μl M-MuLVReverse Transcriptase，将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25℃保温20min，然后42℃保温70min，合成cDNA。以cDNA为模板，用AMDH基因上下游特异性引物AMDH5和AMDH3作PCR，扩增得到AMDH的全长cDNA 1.0kb(图1)。回收并纯化AMDH全长基因片段，并将其连接到pUCm-T(大连宝生物公司)载体上，转化大肠杆菌感受态DH5α(天根生化科技)，采用碱裂解法提取质粒DNA，经1％琼脂糖凝胶电泳，选取大小和理论值相符的重组质粒做进一步的PCR检测和双酶切检测。以重组质粒为模板，用引物AMDH5和AMDH3引物扩增到的1.0kb的PCR产物(图2A)。根据阳性重组质粒pUCm-AMDH载体两端的多克隆位点，用NcoI和XhoI双酶切重组质粒，经1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，连接成功的重组质粒pUCm-AMDH含有1.0kb左右的DNA插入片段(图2B)。
实施例2：
AMDH基因的Gateway入门克隆载体pENTR*-PrbcS-AMDH的构建：
用NcoI和XhoI切开纯化的质粒载体pENTR*-PrbcS-*T-GFP和pUCm-AMDH(图3)，通过琼脂糖凝胶电泳分离已切开的载体和插入片段，从凝胶中回收pENTR*-PrbcS-*T-GFP被切割后产生的载体片断pENTR*-PrbcS(4.0kb)及pUCm-AMDH被切割产生的AMDH基因的DNA片断(1.0kb)，然后用宝生物(TaKaRa)的连接酶试剂盒连接pENTR*-PrbcS和AMDH基因的DNA片断产生入门载体pENTR*-PrbcS-AMDH(图3)。用连接反应混合物转化高效率(10⁸)的大肠杆菌感受态细胞(DH5α，购自天根生化科技公司)，把转化好的大肠杆菌涂于加有卡那霉素(Km，50μg/ml)的平板上，于37℃过夜培养，筛选Km抗性重组子菌落，从Km抗性重组子菌落中提取质粒，选出连接成功的质粒载体pENTR*-PrbcS-AMDH，用两组引物作PCR检测。第一组用AMDH上下游的特异性引物AMDH5和AMDH 3进行PCR扩增，所选的质粒都能扩增出一条1.0kb的AMDH条带(图4A)，第二组用位于PrbcS区域中的特异性引物PrbcS5和AMDH的下游特异性引物AMDH 3进行PCR扩增，所选的质粒能扩增出一条1.1kb的条带(图4A)。用NcoI(Fermentas)和XhoI(Fermentas)双酶切检测，连接成功的质粒在琼脂糖凝胶电泳图上只产生两条带，一条为4.0kb的载体带，另一条为1.0 kb的AMDH基因片段(图4B)。确认是连接成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒pENTR*-PrbcS-AMDH。
实施例3：
AMDH基因植物表达载体pH2-35S-PrbcS-AMDH的构建：
通过Gateway技术的LR反应把PrbcS-AMDH亚克隆到植物表达载体pH2GW7(Gateway的目的载体，比利时VIB/Gent公司)中(图5)。具体的做法是：用质粒抽提试剂盒纯化Gateway的目的载体pH2GW7，在Gateway的LR反应体系中加pENTR*-PrbcS-AMDH和pH2GW7各150ng，1μl LR Clonase II Enzyme Mix(Invitrogen)，混均于25℃反应过夜，通过整合酶的作用把PrbcS-AMDH整合到pH2GW7中获得AMDH的植物表达载体质粒pH2-35S-PrbcS-AMDH(图5)。用反应混合物转化高效率(10⁸)的大肠杆菌感受态细胞(DH5α，购自天根生化科技公司)，把转化好的大肠杆菌涂于加有壮观霉素(Spe，50μg/ml)的平板上，于37℃过夜培养，筛选Spe抗性重组子菌落，从Spe抗性重组子菌落中提取质粒，选出大小和理论预测值相符的整合质粒pH2-35S-PrbcS-AMDH进行PCR检测，用位于载体pH2GW7的特异性引物attB1和AMDH的下游特异性引物AMDH 3进行PCR扩增，所选的质粒能扩增出一条2.5kb的条带(图6A)。然后进一步用酶切验证重组质粒的正确性，用AMDH基因内部的酶切位点Pst I酶切质粒pENTR*-PrbcS-AMDH和pH2-35S-PrbcS-AMDH以及pH2GW7，含有AMDH片段的可以得到0.7kb左右的片段，整合质粒pH2-35S-PrbcS-AMDH可以得到0.7kb的片段(图6B)。确认是整合成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒。pH2GW7携带的筛选标记基因为潮霉素抗性基因(Hgr)，这样可用加有潮霉素的平板筛选转基因植物。
实施例4：
用AMDH基因的植物表达载体转化农杆菌：
制备农杆菌的感受态细胞，用电脉冲法将上述构建好的植物表达载体pH2-35S-PrbcS-AMDH转入农杆菌(C58Cl(pPMP90))中，在加有壮观霉素的平板上筛选转化子。取少量质粒加入农杆菌感受态细胞中，轻轻混匀；将混合物加入到预冷的电转化杯中，轻轻敲击杯身使混和液落至杯底；将电转化杯置于电转化仪(BIO-RAD)滑槽中，用1mm的电击杯和200欧姆，2.5kV/0.2cm的参数进行电击，电击后立即取出电转化杯，迅速加入0.5mlSOC培养基，混匀，转移到1.5ml的离心管中；28℃，200rpm摇床培养3-5h；室温下，7500rpm离心1min，弃大部分上清，保留100μl将细胞悬浮；把农杆菌涂布于有壮观霉素(Spe，50μg/ml)的LB固体培养基上，28℃培养2天获得单菌落；首先用牙签挑取农杆菌菌落放入20μl ddH₂O中，98℃处理5分钟后取出10μl农杆菌裂解液作为PCR反应的模板。用位于载体pH2GW7的特异性引物attB1和AMDH的下游特异性引物AMDH 3进行PCR扩增，所选的质粒能扩增出一条2.5kb的条带(图6C)，经菌落PCR确认的转化子菌落用于转化植物。
实施例5：
用含有AMDH基因植物表达载体的农杆菌转化烟草：
挑取携带有质粒pH2-35S-PrbcS-AMDH的农杆菌单菌落接种于50ml的LB培养基中(含Spe，100μg/ml)，180rpm，28℃培养24h，待菌液OD₆₀₀至1.0左右，离心10min(3000rpm)，沉淀菌体。再用10ml左右的MS液体培养基悬浮，离心10min(3000rpm)，沉淀菌体。重复以上操作2～3次。最后加入一定体积的MS液体培养基重悬浮，使菌体的OD₆₀₀值为0.5。制备烟草(Nicotiana tabacum cv.Xanth)的无菌苗，通过农杆菌介导，用叶盘法转化烟草，然后通过组织培养获得小苗，进一步筛选获得所需的转基因植物。把无菌烟草的叶片切成小片叶盘，把天竺葵的叶柄切成小段，在制备好的农杆菌菌液中浸染15-20min，用无菌吸水纸吸干后，平铺于愈伤组织诱导培养基MS1(MS+NAA02.1μg/ml+BAP0.02μg/ml)上黑暗共培养2天，将外植体转移至含潮霉素(25μg/ml)的芽诱导培养基MS4(MS+NAA0.53μg/ml+BAP0.5μg/ml)上进行芽的诱导，约15天继代一次。待有芽生成后，转入含潮霉素(25ug/ml)的MS培养基上进行根的诱导。
实施例6：
AMDH基因在转基因烟草中的插入情况及转录水平检测：
为了确认通过潮霉素筛选的转基因烟草株系确实含有导入的目的基因的DNA片段，用PCR方法对筛选到的转基因烟草作进一步的鉴定。首先采用CTAB法提取植物基因组：称取植物叶片100mg左右置于1.5ml离心管中，加液氮用特制研棒研磨至粉末状；加入900μl预热到65℃的2×CTAB缓冲液(Tris-HCl pH7.5 100mM，EDTA20mM，NaCl 1.4M，CTAB 2％)，65℃度水浴加热20分钟后取出冷却；加入500μl氯仿-异戊醇混合液(24∶1)摇匀，4℃离心10min(7500rpm)后转移上清至1.5mlEP管；再次加入500μl氯仿-异戊醇混合液(24∶1)摇匀，4℃离心10min(7500rpm)；取出上清置于新的EP管中，加入1/10体积3M pH5.2醋酸钠和等体积异丙醇，摇匀后4℃离心20min(12000rpm)；弃上清，用75％乙醇清洗两次后，干燥，用含RNase的TE缓冲液溶解并降解RNA，获得的基因组DNA样品。以植物基因组DNA为模板，用AMDH基因的上下游引物AMDH5和AMDH3作PCR检测，PCR产物的理论长度1.0kb，成功转入目的基因的植株均能扩增出1.0kb的条带(图7A)，经PCR确认的转基因植株用于RT-PCR分析。
为了考察目的基因在转基因烟草株系中的转录情况，从转基因植物中抽取总RNA，反转绿成cDNA后用于RT-PCR分析，检测AMDH基因在转基因植物中的转录水平。采用TRIzoL Reagent(Invitrogen)提取RNA，取植物嫩叶约0.1g，加入1ml的TRIzoL提取液在研钵中研磨，室温静置5min后移入离心管，再加入0.2ml氯仿，振荡混匀，离心15min(12000rpm)，转移上清液至新管，加入0.5ml异丙醇，混匀室温放置10min，4℃离心10min(12000rpm)，弃上清，沉淀用75％乙醇1ml清洗，4℃离心5min(7500rpm)，弃乙醇真空干燥沉淀或自然晾干，用20μl焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水溶解RNA。所获得的RNA样品用凝胶电泳检测质量和浓度。使用Reverse Transcriptase进行cDNA的合成，取植物总RNA约0.1μg-5μg，oligo(dT)50ng，10mM dNTP mix 1μl，用DEPC处理水补足至10μl，混匀后，短暂离心将之收集于管底，置于65℃加热5min，冰浴10min，加入反应混合物9μl(5×reactionbuffer 4μl，25mM MgCl₂ 4μl，0.1M DTT 2μl，RNA酶抑制剂1μl)，将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25℃保温2min，加入1μl M-MuLV ReverseTranscriptase，将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25℃保温20min，然后42℃保温70min，合成cDNA。以cDNA为模板，用AMDH基因的上下游引物AMDH5和AMDH3作RT-PCR分析，考察转基因烟草中是否有目的基因的转录物。结果证明大部分转基因烟草植株均有目的基因的转录物，而野生型的烟草则没有(图7B)。
实施例7：
转基因烟草苹果酸脱氢酶(MDH)的活性分析：
选取经RT-PCR分析表明有目的基因的转录物的转基因烟草植株测定柠檬酸合成酶的活性。从烟草叶片中抽提可溶性蛋白，取0.2g烟草叶片，加1ml蛋白抽提液[100mM Tris-HCl(pH7.5)；10％(V/V)甘油；10mM巯基乙醇；1mM PMSF；5％(W/V)PVP]研磨，转移至EP管中，13000r/min离心25min(4℃)。将上清移到新的EP管中，用Bradford方法测定植物上清中的蛋白质浓度。苹果酸脱氢酶活性测定按Tesfaye等(Tesfaye，M.，Temple，S.J.，Allan，D.L.，et al.2001，Overexpression of MalateDehydrogenase in Transgenic Alfalfa Enhances Organic Acid Synthesis andConfers Tolerance to Aluminum Plant Physiol.127：1836-1844)的方法进行，其原理为：草酰乙酸与NADH在苹果酸脱氢酶的作用下能够生成L-苹果酸和NAD。在该反应中，通过测定波长为340nm下NADH的减少量从而获得MDH的相对酶活性。
测定MDH酶活性的反应体系为：0.05M Tris-HCl(pH8.0)，4mM草酰乙酸，0.1mM NADH。加入蛋白样品之前，用紫外分光光度仪测定反应溶液在波长340nm处的吸收值(0D值)，然后在反应体系中加入100μg烟草蛋白样品，再次检测340nm处的OD值。计算两次读数的差值得到MDH酶活性数据。
共挑选了三个转基因株系测定其MDH酶活性，结果表明转基因烟草MDH酶活性为野生型烟草的1.4倍左右(图8)，可见AMDH在转基因烟草植株中的表达大大提高了MDH活性。
实施例8：
转基因烟草植株根分泌的苹果酸含量测定：
苹果酸含量采用酶动力学-紫外分光光度法测定(文献)。首先，将0.35mL样品与0.45mL缓冲液Tris-HCl(pH9.0)以及30μL氧化型辅酶I(NAD)溶液(30mg/mL)混合，并读取波长为340nm处的OD值(A1)。接着加入2μL苹果酸脱氢酶悬浮液(16.5U/uL)于上述反应溶液中并混合均匀。15分钟后，读取340nm处的OD值A2。同时测定苹果酸标准样品的OD值A1′、A2′。根据供试样品和苹果酸标准溶液吸光度的增加值(A2-A1)以及(A2′-A1′)，计算供试样品中苹果酸的含量。
将大小均匀一致的转基因幼苗以及野生型烟草幼苗，分别置于AlCl₃浓度为0和30μmol/L的CaCl₂溶液中，16小时后收集CaCl₂溶液并浓缩根分泌的苹果酸。分析结果表明，在有无铝胁迫的情况下，AMDH转基因烟草都具有较高的苹果酸分泌量(图9)。
实施例9：
转基因烟草对铝毒的抗性检测：
植物对铝毒的耐受性一般采用根尖染色情况来衡量。根尖染色的染料有苏木精(hematoxylin)和铬天青(eriochrome cyanine S)，两者均适于鉴定植物对铝的敏感性或忍耐性。其原理是染料能通过死亡的细胞膜进入细胞内部，并与残留于死亡细胞核中的铝结合产生蓝色(苏木精)或红色(铬天青S)物质，这一反应对铝具有高度的专一性(Cancado GMA，Loguercio LL，Martins PR.1999.Hematoxylinstaining as a phenotypic indes for aluminum tolerance selection in tropicalmaize(Zea mays L.).Theor Appl Genet.99：747-754；Ma JF，Zhen SJ，Li XF.1997.A rapid hydroponic screening for aluminum tolerance in barley.Plantsoil.191：133-137)，而且根尖染色程度与铝对植物的毒害程度呈正相关。
将大小均匀一致且生根良好的转基因烟草以及野生型烟草幼苗，置于AlCl₃浓度分别为25μmol/L的CaCl₂溶液(pH值4.3)中处理16h，再经过0.1％的铬天青S染色液染色15min。用蒸馏水冲洗后，在显微镜下观察并记录根尖染色情况。结果表明野生型烟草的根尖均被染成紫色，出现铝离子中毒现象，而AMDH转基因株系AMDH8、AMDH11、AMDH13的根尖不着色或只有很浅的着色(图10)。这些结果初步证明在转基因烟草中过量表达AMDH能增强转基因植物对铝毒的耐受性。
实施例10：
转基因烟草植株在铝毒胁迫下根伸长速率的测定：
根相对伸长率为Al³⁺处理与对照无Al³⁺处理的根系伸长量百分比。根的相对伸长率是衡量植物耐Al性强弱的重要指标，因此我们还测定在铝毒胁迫下转基因烟草植株根相对生长率。将大小均匀一致的转基因烟草和野生型烟草幼苗，分别置于AlCl₃浓度为25μmol/L的CaCl₂溶液中。处理16小时之后，测量供试植株根的生长量，重复三次，实验结果如图11所示。从实验结果可以看出，野生型烟草在25μmol/L的铝胁迫下根相对生长率只有50％，然而AMDH转基因烟草的根相对生长率却基本不受影响，仍然保持在100％左右。进一步证明在转基因烟草中过量表达AMDH能增强转基因植物对铝毒的耐受性。
实施例11：
转基因烟草植株在铝毒胁迫下的生长情况分析：
将大小均匀一致且生根良好的转基因烟草幼苗以及野生型烟草幼苗移载到新的珍珠岩基质中，在温室内进行盆栽试验，每星期浇灌含有0.5mM AlCl₃的Blaydes培养基营养液两次，六周后观察其生长状况。AMDH转基因植株生长良好，并且已经出现花蕾。然而野生型烟草植株生长明显受阻，不仅植株矮小，而且发育迟缓，没有现蕾(图12)。对烟草株高的测量结果说明在铝毒胁迫的基质中AMDH转基因烟草的株高是野生型烟草的1.2～1.5倍。可见AMDH转基因烟草植株可以有效地增强植物对铝的耐受性。
AMDH5：5’-CACCATGGCGAAGGAACCAGTTCGTG-3’
AMDH3：5’-CTCGAGTTAAGAGAGGCATGAGTAAGCG-3’