一种马尾松PINUSMASSONIANA组织培养及再生植株瓶内菌根化方法.pdf

本发明公开了一种马尾松(Pinus massoniana)组织培养及再生植株瓶内菌根化方法，属于生物技术和现代林业技术领域。该方法以马尾松无菌苗顶芽为外植体，首先诱导产生大量生长健壮的丛生芽，进而诱导不定根发生，不定根诱导完成后，在无菌条件下，将具有肉眼可见不定根的植株转移至珍珠岩基质上，同时接种外生菌根真菌彩色豆马勃(Pisolithustinctorius)，于瓶内实现菌根化。菌根化改善了马尾松组培再生植株不定根根系的质量，使平均侧根数、平均根长大大提高。菌根化还使不定根的形态发生了很大变化，在不定根表面形成了由十多层菌丝紧密排列的菌套。通过本方法，马尾松丛生芽诱导率达95％，增殖率达430％，生根率达85％，移栽成活率由65％提高到85％以上。

1、  一种马尾松组织培养及再生植株瓶内菌根化方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
(1)将马尾松无菌苗顶芽(去除顶尖生长点，保留子叶及5mm下胚轴)接种于含有6-苄基嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)和蔗糖的基本培养基GD上，诱导丛生芽；
(2)将已产生丛生芽的无菌苗顶芽转接于含有活性炭(AC)和蔗糖的1/2GD培养基中，促进丛生芽伸长；
(3)单个切下高1.0～1.5cm的嫩芽，接种到含NAA、吲哚丁酸(IBA)和蔗糖的1/4GD或1/2SH培养基中诱导不定根；
(4)将具有肉眼可见不定根的植株转移至无激素的基质中，同时接种事先已培养好的菌根真菌；
(5)将组培再生植株移栽至河沙、珍珠岩与有机土混合基质中，喷水保湿。

2、  根据权利要求1所述的马尾松组织培养及组培再生植株瓶内菌根化方法，其特征在于在步骤(1)所述诱导丛生芽的培养基中6-BA浓度为3～4mg/L，NAA浓度为0.1～0.3mg/L，蔗糖浓度为3％。

3、  根据权利要求1所述的马尾松组织培养及组培再生植株瓶内菌根化方法，其特征在于在步骤(2)所述促进丛生芽伸长的培养基中AC浓度为0.5～1.0g/L，蔗糖浓度为2％。

4、  根据权利要求1所述的马尾松组织培养及组培再生植株瓶内菌根化方法，其特征在于在步骤(3)所述诱导不定根的培养基中NAA浓度为0.1～0.2mg/L，IBA浓度为0.5～1.5mg/L，蔗糖浓度为1％。

5、  根据权利要求1所述的马尾松组织培养及组培再生植株瓶内菌根化方法，其特征在于在步骤(4)中当将具有肉眼可见不定根的植株转移至无激素的基质时，所用的基质为珍珠岩，其中添加含0.5％蔗糖的1/4GD或1/2SH液体培养基。

6、  根据权利要求1所述的马尾松组织培养及组培再生植株瓶内菌根化方法，其特征在于在步骤(4)中菌根真菌接种时所用的真菌为彩色豆马勃，于不定根诱导1周后培养于培养皿中，接种时挑取0.5～0.8cm²大小的菌块，每瓶接种3-4块。

7、  根据权利要求1所述的马尾松组织培养及组培再生植株瓶内菌根化方法，其特征在于在步骤(4)中再生植株的移栽时间为与菌根真菌共培养8-10周后，培养架需用薄膜覆盖，每日喷水2次。

一种马尾松(Pinus massoniana)组织培养及再生植株瓶内菌根化方法
一、技术领域
本发明专利涉及一种马尾松组织培养及无菌条件下组培再生植株菌根合成的方法，属于生物技术和现代林业技术领域。
二、背景技术
马尾松(Pinus massoniana Lamb.)是我国重要的用材树种和产脂树种，也是荒山造林的先锋树种，在全国16个省(自治区、直辖市)都有分布，其人工林面积约占全国人工林面积的18％，在我国林业生产中有着非常重要的地位。马尾松主要靠种子繁殖，因种子园种子产量低且大小年明显，使得马尾松良种供应不足，且不同地理种源在生长上存在较大的差异。其无性繁殖较为困难，扦插成活率低，嫁接易发生砧穗不亲和导致嫁接株死亡的现象，对马尾松的良种繁育造成很大障碍。采用组织培养可望为扩大繁殖马尾松优良品种提供新的途径。
目前，松属树种组织培养再生植株的途径主要有器官发生和体细胞胚胎发生两种。吴若菁(1993)曾对马尾松离体胚进行培养，获得了丛生芽。成小飞等(1995)、张宇等(2006)采用马尾松成熟胚为外植体初步建立了器官发生植株再生体系，但不定芽生长缓慢，生根率、移栽成活率较低。黄健秋等(1995)初步建立了马尾松体细胞胚胎发生植株再生体系，体细胞胚转化为小植株的频率7.4％。
松树是典型的外生菌根型树种，缺少菌根就不能成活或生长很差。而植物组培快繁技术整个繁育过程均在全封闭的无菌条件下进行，组培再生植株缺乏菌根真菌，其根系发育、生长状况往往较差，抵抗力较弱，当组培再生植株从优越的无菌条件移栽至多菌的室外环境时成活率较低。若将菌根真菌引入组培繁育过程，让组培再生植株与菌根菌在瓶内相结合，直接形成菌根化的组培再生植株，将有助于解决上述技术难题。成小飞、郑来友等曾对马尾松组培再生植株菌根合成进行过初步研究(成小飞等，1995；郑来友等，2003)，但其采用的基质为琼脂培养基，菌丝大多停留于培养基表面而难以与不定根接触，菌根化率较低。
综上所述，虽然我国对马尾松组织培养及瓶内菌根合成有所研究，但目前缺乏一个高效的植株再生体系及瓶内菌根化技术，限制了该技术的进一步应用。
三、发明内容
本发明针对上述马尾松组织培养中存在的不足，研究发明一种能够快速生产马尾松组培再生植株的方法，在此基础上，于无菌条件下对组培再生植株进行菌根真菌接种，目的在于提供一种马尾松组织培养及组培再生植株瓶内菌根化方法。
本方法采用的技术方案是：一种马尾松组织培养及再生植株瓶内菌根化的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
1.将马尾松无菌苗顶芽(去除顶尖生长点，保留子叶及5mm下胚轴)接种于含有6-苄基嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)和蔗糖的基本培养基GD(Gresshoff and Doymedium，1972)上，诱导丛生芽；
2.将已产生丛生芽的无菌苗顶芽转接于含有活性炭(AC)和蔗糖的1/2GD培养基中，促进丛生芽伸长；
3.单个切下高1.0～1.5cm的嫩芽，接种到含萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)和蔗糖的1/4GD或1/2 SH(Schenk and Hidebebrandt，1972)培养基中，诱导不定根。
4.将具有肉眼可见不定根的植株转移至无激素的基质中，同时接入事先已培养好的菌根真菌。
5.将组培再生植株移栽至河沙、珍珠岩与有机土混合基质中，喷水保湿。
其中，步骤1所述诱导丛生芽的培养基中6-BA的浓度为3～4mg/L，NAA的浓度为0.1～0.3mg/L，蔗糖的浓度为3％。
步骤2所述促进丛生芽伸长的培养基中AC的浓度为0.5～1.0g/L，蔗糖浓度为2％。
步骤3所述诱导不定根的培养基中NAA的浓度为0.1～0.2mg/L，IBA的浓度为0.5～1.5mg/L，蔗糖的浓度为1％。
步骤4中当将具有肉眼可见不定根的植株转移至无激素的基质中时，所用基质为珍珠岩，其中添加了含0.5％蔗糖的1/4 GD或1/2 SH液体培养基；接种所用的菌根真菌为南京林业大学森林病理实验室保存的彩色豆马勃(Pisolithus tinctorius)，在不定根诱导1周后培养于培养皿中；接种时挑取0.5～0.8cm²大小的菌块，放入组培瓶中，每瓶3-4块。
步骤5中组培再生植株的移栽时间为与菌根真菌共培养8-10周后，培养架需用薄膜覆盖，每日喷水2次。
本发明与现有技术相比，其显著优点是：与选用成熟胚为外植体培养再生植株相比，本发明丛生芽诱导率高，且生长快、植株健壮；与在琼脂培养基上进行菌根真菌接种相比，本发明采用疏松透气的珍珠岩为基质，有利于真菌菌丝在其中伸展，提高了真菌菌丝与不定根接触的机率，从而提高了菌根化率。菌根化改善了松树组培再生植株不定根根系的质量，使平均侧根数、平均根长大大提高；菌根化还使不定根外观形态发生了很大变化，形成许多典型的二叉分枝状短根；石蜡切片观察表明，不定根表面形成了由十多层菌丝紧密排列的菌套。通过本方法，马尾松丛生芽诱导率达95％，增殖率达430％，生根率达85％，移栽成活率由65％提高到85％以上。
四、附图说明
图1在充满菌丝的珍珠岩基质上生长的马尾松再生植株
图2被充满菌丝的珍珠岩基质所包裹的不定根根系
图3菌根化的马尾松再生植株不定根外观形态
五、具体实施方式
下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
取马尾松成熟种子，用洗洁精洗净，流水冲洗1h，在无菌条件下剥除种壳，经70％乙醇表面消毒30～35s后置于0.1％升汞中浸泡3～4min，用无菌水冲洗3～5次后，移入琼脂培养基上萌发成无菌苗。取萌发3周的无菌苗顶芽，去除顶尖生长点，保留子叶及5mm下胚轴，接种于GD+6-BA3mg/L(可至4mg/L)+NAA0.1mg/L(可至0.3mg/L)+蔗糖3％培养基中诱导丛生芽。培养4周后，将已产生丛生芽的无菌苗顶芽转入1/2GD+AC0.5g/L(可至1.0g/L)+蔗糖2％培养基中，培养4周至芽长1.0～1.5cm。单个切下长1.0～1.5cm的嫩芽，接种到1/4GD+NAA0.1mg/L(可至0.2mg/L)+IBA 0.5mg/L(可至1.5mg/L)+蔗糖1％培养基中诱导不定根。以上培养条件为：温度24～26℃，光照2000Lux，每日光照16h。
不定根诱导1周后，将菌根真菌彩色豆马勃接种于倒有20ml综合马铃薯汁培养基的培养皿中，置于培养箱中暗培养，培养温度为28～30℃。
不定根诱导4周后，挑选具有肉眼可见不定根的植株，转移至添加了1/4GD(含蔗糖0.5％)液体培养基的珍珠岩基质中，同时挑取0.5～0.8cm²大小的菌块，放入组培瓶中，每瓶接种3-4块，于温度24～26℃、光照2000Lux、每日光照16h的条件下继续培育。组培再生植株与菌根真菌共培养8-10周后将其从瓶中取出，直接移栽于河沙、珍珠岩与有机土混合基质中，并移至有薄膜覆盖的培养架上，每日喷水2次，促进小苗生长。
实施例2
按所述相同步骤重复进行实施例1，但是将不定根诱导培养基更换为1/2SH+NAA0.2mg/L+IBA1.0mg/L+蔗糖1％、添加至珍珠岩基质中的液体培养基更换为1/2 SH(含蔗糖0.5％)，可取得与实施例1相当的效果。