一种制备枯草芽孢杆菌的方法 【技术领域】
本发明涉及一种制备枯草芽孢杆菌的方法。
背景技术
世界范围每年全世界要生产农药200多万吨，其主要是化学农药，长期使用化学农药，病原物和害虫易产生抗药性，有些化学农药已被证实有致癌、致畸、致突变的问题，同时，化学农药残留也制约着农产品的质量。
近年来，生物农药迅速崛起。生物农药是指以细菌、真菌、病毒、线虫以及由它们产生的代谢物(农用抗生素)为有效成分的农药，生物农药起源于1960年代，其开发在1970年代曾掀起过高潮，但由于当时生物技术、手段、水平相对较低，生物农药本身对工艺、贮藏、运输要求又高，及随后拟除虫菊酯的崛起造成生物农药的开发步入低潮。近年来，随着人类对生存环境质量的要求越来越高，无公害、无污染、无残留、成本低、且不易产生抗性的生物农药又重新受到关注。生物技术尤其是微生物技术的进步更为这类农药的开发提供了便利。目前生物农药销售额达$3亿，约占整个农药市场的1％，且年产值每年上升10％～20％。
其中，微生物农药是公认的“无公害农药”，防治对象不易产生抗药性、不伤害天敌，繁殖快，是综合防治农林病虫害的主要手段。随着全球化学农药公害问题日趋严重，近年来的微生物农药研究备受重视。对枯草芽孢杆菌的研究应用也成热点。
枯草芽孢杆菌，英文名(Bacillus subtilis)，是芽孢杆菌属的一种。因广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。它通过营养竞争进行生长繁殖从而占据生存空间的方式来阻止植物病原菌的生长，能在植物表面迅速形成一层高密保护膜，使病原菌得不到生存空间，从而保护作物免受病原菌危害；枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，抑制病菌孢子萌发和菌丝生长，从而达到预防与治疗的目的。可用于果蔬病害、白粉病、灰霉病、水稻稻瘟病、香蕉叶斑病、橡胶树白粉病和炭疽病等多种作物种传和土传病害。因该制剂防病机理独特，以菌治菌，所以可用于多种作物病害的防治，均收到优异的效果。
目前，市场上常见的是枯草芽孢杆菌可湿性粉剂，多用常规发酵方法如液体深度发酵制备，即只采用液体培养基对微生物进行培养繁殖，之后经过过滤、干燥等工艺得到枯草芽孢杆菌母粉，其含枯草芽孢杆菌孢子数大多为200亿个活芽孢/克，用于防治农作物病虫害用量大，成本高。
【发明内容】
本发明针对现有技术制备的枯草芽孢杆菌可湿性粉剂中孢子数太少的缺陷，提出一种新的制备枯草芽孢杆菌的方法。该方法制备的枯草芽孢杆菌孢子数可达1×1011个活芽孢/克以上。
为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种制备枯草芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：
步骤1：将第一液体培养基调pH值为6.5～7.5，高温灭菌后冷却至室温，接种活化的枯草芽孢杆菌菌种，培养20～40小时，得液体菌种备用；
步骤2：将第二液体培养基高温灭菌后冷却至室温，按培养基体积的3％接种步骤1所得液体菌种，搅拌并通气，在无菌状态培养24～35小时，得种子液备用；
步骤3：将麸皮60％-70％、稻草粉20％-30％、玉米粉10％-20％混合均匀配制成固体培养基，经高温灭菌后，降温至室温，在无菌状态接种步骤2所得种子液并进行培养；
步骤4：将步骤3的培养基在无菌状态进行固体发酵培养72～90小时，干燥后，即得到本发明所述高浓度枯草芽孢杆菌。
步骤1所述第一液体培养基优选为马铃薯蔗糖培养基或牛肉汁蛋白胨培养基，步骤1中最佳培养温度为28～30℃。
步骤2所述通气的通气量优选为1∶1。
步骤2所述第二液体培养基为培养细菌的常规培养基，如玉米粉大豆粉培养基或玉米粉大豆粉葡萄糖培养基，所述玉米粉大豆粉培养基中玉米粉与大豆粉重量比1∶2-3，所述玉米粉大豆粉葡萄糖培养基中玉米粉∶大豆粉∶葡萄糖的重量比为1∶2∶1。
步骤2中接种浓度优选为0.6×109个芽孢/毫升。
步骤2中最佳培养pH值为7.5～8.5。
步骤3的接种量优选为培养基重量的3％～10％。
步骤4所述干燥优选在室温或低温进行。
步骤1得到的液体菌种中活芽孢浓度约为1.0×109个活芽孢/毫升。
本发明所述方法采用液固两相联合发酵工艺，即在液体中培养种子液，达到适宜浓度后再接种到固体培养基上，无需过滤步骤，接种过程在发酵罐内完成，不接触外界环境，不易污染，得到的母粉易于加工和保存，制备的枯草芽孢杆菌含量约1×1011个活芽孢/克。
与现有技术相比，本发明还具有以下特点：
1.生产工艺简单，无三废。
2.装置投资少，生产成本低，仅为液体深度发酵的三分之一。
3.生产过程节能，无脱水、喷雾、干燥过程，能量消耗低。
4.发酵过程中所产生的抗菌物仍保留在粉体中，有助于枯草芽孢杆菌防治虫害。
【具体实施方式】
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
实施例1：
菌种培养：按配方配制马铃薯蔗糖液体培养基，调整pH值为7.5，分装入6个500mL三角瓶中，每瓶100mL，121℃灭菌30分钟，冷却至室温。取枯草芽孢杆菌菌种，用接种环自斜面试管培养基菌种中，挑取一环，接种到三角瓶中，置200转/分摇床上，28℃培养40小时，显微镜镜检，菌种生长旺盛，无杂菌形态，浓度为1×109个活芽孢/毫升，备用。
种子罐培养：种子罐容积为200升，按玉米粉∶大豆粉∶水的重量比为1∶2∶150配制玉米粉大豆粉培养基120升，调整pH值为7.5，120～130℃蒸汽灭菌30分钟，冷却至室温，经镜检正常后，在火焰保护接种1.2升液体菌种，接种浓度为0.6×109个芽孢/毫升，在28℃培养24小时，进气量为1∶1，取样，镜检菌体生长情况，菌体生长旺盛，无杂菌，浓度为活芽孢约1×1010个/毫升，待用。
固体高温灭菌接种罐接种：罐容积为2000升，按配方：麸皮63％，稻草粉23％，玉米粉14％配制培养基。将上述固体培养基装罐，装料系数为60％，开启搅拌，通过螺旋桨叶的轴向混合，使固体培养基混合均匀，通蒸汽灭菌，温度125℃，保温30分钟，降温至35℃。将种子罐种子悬浮液按接种量要求放入接种罐中，开启搅拌，使液体种子液和固体培养基充分混合润湿，完成接种。
固体发酵培养：将接种好的固体培养基放入专用托盘中，移至固体培养室(经过化学灭菌或紫外灭菌)，调整培养室的温度为35℃，并开启排风设备，培养三天。即得到高浓度的枯草芽孢杆菌，测定芽孢数在1.2×1011个活芽孢/克。
实施例2：
菌种培养：按配方配制牛肉汁蛋白胨培养基，调整pH值为7.0，分装入6个500mL三角瓶中，每瓶100mL，125℃灭菌30分钟，冷却至室温。取BS-0898菌种，用接种环自斜面试管培养基菌种中，挑取一环，接种到三角瓶中，置200转/分摇床上，28℃培养20小时，显微镜镜检，菌种生长旺盛，无杂菌形态，备用。
种子罐培养：容积为200升，按玉米粉∶大豆粉∶水重量比1∶3∶200配制玉米粉大豆粉培养基120升，调整pH值为8.5，120～130℃蒸汽灭菌30分钟，冷却至室温，经镜检正常后，在火焰保护接种1.2升液体菌种，接种浓度为0.6×109个芽孢/毫升，在30℃培养30小时，进气量为1∶1，取样，镜检菌体生长情况，菌体生长旺盛，无杂菌，待用。
固体高温灭菌接种罐接种：罐容积为2000升，按配方麸皮60％，稻草粉20％，玉米粉20％配制固体培养基。将上述固体培养基装罐装料数60％，开启搅拌，通过螺旋桨叶的轴向混合，使固体培养基混合均匀，通蒸汽灭菌，温度125℃，保温30分钟，降温至35℃。将种子罐种子悬浮液按接种量要求放入接种罐中，开启搅拌，使液体种子液和固体培养基充分混合润湿，完成接种。
固体发酵培养：将结种子的固体培养基放入专用托盘中，移至固体培养室(经过化学灭菌或紫外灭菌)，调整培养室的温度为35℃，并开启排风设备，培养78小时。干燥，粉碎固体发酵的粉体，即得到高浓度的枯草芽孢杆菌，测定芽孢数在1.1×1011个活芽孢/克。
实施例3：
菌种培养：按配方配制液体牛肉汁蛋白胨培养基，调整pH值为6.5，分装入6个500mL三角瓶中，每瓶100mL，121℃灭菌30分钟，冷却至室温。取枯草芽孢杆菌菌种，用接种环自斜面试管培养基菌种中，挑取一环，接种到三角瓶中，置200转/分摇床上，30℃培养40小时，显微镜镜检，菌种生长旺盛，无杂菌形态，备用。
种子罐培养：种子罐容积为200升，按重量比玉米粉∶大豆粉∶葡萄糖∶水为1∶2∶1∶200配制玉米粉大豆粉葡萄糖培养基120升，调整pH值为7.8，120～130℃蒸汽灭菌30分钟，冷却至室温，经镜检正常后，在火焰保护接种1.2升液体菌种，接种浓度为0.6×109个芽孢/毫升，在28℃培养26小时，进气量为1∶1，取样，镜检菌体生长情况，菌体生长旺盛，无杂菌，待用。
固体高温灭菌接种罐接种：罐容积为2000升，按配方：麸皮60％，稻草粉25％，玉米粉15％配制培养基。将上述固体培养基装罐，装料系数为60％，开启搅拌，通过螺旋桨叶的轴向混合，使固体培养基混合均匀，通蒸汽灭菌，温度125℃，保温30分钟，降温至35℃。将种子罐种子悬浮液按接种量要求放入接种罐中，开启搅拌，使液体种子液和固体培养基充分混合润湿，完成接种。
固体发酵培养：将接种好的固体培养基放入专用托盘中，移至固体培养室(经过化学灭菌或紫外灭菌)，调整培养室的温度为35℃，并开启排风设备，培养80小时。即得到高浓度的枯草芽孢杆菌，测定芽孢数在1.2×1011个活芽孢/克。
实施例4：
菌种培养：按配方配制马铃薯蔗糖琼脂培养基，调整pH值为6.8，分装入6个500mL三角瓶中，每瓶100mL，121℃灭菌35分钟，冷却至室温。取BS-0898菌种，用接种环自斜面试管培养基菌种中，挑取一环，接种到三角瓶中，置200转/分摇床上，30℃培养20小时，显微镜镜检，菌种生长旺盛，无杂菌形态，备用。
种子罐培养：容积为200升，按玉米粉∶大豆粉∶葡萄糖∶水的重量比为1∶2∶1∶200配制玉米粉大豆粉葡萄糖培养基120升，调整pH值为7.5，120～130℃蒸汽灭菌30分钟，冷却至室温，经镜检正常后，在火焰保护接种1.2升液体菌种，接种浓度须为0.6×109个芽孢/毫升，在30℃培养35小时，进气量为1∶1，取样，镜检菌体生长情况，菌体生长旺盛，无杂菌，待用。
固体高温灭菌接种罐接种：罐容积为2000升，按配方麸皮65％，稻草粉25％，玉米粉10％配制固体培养基。将上述固体培养基装罐装料数60％，开启搅拌，通过螺旋桨叶地轴向混合，使固体培养基混合均匀，通蒸汽灭菌，温度125℃，保温30分钟，降温至35℃。将种子罐种子悬浮液按接种量要求放入接种罐中，开启搅拌，使液体种子液和固体培养基充分混合润湿，完成接种。
固体发酵培养：将结种子的固体培养基放入专用托盘中，移至固体培养室(经过化学灭菌或紫外灭菌)，调整培养室的温度为35℃，并开启排风设备，培养90小时。干燥，粉碎固体发酵的粉体，即得到高浓度的枯草芽孢杆菌，测定芽孢数在1.3×1011个活芽孢/克。
实施例5：
菌种培养：按配方配制马铃薯蔗糖琼脂培养基，调整pH值为7.2，分装入6个500mL三角瓶中，每瓶100mL，130℃灭菌40分钟，冷却至室温。取BS-0898菌种，用接种环自斜面试管培养基菌种中，挑取一环，接种到三角瓶中，置200转/分摇床上，29℃培养20小时，显微镜镜检，菌种生长旺盛，无杂菌形态，备用。
种子罐培养：容积为200升，按玉米粉∶大豆粉∶水的重量比1∶2.5∶175配制玉米粉大豆粉培养基120升，调整pH值为7.5，120～130℃蒸汽灭菌30分钟，冷却至室温，经镜检正常后，在火焰保护接种1.2升液体菌种，接种浓度须为0.6×109个芽孢/毫升，在30℃培养32小时，进气量为1∶1，取样，镜检菌体生长情况，菌体生长旺盛，无杂菌，待用。
固体高温灭菌接种罐接种：罐容积为2000升，按配方麸皮70％，稻草粉20％，玉米粉10％配制固体培养基。将上述固体培养基装罐装料数60％，开启搅拌，通过螺旋桨叶的轴向混合，使固体培养基混合均匀，通蒸汽灭菌，温度125℃，保温30分钟，降温至35℃。将种子罐种子悬浮液按接种量要求放入接种罐中，开启搅拌，使液体种子液和固体培养基充分混合润湿，完成接种。
固体发酵培养：将结种子的固体培养基放入专用托盘中，移至固体培养室(经过化学灭菌或紫外灭菌)，调整培养室的温度为35℃，并开启排风设备，培养三天。干燥，粉碎固体发酵的粉体，即得到高浓度的枯草芽孢杆菌，测定芽孢数在1.2×1011个活芽孢/克。
实施例6：本发明所述方法制备的枯草芽孢杆菌的检测
检测方法为常规的微生物定量测定方法，详述如下：
(1)鉴别试验
将制备的枯草芽孢杆菌在32℃培养24h后，菌落直径1-2mm，菌落为乳白色或微黄色，粘稠，圆形，不透明，表面粗糙，有褶皱，无光泽，边缘不整齐，中央颜色深于边缘部分。挑去单菌落进行革兰氏染色后镜检，菌株为革兰氏阳性，有鞭毛，有芽孢，芽孢呈椭圆或柱状，多为两端均匀染色，具备典型的枯草芽孢杆菌菌落特征，则证实为枯草芽孢杆菌活芽孢。
(2)定量测定试验
方法提要：利用稀释平板法，将稀释后芽孢悬浮液定量接种于培养基中，待枯草芽孢杆菌在培养基内长出菌落，计数菌落数，以测定样品的单位重量芽孢数。
试剂和溶液：
1)牛肉膏；
2)蛋白胨；
3)琼脂，生化试剂；
4)氯化钠，分析纯；
5)蒸馏水。
仪器
1)培养皿：直径90mm，高16mm～17mm，底部应完全平底的双碟；
2)量筒：100mL；
3)玻璃试管：18mm×180mm；
4)移液管：1mL；
5)三角瓶：200mL；
6)玻璃珠：5号；
7)超声波振荡器；
8)恒温水浴锅；
9)恒温箱；
10)灭菌锅。
培养基及制备方法：
细菌培养基(LB)：称取胰蛋白胨10g，酵母膏5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL。混合除琼脂外的上述其他成份，调节pH值比最终的pH值高0.2～0.4，加入琼脂，调节pH值，灭菌后pH值为7.4～7.5，在115℃～121℃灭菌30min。枯草芽孢杆菌悬液的制备：
精确称取样品1g(精确至0.0002g)，按无菌操作法放入装有25粒5号玻璃珠的三角烧瓶(250mL)中，量取无菌蒸馏水100mL加入三角烧瓶(250mL)，塞上棉花塞，于超声波振荡器振荡20min后静止片刻，即为10-2芽孢悬浮液(第一次稀释)，吸取上述10-2芽孢悬浮液1.0mL，注入第2个带同样玻璃珠的三角烧瓶(250mL)中，加99mL无菌蒸馏水，塞上棉花塞，同上振荡20min，即10-4芽孢悬浮液(第二次稀释)；依此稀释至10-9芽孢悬浮液。另外从10-9芽孢悬浮液中吸取1.0mL注入18mm×180mm的试管，加9.0mL的无菌蒸馏水，摇匀，10-9和10-10两种芽孢悬浮液平衡比较用。
测定步骤：
将加热融化并冷却至50℃左右的培养基，放在水浴锅内52℃保温待用，将10-9和10-10两种芽孢悬浮液，按无菌操作各吸取1.0mL注入灭菌过的培养皿，每种浓度重复5个培养皿。分别注入融化的培养基20mL，当培养基倒入含有菌液的培养皿后，立即迅速旋转，使充分混合摊布均匀，放置30min，制成平板，倒置于32℃恒温培养箱内培养3d，待长出菌落时，取出平板，进行鉴别试验及结果计算。
菌落计数及结果计算：
对平板上的枯草芽孢杆菌菌落数进行计数，将计数平均结果按下列公式计算。
供检样品的成菌单位CFU(个/g)按式(1)计算：
CFU＝ε×h1
式中：
CFU-1g菌剂所含成菌落单位(相当于芽孢个数)，个/g；
ε-同稀释后5个培养皿的菌落平均数，个；
h1-样品的稀释倍数；
计算求出CFU，即为供检测样品成菌但为数。
允许误差
两次平行测定结果之相对差，应不大于5.0％，取其算术平均值作为测定结果。
pH值的测定
pH值的测定按GB/T 1601进行。
水分
按GB/T 1600中的卡尔·费休法进行。
固体不溶物试验
按HG/T 2467.1-2003中4.6进行测定。
产品的检验及验收
符合GB/T 1604的有关规定。极限数值的处理，采用修约值比较法。
检测结果如表1、表2所示。
表1、本发明制备的枯草芽孢杆菌项目指标
项目 指标 枯草芽孢杆菌有效含量，活芽孢/ 克 ≥1×1011 水分，％ ≤5.0 pH值范围 8.0～9.0 固体不溶物，％ ≤0.5
表2、本发明实施例所制备的枯草芽孢杆菌检测数据
实施例7：本发明所述方法制备的枯草芽孢杆菌的药效试验
于2008年7-8月在海南省文昌市进行200亿活芽孢/克枯草芽孢杆菌可湿性粉剂的田间药效试验，通过叶面喷雾本发明实施例1制备的枯草芽孢杆菌防治水稻稻瘟病(穗茎瘟)，共施药两次，施药制剂量为900克/公顷，1200克/公顷、1500克/公顷。药前发病率分别为0.67％、0.78％、0.80％，病情指数分别为0.07、0.09、0.09。第二次施药后14天调查，发病率分别为3.45％、2.60％、1.98％，病情指数分别为0.71、0.29、0.22，空白对照的发病率为15.10％，病情指数为6.23，该药剂防效达到88.60％、95.34％、96.46％。
参照上述试验方案，同年在广东省和湖北省对实施例2-5制备的枯草芽孢杆菌进行的田间药效试验，防效均达到80％以上，增产率达到7.60％。