虹鳟鱼三倍体制种技术方法.pdf

虹鳟鱼三倍体制种技术方法，在卵、精结合后的适当时机，在一定的时间区间内对处于低温环境的受精卵进行热(休克)处理，然后再回复到原来的低温环境进行冷水孵化；使本应育成二倍体的受精卵，经热休克处理后80％以上生成三倍体受精卵；再由三倍体受精卵育成三倍体苗种(稚鱼)。本技术方案的实施，阻止了受精卵第二极体的排出，诱导受精卵发生成由卵、精核及第二极体各自携带1倍数染色体融合成的含有三倍数染色体的受精卵即三倍体受精卵，实现了三倍体制种的产业化。每只热诱导孵化器每次可生产三倍体受精卵4万粒以上，每个繁殖期(10月～2月)可生产200万粒以上。三倍体诱导率达80％以上。

1.  虹鳟鱼三倍体制种技术方法，其技术特征是：
在10℃水温下，实施人工授精后第10分钟开始对受精卵进行热休克处理；
热休克时间域值：10～12分钟，热休克温度：28～30℃；
然后再回复到原来的低温环境进行冷水孵化；本应育成二倍体的受精卵，经热休克处理后80％以上生成三倍体受精卵；
再由三倍体受精卵育成三倍体苗种稚鱼。

2.  根据权利要求1所述的虹鳟鱼三倍体制种技术方法，其特征是含有以下步骤：
步骤1，对雌、雄虹鳟鱼分别进行人工采卵、采精；
步骤2，单盐等渗液洗涤卵；
步骤3，人工授精获取受精卵；
步骤4，对受精卵实施冷流水10℃吸水膨胀10分钟；
步骤5，实施热流水28～30℃吸水膨胀、热休克10分钟，阻止第2极体排出，诱导发生三倍体受精卵；
步骤6，实施冷流水10℃吸水膨胀40分钟后实施发眼孵化至孵化积温达220度日；
步骤7，实施冷流水10℃稚鱼出膜孵化，至孵化积温达300度日稚鱼孵化出膜；
步骤8，在流水环境下将孵化稚鱼育成上浮稚鱼后，实施开食驯饲30天，育成三倍体稚鱼。

3.  虹鳟鱼三倍体制种装置，其特征是含有受精卵热诱导设备、三倍体稚鱼孵出设备，
受精卵热诱导设备含有热恒温供水器、热诱导孵化器；
热恒温供水器：供水器容积400kg，内设加热、温控装置和水口(器外另设注水管)；
热诱导孵化器：热诱导孵化器由孵化桶注水漏斗、注水管、网盆及底排水口构成；网盆以上部分为盛卵区；
三倍体稚鱼孵出设备含有平列式稚鱼出膜孵化槽、平流式网笼出膜孵化槽、六边形3倍体稚鱼饲育槽；
平列式稚鱼出膜孵化器：由平列槽和放入槽内的6个四方形孵化盘构成，每个盘的底部是进水筛，后侧壁是出水筛，后侧壁的下部延伸成挡水板，水从进水筛反冲入盘，流经盘内的发眼卵后从后壁的出水筛流出，又向下流至盘底，再经下一个盘的进水筛反冲进入下一盘；
平流式网笼出膜孵化槽：该槽由孵化槽及平铺槽底的管状小网笼(长6cm直径3cm)或直径2～3厘米的河卵石构成，发眼卵散放在网笼或卵石的间隙，水流从入水口流经网笼或卵石和发眼卵后，从出水口排出；
六边形3倍体稚鱼饲育槽：槽材质为玻璃钢，呈六边形，槽上口沿围绕一圈厚1厘米、高5厘米的加固带；
槽高80厘米，上口内径与底内径分别为80厘米和60厘米，槽中央设有套管式底排水设施、注水管系一般水龙头；注水龙头偏向一方。

4.  根据权利要求3所述的虹鳟鱼三倍体制种装置，其特征是：
热恒温供水器设电热装置及温度控制仪和供水管；
热诱导孵化器由带有底排水口的塑料桶、盛卵网盆、底注水管部件构成，底注水管使水从器底注入，向上反冲入盛卵网盆；底排水口的功能是快速排出器内冷或热水，保证热休克诱导和冷流水孵化的连续作业；
六边形3倍体稚鱼饲育槽中央设有套管，套管套在排水管外，套管的底部有筛孔通向槽中，槽底部的水通过筛孔上溢，从排水管的上口溢出槽外；
平流式网笼出膜孵化槽，由孵化槽及平铺槽底的长6cm、径3cm管状塑料网笼及套管式排水设备构成；
平列式出膜孵化槽：由平列槽和放入槽内的6个四方形孵化盘及套管式排水设备构成；孵化盘的底部是进水筛、后侧壁是出水筛；后侧壁的下部延伸成挡水板。

虹鳟鱼三倍体制种技术方法
技术领域
本发明涉及虹鳟鱼三倍体制种技术方法，属于鱼类染色体工程育种技术领域。
背景技术
自德国生物学家发现了射线可以控制蛙类受精细胞染色体数量的现象以来，欧美以及日本的鱼类学家进一步开发了人为方法控制鱼类受精细胞染色体行为、数量、性质进而育成新品种的技术，即染色体工程育种技术。这是一项不同于传统的遗传育种的高新技术。
本发明的关健是采用热休克法即热处理法阻止冷水性鱼类虹鳟鱼受精卵第二极体排出诱导产生三倍体受精卵。目前国内尚无可与之相比较的技术实例。在亚洲除本例外，仅日本实施过热休克法诱导虹鳟鱼三倍体的实验。与二倍体比较，三倍体虹鳟鱼具有个体长的大的特点，但是日本民族没有吃大鱼的习惯，食用虹鳟鱼的规格都是100g左右的小鱼，所以没有生产三倍体的需要。因此日本实施的诱导三倍体试验基本是试验室规模的小试验，试验规模多为数十粒至数千粒受精卵，三倍体诱导率达80～95％。所用设备都是箱式热水器等实验室设备，实验目的主要是从鱼类生物学角度探讨染色体数量、行为变化规律。与日本比较，本技术在设备方面的特点是拥有生产规模的三倍体诱导设施，主要是28～30℃恒温供水器，具有反冲、溢水、底排水功能的三倍体受精卵热休克诱导器(兼做孵化器)。在技术上的特点是对受精卵实施流水式吸水膨胀、流水式热休克处理与冷流水孵化连续作业。在规模上的特点是实施生产规模的三倍体诱导。该技术目前正在实施成果转化，初步实现了产业化制种生产，设备上还存在着热供水器出水管路口径偏小的问题。
近十数年来，国内曾有过关于温水性鱼类如鲤、鲫等的三倍体诱导试验报导，试验方法是静水压力法或冷休克法诱导三倍体，但仅仅是试验室规模的小型试验。迄今尚无生产性试验及投入生产的报导。
发明内容
为了克服现有技术结构的不足，本发明推出虹鳟鱼三倍体制种技术方法。本发明要解决的技术问题：
1阻止受精卵第2极体排出，使之生成含有卵细胞卵核携带的1倍数染色体、精细胞精核携带的1倍数染色体及卵细胞第2极体携带的1倍数染色体即含有3倍数染色体的受精卵。
2阻止第2极体排出，采用适于大批量生产三倍体受精卵的热休克法，研发热休克的方法与技术参数。
3提供热休克批量生产三倍体发眼卵的设备装置。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
虹鳟鱼三倍体制种技术方法，在卵、精结合后的适当时机，在一定的时间区间内对处于低温环境的受精卵进行热(休克)处理，然后再回复到原来的低温环境进行冷水孵化；使本应育成二倍体的受精卵，经热休克处理后80％以上生成三倍体受精卵；再由三倍体受精卵育成三倍体苗种(稚鱼)。
本发明的三个关键性技术参数：
参数(1)、热(休克)处理的开始时机：10℃水温下，实施人工授精后第10分钟开始对受精卵进行热(休克)处理。
参数(2)、热休克温度：28～30℃。
参数(3)、热休克时间域值：10～12分钟。
虹鳟鱼三倍体制种技术方法，含有以下步骤：
步骤1，对虹鳟鱼分别进行人工采卵、采精；
步骤2，单盐等渗液洗涤卵；
用单盐(NaCl)等渗液淋浴采出卵。每万粒卵需淋浴400±ml。
单盐等渗液的配制
采用食用盐，用常规溶液配制法制成浓度为0.97～0.98％的单盐NaCl水溶液。每次采卵前，根据当天计划采卵数量，制成足量的等渗液供洗卵使用；
步骤3，实施人工授精，使卵、精结合生成受精卵；
步骤4，对受精卵实施冷流水(10℃)吸水膨胀10分钟；
步骤5，对受精卵实施热流水(28～30℃)吸水膨胀同时实施热休克10分钟，阻止第2极体排出，诱导发生三倍体受精卵。
步骤6，对受精卵实施冷流水(10℃)吸水膨胀40分钟。
步骤7，对受精卵实施冷流水(10℃)发眼孵化至孵化积温达220度日；
步骤8，对发眼卵实施冷流水(10℃)稚鱼出膜孵化至300度日，稚鱼孵化出膜。
步骤9，孵化稚鱼驯饲30天(10℃)
步骤10，三倍体苗种培育。
虹鳟鱼三倍体诱导装置，含三倍体受精卵热诱导设备、三倍体稚鱼孵出设备，
三倍体受精卵热诱导设备含有热恒温供水器、热诱导孵化器(反冲溢流式底排水孵化器)；
热恒温供水器：供水器容积400kg，内设加热、温控装置，和供水口。热水从供水口注入热诱导孵化器；
热诱导孵化器(反冲溢流式底排水孵化器)：热诱导孵化器由孵化桶、底排水口注水漏斗、注水管及网盆等部件构成；网盆以上部分为盛卵区；
三倍体稚鱼孵出设备：有平列式反冲水稚鱼出膜孵化器、平流式网笼出膜孵化槽；
平列式稚鱼出膜孵化器由平列槽和放入槽内的6个四方形浮化盘构成，每个盘的底部是进水筛，后侧壁是出水筛，后侧壁的下部延伸成挡水板，水从进水筛反冲入盘，流经盘底上的发眼卵后从后壁的出水筛流出，又向下流至盘底，再经下一个盘的进水筛反冲进入下一盘；
平流式网笼出膜孵化槽：该槽由孵化槽及平铺槽底的长6cm直径3cm的管状小网笼或直径2～3厘米的河卵石构成，发眼卵放在网笼或卵石上，水流从入水口流经网笼或卵石和发眼卵后，从出水口排出；
三倍体稚鱼饲育设备：
六边形3倍体稚鱼饲育槽：槽材质为玻璃钢，呈六边形，槽上口沿围绕一圈厚1厘米、高5厘米的加固带；
槽高80厘米，上口径与底内径分别为80厘米和60厘米，槽中央设有套管式底排水上溢水的排水设施、注水管系一般水龙头；注水龙头偏向一方；注入槽内的水呈环流式。
本发明采用的技术方案：是实施批量生产的流水式热休克诱导三倍体，现有设备每批次可热休克处理受精卵40万粒以上。每个繁殖期(10月～2月)可生产三倍体发眼卵200万粒以上。
该方案的技术特征是流水式热处理，解决了止水热处理或压力处理易导致缺氧而不适于大批量处理受精卵的问题。
本发明的创新(与目前二倍体制种技术的主要不同点)

本发明三倍体制种的工作原理：
如图4所示，鱼类的成熟卵细胞20内，含有一个携带1倍数染色体(n)的卵核和1个携带1倍数染色体(n)的第二极体(第1极体此前已被排出)。当精细胞进入卵细胞20时，在精细胞21的刺激下，第二极体连同他的1倍数的染色体被排出卵外，携带1倍数染色体(n)的卵核与携带1倍数染色体(n)的精核相互融合，生成具有二倍数染色体的二倍体受精卵，该卵将发育成二倍体鱼。
精细胞21进入卵细胞20后，在适当时机，采取适当的人工措施(本发明采取的是热休克处理法22)，阻止第二极体的排出，就会生成由卵核、精核、第二极体三方融合成的含有三倍数染色体(n、n、n)的受精卵即三倍体受精卵23，该卵将发育成三倍体鱼。
本发明的有益效果，本技术方案的实施，阻止了受精卵第二极体的排出，诱导受精卵发生成由卵、精核及第二极体各自携带1倍数染色体融合成的含有三倍数染色体的受精卵即三倍体受精卵，实现了三倍体制种的产业化。
每只热诱导孵化器每次可生产三倍体受精卵4万粒以上，每个繁殖期(10月～2月)可生产200万粒以上。三倍体诱导率达80％以上。
附图说明
图1为本发明热恒温供水器和反冲溢流式底排水孵化器装置示意图。
图2为本发明平列式稚鱼出膜孵化器装置示意图。
图3为本发明六边形3倍体稚鱼饲育槽装置示意图。
图4为本发明三倍体制种示意图。
图5为本发明反冲波式流动示意图。
图6为本发明直流式网笼出膜孵化槽装置示意图。
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
具体实施方式
实施例1：如图1所示，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
在卵、精结合后的适当时机，在一定的时间区间内对处于低温环境的受精卵进行热(休克)处理，然后再回复到原来的低温环境进行冷水孵化。本应育成二倍体的受精卵，经热休克处理后80％以上会生成三倍体受精卵。再由三倍体受精卵育成三倍体苗种(稚鱼)。
△技术手段的三个关键性技术参数
参数(1)、热(休克)处理的开始时机：10℃水温下，实施人工授精后第10分钟开始对受精卵进行热(休克)处理。
参数(2)、热休克温度：28～30℃。
参数(3)、热休克时间域值：10～12分钟。
△技术手段的关键设备：
热恒温供水器：见图1所示。
热恒温供水器2，为扁方形箱体容器，水容量400kg，箱体连接热处理供水管3；内设电热装置及自动温度控制仪，箱体外有注水管1。
电热装置的散热板、电热元件固定在箱体的底部。
温度控制仪为市售产品。电热装置的电热元件与温度控制仪连接。其功能是向热休克处理器供应热(28～30℃)水。热恒温供水器2内水量保持400kg，水温恒定在28～30℃之间。
注水管1不断地注入10℃的冷水，供水管不断地排出28～30℃的热水，该热水直接注入热诱导孵化器。供水器内水量保持400kg，水温保持28～30℃恒温，可同时供应10个热诱导孵化器，同时对40万粒受精卵进行热休克处理。
热诱导孵化器(反冲溢流式底排水孵化器)见图1所示。其主要结构是塑料桶8、盛卵网盆7、底注水管6、底排水管9。结构特征是所用盛卵网盆7系市售塑料网盆，通透性能好，可以避免因过水不畅导致受精卵窒息死亡的问题。
底注水管6，可以使水从器底注入，向上反冲入盛卵网盆7。底排水管9的功能是热休克处理结束后，将器内的热水在1分钟之内排出，
盛卵网盆7可盛受精卵4～5万粒。该孵化器兼具对受精卵实施吸水膨胀、热休克处理及冷流水孵化的功能。
平列式稚鱼出膜孵化器见图2：
由平列槽50和放入平列槽内的6个四方形孵化盘10构成，槽后端设有底排水管51和溢水排水管52构成的可以实施底排水的套管式排水系统。
每个孵化盘的底部是进水筛，后侧壁是出水筛，后侧壁的下部延伸成挡水板60，水从进水筛反冲入孵化盘10，流经盘内的发眼卵后从后侧壁的出水筛流出，又向下流至盘底，再反冲入下一个孵化盘的进水筛。如图5所示，水流反冲波式流动。每个孵化盘容纳发眼卵1.5万粒，每槽6个孵化盘，可容卵9万粒进行出膜孵化。该设施具备使发眼卵内的稚鱼孵化出膜的功能，稚鱼出膜后，可利用平列槽进行开口饲育。
直流式网笼出膜孵化槽：见图6
该槽由长方形孵化槽101及平铺槽底的网笼81或卵石(直径2～3厘米)构成，发眼卵散放在网笼8或卵石的间隙处，水流从入水口31流经网笼或卵石和发眼卵后，从出水口91排出。网笼或卵石的作用是分离发眼卵，避免卵集堆缺氧，还可避免卵被冲向排水口处。每平米可容纳发眼卵3～4万粒。稚鱼孵出后，撤除网笼或卵石，孵化槽可用于稚鱼开口饲育。
六边形3倍体稚鱼饲育槽13，如图3所示，
六边形3倍体稚鱼饲育槽13材质为玻璃钢，呈六边形，槽上口沿围绕一圈厚1厘米、高5厘米的加固带，可以保证槽体不变形，又减少了一般园形槽近10厘米宽的口沿多占用的空间。两个六边形3倍体稚鱼饲育槽之间各以一边相接，也起到了减少占用空间的作用。省略了10厘米宽的口沿，降低了材质的成本。
槽高80厘米，上口径与底内径分别为80厘米和60厘米，槽内中央设有套管14，套管14套在排水管15外，套管14的底部有排水筛孔，槽底部的水通过筛孔向上流动，再从排水管15的上口溢出槽外。
注水管系一般水龙头。注水龙头偏向一方，使注入水在槽内呈环形流动。水槽溶水量0.25m³，注水的同时也要排水，槽内水随时都在流动交换，交换速度可以通过控制注水量进行调节，最大交换速度为每小时10次。每小时交换6次，每槽可放养尾重1克的稚鱼1万尾，比占有同样空间面积的园形槽和箱式槽分别提高放养量0.3倍和1倍。
本发明采用的技术方案是可以实施批量生产的流水式热休克诱导三倍体，每批次可热休克处理受精卵40万粒。该方案的主要技术特征之一是流水式热处理，解决了止水热处理或压力处理易导致因缺氧卵死亡而不适于大批量处理受精卵的问题。第2个主要特征是实施冷流水吸水膨胀、流水式热休克诱导三倍体及冷流水孵化三项工艺集成式连续作业。解决了间段式作业导致的因震动引起卵死亡的问题。
实施例2：
虹鳟鱼三倍体制种工艺：
步骤1，人工采卵、采精，单盐等渗液洗卵、人工授精。
步骤2，将授精后的卵放入热诱导孵化器，实施冷流水(10℃)吸水膨胀，同时多余精液随水流溢出。
步骤3，10分钟后，停注冷水，改注28～30℃的热水，诱导生成三倍体受精卵。
步骤4，10分钟后，停注热水，打开底排水口，再改注10℃水，实施冷流水吸水膨胀及孵化作业。
步骤：孵化积温达220℃·d前后，将发眼卵移入稚鱼出膜孵化槽，至稚鱼孵出。