一种从色钉菇中提取抗氧化活性物质的方法及其应用 【技术领域】
本发明涉及一种从色钉菇 [Chroogomphus rutilus] 中提取抗氧化活性物质的方 法，以及获得的提取物在抗氧化保健产品、药品开发中的应用，属于医药制备技术领 域。背景技术
药食用高等真菌作为一类高蛋白、低脂肪、富含微量元素的健康食品，具有很 高的营养价值和保健功效。 高等真菌可产生多种结构新颖或具有各种生物活性的次生代 谢产物，为人类开发新药、保健食品等提供了重要的资源。 迄今为止，已经从高等真菌 中发现了多糖、甾体类、生物碱、萜类等具有显著生物活性的物质。 随着化学、药理 学、营养学、临床医学的不断发展，人们对高等真菌的认识和利用将更加广泛深入。 近 年来，人们对高等真菌的研究已越来越偏重于生物活性的研究，而非过去单纯的化学成 分的分离鉴定。
长期以来，在食品保鲜、化妆品制作、保健食品乃至医药领域，人们一直使 用人工合成抗氧化剂，如 BHT( 二叔丁基羟基甲酚 )， BHA( 叔丁基羟基茴香醚 )， TBHQ( 特丁基对苯二酚 ) 和 PG( 没食子酸丙酯 ) 等。 近年研究发现，这些人工合成抗 氧化剂存在安全性问题，具有诸多副作用，如对人体的肝、脾、肺均有不利影响，会诱 发恶性肿瘤等。 因此，近年来，从自然界寻求高效、无毒、安全的天然抗氧化剂的研究 已引起各国科学家的重视。 抗氧剂依其作用原理可分为 ：(1) 自由基终止剂，如 BHA， BHT， TBHQ 和天然存在的生育酚等 ；(2) 还原剂，如抗坏血酸及其盐类、亚硫酸及其 盐类、核黄素等 ；(3) 鳌合剂，如 EDTA、柠檬酸、植酸等 ；(4) 单旋态氧抑制剂，如胡 萝卜素等。 目前，已开发利用或正在研究的天然抗氧化剂多来自植物材料，主要有香辛 料提取物、茶多酚类、天然黄酮类、维生素类、蛋白质和酶类 (SOD)、类胡萝卜素、植 酸、中草药提取物等几类物质。 除植物材料以外，近年，利用高等真菌作材料，研究天 然抗氧化剂已成为该领域的新热点。
国内外对高等真菌抗氧化活性物质研究呈以下特点。 一是在多种食药用真菌子 实体、菌丝体提取物中都发现含有抗氧化活性物质。 这些高等真菌中，既有人工栽培的 食用菌，也有野生菌。 研究表明，不同种类的食用菌抗氧化能力并不相同，说明高等真 菌中含有的抗氧化成分多少、种类均有差异。 二是对抗氧化能力的测定多用的单一粗提 物。 如冷水提取物、热水提取物、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、石油醚、丙酮、氯仿等提取 物。 检测方法多采用清除超氧化物自由基、羟自由基、抑制脂质过氧化、亚铁离子螯合 等。 结果显示，各提取物均有不同程度的抗氧化活性，表明高等真菌中含有的抗氧化物 质存在复杂性。 定性测定结果显示，子实体、菌丝体中含有的抗氧化物质有 ：酚类物 质、黄酮类物质、类黄酮、萜类物质、维生素 C，类胡罗卜素、番茄红素、多糖等。 三 是仅有少数文献报道了高等真菌抗氧化物质的纯化及结构特点。
色钉菇 (Chroogomphus rutilus)，又称血红铆钉菇，俗称红蘑、肉蘑、松树伞、松蘑等，在真菌分类上属于担子菌亚门层菌纲、伞菌目、铆钉菇科。 是针叶树木重要的 外生菌根真菌。 国内外对色钉菇的研究主要集中在其所含多的多糖类物质。 唐超、王清 吉等研究发现低剂量血红铆钉菇多糖对小鼠 S180 肉瘤的抑制率为 76.018％，明显超过抗 癌药物环磷酰胺的抑瘤率，具有显著的抑瘤作用 ；而肝指数、脾指数和胸腺指数与正常 小鼠差异不大，能够有效保护免疫器官。 Sun Y.X.， Li X. 等分析了血红铆钉菇子实体的 四种水溶性多糖 CRPsA-1、 CRPsA-2、 CRPsB-1 和 CRPsB-2 的结构，并通过体外抗氧 化能力检测，发现 CRPsB-1 和 CRPsB-2 具有很好的自由基清除作用和较强的 Fe2+ 螯合能 力。 而采用不同极性的有机化合物分别提取色钉菇中的活性物质并对其活性物质的抗氧 化活性进行研究，国内外均未见报道。 发明内容
本发明的目的是提供一种从色钉菇中提取抗氧化活性物质的方法。
本发明的目的还在于提供上述提取方法获得的提取物在抗氧化保健产品及药物 开发中的应用。
本发明的技术构思如下 ：在化学、生物化合物分离制备技术领域，液 - 固萃取 法是利用溶剂对固体混合物中所需成分的溶解度大，对杂质的溶解度小的原理，把固体 物质放于溶剂中长期浸泡而达到萃取的目的。 本发明提供的方法是采用极性不同的三种 有机溶剂，即非极性的石油醚、中极性的乙酸乙酯、极性的乙醇，分步萃取色钉菇的子 实体，获得极性不同的萃取物，即药用活性物质，然后分析不同极性萃取物的抗氧化效 果，进而用于开发其用途。 具体的，本发明所说的从色钉菇中提取抗氧化活性物质的方法如下 ：
方法一 ：
取烘干后的色钉菇子实体干粉，与石油醚按质量体积比 (0.1 ～ 1) ∶ 20(g ∶ mL) 比例混合后，进行如下步骤 (A) 操作 ：搅拌 2h，静置过夜，滤纸过滤收集上清液，重复 操作 3 ～ 5 次，合并上清液，将合并后的上清液采用旋转蒸发器于 40 ～ 45℃减压浓缩， 然后用真空干燥箱干燥，得到石油醚提取物浸膏，称重，计算产率。 将子实体粉末滤 尽，烘干备用。
本发明还可以采取方法二 ：将方法一得到的石油醚提取物干粉与乙酸乙酯按质 量体积比 (0.1 ～ 1) ∶ 20(g ∶ mL) 比例混合后，重复方法一中的步骤 (A) 操作，即 ：搅 拌 2h，静置过夜，滤纸过滤收集上清液，重复操作 3 ～ 5 次，合并上清液，将合并后的上 清液采用旋转蒸发器于 40 ～ 45℃减压浓缩，然后用真空干燥箱干燥，得到乙酸乙酯提取 物浸膏，称重，计算产率。 将子实体粉末滤尽，烘干备用。
本发明还可以采取方法三 ：将方法二得到的乙酸乙酯提取物干粉与无水乙醇按 质量体积比 (0.1 ～ 1) ∶ 20(g ∶ mL) 比例混合后，重复方法一中的步骤 (A) 操作，即 ： 搅拌 2h，静置过夜，滤纸过滤收集上清液，重复操作 3 ～ 5 次，合并上清液，将合并后的 上清液采用旋转蒸发器于 40 ～ 45℃减压浓缩，然后用真空干燥箱干燥，得到乙醇提取膏 状物，称重并计算产率。
各方法提取物的得率＝ [ 每种提取物的质量 (g)/ 子实体干粉的质量 (g)]×100％
各提取方法得到的提取物的得率见表 1。
表 1 色钉菇子实体三种提取物的得率 (％ )
为了实现本发明获得的活性物质应用的目的，申请人进行了以下实验研究 ：
(1) 三种提取物的体外抗氧化活性测定
方法一 ：采用清除 DPPH(1，1- 二苯基 -2- 三硝基苯肼 ) 自由基能力方法。
具体操作如下 ：
将色钉菇三种提取物分别用无水甲醇配置成 20mg/mL 的母液。 随后，用无水甲 醇稀释母液，得 0.5mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL 的样品 溶液，用于清除 DPPH 自由基的检测。
取 2mL 不同浓度的样品溶液于试管中，向其中加入 2mL 无水乙醇配制的浓度为 -4 2×10 mol/L 的 DPPH 溶液，混合均匀后避光反应 30min，于 517nm 处测定其吸光值。 同时测定 2mL 不同浓度样品溶液与 2mL 无水乙醇的吸光值 ；2mL DPPH 溶液和 2mL 无水 甲醇的吸光值。 以 Vc( 维生素 C) 作为阳性对照。 每个实验组重复 3 次，按下面公式计 算样品的 DPPH 清除率 ：
样品的 DPPH 清除率 (％ ) ＝ [A0-(Ai-Aj)]/A0×100％
其中 ：A0 是 2mL DPPH+2mL 无水甲醇的吸光值 ；Ai 是 2mL DPPH+2mL 样品液 的吸光值 ；Aj 是 2mL DPPH+2mL 无水乙醇的吸光值。
结果 ：实验数据采用 Statistica 6.0 进行统计分析， IC50 软件计算提取物的 IC50 值，结果见表 2。
表 2 色钉菇三种提取物清除 DPPH 自由基的 IC50 比较
由表 2 可知 ：色钉菇的三种提取物特别是乙酸乙酯提取物具有较强的清除 DPPH 自由基的能力，即具有显著的体外抗氧化活性。
方法二 ：采用抑制小鼠肝细胞脂质过氧化活性的方法
具体操作如下 ：
将小白鼠断颈处死后，立刻取肝脏用生理盐水制成 5％肝匀浆溶液。 按硫代巴 比妥酸法测定。 以同浓度 Vc( 维生素 C)、 BHA( 叔丁基羟基茴香醚 ) 为阳性对照，将 试管分为空白、对照 1 组和样品 1 组，置于冰水浴中预冷，之后于各管中加入鼠肝匀浆 悬液 200μL，对照管和样品管中各加入 1mmol/L 的 FeSO4 溶液 50μL 和 0.01mol/L 的 L-Cys( 半胱氨酸 ) 溶液 20μL，样品管中分别加入不同浓度的提取物 300μL，用 0.1mol/ L 磷酸缓冲液 (pH ＝ 7.4) 补充至体积 1mL，置于 37℃水浴中温育 30min，取出后立即加
入 20％ TCA( 三氯乙酸 ) 溶液 0.5mL，5000r/min 离心 10min，取上清液 1mL，加 0.67％ TBA( 硫代巴比妥酸 ) 溶液 1mL，沸水浴中煮 10min，最后用 0.1mol/L 磷酸缓冲液 (pH ＝ 7.4) 调零，然后于 532nm 处测其吸光值，并记录数据。 实验重复 3 次。 按下面公式计算 小鼠肝细胞脂质过氧化抑制率 (％ ) ：
肝细胞脂质过氧化抑制率 (％ ) ＝ [A0-(A-Ab)]/A0×100％
其中 ：A0 为只加组织匀浆的 OD532 值 ；Aa 为加样品和组织匀浆的 OD532 值 ；Ab 为样品的 OD532 值。
结果 ：实验数据采用 Statistica 6.0 进行统计分析， IC50 软件计算提取物的 IC50 值，结果见表 3。
表 3 色钉菇三种提取物对小白鼠肝细胞脂质过氧化的抑制率 (％ )IC50 比较
由表 3 可知 ：色钉菇的三种提取物特别是乙酸乙酯、乙醇提取物均具有较强的 抑制小鼠肝细胞脂质过氧化能力的作用，即具有显著的体外抗氧化活性。 其活性虽然与 强氧化剂 BHA 相比，略差些，但显著高于 Vc。
(2) 色钉菇乙醇提取物的体内抗氧化实验
方法 ：采用 D- 半乳糖衰老模型。 将健康雄性昆明小鼠 ( 体重在 23-26g) 适应性 饲养 7d 后，随机分为衰老组 (M)，空白对照组 (C)，阳性对照组 (X1、X2、X3) 和给药 组 (Y1、Y2、Y3) 共 4 组，每组 12 只。 将色钉菇乙醇提取物、阳性对照物 Vc 用生理盐 水配制成所需的浓度。 D- 半乳糖的注射量为 120mg/(kg · d)。 各组处理方法如下 ：
衰老组 (M) ：每日皮下注射 0.2mL D- 半乳糖，灌胃等量的生理盐水。
空白对照组 (C) ：每日皮下注射等量的生理盐水。
给 药 组 ：每 日 皮 下 注 射 0.2mL D- 半 乳 糖， 分 别 以 浓 度 为 100mg/(kg · d) (Y1)、200mg/(kg · d)(Y2)、400mg/(kg · d)(Y3) 的乙醇提取物灌胃。
阳性对照组 ：每日皮下注射 0.2mL D- 半乳糖，分别以浓度为 100mg/(kg · d) (X1)、200mg/(kg · d)(X2)、400mg/(kg · d)(X3) 的 Vc 灌胃。
每天灌胃小鼠 1 次，每次 0.2mL，连续 30d。 各组均在室温 (20-25℃ ) 环境下常 规饲养，自然光照 12h 白天、12h 黑夜，自由饮水、进食。 连续灌胃 30d 后，禁食 24h。 眼眶采血，低温离心分离血清 (4℃，3000r/min，10min)， -20℃保存备用。 将取血后的 小鼠颈椎脱臼处死，取肝用预冷的 PBS 缓冲液 (0.2mol/L，pH7.4) 做成肝匀浆 (1.0g 湿组 织加 9.0mL 缓冲液 )，于 4℃，6000r/min 离心 10min，分离上清，-20℃保存备用。 采用 黄嘌呤氧化酶法检测 SOD( 超氧化化物岐化酶 ) 活力 ( 参考试剂盒说明 )，二硫代二硝基 苯甲酸法检测 GSH-px 活力 ( 谷胱甘肽过氧化物酶 )( 参考试剂盒说明 )，硫代巴比妥酸法 检测 MDA( 丙二醛 ) 含量 ( 参考试剂盒说明 )。
结果 ：在 D- 半乳糖的作用下，模型组小鼠血浆和肝脏的 SOD 活力显著下降，
与空白对照组比，差异十分显著，说明衰老模型的复制是成功的。
色钉菇乙醇提取物低、中剂量组肝脏组织的 SOD 的活力均显著高于模型组 (p ＜ 0.05)，但低于 Vc 水平 ；高剂量组小鼠肝脏组织中的 SOD 的活力超过 Vc 水平。 色 钉菇乙醇提取物各剂量组血浆和肝脏 GSH-px 活力均显著高于同剂量的 VC 阳性对照组 (p ＜ 0.05)。 色钉菇乙醇提取物各剂量组血浆和肝脏 MDA 含量均低于 VC 阳性对照组，说 明色钉菇乙醇相有抑制 MDA 产生，减少细胞膜脂质过氧化的作用。
(3) 色钉菇石油醚、乙酸乙酯、乙醇提取物中粗三萜含量的测定
具体操作方法如下 ：
将各提取物用甲醇配成 1mg/mL 的溶液，精密吸取各提取物 0.5mL 分别置于具 塞试管中，准确加入 5 ％香草醛的冰醋酸溶液 0.4mL、高氯酸 1.6mL，混匀，置 70 ℃恒 温水浴中加热 15min，冷却至室温，并转移至 10mL 容量瓶中加乙酸乙酯稀释至刻度，摇 匀，在 560nm 波长处测定光吸收值，根据标准曲线计算各代谢提取物中粗三萜的质量， 按下式求出样品粗三萜的含量 ：
样品粗三萜含量 (％ ) ＝ m/c×v，
其中 ：m 为供试液中粗三萜总量 (mg) ；c 为供试液的浓度 (1mg/mL) ；v 为供 试液体积 (mL)。 结果 ：色钉菇石油醚、乙酸乙酯、乙醇提取物中粗三萜含量分别为 ( ％， mg/ mg) ：25.73、9.21、13.77。
(4) 色钉菇石油醚、乙酸乙酯、乙醇提取物总酚含量的测定
具体操作方法如下 ：
将各提取物用甲醇配成 1mg/mL 的溶液，精密吸取各提取物 1.0mL 分别置于具 塞试管中，分别加入 1mL Folin- 酚试剂，室温放置 3 ～ 4min，再加入 10％ Na2CO3 饱和 溶液 1mL，用 H2O 稀释至 10mL，在暗处反应 90min 后，在 760nm 处测定其吸收值。 根 据标准曲线计算各提取物中总酚的百分含量。
各提取物中总酚含量 (％ ) ＝ m/c×v，
其中 ：m 为供试液中总酚总量 (mg) ；c 为供试液的浓度 (1mg/mL) ；v 为供试 液体积 (mL)。
结果 ：色钉菇石油醚、乙酸乙酯、乙醇提取物中总酚含量分别为 ( ％， mg/ mg) ：53.4、33.92、34.02。
(5) 色钉菇石油醚、乙酸乙酯、乙醇提取物中总黄酮含量的测定
将各提取物用甲醇配成 1mg/mL 的溶液，精密吸取各提取物 1.0mL 分别置于具 塞试管中，分别加入 1mL 甲醇，再加入 10％ KOH 溶液 0.5mL，室温放置 5min，用甲醇 稀释至 10mL，在 415nm 处测定其吸收值。 根据标准曲线计算各提取物中总黄酮的百分 含量。
各提取物中总黄酮含量 (％ ) ＝ m/c×v，
其中 ：m 为供试液中黄酮总量 (mg) ；c 为供试液的浓度 (1mg/mL) ；v 为供试 液体积 (mL)。
结果 ：色钉菇石油醚、乙酸乙酯、乙醇提取物中总黄酮含量分别为 ( ％， mg/ mg) ：4.62、3.11、2.90。
以上实验结果表明 ：色钉菇的三种提取物均具有较强的抗氧化功效，含丰富的 抗氧化活性物质，可做为抗氧化保健产品及药物的原料。 可用于抗氧化保健产品及药品 的制备。
本发明取得的有益效果如下 ：本发明的提取方法从色钉菇中获取了三种活性提 取物，并研究了提取物抗氧化活性，在筛选的 20 多种大型真菌中，其抗氧化活性最强。 (1) 本发明成本较低，且所用方法简便、易操作。 (2) 本发明获得的活性提取物具有很高 的抗氧化活性，为抗氧化保健产品及药物的研发提供了实用材料。 (3) 本发明属于纯天然 活性物质的提取方法，提取过程中使用的溶剂残留少，对人无害且不会造成环境污染， 属于环境友好型。 具体实施方式
以下实施例用于说明本发明。
实施例 1 色钉菇石油醚提取物的提取 ( 制备 ) 方法
(1) 色钉菇新鲜子实体干燥后粉碎成干粉 ；
(2) 色钉菇子实体干粉与石油醚按质量体积比 (0.1 ～ 1) ∶ 20(g ∶ mL) 比例混 合后，搅拌 2h，静置过夜，用抽滤和倒吸的方法吸出滤液 ( 上层清液用倒吸法，下层用 抽滤法 )，合并滤液后采用旋转蒸发器于 40-45℃减压浓缩 ； (3) 如此反复抽提 3-5 次，直到颜色非常浅，将子实体粉末滤尽，烘干备用 ；
(4) 将浓缩得到的粘稠状石油醚提取物用真空干燥箱干燥，得石油醚提取物浸 膏。 称重，计算产率 ：[ 产物 (g)/ 干粉总重 (g)]×100％＝ 5.145％。 将产物置于 -20℃ 冷冻保存备用。
实施例 2 色钉菇乙酸乙酯提取物的提取 ( 制备 ) 方法
(1) 将 实 施 例 1 得 到 的 石 油 醚 提 取 子 实 体 干 粉 与 乙 酸 乙 酯 以 (0.1 ～ 1) ∶ 20(g ∶ mL) 混合，搅拌 2 小时，静置过夜。 用抽滤和倒吸的方法吸出滤液 ( 上层 清液用倒吸法，下层用抽滤法 )，合并滤液后于 40-45℃减压浓缩 ；
(2) 如此反复抽提 3-5 次，直到颜色非常浅。 将子实体粉末滤尽，烘干备用 ；
(3) 将浓缩得到的粘稠浸膏用真空干燥箱干燥，得到乙酸乙酯提取物浸膏。 称 重，计算产率 ：[ 产物 (g)/ 干粉总重 (g)]×100％＝ 4.296％。 将产物置于 -20℃冷冻保 存备用。
实施例 3 色钉菇乙醇提取物的提取 ( 制备 ) 方法
(1) 将 实 施 例 2 得 到 的 乙 酸 乙 酯 提 取 子 实 体 干 粉 与 乙 醇 以 (0.1 ～ 1) ∶ 20(g ∶ mL) 混合，搅拌 2h，静置过夜。 用抽滤和倒吸的方法吸出滤液 ( 上层清液 用倒吸法，下层用抽滤法 )，合并滤液后于 40-45℃减压浓缩 ；
(2) 如此反复抽提 3-5 次，直到颜色非常浅。 将子实体粉末滤尽、烘干 ；
(3) 将浓缩得到的粘稠浸膏用真空干燥箱干燥，得到乙醇提取物膏状物。称重， 计算产率 ：[ 产物 (g)/ 干粉总重 (g)]×100％＝ 3.775％。 将产物置于 -20℃冷冻保存备 用。
实施例 4 色钉菇石油醚、乙酸乙酯、乙醇提取物清除 DPPH 自由基能力检测
(1) 样品的制备 ：将色钉菇提取物用无水甲醇配置成 20mg/mL 的母液，4℃保
存备用。 母液用无水甲醇或蒸馏水稀释为浓度是 0.5mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、6mg/ mL、8mg/mL、10mg/mL 的样品溶液，用于清除 DPPH 的检测 ；
(2) 检测方法 ：取 2mL 不同浓度的样品溶液于试管中，再向其中加入 2mL 乙醇 配置的浓度为 2×10-4mol/L 的 DPPH 溶液，混合均匀，暗处反应 30min 后于 517nm 处测 定其吸光值 ；同时测 2mL 不同浓度样品溶液与 2mL 无水乙醇的吸光值 ；2mL DPPH 溶液 和 2mL 无水甲醇的吸光值。 以 Vc 作为阳性对照。 每个实验组重复 3 次，按以下公式计 算样品的 DPPH 清除率 ：
样品 DPPH 清除率 (％ ) ＝ [A0-(Ai-Aj)]/A0×100％
其中 ：A0 是 2mL DPPH+2mL 无水甲醇的吸光值 ；Ai 是 2mL DPPH+2mL 样品液 的吸光值 ；Aj 是 2mL DPPH+2mL 无水乙醇的吸光值 ；
(3) 数据处理 ：实验数据用 Statistica 6.0 进行统计分析，并用 IC50 软件计算提取 物的 IC50 值。 Vc、石油醚、乙酸乙酯、乙醇提取物的 IC50 值分别为 ：为 0.015、0.382、 0.259、1.024mg/mL。
实施例 5 色钉菇石油醚、乙酸乙酯、乙醇提取物抑制小鼠肝细胞脂质过氧化活 性的检测
(1) 样品的制备 ：将小白鼠断颈处死后，立刻取肝脏用生理盐水制成 5％肝匀浆 溶液。
(2) 检测方法 ：以同浓度 Vc( 维生素 C)、 BHA( 叔丁基羟基茴香醚 ) 为阳性对 照，将试管分为空白、对照 1 组和样品 1 组，置于冰水浴中预冷，之后于各管中加入鼠肝 匀浆悬液 200μL，对照管和样品管中各加入 1mmol/L 的 FeSO4 溶液 50μL 和 0.01mol/ L 的 L-Cys( 半胱氨酸 ) 溶液 20μL，样品管中分别加入不同浓度的提取物 300μL，用 0.1mol/L 磷酸缓冲液 (pH ＝ 7.4) 补充至体积 1mL，置于 37℃水浴中温育 30min，取出后 立即加入 20％ TCA( 三氯乙酸 ) 溶液 0.5mL，5000r/min 离心 10min，取上清液 1mL，加 0.67％ TBA( 硫代巴比妥酸 ) 溶液 1mL，沸水浴中煮 10min，最后用 0.1mol/L 磷酸缓冲液 (pH ＝ 7.4) 调零，然后于 532nm 处测其吸光值，并记录数据。 实验重复 3 次。 按下面 公式计算各提取物脂质过氧化抑制率 (％ ) ：
各提取物脂质过氧化抑制率 (％ ) ＝ [A0-(A-Ab)]/A0×100％
其中 ：A0 为只加组织匀浆的 OD532 值 ；Aa 为加样品和组织匀浆的 OD532 值 ；Ab 为样品的 OD532 值。
(3) 数据处理 ：实验数据采用 Statistica 6.0 进行统计分析， IC50 软件计算提取物 的 IC50 值， BHA、 Vc、石油醚、乙酸乙酯、乙醇提取物的脂质过氧化抑制率 IC50 值分别 为 ：0.007、5.285、5.187、0.122、0.638mg/mL。
实施例 6 色钉菇乙醇提取物的体内抗氧化实验
方法 ：采用 D- 半乳糖衰老模型。 将健康雄性昆明小鼠 ( 体重在 23-26g) 适应性 饲养 7d 后，随机分为衰老组 (M)，空白对照组 (C)，阳性对照组 (X1、X2、X3) 和给药 组 (Y1、Y2、Y3) 共 4 组，每组 12 只。 将色钉菇乙醇提取物、阳性对照物 Vc 用生理盐 水配制成所需的浓度。 D- 半乳糖的注射量为 120mg/(kg · d)。 各组处理方法如下 ：
衰老组 (M) ：每日皮下注射 0.2mL D- 半乳糖，灌胃等量的生理盐水。
空白对照组 (C) ：每日皮下注射等量的生理盐水。给 药 组 ：每 日 皮 下 注 射 0.2mL D- 半 乳 糖， 分 别 以 浓 度 为 100mg/(kg · d) (Y1)、200mg/(kg · d)(Y2)、400mg/(kg · d)(Y3) 的乙醇提取物灌胃。
阳性对照组 ：每日皮下注射 0.2mL D- 半乳糖，分别以浓度为 100mg/(kg · d) (X1)、200mg/(kg · d)(X2)、400mg/(kg · d)(X3) 的 Vc 灌胃。
每天灌胃小鼠 1 次，每次 0.2mL，连续 30d。 各组均在室温 (20-25℃ ) 环境下常 规饲养，自然光照 12h 白天、12h 黑夜，自由饮水、进食。 连续灌胃 30d 后，禁食 24h。 眼眶采血，低温离心分离血清 (4℃，3000r/min，10min)， -20℃保存备用。 将取血后的 小鼠颈椎脱臼处死，取肝用预冷的 PBS 缓冲液 (0.2mol/L，pH7.4) 做成肝匀浆 (1.0g 湿组 织加 9.0mL 缓冲液 )，于 4℃，6000r/min 离心 10min，分离上清，-20℃保存备用。 采用 黄嘌呤氧化酶法检测 SOD 活力 ( 参考试剂盒说明 )，二硫代二硝基苯甲酸法检测 GSH-px 活力 ( 参考试剂盒说明 )，硫代巴比妥酸法检测 MDA 含量 ( 参考试剂盒说明 )。
结果 1 ：色钉菇乙醇提取物对小鼠血清和肝组织中 SOD 活性的影响
SOD 在机体的氧化和抗氧化平衡过程中起着重要的作用。 SOD 能清除超氧阴离 2子 (O ·) 自由基，保护细胞免受损伤。 色钉菇乙醇提取物对小鼠血清和肝组织中 SOD 活性的影响结果见表 4。
表 4 色钉菇乙醇提取物对小鼠的血清和肝组织中 SOD 活性影响
注 ：每个值均为 ：x±SD，n ＝ 12 ；字母 a 为与衰老模型组相比 p ＜ 0.05，b 为 与衰老模型组相比 p ＜ 0.01。
由表 4 可见，在 D- 半乳糖的作用下，模型组小鼠血浆和肝脏的 SOD 活力显著下 降，与空白对照组比，差异十分显著，说明衰老模型的复制是成功的。 Vc 低剂量组血浆 中 SOD 的活力低于模型组，但肝脏组织的 SOD 的活力显著高于模型组，其原因可能为低 剂的 Vc 不能明显提高血浆中 SOD 的活力，但中、高剂量组血浆和肝脏组织的 SOD 活力 均显著高于模型组 (p ＜ 0.05)。 低、中剂量组血浆中 SOD 的活力低于模型组，高剂量组 显著高于模型组，但不能使血浆中的 SOD 的活力提高到正常水平，因此低于空白对照水 平。 提取物低、中剂量组肝脏组织的 SOD 的活力均显著高于模型组 (p ＜ 0.05)，但低于 Vc 水平，高剂量组小鼠肝脏组织中的 SOD 的活力超过 Vc 水平。 说明高剂量的色钉菇乙
醇提取物对小鼠血清和肝脏组织中 SOD 的活力影响显著，对清除体内的 · O2-，维持氧 化和抗氧化的平衡起到具有十分重要的作用。
结果 2 ：色钉菇乙醇提取物对小鼠血清和肝组织中 GSH-px 活性的影响
GSH-px 是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解的酶。色钉菇乙醇提 取物对小鼠血清和肝组织中 GSH-px 活性的影响结果见表 5。
表 5 色钉菇乙醇提取物对小鼠血清和肝组织中 GSH-px 活性影响
注 ：每个值均为 ：x±SD，n ＝ 12 ；字母 a 为与衰老模型组相比 p ＜ 0.05，b 为 与衰老模型组相比 p ＜ 0.01。
由表 5 可见，模型组小鼠血浆和肝脏组织中 GSH-px 活力显著低于空白对照组 (p ＜ 0.05)，而灌服色钉菇乙醇提取物和 VC 的各剂量组血浆和肝脏组织中 GSH-px 活力均高 于模型组，说明色钉菇乙醇提取物和 VC 均可明显提高小鼠血浆和肝脏中 GSH-px 活力。 同时 Vc 低、中剂量组的小鼠血浆和肝脏组织中 GSH-px 活力高于模型组，但低于空白对 照组，说明中低剂量组的 Vc 不能使衰老小鼠中 GSH-px 的活力恢复到正常小鼠水平。 色 钉菇乙醇提取物各剂量组血浆和肝脏 GSH-px 活力均显著高于同剂量的 VC 阳性对照组 (p ＜ 0.05)，说明低、中、高剂量的色钉菇乙醇提取物均能显著提高小鼠血浆和肝脏组织中 GSH-px 的活力。 GSH-px 对活性氧和组织产生的 · OH 及 H2O2 有较强的清除能力，可 减轻脂质过氧化对机体组织的损伤，在防止畸变，预防衰老方面有非常重要的作用。
结果 3 ：色钉菇乙醇提取物对小鼠血清和肝组织中 MDA 含量的影响
MDA 是在脂质过氧化过程中产生的，因此 MDA 的量常常可反应机体内脂质过 氧化的程度，间接反映出细胞的损伤程度。 MDA 的测定常常与 SOD 的测定相互配合， SOD 活力的高低间接反应了机体清除氧自由基的能力，而 MDA 的高低又间接反映了机体 细胞受自由基攻击的严重度。 色钉菇乙醇提取物对小鼠血清和肝组织中 MDA 含量的影 响结果见表 6。
表 6 色钉菇乙醇提取物对小鼠的血清和肝组织中 MDA 含量影响
注 ：每个值均为 ：x±SD，n ＝ 12 ；字母 a 为与衰老模型组相比 p ＜ 0.05，b 为 与衰老模型组相比 p ＜ 0.01。由表 6 可见，模型组小鼠血浆和肝脏中 MDA 含量高于空白对照组，而灌服色钉 菇乙醇提取物的各剂量组血浆和肝脏 MDA 含量均显著低于模型组，说明色钉菇乙醇提取 物均可明显降低小鼠血浆和肝脏中 MDA 含量。 并且色钉菇乙醇提取物各剂量组血浆和 肝脏 MDA 含量均低于 VC 阳性对照组，特别是在低剂量组时差异显著 (p ＜ 0.05)，说明 色钉菇乙醇提取物在降低 MDA 含量的效果上好于 Vc。 说明低、中、高剂量的色钉菇乙 醇提取物均能对抗小鼠血浆和肝脏 MDA 含量的升高。 由此表明，色钉菇乙醇相有抑制 MDA 产生，减少细胞膜脂质过氧化的作用。
实施例 7 色钉菇石油醚、乙酸乙酯、乙醇提取物中粗三萜含量的测定
(1) 标准曲线的制作
将齐墩果酸 (≥98％，中药固体制剂研究中心 ) 用甲醇配成 0.2mg/mL 的标准溶 液，精密吸取该液 0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 和 0.8mL，分别置于具塞试管中，挥 去溶剂，准确加入 5％香草醛的冰醋酸溶液 0.4mL、高氯酸 1.6mL，混匀，置 70℃恒温水 浴中加热 15min，冷却至室温，并转移至 10mL 容量瓶中加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀， 在 560nm 波长处测定光吸收值，以齐墩果酸质量为横坐标 (x)，吸光值为纵坐标 (y) 做标 准曲线，求出回归方程 ：y ＝ 8.047x+0.0248， r ＝ 0.9991(n ＝ 6)。
(2) 粗三萜含量测定方法
取浓度为 1mg/mL 的各提取物 0.5mL，按标准曲线的测定方法，测出其在 560nm 下的 OD560 值，根据标准曲线计算各代谢提取物中粗三萜的质量，按下式求出各提取物粗 三萜的含量 ：
各提取物粗三萜含量 (％ ) ＝ m/c×v。
其中 ：m 为供试液中粗三萜总量 (mg) ；c 为供试液的浓度 (1mg/mL) ；v 为供 试液体积 (mL)。
(3) 数据处理及结果 ：实验数据均用 Statistica 6.0 进行统计分析。 色钉菇石油 醚、乙酸乙酯、乙醇提取物中粗三萜含量分别为 (％， mg/mg) ：25.73、9.21、13.77。实施例 8 色钉菇石油醚、乙酸乙酯、乙醇提取物总酚含量的测定
(1) 标准曲线的制作
没食子酸 (≥98 ％，中药固体制剂研究中心 ) 为标准品，将没食子酸用甲醇配 成 0.1mg/mL 的 标准溶 液，精密 吸取该液 0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、 100μg/mL，分别加入 1mL Folin- 酚试剂，室温放置 3 ～ 4min，再加入 10％ Na2CO3 饱 和溶液 1mL，用 H2O 稀释至 10mL，在暗处反应 90min 后，在 760nm 处测定其吸收值。 以没食子酸的质量为横坐标 (x)，吸光值为纵坐标 (y) 做标准曲线，求出回归方程 ：y ＝ 0.0097x+0.114， r ＝ 0.9956(n ＝ 6)。
(2) 总酚含量的测定方法
按标准曲线的测定方法，取浓度为 1mg/mL 的各提取物 1mL，测其在 760nm 下 的 OD760 值，根据标准曲线计算各提取物中总酚的百分含量。
各提取物中总酚含量 (％ ) ＝ m/c×v，
其中 ：m 为供试液中总酚总量 (mg) ；
c 为供试液的浓度 (1mg/mL) ；
v 为供试液体积 (mL)。
(3) 数据处理及结果 ：实验数据均用 Statistica 6.0 进行统计分析。 色钉菇石油 醚、乙酸乙酯、乙醇提取物中总酚含量分别为 (％， mg/mg) ：53.4、33.92、34.02。
实施例 9 色钉菇石油醚、乙酸乙酯、乙醇提取物中总黄酮含量的测定
(1) 标准曲线的制作
将芦丁 (≥98％，中药固体制剂研究中心 ) 用甲醇配成 0.1mg/mL 的标准溶液， 精密吸取该液 0、0.5、1、1.5、2、2.5mL，分别加入 1mL 甲醇，再加入 10 ％ KOH 溶液 0.5mL，室温放置 5min，用甲醇稀释至 10mL，在 415nm 处测定其吸收值。 以芦丁质量 为横坐标 (x)，吸光值为纵坐标 (y) 做标准曲线，求出回归方程 ：y ＝ 3.189x+0.0063， r2 ＝ 0.9991(n ＝ 5)。
(2) 总黄酮含量的测定方法
按标准曲线的测定方法，取浓度为 1mg/mL 的各提取物 1mL，测其在 434nm 下 的 OD434 值，根据标准曲线计算各提取物中总黄酮的百分含量。
各提取物中总黄酮含量 (％ ) ＝ m/c×v，
其中 ：m 为供试液中黄酮总量 (mg) ；
c 为供试液的浓度 (1mg/mL) ；
v 为供试液体积 (mL)。
(3) 数据处理及结果 ：实验数据均用 Statistica 6.0 进行统计分析。 色钉菇石油 醚、乙酸乙酯、乙醇提取物中总黄酮含量分别为 (％， mg/mg) ：4.62、3.11、2.90。13