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PRRSV亚单位疫苗
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本申请要求2004年6月17日提交的临时申请序列号60/581,350的优先权，该申请的教导和内容清楚地包括在此作为参考。
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发明背景
发明领域
本发明广泛地涉及用于猪生殖和呼吸综合征(porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRS)的疫苗。具体地说，本发明涉及通过给予包含PRRS病毒(PRRSV)DNA亚单位的疫苗在猪中预防PRRS。更具体地说，本发明涉及DNA亚单位疫苗中开放读码框1(ORF1)的应用，ORF1为猪提供对抗PRRSV的保护性免疫。甚至更具体地说，本发明涉及ORF1选定部分的单独使用及其与PRRSV基因组中的其它部分联用，或与对抗PRRSV的其它疫苗联用。
现有技术的描述
PRRS是全球猪产业中的主要疾病。PRRS是由PRRSV感染引起的。目前，可获得修饰的活疫苗(MLV)，其正确使用可给猪提供对抗PRRSV感染引起的临床疾病的保护。PRRS MLV疫苗需要在接受免疫接种的动物中复制，以确保诱导有效的免疫应答(例如，参见Meng，X.J.，猪生殖和呼吸综合征病毒的异质性：目前疫苗有效性与未来疫苗发展的预示(Heterogeneity of PorcineReproductive and Respiratory Syndrome Virus：Implications for Current VaccineEfficacy and Future Vaccine Development)；74Vet.Micro.，309-329(2000))。然而，这种复制的问题在于，疫苗接种后PRRS MLV可在动物中持续存在几周，并且还可散播至其它PRRSV-阴性猪。在一些没有良好生物安全措施以防止PRRSV MLV从接受免疫接种的动物散播到其它PRRSV-阴性群体的猪群中，PRRS MLV从接受免疫接种动物的散播是一个问题。虽然已使用了数以百万计的PRRS MLV而没有发生问题，但文献中还是有一些关于PRRS MLV恢复成毒力更强的野生型PRRSV强毒株的零星报道。解决PRRS MLV散播和可能恢复毒力等问题的尝试也已通过利用由灭活PRRS病毒(即PRRS KV)构成的疫苗进行。但是，研究发现，虽然PRRS KV可在接受免疫接种的猪中诱导强的体液应答，但它不能有效防止PRRS-相关疾病。
因此，本领域需要能够诱导保护性免疫应答而不存在PRRS MLV相关问题的免疫接种的方法和疫苗。优选地，给予的疫苗不会在接受免疫接种的动物中主动复制，并可诱导强的体液和细胞介导的免疫应答。
                        发明概述
本发明通过提供PRRSV DNA疫苗解决了现有技术所固有的问题，并实现了本领域的显著进展。理论上，表达PRRS抗原的DNA疫苗质粒可用作合成PRRSV抗原的模板(即类似于PRRS MLV)，而且还具有在动物中不进行主动复制的特征(即类似于PRRS KV)。尚不知道诱导对抗PRRSV的保护性宿主应答所需的保护性免疫原。由于PRRS MLV可在接受免疫接种的猪中诱导保护性应答，认为PRRS MLV在接受免疫接种的动物中的复制必将在接受免疫接种的动物中诱导强的体液和细胞介导的免疫应答。
PRRSV的ORF1编码PRRSV复制和新的后代产生所需的复制结构。ORF1具有称为ORF1a和ORF1b的两个区域，它们包括ORF1复制酶复合物(Dea等，猪生殖和呼吸综合征(Prrs)病毒结构蛋白的目前进展：北美和欧洲隔离群的比较(Current Knowledge on the Structural Proteins of Procine Reproductive andRespiratory Syndrome(Prrs)Virus：Comparison of the North American andEuropean Isolates)；145(4)Archives of Virology，659-688(2000))。认为编码复制酶的蛋白质在其它病毒家族中是关键的免疫原(Leitner等，基于DAN和RNA的疫苗：原理、进展和前景)(DAN and RNA-Based Vaccines：Principles，Progressand Prospects)；18Vaccine 765-777(2000))。当细胞感染PRRSV时，由于细胞感染期间复制酶相关抗原的表达，病毒复制酶的活性可提供有力的辅助作用。复制酶相关抗原可用作感染细胞中产生的“危险信号”，并诱导强的宿主免疫应答(即IFN、HSP、凋亡)。因此，复制酶相关“危险信号”可能是为何受激发时PRRS MLV能够诱导保护作用而非复制性PRRS(即PRRS KV中的灭活抗原)不会引起保护作用的关键因素所在。
ORF1的长度接近12,000个核苷酸，使其在真核细胞中难以转染和充分表达。因此，采用表达文库免疫(ELI)为工具，将ORF1依序和任意地分成较小的区段，以确定各种病原体的保护性免疫原。ELI将特定病原体的基因组剪切成小片段，可将小片段克隆入DNA疫苗载体、然后给予宿主，以确定任意片段是否能够诱导免疫应答(Johnston and Barry；Genetic to Genomic Vaccination；15(8)808-809(1997))。优选地，免疫应答是保护性的。本发明是基于以下假设：宿主针对ORF1-产生的蛋白质的免疫应答是防止PRRSV激发所必需的。在DNA疫苗载体中设置编码PRRSV ORF 2-7的区域相对较容易，因为这些ORF的长度为317-720个核苷酸。如上所述，PRRSV中ORF1区的大小接近12,000个核苷酸长度。将这样大小的区域设置入DNA疫苗载体中会导致在真核细胞中不能转录和后续表达。因此，需要使ORF1区域断裂形成较小的区段，以更好地确保ORF1所有区域的充分表达。已采用表达文库免疫(ELI)为工具来确定各种病原体的保护性免疫原。ELI利用将特定病原体的基因组剪切成小的片段。这些小片段克隆入DNA疫苗载体，然后给予宿主，以确定任意片段是否能够诱导保护性免疫应答。在这里，已改进ELI技术，用于开发由PRRSV基因组的ORF1编码区依序组成的PRRSV DNA疫苗。该方法称为SELI(顺序表达文库免疫，sequential expression library immunization)。这不同于采用整个ORF1区域作为DNA疫苗的Barfoed等(具有PRRS病毒开放读码框1-7的猪DNA疫苗(DNA Vaccination of Pigs with Open Reading Frame1-7 of PRRS Virus)；22Vaccine，3628-3641(2004))的所述。
本发明疫苗可仅仅包含PRRSV ORF1部分、与PRRSV ORF1的其它部分组合，并与可有效产生对抗PRRSV感染的免疫应答的其它组合物(如其它PRRSV疫苗)一起。适用于本发明目的的ORF1部分具有足够的大小，以在接受疫苗的动物中激发免疫应答。优选地，该部分包括高达约9,000个碱基对，更优选地，该ORF-1部分包括约21-9,000个连续的核苷酸碱基对，更优选约21-6,000个连续的核苷酸碱基对，甚至更优选约21-3,000个连续的核苷酸碱基对，更优选约21-2,000个连续的核苷酸碱基对，甚至更优选约21-1,000个连续的核苷酸碱基对，更优选约21-500个连续的核苷酸碱基对，甚至更优选约21-300个连续的核苷酸碱基对，更优选约21-150个连续的核苷酸碱基对，甚至更优选约21-75个连续的核苷酸碱基对，更优选约21-50个连续的核苷酸碱基对，甚至更优选约21-25个连续的核苷酸碱基对，更优选约21-23，最优选至少约21个连续的核苷酸碱基对。由这些优选部分中的任一种形成的蛋白质也是本发明的一部分。可将来自任何PRRSV株的任何ORF1或其部分用于本发明的目的，但是，优选使用具有毒力的株。
可将一个或多个选定部分克隆入合适的表达载体。合适的表达载体的例子包括腺病毒载体、志贺氏菌属载体、pVC1650(Valentis，Inc.，Burlingame，California)、WRG720(W.R.Grace，New York，New York)和pcDNA3(Invitrogen，Carlsbad，California)。一些优选的载体包含立即早期巨细胞病毒启动子、内含子A和多聚a腺苷酰化部分(例如，牛生长激素(BGH)或人生长激素(HGH))。此外，例如采用杆状病毒表达系统，可在昆虫细胞培养物中表达纯化的PRRSV蛋白。然后可将该蛋白质与佐剂组合并给予。当然，本领域技术人员可以选择能够在真核细胞中介导各种PRRSV ORF表达的合适的表达系统和载体。优选地，在将各部分ORF1克隆入合适的表达载体之后，验证克隆的方向。
在本发明的一个实施例中，选择用于本发明的PRRSV病毒VR-2332。利用Genbank U87392产生13个ORF1的重叠克隆。该ORF1包括12,071个核苷酸碱基对。该部分大小为773-975个bp。克隆用字母A-M表示，克隆A(SEQ IDNo.2)为939个bp，克隆B(SEQ ID No.3)为957个bp，克隆C(SEQ ID No.4)为976个bp，克隆D(SEQ ID No.5)为954个bp，克隆E(SEQID No.6)为939个bp，克隆F(SEQ ID No.7)为957个bp，克隆G(SEQ ID No.8)为957个bp，克隆H(SEQ ID No.9)为852个bp，克隆I(SEQ ID No.10)为917个bp，克隆J(SEQ ID No.11)为972个bp，克隆K(SEQID No.12)为966个bp，克隆L(SEQID No.13)为783个bp，克隆M(SEQID No.14)为774bp。克隆A-H来自ORF1的区域1a，克隆I-M来自ORF 1的区域1b。克隆A采用可靠(authentic)的ORF1A ATG起始密码子。其余ORF1克隆的5起始端加有框内ATG起始密码子。将这些克隆各自克隆入DNA表达载体pVC1650。该载体包含立即早期巨细胞病毒启动子和内含子A，并在真核细胞中引导各种PRRSV ORF的表达。表1提供了关于各个克隆以及各克隆来自哪个核苷酸序列区域的信息。
                                表1
             BIV PRRSV ORF1a/1b顺序表达文库免疫(SELI)克隆

  SEQ  ID  ORF1  SELI  克隆  大小  (碱基  对)  克隆的  区域  克隆的核苷酸跨  距(采用Genbank  U87392作为对  照)  克隆入表达  载体  pVC1650的  状态和验证  的方向  使用猪抗  -PRRSV恢复  期血清转染后  的IFA反应  2  A  939  ORF1a  190-1128  √    3  B  957  ORF1a  1126-2082  √    4  C  976  ORF1a  2082-3057  √    5  D  954  ORF1a  3037-3990  √    6  E  939  ORF1a  3985-4923  √    7  F  957  ORF1a  4924-5880  √  -  8  G  957  ORF1a  5863-6819  √  -  9  H^*  852  ORF1a  6808-7659  √    10  I^*  917  ORF1b  7735-8651  √  -  11  J  972  ORF1b  8634-9605  √  弱  12  K  966  ORF1b  9588-10553  √  -  13  L  783  ORF1b  10536-11318  √  -  14  M  774  ORF1b  11298-12071  √  -
^*附注：原始H和I克隆侧接ORF1a/1b减去1个移码区域，并设计新的引物以产生稍微较小的RT-PCR产物。
然后，将各部分用于各种组合中，以及单独用于在含有其它PRRSV ORF的疫苗制剂中。
在另一个实施例中，将克隆A-M和ORF2-6的克隆克隆入pVC1650表达载体，将ORF7的克隆克隆入WRG720表达载体。当然，本领域技术人员能够选择合适的载体。此外，可通过标准技术，例如但不限于通用分子克隆、诱变和化学核酸合成技术，产生本发明的核酸序列。为了本发明的目的，本发明涵盖了与克隆A-M中任一个具有至少75％序列相同性，更优选至少75％，甚至更优选至少80％，甚至更优选至少85％，甚至更优选至少90％，甚至更优选至少95％，甚至更优选至少98％，更优选至少99％，最优选100％序列相同性的DNA序列。
在本发明的一方面，将各克隆A-M作为疫苗组分单独使用。通过任何常规方法进行的给药，用疫苗免疫动物。给予方法的例子包括：口服、经皮、静脉内、皮下、肌内、眼内、腹膜内、直肠内、阴道内、鼻内、胃内、气管内、肺内、或它们的任意组合。优选的给予方式是肌内、皮下和鼻内给药。需要或必要时，可以各种间隔进行一次或几次增强免疫接种。给予上述疫苗后，动物中发生免疫应答，用PRRSV有毒形式激发后，PRRSV感染在发病率和/或严重性方面的临床症状降低。
在本发明的另一方面，如上所述，给予动物克隆A-M的组合。这种组合包含两种或多种上述克隆。因为使用猪抗-PRRSV恢复期血清转染后，这些克隆中的某些克隆(A，B，C，D，E，H和J)可引起IFA反应，所以在本发明中优选这些克隆的组合。
在本发明的另一方面，克隆A-M(无论单独使用或联合使用，如上所述)与疫苗制剂中PRRSV的其它一种或多种ORF联合使用。合适的ORF包括ORF2-7。
在本发明的另一方面，将PRRSV ORF DNA与其它PRRSV疫苗组合。优选地，该疫苗能够在加入PRRSV ORF1 DNA之前有效诱导免疫应答。
在本发明的又一方面，提供了一种载体。本发明载体具有插入其中的包含至少一部分PRRSV ORF1 DNA的外来DNA(并非来自载体)。在优选的形式中，载体是质粒。优选地，该PRRSV ORF1 DNA部分具有来自PRRSV ORF1 DNA的至少21个连续核苷酸。在一些优选的形式中，该部分具有来自以下序列的至少150个连续核苷酸：与SEQ ID No 1-14中任一个具有至少85％序列相同性的序列以及它们的组合。对于组合物本身而言，序列相同性的百分比和序列长度可变化，如上所述。在其它优选的形式中，载体还包含第二部分的PRRSVDNA。第二部分选自：来自除ORF1以外的PRRSV ORF的至少21个连续核苷酸、来自ORF1的至少21个连续核苷酸，以及它们的组合。在具有附加的来自ORF1的21个连续核苷酸的实施方式中，该21个核苷酸与第一部分PRRSVORF1 DNA中包含的至少21个核苷酸不同。还优选用于构建载体的PRRSVDNA来源于PRRSV强毒株。
本发明的另一方面包括含有本发明质粒的宿主细胞。这就包括通过引入上述各ORF1片段产生的质粒。优选地，细胞包含具有来自PRRSV ORF1 DNA的至少21个连续核苷酸的质粒。在其它优选的形式中，细胞包含具有来自以下序列的至少150个连续核苷酸的质粒：与SEQ ID No 1-14中的任一个具有至少85％序列相同性的序列，以及它们的组合。在另一些优选的形式中，细胞中的质粒包含第二部分PRRSV DNA，其选自：来自除ORF1以外的PRRSV ORF的至少21个连续核苷酸，来自ORF1的至少21个连续核苷酸，以及它们的组合。优选地，用于构建细胞所含质粒的PRRSV DNA来源于PRRSV毒性株。
在本发明的另一方面，本发明组合物适用于在动物中诱导免疫应答以及完全防止或降低PRRSV感染导致的病症和症状的严重性的方法中。
本发明组合物可包含药学上可接受的佐剂、载体和/或赋形剂。
如本文所用，将采用以下定义：“序列相同性”如本领域所知，指两个或多个多肽序列或是两个或多个多核苷酸序列之间的关系，即参比序列和要与参比序列进行比较的给定序列之间的关系。序列相同性的测定是如下进行的：使序列最适对齐以产生最高程度的序列相似性之后，比较给定序列与参比序列来确定序列相同性，如通过这些序列串之间的匹配所确定的那样。通过比对，基于位置关系确定序列相同性，例如如果在某一特定位置，核苷酸或氨基酸残基相同，则该位置处的序列是“相同”的。然后，将这种位置相同性的总数除以参比序列中核苷酸或残基的总数，得到％序列相同性。可通过已知方法容易地计算序列相同性，包括但不限于以下文献中所述的方法：《计算机分子生物学》(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.N.编，Oxford University Press，New York(1988)，《生物计算机：信息学与基因组计划》(Biocomputing：Informatics and Genome Projects)，Smith，D.W.编，Academic Press，New York(1993)；《序列数据的计算机分析》(Computer Analysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，Humana Press，New Jersey(1994)；《分子生物学中的序列分析》(Sequence Analysis in Molecular Biology)，vonHeinge，G.，Academic Press(1987)；《序列分析引物》(Sequence AnalysisPrimer)，Gribskov，M.和Devereux，J.编，M.Stockton Press，New York(1991)；以及Carillo，H.和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48：1073(1988)，这些文献的教导包括在此作为参考。确定序列相同性的优选方法被设计成能使待测序列间达到最大匹配。在确定给定序列间的序列相同性的公众可获得的计算机程序中规定了确定序列相同性的方法。这些程序的例子包括但不限于：GCG程序包(Devereux，J.等，Nucleic Acids Research，12(1)：387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S.F.等，J.Molec.Biol.，215：403-410(1990)。BLASTX程序可从NCBI和其它来源公开获得(BLAST Manual，Altschul，S.等，NCVI NLM NIH Bethesda，MD 20894，Altschul，S.F.等，J.Molec.Biol.，215：403-410(1990)，它们的内容包括在此作为参考)。这些程序利用缺省缺口权重(default gap weight)对序列进行最适比对，使得给定序列与参比序列之间产生最高水平的序列相同性。作为例子，核苷酸序列与参比核苷酸序列具有至少，例如，95％“序列相同性”的多核苷酸表示，给定多核苷酸的核苷酸序列与参比序列相同，只是每100个参比核苷酸序列的核苷酸中，给定多核苷酸序列最多可包含5点突变。换言之，在核苷酸序列与参比核苷酸序列具有至少95％相同性的多核苷酸中，参比序列中最多5％的核苷酸可缺失或被其它核苷酸所取代，或占参比序列中核苷酸总量最多5％的一定数量的核苷酸可插入参比序列中。参比序列的这些突变可发生在参比核苷酸序列的5’或3’末端位置或末端位置间的任意位置，这些改变可各自散布在参比序列的核苷酸间或以一个或多个连续组散布在参比序列中。类似地，给定氨基酸序列与参比氨基酸序列具有至少，例如95％序列相同性的的多肽表示，多肽的给定氨基酸序列与参比序列相同，只是每100个参比氨基酸序列的氨基酸中，给定多肽序列最多可包含5个氨基酸变化。换言之，为了获得与参比氨基酸序列具有至少95％序列相同性的给定多肽序列，参比序列中最多5％的氨基酸残基可缺失或被其它氨基酸所取代，或可将占参比序列中氨基酸残基总量最多5％的一定数量的氨基酸插入参比序列中。参比序列的这些改变可发生在参比氨基酸序列氨基或羧基端位置，或这些末端位置间的任意位置，这些可各自散布在参比序列的残基间或以一个或多个连续组散布在参比序列中。优选地，不相同的残基位置因保守氨基酸取代而不同。但是，当确定序列相同性时，并不将保守取代视为匹配。
类似地，如本文所用，“序列同源性”也指确定两个序列相关性的方法。为了确定序列同源性，如上所述对两个或多个序列进行最适比对，需要时可引入缺口。但是，与“序列相同性”不同，当测定取代序列同源性时，将保守氨基酸取代计为匹配。换言之，为了获得与参比序列具有95％序列同源性的多肽或多核苷酸，参比序列中的95％氨基酸残基或核苷酸必需匹配或包含用其它氨基酸或核苷酸的保守取代，或可将占参比序列中总的氨基酸残基或核苷酸最多5％的一定数量的氨基酸或核苷酸(不包括保守取代)插入参比序列中。
“保守取代”指氨基酸残基或核苷酸被具有相似特征或性质(包括大小、疏水性等)的其它氨基酸残基或核苷酸所取代，使得整体功能性没有显著改变。
“分离的”指从其天然状态进行“人工手动”改变，即如果天然存在，则从其原始环境改变或除去，或同时改变和除去。例如，活体中天然存在的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但从其天然状态共存物质中分离的相同多核苷酸或多肽是“分离的”，如本文所用。
“核酸”指多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)，以及合适的话，核糖核酸(RNA)。该术语还应理解为包括作为等价形式的从核苷酸类似物制备的RNA或DNA的类似物，并且可应用于所述单链(正义或反义)和双链多核苷酸的实施方式。
“启动子”指调节可操作地连接于启动子的选定DNA序列的表达的DNA序列，影响选定DNA序列在细胞中的表达。该术语包括“组织特异性”启动子，即仅在特定细胞(例如特殊组织的细胞)中影响选定DNA序列的表达。该术语还包括所谓的“遗漏”启动子，它主要在一种组织中调节选定DNA的表达，但在其它组织也能够引起表达。该术语还包括非组织特异性启动子，以及组成型表达或可诱导的启动子(即可控制表达水平)。
“转染”指通过由核酸介导的基因转移而将核酸导入(即通过表达载体)受体细胞。如本文所用，“转化”指由于细胞摄取外源性DNA或RNA而导致的细胞基因型改变的过程，例如，转化细胞表达重组形式的多肽，或者在从转移基因进行反义表达的情况下，天然存在形式的该蛋白质表达被打断。转染也可使用化学试剂(即脂质)。
术语“载体”指能够转运它所连接的其它核酸的核酸分子。一种优选的载体是游离基因，即能够染色体外复制的核酸。优选的载体是能够自主复制和/或表达它们所连接的核酸的载体。能够指导其可操作地连接的基因的表达的载体在本文中被称为“表达载体”。一般来说，重组DNA技术中采用的表达载体常常是“质粒”的形式，通常指环状双链DNA，在其载体形式中不结合染色体。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用形式的载体。载体也可包括其它复制子，例如噬菌体或粘粒(comsmid)，其中可插入其它DNA区段，以使插入的区段复制。本发明旨在包括上述产生等价作用的其它形式的表达载体，它们在本领域迄今为止已知的。
核酸或多核苷酸的“扩增”指导致形成一拷贝或多拷贝核酸或多核苷酸分子(指数扩增)或仅形成一拷贝或多拷贝核酸或多核苷酸分子互补链(线性扩增)的任何方法。扩增方法包括聚合酶链反应(PCR)，该方法基于变性、寡核苷酸引物退火以及嗜热模板依赖性多核苷酸聚合酶导致的引物延伸的重复循环，导致与引物侧接的多核苷酸分析物的所需序列的拷贝指数级增加。对可与DNA的相对链退火的2个不同引物进行定位，从而使得一个引物的聚合酶催化延伸产物可用作另一个引物的模板链，导致长度为所述寡核苷酸引物5’端之间的距离所限定的不连续双链片段的累积。引导这种扩增的试剂包括寡核苷酸引物、核苷酸聚合酶和三磷酸核苷，例如，脱氧三磷酸腺苷(dATP)、脱氧三磷酸鸟苷(dGTP)、脱氧三磷酸胞苷(dCTP)和脱氧三磷酸胸苷(dTTP)。其它扩增方法包括：使用单一寡核苷酸引物的单链多核苷酸扩增、连接酶链式反应(LCR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、Q-β-复制酶方法和3SR。
本文所引用的所有参考文献的教导和内容清楚地包括在此作为参考。
                     优选实施方案详述
以下实施例列出了本发明的优选实施方案。但是，应理解，提供这些实施例是为了说明，而不是要限制本发明的总体范围。
                          实施例1
本实施例提供了关于含有PRRSV基因组各区域的DNA疫苗效力的数据。实施例从获自Spring Prairie Colony，Hawley，MN 56549的40只PRRSV-阴性混合性别猪开始。试验开始时猪为3-4周龄。在整个研究中为动物提供足以满足其大小、年龄和状况的食物。随意饮水。
为得到PRRSV DNA疫苗，从PRS病毒产生19个cDNA克隆。产生的13个cDNA克隆按顺序代表PRRSV基因组的开放读码框(ORF)1a/1b区域。克隆A利用可靠的ORF1a ATG起始密码子。剩下的ORF 1a/1b克隆B-M具有分别加在5’端的ATG起始密码子。将所有上述克隆分别克隆入DNA表达载体pVC1650。pVC1650载体含有立即早期巨细胞病毒启动子和内含子A，以在真核细胞中引导各种PRRSV ORF的表达。六种其它的cDNA克隆代表了PRRSV结构蛋白ORF2、3、4、5、6和7。将ORF2、3、4、5和6克隆也分别克隆入上述的DNA表达载体pVC1650。将ORF7基因克隆入称为WRG7020的类似表达载体。WRG7020载体还包含立即早期巨细胞病毒启动子和内含子A，以在真核细胞中引导PRRSV ORF7的表达。
产生了两组疫苗，称为“A1-19”和“T1-19”。对于A1-19疫苗，将上述克隆克隆入Valentis，Inc.pVC1650表达质粒。分别用磷酸铝(Adju-Phos)配制各质粒构建物(Ulmer等，用常规铝佐剂促进DNA疫苗效力，Enhancement ofDNA Vaccine Potency Using Conventional Aluminum Adjuvants；18 Vaccine，18-28(1999)，各所得1毫升剂量中含有250μg ORF克隆和1000μg计算量的铝。最终疫苗分别由1ml IM剂量的各配制的ORF克隆构成。对于T1-19疫苗，将上述克隆克隆入Valentis，Inc.pVC1650表达质粒。用TGV200PINC-聚合物分别配制各质粒构建物，分别得到250μg ORF克隆/1ml剂量。最终疫苗各自由1ml IM剂量的各配制的ORF克隆构成。
为得到对照，产生由ORF PCV2的cDNA克隆和SIV的HA基因构成的DNA疫苗。将两种ORF各自克隆入Valentis，Inc.pVC1650表达质粒。分别用磷酸铝(Adju-Phos^)配制PCV2ORF2和SIV HA基因的质粒构建物，各所得1毫升剂量中含有250μg ORF克隆和1000μg计算量的铝(称为A20和A21)。此外，用TGV200 PINC-聚合物分别配制PCV2 ORF2和SIV HA基因的质粒构建物，分别得到250μg各克隆/1ml剂量(称为T20和T21)。最终疫苗由四种独立的1ml IM剂量的各配制的克隆构成。表2显示了所有产生的疫苗，包括对照疫苗。
                                 表2  质粒  克隆区域  克隆的核苷酸跨度(使用Genbank U87392作为对照)  1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  ORF1a  ORF1a  ORF1a  ORF1a  ORF1a  ORF1a  ORF1a  ORF1a  ORF1b  ORF1b  190-1128  1126-2082  2082-3057  3037-3990  3985-4923  4924-5880  5863-6819  6808-7659  7735-8651  8634-9605  11  12  13  14  15  16  17  18  19  20  21  ORF1b  ORF1b  ORF1b  ORF2  ORF3  ORF4  ORF5  ORF6  ORF7  ORF2  SIV HA  9588-10553  10536-11318  11298-12071  NA  NA  NA  NA  NA  NA  NA  NA
将40只猪分成四组：组1在第0、21和42天给予19×1ml剂量的A1-A19Adju-Phos；组2在第0、21和42天给予19×1ml剂量的T1-T19 TGV200；组3在第0、21和42天给予4×1ml各自剂量的A20、A21、T20和T21；组4为阴性对照，不进行任何处理。
在试验的第56天，给予组1、2和3中的所有猪PRRSV的SDSU#73强毒株。在给予猪之前，将PRRSV的SDSU#73强毒株1∶10稀释在含有4％胎牛血清的EMEM中。将总共2ml稀释的激发病毒鼻内递送至合适的猪，每个鼻孔给予1ml稀释的病毒。PRRSV激发病毒的激发前和激发后滴度分别为10^4.59TCID₅₀/ml和10^4.65TCID₅₀/ml。
试验第0、21、42和56天取猪血以监测疫苗接种的血清转化。还在试验第57、59、61、63、66和70天取猪血，以监测激发后血清转化和病毒血症。从第54到第70天每天记录临床观察结果。在第70天，对猪进行尸体剖检，将大体肺损伤记录为PRRSV导致的肺受累百分比。试验开始前以及在第56天和第70天对猪进行称量。本实施例中该方案的总结如表3所示。
                               表3  组  猪/  株  第一次免疫接  种(第0天)  第二次免疫接  种(第21天)  第三次免疫接  种(第42天)  激发(第56天)  收集样品和终止试验(第70天)  1    2   3   4  10    10   10   10  A1-A19  Adju-Phos   T1-T19  TGV200  A20-A21  T20-T21  无  A1-A19  Adju-Phos   T1-T19  TGV200  A20-A21  T20-T21  无  A1-A19  Adju-Phos   T1-T19  TGV200  A20-A21  T20-T21  无  鼻内给予2毫升强毒  SDSU#73PRRSV   同上   同上   无  评价临床健康、直肠温度。尸体  解剖时评价动物肺损伤并收集  指定的肺组织。  同上   同上   同上
为了评价本实施例的结果，确定试验处理效力的主要标准是PRRSV特征性肺损伤的发展。评价血清学反应、激发后ADG和直肠温度作为支持性标准。实施例的结果总结在表4中。
                                 表4  组  组平均  肺评分  每组中肺固结  评分之20％的  猪的百分比  激发后最高组  平均温度  ()  激发后峰病毒  血症的  最高百分比  组平均激发后  ADG  1(A1-A19  Adju-Phos)  2(T1-T19  TGV200)  3(激发对照)  (阴性对照)  19.84   28.42   37.68  0.0A  37.5   70.0   70.0  0.0  105.9   106.0   106.1  103.9  100％   100％   100％  0％  0.16   0.43   0.68  1.48
通过IDEXX PRRS ELISA测定，所有分别接受三次剂量A1-A19 Adju-Phos或T1-T19 TGV200 DNA疫苗原型的猪中不存在PRRSV的血清转化。强毒PRRSV激发后，发现组2猪的ELISA S/P比值比组1猪上升得更快。组3猪(未免疫接种/激发的对照)为阴性S/P比，直到接触强毒PRRSV激发。组4的严格阴性对照猪在整个试验过程中为阴性S/P比。血清学结果记录在表5中。                                                             表5  组  猪  第0天  ELISA  第21天  ELISA  第42天  ELISA  第56天  ELISA  (0dpc)  VI  第59天  ELISA  (3dpc)  VI  第61天  ELISA  (5dpc)  VI  第63天  ELISA  (7dpc)  VI  第66天  ELISA (10dpc)  VI  第70天  ELISA (14dpc)  VI  1  1  1  1  1  1  1  1  1  1  802  808  812  814  818  826  830  832  839  842  平均值  0.14  0.00  -0.02  -0.03  0.01  0.00  -0.01  -0.02  0.01  0.02  0.01  -0.09  -0.01  0.01  0.01  -0.01  0.00  0.00  0.00  -0.05  -0.01  -0.02  0.01  -0.01  -0.02  -0.03  0.36  -0.02  0.04  -0.02  0.01  -0.01  0.03  0.22  0.02  0.00  0.02  0.23  0.01  0.02  0.03  0.08  0.17  0.08  N  N  N  N  N  N  N  N  N  N  0.21  0.02  0.02  0.02  0.18  0.01  -0.01  0.04  0.06  0.19  0.07  POS  POS  N  N  POS  N  POS  N  POS  N  0.97  0.08  0.10  0.13  0.83  0.10  0.06  0.18  0.13  0.92  0.35  POS  POS  POS  POS  POS  POS  POS  POS  POS  POS  2.29  0.66  0.60  0.54  2.74  0.37  0.39  0.93  0.36  2.30  1.12  POS  POS  POS  POS  POS  POS  POS  POS  POS  POS  2.66  1.01  0.92  1.15  2.97  0.45  0.97  1.39  0.72  2.48  1.47  N  N  N  N  N  POS  POS  POS  N  N  2.69  1.22  1.21  1.80  3.24  ND  1.68  1.71  1.13  ND  1.84  N  N  N  N  N  ND  N  N  POS  ND  2  2  2  2  2  2  2  2  2  2  806  813  821  822  836  844  845  846  847  849  0.01  -0.02  0.00  -0.01  -0.02  0.00  0.04  -0.01  -0.01  0.03  0.05  0.00  0.05  0.00  0.05  -0.02  0.01  -0.02  0.01  -0.02  0.11  -0.03  0.04  -0.01  0.12  0.00  0.06  -0.03  0.02  -0.01  0.31  0.05  0.07  0.03  0.22  0.05  0.32  0.09  0.04  0.11  N  N  N  N  N  N  N  N  N  N  0.26  0.07  0.10  0.05  0.23  0.03  0.19  0.09  0.02  0.08  POS  POS  POS  POS  POS  POS  POS  N  POS  POS  0.58  0.22  0.15  0.41  0.79  0.31  1.00  0.75  0.43  0.45  POS  POS  POS  POS  POS  POS  POS  POS  POS  POS  2.51  0.83  1.12  1.78  2.93  1.72  2.80  2.57  2.05  1.97  POS  POS  POS  POS  POS  POS  POS  POS  POS  POS  3.22  1.47  2.28  2.37  3.52  2.33  3.44  3.17  2.94  2.48  N  POS  N  N  POS  POS  N  POS  POS  N  3.34  1.73  2.52  2.01  3.62  2.17  3.26  3.06  2.96  2.56  N  N  N  POS  N  N  N  N  N  N
  平均值  0.00  0.01  0.03  0.13  0.11  0.51  2.03  2.72  2.72  3  3  3  3  3  3  3  3  3  3  811  815  819  823  831  833  840  841  843  848  平均值  -0.03  0.00  -0.01  0.00  0.00  -0.02  0.00  -0.02  0.00  0.03  0.00  -0.02  -0.01  0.00  -0.01  -0.02  -0.02  -0.02  -0.01  -0.02  -0.02  -0.02  0.02  0.06  0.04  0.03  0.00  0.00  0.01  -0.02  -0.01  0.00  0.01  0.00  0.06  0.01  0.02  0.01  0.01  0.05  0.06  0.02  0.02  0.03  N  N  N  N  N  N  N  N  N  N  0.01  0.03  0.02  0.01  0.01  0.01  0.12  0.06  0.02  0.05  0.03  POS  POS  POS  POS  POS  POS  POS  POS  N  POS  0.05  0.07  0.08  0.04  0.07  0.03  0.18  0.14  0.11  0.10  0.09  POS  POS  POS  N  POS  POS  POS  POS  POS  POS  0.55  0.57  0.25  0.44  0.78  0.15  0.41  0.71  0.41  0.30  0.46  POS  POS  POS  POS  POS  POS  POS  POS  POS  POS  1.44  1.32  0.87  1.13  1.48  0.43  1.30  1.33  0.84  0.74  1.09  POS  POS  POS  POS  N  POS  POS  POS  N  N  1.77  1.33  1.13  1.61  1.75  0.90  2.15  1.50  0.80  1.35  1.43  N  N  N  N  POS  N  POS  N  N  N  4  4  4  4  4  4  4  4  4  4  803  804  805  810  817  828  834  737  838  850  平均值  -0.03  0.01  0.03  0.01  0.03  -0.02  -0.01  0.00  0.00  0.04  0.01  0.00  -0.03  -0.01  -0.06  -0.02  -0.03  -0.02  -0.03  -0.01  -0.01  -0.02  0.04  0.02  -0.03  -0.03  -0.15  0.04  0.03  0.01  0.00  0.03  0.00  0.04  0.12  0.00  0.08  -0.02  0.00  0.00  0.03  0.08  0.09  0.04  N  N  N  N  N  N  N  N  N  N  0.04  0.11  -0.01  0.08  -0.01  -0.01  0.00  0.03  0.11  0.06  0.04  N  N  N  N  N  N  N  N  N  N  0.04  0.12  0.00  0.06  -0.01  0.01  0.00  0.05  0.11  0.07  0.05  N  N  N  N  N  N  N  N  N  N  0.02  0.08  0.01  0.02  -0.04  -0.02  -0.17  0.02  0.09  0.08  0.0I  N  N  N  N  N  N  N  N  N  N  0.01  0.13  -0.01  0.02  -0.04  0.00  -0.02  0.03  0.07  0.07  0.03  N  N  N  N  N  N  N  N  N  N  -0.02  0.10  -0.03  0.02  -0.10  -0.01  -0.01  -0.02  0.01  0.06  0.00  N  N  N  N  N  N  N  N  N  N
从激发前两天到激发后整14天内监测猪温度。整个激发期间，组4未免疫接种/未激发对照的基线组平均温度为103.4。
在激发后的一些点，所有PRRSV激发组的组平均温度升高，但是，在激发后组平均温度到达峰值的天数中存在暂时差异。所有用PRRSV激发的组中，组平均峰温度为105.9-106.1，而阴性对照组的平均峰温度为103.9。组3显示激发后温度梯度升高，激发后第9天达到峰值106.1。组1和2在激发后两天时显示温度急剧升高，峰值温度各为105.9和105.6。注意，组1和2中DNA免疫接种猪激发后温度快速升高的方式与PRRS KV免疫接种动物激发后应答的方式相类似。观察到，用实验PRRS KV原型免疫接种的猪通常是“体液致敏(humorally-primed)”的(即免疫接种后对PRRSV呈血清阳性)。免疫接种这些实验PRRS KV原型的动物还显示激发后很快温度就快速升高，正如在本实验组1和2的DNA免疫接种猪中所见。这种PRRSV激发后快速温度升高的相似性是DNA免疫接种猪的免疫系统确实对PRRSV抗原致敏的另一种指标。
在成功PRRSV激发中，组3猪显示特征性肺损伤。尸体解剖，组4猪没有肺损伤。组1和2猪组的平均肺损伤分别为19.84和28.42。各个猪的肺评分记录在表6中。
           表6    组    动物    肺评分    1    1    1    1    1    1    1    1    1    1    802    808    812    814    818    826    830    832    839    842    平均值    2.00    0.90    55.00    0.20    1.00    ND    70.00    2.90    26.75    ND    19.84    2    2    2    2    2    2    806    813    821    822    836    844    23.00    32.50    4.00    28.95    37.50    67.00    2    2    2    2    845    846    847    849    平均值    16.70    52.50    14.00    8.00    28.42    3    3    3    3    3    3    3    3    3    3    811    815    819    823    831    833    840    841    843    848    平均值    2.75    33.50    51.00    72.00    75.00    15.50    39.00    37.50    9.50    41.00    37.68    4    4    4    4    4    4    4    4    4    4    803    804    805    810    817    828    834    837    838    850    平均值    0.00    0.00    0.00    0.00    0.00    0.00    0.00    0.00    0.00    0.00    0.00
由这些结果可清楚地得出，在呼吸模型中，包含PRRSV基因组各区域的DNA疫苗可诱导对毒性激发的保护作用。
                                   序列表
<110>勃林格殷格翰动物保健有限公司(Boehringer Ingelheim Vetmedica，Inc.)
     E.M.瓦格恩(VAUGHN，Eric M.)
     R.斯塔莫(STAMMER，Richard)
<120>PRRSV亚单位疫苗
<130>35072-PR0
<160>14
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>15411
<212>DNA
<213>猪生殖和呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus)
<400>1
atgacgtata ggtgttggct ctatgccttg gcatttgtat tgtcaggagc tgtgaccatt     60
ggcacagccc aaaacttgct gcacagaaac acccttctgt gatagcctcc ttcaggggag    120
cttagggttt gtccctagca ccttgcttcc ggagttgcac tgctttacgg tctctccacc    180
cctttaacca tgtctgggat acttgatcgg tgcacgtgta cccccaatgc cagggtgttt    240
atggcggagg gccaagtcta ctgcacacga tgcctcagtg cacggtctct ccttcccctg    300
aacctccaag tttctgagct cggggtgcta ggcctattct acaggcccga agagccactc    360
cggtggacgt tgccacgtgc attccccact gttgagtgct cccccgccgg ggcctgctgg    420
ctttctgcaa tctttccaat cgcacgaatg accagtggaa acctgaactt ccaacaaaga    480
atggtacggg tcgcagctga gctttacaga gccggccagc tcacccctgc agtcttgaag    540
gctctacaag tttatgaacg gggttgccgc tggtacccca ttgttggacc tgtccctgga    600
gtggccgttt tcgccaattc cctacatgtg agtgataaac ctttcccggg agcaactcac    660
gtgttgacca acctgccgct cccgcagaga cccaagcctg aagacttttg cccctttgag    720
tgtgctatgg ctactgtcta tgacattggt catgacgccg tcatgtatgt ggccgaaagg    780
aaagtctcct gggcccctcg tggcggggat gaagtgaaat ttgaagctgt ccccggggag    840
ttgaagttga ttgcgaaccg gctccgcacc tccttcccgc cccaccacac agtggacatg    900
tctaagttcg ccttcacagc ccctgggtgt ggtgtttcta tgcgggtcga acgccaacac    960
ggctgccttc ccgctgacac tgtccctgaa ggcaactgct ggtggagctt gtttgacttg   1020
cttccactgg aagttcagaa caaagaaatt cgccatgcta accaatttgg ctaccagacc   1080
aagcatggtg tctctggcaa gtacctacag cggaggctgc aagttaatgg tctccgagca   1140
gtaactgacc taaacggacc tatcgtcgta cagtacttct ccgttaagga gagttggatc   1200
cgccatttga aactggcggg agaacccagc tactctgggt ttgaggacct cctcagaata   1260
agggttgagc ctaacacgtc gccattggct gacaaggaag aaaaaatttt ccggtttggc   1320
agtcacaagt ggtacggcgc tggaaagaga gcaagaaaag cacgctcttg tgcgactgct   1380
acagtcgctg gccgcgcttt gtccgttcgt gaaacccggc aggccaagga gcacgaggtt   1440
gccggcgcca acaaggctga gcacctcaaa cactactccc cgcctgccga agggaattgt   1500
ggttggcact gcatttccgc catcgccaac cggatggtga attccaaatt tgaaaccacc    1560
cttcccgaaa gagtgagacc tccagatgac tgggctactg acgaggatct tgtgaatgcc    1620
atccaaatcc tcagactccc tgcggcctta gacaggaacg gtgcttgtac tagcgccaag    1680
tacgtactta agctggaagg tgagcattgg actgtcactg tgacccctgg gatgtcccct    1740
tctttgctcc ctcttgaatg tgttcagggc tgttgtgggc acaagggcgg tcttggttcc    1800
ccagatgcag tcgaggtctc cggatttgac cctgcctgcc ttgaccggct ggctgaggtg    1860
atgcacctgc ctagcagtgc tatcccagcc gctctggccg aaatgtctgg cgattccgat    1920
cgttcggctt ctccggtcac caccgtgtgg actgtttcgc agttctttgc ccgtcacagc    1980
ggagggaatc accctgacca agtgcgctta gggaaaatta tcagcctttg tcaggtgatt    2040
gaggactgct gctgttccca gaacaaaacc aaccgggtca ccccggagga ggtcgcagca    2100
aagattgacc tgtacctccg tggtgcaaca aatcttgaag aatgcttggc caggcttgag    2160
aaagcgcgcc cgccacgcgt aatcgacacc tcctttgatt gggatgttgt gctccctggg    2220
gttgaggcgg caacccagac gatcaagctg ccccaggtca accagtgtcg tgctctggtc    2280
cctgttgtga ctcaaaagtc cttggacaac aactcggtcc ccctgaccgc cttttcactg    2340
gctaactact actaccgtgc gcaaggtgac gaagttcgtc accgtgaaag actaaccgcc    2400
gtgctctcca agttggaaaa ggttgttcga gaagaatatg ggctcatgcc aaccgagcct    2460
ggtccacggc ccacactgcc acgcgggctc gacgaactca aagaccagat ggaggaggac    2520
ttgctgaaac tggctaacgc ccagacgact tcggacatga tggcctgggc agtcgagcag    2580
gttgacctaa aaacttgggt caagaactac ccgcggtgga caccaccacc ccctccgcca    2640
aaagttcagc ctcgaaaaac gaagcctgtc aagagcttgc cggagagaaa gcctgtcccc    2700
gccccgcgca ggaaggttgg gtccgattgt ggcagcccgg tttcattagg cggcgatgtc    2760
cctaacagtt gggaagattt ggctgttagt agcccctttg atctcccgac cccacctgag    2820
ccggcaacac cttcaagtga gctggtgatt gtgtcctcac cgcaatgcat cttcaggccg    2880
gcgacaccct tgagtgagcc ggctccaatt cccgcacctc gcggaactgt gtctcgaccg    2940
gtgacaccct tgagtgagcc gatccctgtg cccgcaccgc ggcgtaagtt tcagcaggtg    3000
aaaagattga gttcggcggc ggcaatccca ccgtaccagg acgagcccct ggatttgtct    3060
gcttcctcac agactgaata tgaggcctct cccccagcac cgccgcagag cgggggcgtt    3120
ctgggagtag aggggcatga agctgaggaa accctgagtg aaatctcgga catgtcgggt    3180
aacattaaac ctgcgtccgt gtcatcaagc agctccttgt ccagcgtgag aatcacacgc    3240
ccaaaatact cagctcaagc catcatcgac tcgggcgggc cctgcagtgg gcatctccaa    3300
gaggtaaagg aaacatgcct tagtgtcatg cgcgaggcat gtgatgcgac taagcttgat    3360
gaccctgcta cgcaggaatg gctttctcgc atgtgggatc gggtggacat gctgacttgg    3420
cgcaacacgt ctgtttacca ggcgatttgc accttagatg gcaggttaaa gttcctccca    3480
aaaatgatac tcgagacacc gccgccctat ccgtgtgagt ttgtgatgat gcctcacacg    3540
cctgcacctt ccgtaggtgc ggagagcgac cttaccattg gctcagttgc tactgaagat    3600
gttccacgca tcctcgagaa aatagaaaat gtcggcgaga tggccaacca gggacccttg    3660
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cgggttaaaa agcctcgtgt tgggtggcag aaaagctgtt aaacagggag tggtaaacct    14880
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cagtcaatca gctgtgccag atgctgggta agatcatcgc tcagcaaaac cagtccagag    15000
gcaagggacc gggaaagaaa aataagaaga aaaacccgga gaagccccat tttcctctag   15060
cgactgaaga tgatgtcaga catcacttta cccctagtga gcggcaattg tgtctgtcgt   15120
caatccagac cgcctttaat caaggcgctg ggacttgcac cctgtcagat tcagggagga   15180
taagttacac tgtggagttt agtttgccta cgcatcatac tgtgcgcctg atccgcgtca   15240
cagcatcacc ctcagcatga tgggctggca ttcttgaggc atctcagtgt ttgaattgga   15300
agaatgtgtg gtgaatggca ctgattgaca ttgtgcctct aagtcaccta ttcaattagg   15360
gcgaccgtgt gggggtgaga tttaattggc gagaaccatg cggccgaaat t            15411
<210>2
<211>939
<212>DNA
<213>猪生殖和呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus)
<400>2
atgtctggga tacttgatcg gtgcacgtgt acccccaatg ccagggtgtt tatggcggag      60
ggccaagtct actgcacacg atgcctcagt gcacggtctc tccttcccct gaacctccaa     120
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atctttccaa tcgcacgaat gaccagtgga aacctgaact tccaacaaag aatggtacgg     300
gtcgcagctg agctttacag agccggccag ctcacccctg cagtcttgaa ggctctacaa     360
gtttatgaac ggggttgccg ctggtacccc attgttggac ctgtccctgg agtggccgtt     420
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gccttcacag cccctgggtg tggtgtttct atgcgggtcg aacgccaaca cggctgcctt     780
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aaggagagtt ggatccgcca tttgaaactg gcgggagaac ccagctactc tgggtttgag     120
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<400>4
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