一种诱导CD4SUP/SUPCD25SUP/SUP调节性T细胞的多肽及应用.pdf

本发明属于免疫学领域，具体涉及一种诱导CD4+CD25+调节性T细胞(Tregs)、具免疫抑制作用的血吸虫来源的多肽及应用。所说的能诱导CD4+CD25+Tregs的多肽，其氨基酸序列为VPGGGTALLRCIPVLDTLSTKNED。该多肽体内免疫或体外预处理小鼠脾、淋巴结细胞后，均显著增加了CD4+CD25+Foxp3+T细胞的数量；肽体内免疫或体外预处理小鼠CD4+CD25+Tregs细胞后，均显著增强了CD4+CD25+Tregs的抑制功能。本发明提供的多肽，可有效抑制炎症病理反应，具有广阔的应用前景。

1、  一种能诱导CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的多肽，其特征在于，其氨基酸序列为VPGGGTALLRCIPVLDTLSTKNED，如SEQ.ID.NO.1。

2、  权利要求1所说的能诱导CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的多肽具有增强CD4⁺CD25⁺调节性T细胞抑制效应的作用。

3、  权利要求1所说的能诱导CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的多肽作为增强CD4⁺CD25⁺调节性T细胞抑制效应的免疫抑制剂的应用。

4、  权利要求1所说的能诱导CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的多肽在制备治疗免疫反应引起的炎症性疾病药物中的应用。

一种诱导CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的多肽及应用
技术领域
本发明属于免疫学领域，具体涉及一种诱导CD4⁺CD25⁺调节性T细胞、具免疫抑制作用的血吸虫来源的多肽及应用。
背景技术
近些年来，“卫生假说”认为，西方发达国家过敏性疾病及自身免疫病的发病率明显增高，是由于幼年时获感染的机率降低所致。在人类与病原体共同进化的历史长河中，病原体已进化出多种机制来调节宿主的免疫调控网络。其中最重要的一个机制就是病原体感染能诱导产生调节性T细胞----专职的具免疫抑制功能的免疫细胞，主要包括在外周抗原激活诱导的Trl细胞、Th3细胞、CD4⁺CD25⁺T调节细胞(T regulatory cells，Tregs)等，对维持外周免疫耐受、控制宿主免疫病理损伤等具有重要作用，同时也可能帮助病原体抑制机体免疫功能、逃避机体抗感染免疫反应，有利于病原体在宿主体内长期持续感染。因而，模拟诱导病原体调节宿主免疫功能可用来开发一种新免疫治疗策略：即运用具免疫调节(特指诱导免疫抑制)功能的病原体和/或它的特定抗原，通过诱导CD4⁺CD25⁺Treg细胞等介导免疫抑制，从而对自身免疫病、过敏性疾病、器官移植后免疫排斥等起到治疗作用(Padraic G.Fallon1 and Antonio Alcami.Pathogen-derived immunomodulatory molecules：future immunotherapeutics？TRENDS in Immunology，2006，Vol.27 No.10：470-476)。
血吸虫感染是一种典型的慢性感染模型，大量研究已经明确证明它能诱导机体产生Tregs，从而抑制机体免疫功能。而且，研究也已表明，血吸虫感染或暴露于血吸虫来源的抗原可预防1型糖尿病(IDDM)、多发性硬化症(Multiple sclerosis，MS)、克罗恩病(Cronh’sdisease)等Th1类细胞介导的疾病；还可以预防过敏性疾病如哮喘，Th2类细胞介导的疾病。进一步的机制研究表明，血吸虫在哺乳动物宿主体内不同生活史阶段产生的抗原分子可诱导宿主产生Tregs，有效抑制Th1、Th2细胞介导的疾病(David W.Dunne andAnne Cooke.Aworm’s eye view of the immune system：consequences for evolution of human autoimmunedisease.Nat.Rev.Immunol.2005，5：420-426)。因而，利用具有免疫调节功能的病原体来治疗无关的免疫性疾病、尤其更为合理的方法是分离、鉴定、制备并应用这样一种病原体来源的具有免疫调节性的抗原分子来模拟病原体感染后诱导Tregs的效应，将是一种新颖的治疗自身免疫病、过敏性疾病等、器官移植后免疫排斥等免疫性疾病的治疗方法。
目前，利用抗原或多肽治疗自身免疫病或过敏性疾病的研究中，主要是利用口服自身抗原、过敏原来诱导产生调节性T细胞，进而诱导耐受，预防疾病的发生。在NOD(非肥胖性糖尿病)小鼠中，口服人胰岛素可诱导产生CD4⁺Tregs，使小鼠对随后注射胰岛素的刺激产生耐受。同样，在变应性脑脊髓炎的小鼠模型中，皮内免疫过敏原可诱导产生抗原特异性的CD4⁺Tregs，从而抑制免疫反应，减少小鼠变应性脑脊髓炎的发生。但是，完整的抗原或蛋白免疫可能交叉连接IgE，从而活化过敏性个体体内的肥大细胞和嗜碱性粒细胞，引发更严重的过敏性疾病；或活化自身免疫病患者体内的致病性B、T细胞，加剧病情恶化。例如，狨猴利用髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白进行耐受治疗，可保护狨猴抗自身免疫性脑脊髓膜炎的发生，但同时也引发了严重的、致死性脱髓鞘疾病。因而，鉴定具有治疗作用的表位肽(仅是全长抗原的一个小片段)应该既能起到免疫治疗作用、又可减少不良副反应，将是一种新的、很有前景的治疗策略(Mark Larche，David C Wraith.Peptide-based therapeutic vaccines for allergic and autoimmune diseases.Natrue medicinesupplement.2005，11(4)：S69-S76)，(MichaelSela，Edna Mozes.Therapeutic vaccines inautoimmunity.PNAS，2004，101(2)：14586-14592)。
综上所述，目前主要在国外，能诱导Tregs的多肽已被成功地尝试用于治疗多种自身免疫病和过敏性疾病，并取得了较好的治疗效果。但选择合适的表位和相应的表位肽是治疗成功的关键。因而，分离、鉴定能诱导Tregs的病原体来源多肽如血吸虫来源多肽以用于模拟病原体感染产生的免疫抑制效应，将是十分关键的因素。但是，国内目前还没有关于能诱导Tregs并具免疫抑制性的病原体多肽的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种能诱导CD4⁺CD25⁺调节性T细胞、具有免疫抑制性的多肽。
本发明所说的能诱导CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的多肽，其氨基酸序列为VPGGGTALLRCIPVLDTLSTKNED，如SEQ.ID.NO.1。发明人从编码日本血吸虫T表位的多肽中，基于发明人经筛选得到的上述序列。
上述所说的多肽具有增强CD4⁺CD25⁺调节性T细胞抑制效应的作用。
上述所说的多肽作为增强CD4⁺CD25⁺调节性T细胞抑制效应的免疫抑制剂的应用。
上述所说的多肽在制备治疗由免疫反应引起的炎症性疾病药物中的应用。
经实验表明，本发明所说的肽体内免疫或体外预处理小鼠脾、淋巴结细胞后，均显著增加了CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞的数量；肽体内免疫或体外预处理小鼠CD4⁺CD25⁺Tregs细胞后，均显著增强了Tregs的抑制功能。
本发明提供有多肽，可有效抑制炎症病理反应，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1 SJMHE1增加CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T cells数量
A：SJMHE1体内免疫BALB/c小鼠，增加CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T cells数量；
B：SJMHE1体外预处理naive小鼠脾、淋巴细胞4d后，增加CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T cells数量；
C：SJMHE1体内免疫BALB/c小鼠，CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T cells检测流式图；
D：SJMHE1体外预处理naive小鼠脾、淋巴细胞4d后，CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T cells检测流式图；
图2 SJMHE1增强CD4⁺CD25⁺Tregs的抑制功能
A：SJMHE1体内免疫小鼠，SJMHE1增强CD4⁺CD25⁺Tregs的抑制功能
B：SJMHE1体外预处理naive小鼠CD4⁺CD25⁺T细胞，增强其免疫抑制功能
图3 IL-10、TGF-β1均参与了SJMHE1增强CD4⁺CD25⁺Tregs抑制效应的作用机制；
A：SJMHE1体内免疫小鼠，Transwell实验证明，IL-10、TGF-β1均参与了肽增强CD4⁺CD25⁺Tregs的抑制效应；
B：体外预处理naive小鼠CD4⁺CD25⁺T细胞，Transwell实验证明，IL-10、TGF-β1均参与了肽增强CD4⁺CD25⁺Tregs的抑制效应；
图4 SJMHE1诱导的CD4⁺CD25⁺Tregs抑制DTH反应和脾、淋巴细胞的增生；
A：SJMHE1体内免疫诱导的CD4⁺CD25⁺Tregs抑制DTH反应；
B：SJMHE1诱导的CD4⁺CD25⁺Tregs抑制DTH小鼠脾、淋巴细胞对OVA抗原的增生；
C：SJMHE1诱导的CD4⁺CD25⁺Tregs抑制OVA免疫小鼠CD4⁺CD25^-对OVA抗原的增生；
图5 SJMHE1处理的BmDCs和Mφs诱导产生CD4+CD25+Tregs；
A：SJMHE1处理的BmDCs诱导产生CD4⁺CD25⁺Tregs；
B：SJMHE1处理的Mφs诱导产生CD4⁺CD25⁺Tregs；
C：SJMHE1处理的BmDCs抑制CD4⁺T细胞的增生；
D：SJMHE1处理的Mφs抑制CD4⁺T细胞的增生；
图6SJMHE1处理的BmDCs和Mφs呈不成熟的耐受表型；
A：SJMHE1处理的BmDCs和Mφs，在倒置显微镜下，其形态学分析呈未刺激的圆形形态；
B：SJMHE1处理的BmDCs和Mφs，其表面分子表达下降；
图7 SJMHE1在TLR2^-/-小鼠中不能诱导产生CD4⁺CD25⁺Tregs；
A：SJMHE1体内免疫TLR2^-/-、TLR4^-/-小鼠，TLR2^-/-小鼠中不能诱导产生CD4⁺CD25⁺Tregs；
B：SJMHE1体外预处理TLR2^-/-、TLR4^-/-小鼠脾、淋巴细胞，TLR2^-/-小鼠中不能诱导产生CD4⁺CD25⁺Tregs；
C：SJMHE1体内免疫TLR2^-/-、TLR4^-/-小鼠，SJMHE1不能增强TLR2^-/-小鼠CD4⁺CD25⁺Tregs的抑制性；
D：SJMHE1体外预处理TLR2^-/-、TLR4^-/-小鼠CD4⁺CD25⁺Tregs，SJMHE1不能增强TLR2^-/-小鼠CD4⁺CD25⁺Tregs的抑制性；
图8 SJMHE1处理TLR2^-/-小鼠BmDCs和BmMφs不能诱导产生CD4⁺CD25⁺Tregs；
A：SJMHE1体内免疫TLR2^-/-、TLR4^-/-小鼠，分离小鼠BmDCs/BmMφs，SJMHE1不能诱导TLR2^-/-小鼠BmDCs/BmMφs产生CD4⁺CD25⁺Tregs；
B：SJMHE1体外预处理TLR2^-/-、TLR4^-/-小鼠BmDCs/BmMφs，SJMHE1不能诱导TLR2^-/-小鼠BmDCs/BmMφs产生CD4⁺CD25⁺Tregs。
具体实施方式：
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
实施例一：肽体内免疫或体外预处理小鼠脾、淋巴结细胞后，CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞的数量变化；
1)合成日本血吸虫一T细胞表位肽SJMHE1，其氨基酸序列(SEQ.ID.NO.1)为VPGGGTALLRCIPVLDTLSTKNED(Val Pro Gly Gly Gly Thr Ala Leu Leu Arg Cys Ile ProVal Leu Asp Thr Leu Ser Thr Lys Asn Glu Asp)。并合成对照肽OVA^323-339，其序列为(SEQ.ID.NO.2)：ISQAVHAAEINEAGRY(Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala Glu Ile Asn GluAla Gly Arg Tyr)；肽、对照肽的合成纯度均≥99％。上述多肽均由上海生工公司完成，肽的纯度大于99％，由HPLC鉴定。
2)将肽(SJMHE1)、对照肽(OVA^323-339)、PBS与IFA制成乳化剂，IFA购自Sigma公司，每100μl乳化剂中含肽、按照肽各10μg，皮下免疫小鼠，两周免疫一次，共免疫两次；即：每次在小鼠背部皮射100μl SJMHE1的乳化剂(含10μgSJMHE1)、OVA^323-339乳化剂(含10μg OVA^323-339)或PBS乳化剂。清洁级BALB/c小鼠：购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，8周龄，雌性。
3)分离各组免疫小鼠的脾、淋巴结，制成单细胞悬液，经红细胞裂解液裂解红细胞后，取含有106个细胞的悬液，加入染色缓冲液至终体积为100μl。加入0.25μg PerCP标记大鼠抗小鼠CD3单克隆抗体、0.125μg FITC标记大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体和0.06μgAPC标记大鼠抗小鼠CD25单克隆抗体，4℃避光孵育30min，以标记细胞表面CD3、CD4和CD25抗原。将标记了表面抗原的细胞悬液经固定、破膜后，加Fc阻断剂，阻断抗体的非特异性结合后，加入0.5μg PE标记大鼠抗小鼠Foxp3单克隆抗体，4℃避光孵育30min，进行胞内染色。最后将标记好的细胞经缓冲液洗涤后，用500μl重悬，经FACSCalibur流式细胞仪检测CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞的数量、比例。实验中所用CD4、CD25、Foxp3流式检测抗体购自eBioscience公司的Mouse Regulatory T cell Staining Kit(货号：88-88111-40)；PerCP标记的抗CD3抗体购自eBioscience公司，货号为：553067。
4)分离naive小鼠的脾、淋巴结，制成单细胞悬液，经红细胞裂解液裂解红细胞后，24孔培养板中每孔含10⁶个细胞，同时加入1μg/ml SJMHE1或OVA^323-339，在完全1640培养液中，37℃，5％CO₂孵箱培养4d后，按上述步骤3)的方法标记表面CD3、CD4、CD25分子，以及胞内Foxp3分子，经FACSCalibur流式细胞仪检测CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞的数量、比例。
结果如图1所示，肽体内免疫或体外预处理小鼠脾、淋巴结细胞后，均显著增加了CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞的数量；
实施例二：肽体内免疫或体外预处理小鼠CD4⁺CD25⁺Tregs细胞后，对Tregs抑制功能的影响；
1)按上述实施例一中的方法免疫小鼠，分离各组免疫小鼠的脾、淋巴结，制成单细胞悬液，经红细胞裂解液裂解红细胞后，用Mouse CD4⁺CD25⁺Regulatory T cell IsolationKit(购自Miltenyi Biotec公司，货号：130-091-041)分离小鼠CD4⁺CD25⁺、CD4⁺CD25^-T细胞；非CD4⁺细胞经50μg/ml丝裂霉素，37℃，5％CO₂孵箱处理30min后，为APC。取5×10⁴/孔纯化的CD4⁺CD25⁺T细胞、1×10⁵/孔CD4⁺CD25^-T细胞、1×10⁵/孔APC，加0.1μg/ml SJMHE1或OVA^323-339，在抗-CD3刺激下，37℃，5％CO₂孵箱培养3d后，以³H掺入法检测肽对CD4⁺CD25⁺Tregs抑制功能的影响，即细胞收获前16～18h加入³H-TdR，0.5uCi/孔，Beckman液闪仪测定cpm值。(抗-CD3抗体购自BD Pharmingen公司，货号：553057)
2)分离naive小鼠的脾、淋巴结，制成单细胞悬液，经红细胞裂解液裂解红细胞后，按上述步骤1)的方法分离小鼠CD4⁺CD25⁺、CD4⁺CD25^-T细胞、及APC；用0.1μg/mlSJMHE1或OVA^323-339在37℃，5％CO₂孵箱中预处理CD4⁺CD25⁺T细胞30min后，按上述步骤1)的细胞比例与CD4⁺CD25^-T细胞、APC共培养，以³H掺入法检测肽体外预刺激CD4⁺CD25⁺Tregs后，对其抑制功能的影响。
结果如图2所示，肽体内免疫或体外预处理小鼠CD4⁺CD25⁺Tregs细胞后，均显著增强了Tregs的抑制功能；
实施例三：肽体内免疫或体外预处理小鼠CD4⁺CD25⁺Tregs细胞后，肽对CD4⁺CD25⁺Tregs抑制效应影响的作用机制；
1)按上述实施例一中的方法免疫小鼠，分离各组免疫小鼠的脾、淋巴结，制成单细胞悬液，经红细胞裂解液裂解红细胞后，按上述实施例二中的方法分离小鼠CD4⁺CD25⁺、CD4⁺CD25^-T细胞；非CD4⁺细胞经50μg/ml丝裂霉素，37℃，5％CO₂孵箱处理30min后，为APC。在24孔培养板中加入0.4μm Millicell(Millipore公司，半透膜隔板，可将细胞隔开，只允许可溶性的分子通过)，取2.5×10⁴/孔纯化的CD4⁺CD25⁺T细胞加入Millicell的上部、5×10⁵/孔CD4⁺CD25^-T细胞加入Millicell的下部；5×10⁵/孔APC和0.1μg/mlSJMHE1上下部均加入，在抗-CD3刺激下，37℃，5％CO₂孵箱培养3d后，以³H掺入法检测肽对CD4⁺CD25⁺Tregs抑制功能的影响。同时有些孔加入3μg/ml大鼠抗小鼠IL-10IgG1型单克隆抗体(Biolegend公司，货号：504903)、0.5μg/ml大鼠抗小鼠TGF-β1 IgG1型单克隆抗体(USBiological公司，货号：T8250-16A)，或者两种抗体均加入，检测IL-10、TGF-β1是否参与肽对CD4⁺CD25⁺Tregs抑制功能影响的作用机制；
2)分离naive小鼠的脾、淋巴结，制成单细胞悬液，经红细胞裂解液裂解红细胞后，按上述实施例二中的方法分离小鼠CD4⁺CD25⁺、CD4⁺CD25^-T细胞、及APC；用0.1μg/mlSJMHE1在37℃，5％CO₂孵箱预处理CD4⁺CD25⁺T细胞30min后，按上述步骤1)的细胞比例、培养方式与CD4⁺CD25^-T细胞、APC共培养，以³H掺入法检测肽体外预刺激CD4⁺CD25⁺Tregs后，IL-10、TGF-β1是否参与肽对CD4⁺CD25⁺Tregs抑制功能影响的作用机制；
结果如图3所示，肽体内免疫或体外预处理小鼠CD4⁺CD25⁺Tregs细胞，IL-10、TGF-β1均参与了肽增强CD4⁺CD25⁺Tregs抑制效应的作用机制；
实施例四：建立迟发型超敏反应模型(DTH)，检测肽诱导的CD4⁺CD25⁺Tregs体内的调节效应；
1)分离SJMHE1、OVA^323-339免疫小鼠CD4⁺CD25⁺、CD4⁺CD25^-T细胞，立即尾静脉过继转移入8w龄BALB/c小鼠，每只注射1×10⁶，1d后，各组小鼠足垫部免疫100μl含100μg OVA(fraction V，Sigma公司)的乳化剂，CFA乳化(完全福氏佐剂，Sigma公司)。小鼠足垫部免疫OVA 13d后，左耳皮下注射20μl OVA(1mg/ml)，右耳皮下注射20μl PBS；建立DTH小鼠模型；24h后，用游标卡尺(Mitutoyo公司)检测小鼠耳朵厚度的改变，即：左耳的厚度减去右耳的厚度。
2)上述步骤1)中各组经过继转移SJMHE1、OVA^323-339免疫小鼠CD4⁺CD25⁺、CD4⁺CD25^-T细胞，并经OVA免疫和激发DTH模型小鼠，脱臼处死后，按前述方法制备脾、淋巴结单个核细胞悬液，在96孔圆底培养板中，每孔5×10⁵细胞，并分别加入1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml OVA刺激，37℃，5％CO₂孵箱培养3d后，以³H掺入法检测脾、淋巴结单个核细胞对OVA刺激的增殖反应能力；
3)BALB/c小鼠皮下免疫100μg OVA的乳化剂(CFA乳化)，2w后分离免疫小鼠CD4⁺CD25^-T细胞、APC。同时，分离SJMHE1、OVA^323-339免疫小鼠CD4⁺CD25⁺T细胞，在96孔圆底培养板中，每孔加上述1×10⁵CD4⁺CD25⁺T细胞，1×10⁵CD4⁺CD25^-T细胞、1×10⁵APC，并在100μg/ml OVA刺激下，37℃，5％CO₂孵箱培养3d后，以³H掺入法检测免疫小鼠CD4⁺CD25^-T细胞对OVA刺激的增殖反应能力；
结果如图4所示，转移了肽免疫产生的CD4⁺CD25⁺Tregs，能显著减轻DTH小鼠的病理改变，减少外周脾、淋巴细胞对OVA的刺激反应；肽免疫产生的CD4⁺CD25⁺Tregs能显著抑制OVA免疫小鼠CD4⁺CD25^-T细胞对OVA刺激的增生反应。
实施例五：肽处理巨噬细胞(Mφs)、树突状细胞(DCs)后，与naive CD4⁺T细胞共培养，检测CD4⁺T细胞中CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞的数量变化及其增殖能力；研究肽通过何种APC诱导产生CD4⁺CD25⁺Tregs；
1)取BALB/c小鼠股骨、胫骨，尽量去除周围组织肌肉，PBS、不完全1640洗涤后，用镊子固定长骨，剪刀剪去骨两端，用5ml注射器抽取不完全1640，针头分别从两端插入骨髓腔，反复冲洗骨髓至培养皿中，直至骨变白；收集含骨髓前体细胞的不完全1640，经红细胞裂解后，置37℃，5％CO₂孵箱内孵育3h，吸出悬浮和半贴壁细胞，离心弃上清后，用DC培养液重悬(加入了诱导DC细胞分化的细胞因子1ng/ml rGM-CSF、1ng/mlrIL-4，均购自Peprotech公司，货号分别为：500-P65、500-P54)，计数后调整密度为6×10⁵/ml，加入24孔培养板中培养；同时，有些培养孔中加入1μg/ml SJMHE1或OVA^323-339刺激BmDCs；培养周期为8d，有些培养孔在培养6d时加入1μg/ml LPS，诱导BmDCs成熟，作为SJMHE1、OVA^323-339处理BmDCs的对照；同时设不加任何刺激剂的medium为阴性对照。
2)24孔培养板中，每孔6×10⁵小鼠巨噬细胞系RAW264.7(Mφs)，购自AmericanType Culture Collection(Manassas，VA)，有些培养孔中加入1μg/ml SJMHE1或OVA^323-339刺激Mφs；培养周期为2d，有些培养孔在培养24h后加入1μg/ml LPS，诱导Mφs成熟，作为SJMHE1、OVA^323-339处理Mφs的对照；同时设不加任何刺激剂的medium为阴性对照。
3)收集经不同处理的用染色缓冲液洗涤后，取5×10⁵细胞重悬于染色缓冲液中，然后按说明书加入FITC-CD80(货号：11-0801-81)、PE-CD40(货号：12-0401-81)、PE-CD86(货号：12-0862-81)、FITC-MHCII(货号：11-5321-82)，均购自eBioscience公司，检测表面分子的表达变化。
4)用Mouse CD4⁺T Cell Isolation Kit(购自Miltenyi Biotec公司，货号：130-090-860)分离naive小鼠的CD4⁺T细胞，与上述步骤1)、2)中SJMHE1、OVA^323-339、LPS、medium处理BmDCs/Mφs共培养(BmDCs/Mφs经50μg/ml丝裂霉素处理)，37℃，5％CO₂孵箱内孵育3d后，按前述实施例一中的方法，流式细胞仪检测CD4⁺T细胞中CD4⁺CD25⁺Tregs数量、比例；同时，以³H掺入法检测CD4⁺T细胞的增殖能力；
结果如图5、图6所示，CD4⁺T细胞与肽处理的共培养后，能诱导CD4⁺T细胞中CD4⁺CD25⁺Tregs数量的增加；而且，CD4⁺T细胞的增生能力显著减低；肽处理的BmDCs/Mφs呈不成熟的耐受表型，其表面分子的表达水平降低。
实施例六：肽体内免疫或体外预处理TLR2^-/-、TLR4^-/-小鼠脾、淋巴结细胞后，CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞的数量、功能变化；鉴定肽通过何种TLR诱导产生CD4⁺CD25⁺Tregs；
TLR2^-/-、TLR4^-/-小鼠：购自南京大学国家小鼠遗传资源中心，8周龄，雌性。
1)按前述实施例一中的方法体内免疫或体外预处理TLR2^-/-、TLR4^-/-小鼠脾、淋巴结细胞后，流式细胞仪检测CD4⁺CD25⁺Tregs数量、比例；
2)按前述实施例二中的方法体内免疫或体外预处理TLR2^-/-、TLR4^-/-小鼠CD4⁺CD25⁺Tregs细胞后，以³H掺入法检测肽对TLR2^-/-、TLR4^-/-小鼠CD4⁺CD25⁺Tregs抑制功能的影响；
结果如图7所示，肽体内免疫或体外预处理TLR2^-/-、TLR4^-/-小鼠脾、淋巴结细胞后，TLR4^-/-小鼠的CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞的数量增加，功能增强，而TLR2^-/-小鼠的CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞的数量不增加，功能也不增强，即：肽在TLR2^-/-小鼠中不能诱导产生CD4⁺CD25⁺Tregs。提示，肽诱导产生CD4⁺CD25⁺Tregs可能通过TLR2。
实施例七：肽体内免疫或体外预处理TLR2^-/-、TLR4^-/-小鼠与naive CD4⁺T细胞共培养后，CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞的数量、功能变化；鉴定肽通过何种APC诱导产生CD4⁺CD25⁺Tregs；
1)按实施例五中的方法制备BmDCs，同时在制备的骨髓前体中细胞中加入1ng/mlrM-CSF(购自Peprotech公司，货号为：500-P62G)，诱导分化按实施例五中的方法用不同的刺激剂刺激BmDCs；按刺激BmDCs的方法刺激
2)用Mouse CD4⁺T Cell Isolation Kit(购自Miltenyi Biotec公司，货号：130-090-860)分离naive TLR2^-/-、TLR4^-/-小鼠的CD4⁺T细胞，与上述步骤1)中处理的BmDCs/BmMφs共培养(BmDCs/Mφs经50μg/ml丝裂霉素处理)，37℃，5％CO₂孵箱内孵育3d后，按前述实施例一中的方法，流式细胞仪检测CD4⁺T细胞中CD4⁺CD25⁺Tregs数量、比例；
结果如图8所示，肽体内免疫或体外预处理TLR2^-/-、TLR4^-/-小鼠BmDCs/BmMφs，TLR4^-/-小鼠BmDCs与naive CD4⁺T细胞共培养后，可诱导CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞数量的增加；而TLR2^-/-小鼠BmDCs/BmMφs均不能诱导CD4⁺T细胞中CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞数量的增加；即：肽处理TLR2^-/-小鼠BmDCs和BmMφs不能诱导产生CD4⁺CD25⁺Tregs；提示，肽可能通过DCs上的TLR2诱导产生CD4⁺CD25⁺Tregs。
以上实验说明SJMHE1可能通过DCs上的TLR2诱导产生CD4⁺CD25⁺Tregs，增强其免疫抑制功能，并在DHT模型小鼠中证实，可有效抑制炎症病理反应，具有广阔的应用前景。
本发明不限于这些公开的实施方案，本发明将覆盖在专利书中所描述的范围，以及权利要求范围的各种变型和等效变化。
SEQUENCE LISTING
<110>南京医科大学
<120>一种诱导CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的多肽及应用
<160>2
<210>1
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
Val Pro Gly Gly Gly Thr Ala Leu Leu Arg Cys Ile Pro Val Leu
1               5                   10                  15
Asp Thr Leu Ser Thr Lys Asn Glu Asp
                20              24
<210>2
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<400>2
Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg
1               5                   10                  15
Tyr
16