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本发明涉及包含多肽的新型运输分子，其中所述的多肽具有排列于这样的序列中的氨基酸残基，所述的序列为HIV-TAT蛋白质的碱性部分的反向序列。所述的新型运输多肽可用于货物分子的跨膜或细胞内递送，所述货物分子的非限定性实例包括多肽和核酸。所述的新型运输多肽可以与货物分子以共价方式或非共价方式结合。

1.  一种用于递送货物分子的运输分子，其中所述的运输分子包含反向序列多肽，该反向序列多肽具有根据SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列。

2.  根据权利要求1所述的运输分子，其中所述的反向序列多肽与所述的货物分子以共价方式连接。

3.  根据权利要求1所述的运输分子，其中所述的反向序列多肽与正电荷主链以共价方式结合，并且所述的主链与所述的货物分子以非共价方式连接。

4.  根据权利要求3所述的运输分子，其中所述的反向序列多肽与正电荷主链以共价方式结合，并且所述的主链与所述的货物分子以非共价方式结合。

5.  根据权利要求1所述的运输分子，其中所述的运输分子增加了所述货物分子穿过生物学膜的渗透。

6.  根据权利要求5所述的运输分子，其中所述的生物学膜见于皮肤中。

7.  根据权利要求1所述的运输分子，其中所述的运输分子增加了所述货物分子的细胞内渗透。

8.  一种用于递送货物分子的缀合体，其中所述的缀合体包含：
包含反向序列多肽的运输分子，所述的反向序列多肽具有在SEQ IDNO.1中列出的氨基酸序列；以及
货物分子。

9.  根据权利要求8所述的缀合体，其中所述的运输分子与所述的货物分子以共价方式连接。

10.  根据权利要求8所述的缀合体，其中所述的运输分子与所述的货物分子以非共价方式连接。

11.  根据权利要求8所述的缀合体，其中所述的货物分子为治疗试剂。

12.  根据权利要求11所述的缀合体，其中所述的治疗试剂选自：肽、蛋白质、寡核苷酸、酶和抗原。

13.  根据权利要求11所述的缀合体，其中所述的治疗试剂由肉毒杆菌毒素血清型或其片段衍生得到。

14.  根据权利要求13所述的缀合体，其中所述的诊断试剂选自：放射不可透过性造影剂、顺磁性造影剂、超顺磁性造影剂和CT造影剂。

15.  一种用于治疗疾病的方法，其中所述的方法包括：
选择货物分子；
选择运输分子；
将所述的货物分子与所述的运输分子以共价方式或非共价方式结合，从而形成货物分子/运输分子缀合体；以及
将所述的缀合体施用至靶细胞或膜，从而引起所述的货物分子的细胞内或跨膜递送。

使用反向序列HIV-TAT多肽的运输分子
相关申请的交叉引用
本申请要求2006年12月29日提交的美国临时申请系列No.60/882,639的优先权，该申请的内容以引用方式全部并入文本。
技术领域
本发明涉及包含多肽的新型运输分子(transport molecule)，其中所述的多肽具有排列于这样的序列中的氨基酸残基，所述的序列为HIV-TAT蛋白质的碱性部分的反向序列。所述的新型运输分子可用于货物分子的跨膜或细胞内递送，所述货物分子的非限定性实例包括多肽和核酸。所述的新型运输分子可以与货物分子以共价方式或非共价方式结合。本发明优选的运输分子的减小的尺寸还使对货物分子的生物学活性的干扰达到最小。
背景技术
诊断或治疗试剂的跨膜或细胞内递送通常由于该试剂不能到达所关注的组织或细胞内位点处而变得棘手。这种复杂的情况可能部分由于膜有机体已进化成将外部化合物保持在外从而作为保护有机体的方式。
例如，考虑人类皮肤的复杂结构，人类皮肤保护身体器官免受外界环境的威胁，并且起到恒温器的作用，从而保持身体温度。皮肤由多个不同的层构成，每层都具有特定的功能。主要的层包括皮下组织、真皮和表皮。皮下组织为皮肤的最深层。其既作为绝缘体以用于身体热量的保持，又作为震动吸收器以用于器官的保护(Inlander，Skin，New York，N.Y.：People′s Medical Society，1-7(1998))。此外，皮下组织还储存了脂肪以用于储能。皮肤的pH通常为5至6。这种酸性情况是由于存在皮脂腺所分泌的两性氨基酸、乳酸和脂肪酸。术语“酸性外膜(acid mantle)”是指在皮肤的大部分区域中存在的水溶性物质。皮肤的缓冲能力部分是由于在皮肤的角质层中储存的这些分泌物。
真皮，其位于皮下组织以上，为1.5至4毫米厚。真皮是皮肤的三个层中最厚的。此外，真皮还具有大部分的皮肤结构物，包括汗腺和脂腺(其通过皮肤中被称为毛孔或粉刺的孔分泌物质)、毛囊、神经末梢、血液和淋巴管(Inlander，Skin，New York，N.Y.：People′sMedical Society，1-7(1998))。然而，真皮的主要成分为结缔组织，例如胶原和弹性蛋白。
表皮为表皮细胞的层叠的层，其位于真皮上面并且为皮肤的最外层。表皮只有0.1至1.5毫米厚(Inlander，Skin，New York，N.Y.：People′s Medical Society，1-7(1998))，其由角质形成细胞构成，并且根据其分化状态而被分成多个层。表皮可以被进一步分为角质层和有活力的表皮，其由granular melphigian和基细胞构成。
通过局部或透皮施加生理学活性试剂的一个显著的问题在于皮肤是渗透的有效屏障。角质层的油性及其细胞的紧密的构造提供了针对单独使用的或者处于水或油状溶液中的气体、固体或液体化学试剂的有效屏障。因此，角质层阻挠了将治疗、化妆或诊断试剂以局部方式施加到身体的局部区域的努力。由于许多生理学活性试剂理想地应该以局部方式施加到局部化的区域中、以使该试剂的局部浓度足够高从而具有治疗益处而不会导致全身性过量，因此上述情况是成问题的。此外，治疗或诊断试剂通过胃肠道的吸收通常是不希望的，因为这可能导致该试剂通过正常的新陈代谢过程而发生不想要的化学变化。
除了诸如皮肤之类的宏观结构以外，细胞通常对许多治疗或诊断试剂是不可渗透的或者几乎不可渗透的，特别是如果所述的试剂为诸如蛋白质或核酸之类的大分子则更是如此。此外，一些小分子以极低的速率进入活细胞中。缺少在体内将大分子递送至细胞中的手段已经成为具有细胞内作用位点的、潜在大量的治疗和诊断试剂(例如蛋白质和核酸)的治疗、预防和诊断用途的障碍。
已经研发出多种在体外将大分子递送至细胞中的方法。一系列这样的方法包括电穿孔、与脂质体的膜融合、用包被有DNA的微粒进行的高速轰击、与磷酸钙-DNA沉淀物的温育、DEAE-右旋糖苷介导的转染、用经修饰的病毒核酸进行的感染、以及直接微注射到单个细胞中。这些体外方法通常将核酸分子递送至总体细胞群的仅一部分中，并且这些方法往往破坏了大量的细胞。在体内将大分子试验性地递送至细胞中已采用刮擦负载、磷酸钙沉淀和脂质体来完成。但是，到目前为止，这些技术对于体内细胞递送而言显示出有限的用途。此外，即使就体外细胞而言，这些方法对于递送蛋白质而言也具有特别有限的用途。
需要用于在体外和体内有效地将生物活性蛋白质递送至完整细胞中的一般方法(L.A.Sternson，″Obstacles to PolypeptideDelivery″，Ann.N.Y.Acad.Sci，57，pp.19-21(1987))。化学添加脂肽(P.Hoffmann et al.，″Stimulation of Human and MurineAdherent Cells by Bacterial Lipoprotein and SyntheticLipopeptide Analogues″，Immunobiol.，177，pp.158-70(1988))或者诸如聚赖氨酸或聚精氨酸之类的碱性聚合物(W.-C.Chen et al.，″Conjugation of Poly-L-Lysine Albumin and HorseradishPeroxidase：A Novel Method of Enhancing the Cellular Uptake ofProteins″，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，pp.1872-76(1978))不能证明是高度可靠的或者通常有用的。已经将叶酸用作运输部分(C.P.Leamon and Low，Delivery of Macromolecules into Living Cells：A Method That Exploits Folate Receptor Endocytosis″，Proc.Natl.Acad.Sci USA，88，pp.5572-76(1991))。已有证据表明叶酸缀合体的内化，但无细胞质递送的证据。即使在体内存在高水平的循环的叶酸，但是该系统的用途还没有完全被证明。此外，假单胞菌的外毒素也已经被用作运输部分(T.I.Prior et al.，″Barnase Toxin：A New Chimeric Toxin Composed of Pseudomonas Exotoxin A andBarnase″，Cell，64，pp.1017-23(1991))。但是，该系统用于细胞内递送生物学活性货物分子的效率和一般适用性在已经出版的著作中还不清晰。
用于细胞内递送某类治疗试剂的一种之前报道的方法涉及使用运输试剂，该运输试剂含有用于细胞内递送某类化合物的HIV-TAT蛋白质的碱性区域。例如，参见美国专利No.5,652,122；5,670,617；5,674,980；5,747,641；5,804,604；和6,316,003。此外，已经报道经纯化的人类免疫缺陷病毒1型(″HIV″)TAT蛋白质由在培养物中生长的人类细胞从周围培养基中摄取(A.D.Frankel and C.O.Pabo，″Cellular Uptake of the TAT Protein from Human ImmunodeficiencyVirus″，Cell，55，pp.1189-93(1988))。通常，TAT蛋白质反式激活某些HIV基因，并且是病毒复制所必须的。全长HIV-1TAT蛋白质具有86个氨基酸残基。HIV TAT基因具有两个外显子。TAT氨基酸1-72由外显子1编码，而氨基酸73-86由外显子2编码。全长TAT蛋白质可以表征为包含2个赖氨酸和6个精氨酸的碱性区域(氨基酸49-57)、以及含有7个半胱氨酸残基的半胱氨酸富集区域(氨基酸22-37)。特别地，认为所述的碱性区域(即，氨基酸49-57)对于核定位是重要的(Ruben，S.et al.，J.Virol.63：1-8(1989)；Hauber，J.et al.，J.Virol.63 1181-1187(1989))。
发明概述
尽管HIV-TAT的碱性区域之前已经被用于增加某类分子的细胞内递送，但是本发明是以意想不到的发现为基础的，所述的发现如本文所述，即，HIV-TAT的碱性区域的反向序列可以用于增加货物分子的跨膜或细胞内递送。作为上述发现的结果，本发明提供能够增加货物分子的跨膜或细胞内渗透的新型运输分子。因此，本发明的运输分子可以用于在体外或体内将货物分子递送穿过膜(例如透皮方式)或者通过细胞膜而进入到真核细胞(例如进入到细胞核或细胞质)中。本发明进一步涉及运输分子与货物分子的共价或非共价结合的缀合体。
此外，本发明提供了使用本发明的新型运输分子来增加货物分子的跨膜或细胞内渗透的方法。该方法特别适用于这样的货物分子，该货物分子(1)不能天然地进入靶细胞、细胞核或膜，或者(2)不能天然地以有用的速率进入到靶细胞、细胞核或膜。在某些优选的实施方案中，本发明的运输分子可用于将蛋白质或肽(例如调节因子、酶、抗体、药物或毒素)、以及DNA或RNA递送至细胞核或者穿过膜。特别优选的货物分子包括毒素，其非限定性实例包括肉毒杆菌毒素、waglerin毒素和破伤风毒素。根据本发明的货物分子的细胞内递送是通过对所关注的细胞施用新型运输分子与货物分子的缀合体来完成的。在其他实施方案中，本发明提供了通过向所关注的膜施用运输分子/货物分子缀合体来递送货物分子穿过膜的方法。在一个特别优选的实施方案中，将所述的运输分子/货物分子缀合体进行局部施用，从而提高所关注的货物分子的透皮渗透。
附图说明
图1：在人皮肤中，使用K15RT2的¹²⁵I-相关放射性在体外的经皮渗透情况，其中所述的K15RT2为具有与SEQ ID NO 1相对应的、通过G间隔体与任一末端连接的多肽的十五(15)个赖氨酸。
发明详述
运输分子的形成
本发明优选的运输分子的特征在于存在这样的多肽，该多肽具有与HIV-TAT碱性区域氨基酸序列(天然存在的HIV-TAT蛋白质的氨基酸49-57)的反向序列相应的序列。HIV-TAT碱性区域的反向序列(其为RRRQRRKKR(SEQ ID NO.1))在下文中被称为“反向序列多肽”，并且可以与所关注的货物分子以共价方式或非共价方式连接，从而形成缀合体。在某些实施方案中，有利地将一个或多个反向序列多肽以直接方式或者通过肽或聚合物连接体而与所关注的货物分子共价连接。例如，如本文所述，反向序列多肽可以通过化学交联或者通过基因融合而与货物分子有利地连接。
本发明还预期了反向序列多肽的变体。通常，可以用作运输分子来改善货物分子的透皮或跨膜渗透的反向序列多肽的任何变体被认为是本发明的一部分。例如，在一些实施方案中，反向序列多肽的变体是通过删除和/或取代存在于反向序列多肽中的至少一个氨基酸、从而产生经修饰的反向序列多肽来形成的。因此，可以制备这样的经修饰的反向序列多肽，其具有与所述的反向序列多肽基本相似、但不相同的氨基酸序列。优选的经修饰的反向序列多肽包括功能等价的那些多肽或其功能等价的肽片段。这些功能等价物或功能等价的片段具有与天然存在的反向序列多肽基本相似的跨膜或细胞内渗透能力。
反向序列多肽或其变体可以采用多种方法获得，所述方法包括基因工程技术或化学合成。在某些优选的实施方案中，可以进行一个或多个取代，从而调控反向序列多肽的渗透能力，以使得所得的运输分子趋向于定位在某些区域(例如靶细胞的细胞质)中。相似的行为已经在天然存在的HIV-TAT的碱性区域中观察到，并且已经用于将HIV-TAT片段定位或部分定位于细胞质中(例如参见Dang，C.V.andLee，W.M.F.，J.Biol.Chem.264：18019-18023(1989)；Hauber，J.et al.，J.Virol.63：1181-1187(1989)；Ruben，S.A.et al.，J.Virol.63：1-8(1989))。备选地，可以将用于结合细胞质成分的序列与所述的反向序列多肽连接，从而将反向序列多肽和货物分子保留在细胞质中，或者调节货物分子的核吸收。在其他实施方案中，可以将胆固醇或其他脂质衍生物加入到反向序列多肽或其变体中，从而增加运输分子的膜溶解性。当然，可以在将给定的货物分子递送至细胞质中后，将同一货物分子进一步递送至细胞核中。核递送必需涉及穿越细胞质的某些部分。
虽然反向序列多肽可以用于货物分子的跨膜或细胞内递送，但是本发明所预期的运输分子还可以包含HIV-TAT天然蛋白质的、增强跨膜或细胞内运输的任何其他部分。例如，如果需要的话，运输分子还可以包含全部HIV-TAT多肽的所有86个残基，其中所述的多肽具有天然HIV-TAT蛋白质的局部序列，这些序列增多了已经被证明能够增大吸收活性的任何部分的序列，所述序列的非限定实例包括残基1-58，37-72，或49-57。但是，在优选的实施方案中，运输分子不包含HIV-TAT的半胱氨酸富集区域，该区域相应于天然HIV-TAT序列的氨基酸22-37，并且这16个氨基酸中有7个氨基酸为半胱氨酸。这些半胱氨酸残基能够互相形成二硫键，与可能存在的其他HIV-TAT蛋白质分子或其片段的半胱氨酸富集区域中的半胱氨酸残基形成二硫键，和与构成所关注货物分子的蛋白质或多肽中可能存在的半胱氨酸残基形成二硫键。这种二硫键的形成可能导致货物分子的生物学活性丧失。此外，即使不可能与货物分子形成二硫键(例如，当治疗试剂为不具有半胱氨酸残基的蛋白质)，运输分子之间形成的二硫键也会导致运输分子、运输分子-货物分子缀合体或者这二者的积聚和不溶。因此，天然HIV-TAT蛋白质的半胱氨酸富集区域在HIV-TAT相关蛋白质用于递送治疗或诊断试剂的用途中成为潜在的、严重问题的来源。通过缺失HIV-TAT蛋白质中存在的半胱氨酸富集区域，本发明优选的运输分子避免了二硫键积聚的问题，其中所述的二硫键积聚可以导致运输多肽/治疗试剂的共价或非共价缀合体的生物学活性的丧失或不溶，或者两者。此外，本发明优选的运输分子的减小的尺寸还有利地使对治疗或诊断试剂的生物学活性的干扰达到最小。在涉及每个货物分子连接多个反向序列多肽的实施方案中，减小的运输分子尺寸的其他优点为增大吸收效率。
此外，本发明还预期了这样的运输分子，其包含一个或多个与得自其他病毒的TAT蛋白质组合的反向序列多肽，其中所述病毒的非限定实例包括：HIV-2(M.Guyader et al.，″Genome Organization andTransactivation of the Human Immunodeficiency Virus Type 2″，Nature，326，pp.662-669(1987))，马传染性贫血病毒(R.Carrollet al.，″Identification of Lentivirus TAT Functional DomainsThrough Generation of Equine Infectious Anemia Virus/HumanImmunodeficiency Virus Type 1 TAT Gene Chimeras″，J.Virol.，65，pp.3460-67(1991))以及猿免疫缺陷病毒(L.Chakrabarti etal.，″Sequence of Simian Immunodeficiency Virus from Macaqueand Its Relationship to Other Human and Simian Retroviruses″，Nature，328，pp.543-47(1987)；S.K.Arya et al.，″New Humanand Simian HIV-Related Retroviruses Possess FunctionalTransactivator(tat)Gene″，Nature，328，pp.548-550(1987))。应该理解的是，包括由这些其他TAT蛋白质衍生得到的任何多肽和反向序列多肽的运输分子都落入本发明的范围内，包括特征在于存在TAT碱性区域且缺乏TAT半胱氨酸富集区域的那些。
当本发明的运输分子为多肽时，该运输分子可以是化学合成的，或者是通过重组DNA方法制备的。具有已知氨基酸序列的多肽的化学合成或重组DNA制备方法是公知的。用于多肽或DNA合成的自动化设备是市售可得的。用于制备多肽运输分子的宿主细胞、克隆载体、DNA表达控制序列以及寡核苷酸连接体也是市售可得的。
根据本发明，货物分子以共价或非共价的方式与运输分子结合，从而形成缀合体。在优选的实施方案中，本发明所预期的货物分子包括具有预防、治疗或诊断用途的任何物质。而且，本发明还预期了任何生物学活性试剂，包括可能对接受者具有不利作用的货物分子，例如用于对动物实施安乐死的毒素。在用于实施本发明的货物分子的选取中存在广泛的自由。本发明所预期的货物分子的非限定性实例包括药物、诊断试剂、酶、蛋白质、多肽、寡核苷酸、抗原和毒素。本发明所预期的货物分子可以采用已知的技术(例如化学合成、基因工程方法或者由其天然存在的来源中分离)来获得或制备。
在一个优选的实施方案中，所述的货物分子为由肉毒杆菌毒素血清型衍生得到的毒素分子。特别优选的是由肉毒杆菌血清型A，B，C，D，E，F，和G直接分离得到的毒素，而且这些肉毒杆菌血清型的修饰形式也清楚地被认为是本发明的一部分。所述的修饰形式包括但不限于其中含有氨基酸残基的加入或删除的毒素分子，前体条件是所述的这些加入或删除基本上不改变毒素分子的生物学作用。在其他的实施方案中，所述的货物分子为抗原，并且与运输分子缀合是为了制备疫苗。例如，所述的货物分子可以为得自疫苗所免疫针对的细菌、病毒或其他感染试剂的抗原(例如HIV的gp120)。倘若所述的抗原进入到了细胞中，细胞质可以使细胞对所述的分子进行处理，并将其表达在细胞表面上。抗原在细胞表面的表达将引发杀伤T淋巴细胞的应答，由此诱导免疫。
在本发明另一个实施方案中，所述的货物分子为蛋白质，例如期望递送至细胞内、特别是递送至细胞核内的酶、抗体、毒素或调节因子(例如转录因子)。例如，一些病毒致癌基因通过与细胞基因的启动子结合而不适当地开启细胞基因的表达。通过在细胞核内提供竞争性结合蛋白质，病毒致癌基因的活性可以被抑制。
在另一个实施方案中，所述的货物分子为用作诊断工具(或者探针)或者用作治疗试剂的核苷酸序列，例如与靶细胞内基因或基因区域互补并且能够通过与细胞内基因或基因区域杂交来抑制这些基因或基因区域的活性的寡核苷酸序列。可以使用本发明的运输分子来有利地提高单链和双链核酸体外和体内进入细胞内的速率。例如，多肽与核酸的化学交联方法是本领域公知的。在本发明优选的实施方案中，所述的货物分子为单链反义核酸。反义核酸可用于抑制与其互补的序列的细胞内表达。在本发明的另一个实施方案中，所述的货物分子为包含由与核酸结合的蛋白质识别的结合位点的双链核酸。所述的与核酸结合的蛋白质的实例为病毒反式激活子(trans-activator)。
所关注的货物分子还可以为药物，例如肽类似物或小分子酶抑制剂，其特异性且可靠性地到细胞核内的导入是期望的
本发明的货物分子还可以为这样的诊断试剂，该诊断试剂在体外或体内提供了关于所述货物分子所存在的局部环境的信息。在选择诊断试剂中所考虑的因素包括但不限于：所寻求的试验信息的类型、诊断或成像的条件、给药的途径、非毒性、检测的方便性、检测的可定量性、以及实用性。许多此类的诊断试剂是本领域的技术人员所公知的。合适的诊断试剂的非限定性实例包括：放射不可透过性造影剂、顺磁性造影剂、超顺磁性造影剂、CT造影剂和其他造影剂。例如，放射不可透过性造影剂(用于X射线成像)包括：无机和有机碘化合物(例如泛影酸)、放射不可透过性金属及其盐(例如银，金，铂等)和其他放射不可透过性化合物(例如钙盐、钡盐，如硫酸钡、钽和氧化钽)。合适的顺磁性造影剂(用于MR成像)包括：二乙烯三胺五乙酸钆(Gd-DTPA)及其衍生物；以及其他的钆、锰、铁、镝、铜、铕、铒、铬、镍和钴的络合物，包括与以下物质形成的络合物，所述的物质为1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N″，N″′-四乙酸(DOTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，-N′，N″-三乙酸(DO 3A)、1，4，7-三氮杂环壬烷-N，N′，N″-三乙酸(NOTA)、1，4，8，10-四氮杂十四烷-N，N′，N″，N″′-四乙酸(TETA)、羟基苄基乙烯-二胺二乙酸(HBED)等。合适的超顺磁性造影剂(用于MR成像)包括：磁铁矿、超顺磁铁氧化物、单晶铁氧化物、特别是上文所述各种试剂的络合形式，如本文所述，这些试剂可以与反向序列多肽或者与包含反向序列多肽的正电荷主链以共价或非共价方式连接。其他合适的成像试剂为CT造影剂(包括碘酸盐的和非碘酸盐的CT造影剂、以及离子和非离子的CT造影剂)以及诸如自旋标记物或其他可有效诊断的试剂之类的造影剂。
诊断试剂的其他实例包括编码蛋白质的标志物基因，当该基因在细胞内表达时，所述的蛋白质可以容易地检测，所述的蛋白质包括但不限于：β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白质、蓝色荧光蛋白质、荧光素酶等。还可以使用多种标记物，例如放射性核素、氟石、酶、酶底物、酶辅助因子、酶抑制剂、配体(特别是半抗原)等。其他有用的物质为用放射性同位素或成分标记的那些(例如^99mTc葡庚糖酸盐)。
货物分子与运输分子的连接可以通过在所述的两种组分之间形成连接的任何手段来实现，所述的连接足够稳定以耐受所采用的条件，并且不改变任何组分的功能。所述的两种组分之间的连接可以是非共价的或共价的。例如，可以采用重组技术通过以下过程来以共价方式将作为多肽的运输分子与基于蛋白质/多肽的货物分子连接，其中所述的过程为：将编码货物分子的基因与编码多肽运输分子的基因连接，然后将所得的基因构建体引入能够表达该缀合体的细胞中。备选地，可以采用已知的技术，在细胞中表达两种分开的核苷酸序列，或者可以以化学方式合成所述的核苷酸序列然后顺次共价连接。此外，基于蛋白质/肽的货物分子与运输分子形成的缀合体可以采用化学方式合成为一条氨基酸序列(即，其中两种组分均存在的一条氨基酸序列)，由此不需要连接。
多种化学交联方法是已知的，并且可潜在地用于将本发明的运输多肽与作为大分子的货物分子缀合。许多已知的化学交联方法是非特异性的，即，这些方法不会将偶联点指定于运输多肽或货物大分子上的任何特定位点。结果，非特异性交联试剂的使用可以攻击功能位点或者在空间上阻断活性位点，从而使缀合的蛋白质发生生物学失活。
用于增加本发明实施过程中的偶联特异性的优选方法将化学偶联定向于在待交联的一种或两种多肽中仅发现一次或少数几次的官能团。例如，在许多蛋白质中，作为唯一含有巯基的蛋白质氨基酸的半胱氨酸仅出现少数几次。此外，例如，如果多肽不含赖氨酸残基，则对伯胺具有特异性的交联反应剂对该多肽的氨基末端是具有选择性的。成功地采用所述的方法来增加偶联特异性需要所述的多肽在可以发生改变但不会丧失分子的生物学活性的分子区域中具有相当适当的反应性残基。
当半胱氨酸残基存在于多肽序列的部分中且这些半胱氨酸参与交联反应可能会干扰生物学活性时，可以替换所述的半胱氨酸残基。当半胱氨酸残基被替换时，通常期望的是使在多肽折叠中所产生的变化最小。当所述的替换物与半胱氨酸在化学和空间上相似时，多肽折叠中的变化最小。就上述原因而言，丝氨酸优选地作为半胱氨酸的替换物。可以将半胱氨酸残基引入到多肽的氨基酸序列中，以用于交联。当引入半胱氨酸残基时，引入到氨基或羧基的末端处或者附近是优选的。无论所关注的多肽是通过化学合成制备的，还是通过重组DNA的表达制备的，传统的方法都可以用于此类氨基酸序列的修饰。
两种组分的偶联可以通过偶联或缀合试剂来完成。目前具有多种可以使用的分子内交联反应剂(例如参见Means，G.E.and Feeney，R.E.，Chemical Modification of Proteins，Holden-Day，1974，pp.39-43)。在这些反应剂中，例如有：J-琥珀酰亚胺3-(2-吡啶基二硫代)丙酸盐(SPDP)或N，N′-(1，3-亚苯基)双马来酰亚胺(这二者对巯基均具有高度的特异性并且形成了不可逆的连接)；N，N′-乙烯基-双-(碘乙酰胺)或者其他具有6-11个碳亚甲基桥的此类反应剂(其对巯基具有相对的特异性)；以及1，5-二氟-2，4-二硝基苯(其与氨基和酪氨酸基团形成了不可逆的连接)。可用于上述目的的其他交联反应剂包括：p，p′-二氟-m，m′-二硝基二苯基砜(其与氨基和苯酚基团形成了不可逆的交联)；二亚胺代己二酸二甲酯(其对氨基具有特异性)；苯酚-1，4-二磺酰氯(其主要与氨基发生反应)；六亚甲基二异氰酸酯或二异硫代氰酸酯，或者苯偶氮基-p-二异氰酸酯(其主要与氨基发生反应)；戊二醛(其与多种不同的侧链发生反应)以及disdiazobenzidine(其主要与酪氨酸和组氨酸发生反应)。
交联反应剂可以为同双功能的，即，具有可以发生相同反应的2个官能团。优选的同双功能交联反应剂为双马来酰亚胺己烷(″BMH″)。BMH含有2个马来酰亚胺官能团，该官能团在温和的条件(pH 6.5-7.7)下特异性地与含有巯基的化合物发生反应。所述的2个马来酰亚胺基团通过烃链连接。因此，BMH可用于含有半胱氨酸残基的多肽的不可逆的交联。
交联反应剂还可以为异双功能的。异双功能交联试剂具有2个不同的官能团，例如胺反应性基团和硫醇反应性基团，这两个基团分别交联胺反应性基团和硫醇反应性基团。异双功能交联试剂的实例为：琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(″SMCC″)、m-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(″MBS″)、琥珀酰亚胺4-(p-马来酰亚胺苯基)丁酸酯(″SMPB″)、以及MBS的延伸链类似物。这些交联剂的琥珀酰亚胺基团与伯胺发生反应，并且硫醇反应性马来酰亚胺与半胱氨酸残基的巯基形成了共价键。
交联反应剂在水中通常具有低的溶解度。可以将诸如磺酰基之类的亲水性部分加入到所述的交联反应剂中，从而提高其水溶性。磺基-MBS和磺基-SMCC为针对水溶性进行修饰的交联反应剂的实例。
许多交联反应剂形成了在细胞内条件下基本不可裂解的缀合体。然而，某些交联反应剂包含在细胞内条件下可以裂解的共价键，例如二硫化物。例如，二硫代双(琥珀酰亚胺丙酸酯)(″DSP″)、Traut’s反应剂和N-琥珀酰亚胺3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(″SPDP″)是公知的可裂解的交联剂。可裂解的交联反应剂的使用可以使货物部分在被递送至靶细胞中后与运输多肽分离。直接的二硫键也是可以使用的。
一些诸如n-γ-马来酰亚胺丁酰氧基-琥珀酰亚胺酯(″GMBS″)和磺基-GMBS之类的新型交联反应剂具有降低的免疫原性。在本发明的一些实施方案中，这种降低的免疫原性是有利的。
包括上文所述的那些在内的多种交联反应剂是市售可得的。详细的使用说明书可以容易地得自售货供应商。关于蛋白质交联和缀合体的制备的普通参考文献为：S.S.Wong，Chemistry of ProteinConjugation and Cross-Linking，CRC Press(1991)。
化学交联可以包括间隔臂的使用。间隔臂提供了分子内挠性，或者调节了缀合部分之间的分子内距离，并由此可以帮助保持生物学活性。间隔臂可以为包含间隔氨基酸的多肽部分的形式。例如，在一个具体的实施方案中，所述的间隔连接体由一个或多个甘氨酸单元(例如GG二聚体)构成。备选地，间隔臂可以为交联反应剂的一部分，例如“长链SPDP”(Pierce Chem.Co.，Rockford，Ill.，cat.No.21651H)中的一部分。
本领域的普通技术人员将会意识到，当运输多肽与货物部分基因融合时，加入氨基末端甲硫氨酸是有利的，但是在某些实施方案中不必加入间隔氨基酸(例如CysGlyGly或GlyGlyCys)。独特的末端半胱氨酸残基为化学交联的优选手段。根据本发明一些优选的实施方案，反向序列多肽的羧基末端与含有多肽或蛋白质的货物分子的氨基末端基因融合。
在某些优选的实施方案中，所述的反向序列多肽本身为这样的运输分子，该运输分子以非共价方式与货物分子结合，从而形成可以增强所述货物分子的递送的非共价缀合体。备选地，所述的反向序列多肽并非以共价方式与货物分子连接，而是以共价方式与主链分子连接(直接地或者通过连接体)，从而形成了运输分子，其又与货物分子以非共价方式结合从而形成缀合体。在特别优选的实施方案中，所述的运输分子包括与正电荷主链以共价方式连接的反向序列多肽的一个或多个拷贝。任选地，天然HIV-TAT或得自其他病毒的TAT蛋白质的其他运输增强性片段也可以与正电荷主链连接。正电荷主链通常为原子的线性链，在该链中，或者具有在生理学pH下带正电荷的基团，或者具有与从主链延伸的侧链相连接的、带正电荷的基团。所述的线性主链为烃主链，在某些实施方案中，该烃主链被选自氮、氧、硫、硅和磷中的杂原子所中断。大部分的主链原子通常为碳。此外，所述的主链通常为重复单元的聚合物(例如氨基酸、聚(氧乙烯)、聚(丙烯胺)(poly(propyleneamine))等)。在一组实施方案中，正电荷主链为聚丙烯胺，其中大量的胺的氮原子以带有正电荷的铵基(四取代的)形式存在。在另一组实施方案中，所述的主链与多个包含正电荷基团(例如铵基、吡啶基、膦基、锍基、胍基或脒基(amidinium group))的侧链部分连接。在这组实施方案中，所述的侧链部分可以沿着所述主链以多种间距放置，所述的间距在分离方面是一致的，或者是可变化的。此外，所述侧链的长度可以相同或不同。例如，在一组实施方案中，所述的侧链可以为线性或支化的烃链，其具有1至20个碳原子，并且以上文所述的正电荷基团之一在远端(远离主链)终结。
在一组实施方案中，所述的正电荷主链为具有多个正电荷侧链基团(例如赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、高精氨酸等)的多肽。本领域的技术人员将理解，当将氨基酸用于本发明的该部分中时，所述的侧链在连接的中心处可以具有D-或L-(R或S构型)形式。
备选地，所述的主链可以为诸如类肽之类的多肽的类似物。例如，参见Kessler，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.32：543(1993)；Zuckermann et al.Chemtracts-Macromol.Chem.4：80(1992)；和Simon et al.Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 89：9367(1992)。简而言之，类肽为这样的聚甘氨酸，其中侧链与主链氮原子连接，而并非与α-碳原子连接。同上，所述侧链的一部分通常以正电荷基团处终结，从而提供了正电荷主链成分。类肽的合成在(例如)美国专利No.5,877,278中有所描述。如本文所用的术语，具有类肽主链构造的正电荷主链被认为为“非肽类”，这是因为这种主链并非由在α-碳位置处具有天然存在的侧链的氨基酸构成。
可以使用多种其他的主链，例如多肽的空间或电子模拟物，其中肽的酰胺键可以用替代物替换，所述的替代物例如：酯键，硫代酰胺(--CSNH--)，反向的硫代酰胺(--NHCS--)，氨基亚甲基(--NHCH₂--)或者反向的亚甲基氨基(--CH₂NH--)，酮-亚甲基(--COCH₂--)，亚膦酸酯(--PO₂RCH₂--)，亚膦酰胺(phosphonamidate)和亚膦酰胺的酯(--PO₂RNH--)，反向肽(--NHCO--)，反式-烯烃(--CR＝CH--)，氟代烯烃(--CF＝CH--)，二亚甲基(--CH₂CH₂--)，硫醚(--CH₂S--)，羟基亚乙基(--CH(OH)CH₂--)，亚甲基氧(--CH₂O--)，四唑(CN₄)，磺酰胺(--SO₂NH--)，亚甲基磺酰胺(--CHRSO₂NH--)，反向磺酰胺(--NHSO₂--)，以及具有丙二酸酯和/或偕-二氨基-烷基亚单元的主链，例如如Fletcher et al.((1998)Chem.Rev.98：763)所综述以及其中引用的文献所详述的那样。许多之前的取代得到与由α-氨基酸形成的主链大致相当的电子等排的聚合物主链。
在另一个特别优选的实施方案中，所述的主链部分为聚赖氨酸，并且所述的反向序列多肽连接至赖氨酸侧链的氨基基团上。在这种特别优选的实施方案中使用的聚赖氨酸可以为任何市售可得的聚赖氨酸(Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.，USA)，例如MW＞70,000的聚赖氨酸，MW为70,000至150,000的聚赖氨酸，MW为150,000至300,000的聚赖氨酸，以及MW＞300,000的聚赖氨酸。对聚赖氨酸的适当的选择取决于组合物的其余成分，并且将足以向所述的组合物提供整体净正电荷。
运输分子/货物分子缀合体的递送
本发明总体而言适用于小分子和大分子(例如蛋白质、核酸和多糖)的治疗、预防或诊断的细胞内或跨膜递送，其中所述的小分子和大分子不能固有地以有用的速率进入到靶细胞中或者渗透过生物学膜。本发明的方法和组合物可以适用于任何有机体，包括人。本发明的方法和组合物还适用于子宫里的动物和人。根据本发明的一个优选的实施方案，在将运输分子-货物缀合体引入到活的人体或动物中、或者活的人体或动物上之后，将货物分子递送至各种器官和组织的细胞中。例如，可以将货物分子/运输分子缀合体与期望引入货物分子的细胞接触。结果，所述的缀合体进入到细胞中，从而穿越进入核中。在另一个实施方案中，将货物分子/运输分子缀合体施用到膜的表面上，从而使货物分子/运输分子缀合体发生跨膜渗透。例如，可以将货物分子/运输分子缀合体局部施用到将受益于货物分子的治疗作用的区域上。在特别优选的实施方案中，所述的货物分子为肉毒杆菌毒素血清型，并且可以将货物分子/运输分子缀合体局部施用到具有皱纹或褶皱的皮肤区域中，从而减少皱纹或褶皱的出现。
备选地，所述的货物分子/运输分子缀合体可以通过所制备的并被移植到个体中的细胞来在体内进行递送。所述的细胞被基因工程改造，这样它们可以连续地在体内表达货物分子/运输分子缀合体。
备选地，本发明可以用于在体外递送货物分子。例如，在其中货物分子被递送至培养物的细胞中的体外应用中，可以将货物分子/运输分子缀合体简单地加入到培养基中。这可以用作(例如)递送其对细胞功能的影响待被估计的物质至核中的手段。例如，可以测定经纯化的转录因子的活性，或者可以在将货物分子用于体内治疗之前，将体外测定用于提供对该货物分子活性的重要的测试。
还可以通过制备能够在体外合成所需的货物分子/运输分子缀合体的细胞，或者通过在合适的条件下将得自个体的样品(例如血液、骨髓)与货物分子/运输缀合体结合，来在体外进行递送。例如，可以将关注的货物分子-TAT蛋白质缀合体或与TAT蛋白质结合的所选货物分子，与得自个体的样品(例如血液、骨髓)结合，从而将所关注的分子引入到该样品中存在的细胞中，并且在以这种方式进行处理后，将所得的样品返回至个体中。以上述方式进行的一系列处理可以用于阻止或抑制感染试剂的作用。例如，可以从感染有HIV或其他病毒的个体，或者从具有基因缺陷的个体取出血液。然后，在适于缀合体进入细胞以及所述样品被保持在其可以被返回至个体中的状态中的条件下，将所述的血液与货物分子/运输分子缀合体结合，其中所关注的货物分子为能够使所述病毒灭活的药物，或者是能够与所选病毒序列杂交并使其灭活的寡核苷酸序列，或者是补充缺失或缺陷蛋白质的蛋白质。处理后，将所得的血液返回至个体中。
可以通过将所述的货物分子/运输分子缀合体施用至其中所述缀合体用于诊断、预防或治疗目的的个体中来进行递送。所述的靶细胞可以为体内细胞，即，构成活的动物或人的器官或组织的细胞、或者在活的动物或人中发现的微生物。
在一些实施方案中，将运输分子/货物分子缀合体与增加稳定性和渗透能力的试剂结合。例如，与HIV-TAT蛋白质结合并增加其稳定性和渗透能力的金属离子可以用于上述目的。备选地，在细胞外，将向溶酶体试剂与运输分子和货物分子联合提供，从而增加细胞的吸收。所述的向溶酶体试剂可以单独使用或者与稳定剂联合使用。例如，诸如氯喹、莫能星、金刚烷胺和甲胺之类的向溶酶体试剂可以用于上述目的，其中所述的试剂已经显示出在某些细胞中增加天然存在的HIV-TAT的吸收达几百倍。
在另一个实施方案中，在细胞外，将碱性肽与运输分子和货物分子一起提供，从而增加货物分子的吸收，其中所述的碱性肽例如与残基38-58、HIV-TAT或精蛋白相应的肽序列。此外，所述的碱性肽可以单独使用，或者与稳定试剂或向溶酶体试剂组合使用。
本发明的药物组合物可以用于治疗、预防或诊断用途，并且可以为多种形式。这些形式包括(例如)固体、半固体和液体剂型，例如片剂、丸剂、粉末、液体溶液或悬浮液、气雾剂、脂质体、栓剂、可注射和可注入的溶液、以及缓释剂型。优选的剂型取决于所计划的给药方式，以及治疗、预防或诊断用途。根据本发明，所选的货物分子/运输分子缀合体可以通过常规的给药途径施用，例如肠胃外途径、皮下途径、静脉内途径、肌内途径、病灶内途径、胸骨内途径、颅骨内途径和气雾剂途径。此外，还可以采用局部给药途径，即，在合适的情况下，将所述的组合物局部施加到身体的特定部分(例如皮肤、下消化道、阴道、直肠)。所述的组合物还优选地包含本领域的技术人员已知的、常规的药学可接受的载体和佐剂。
通常，可以采用与药学上重要的多肽(例如α-干扰素)所采用的方法和组合物相似的方法和组合物来配制和施用本发明的药物组合物。应该理解的是，常规剂量将根据具体涉及的货物分子以及患者的健康情况、重量、年龄、性别、病况或疾病和所需的给药模式而变化。本发明的药物组合物包括药学上适当的载体、佐剂和媒介物。通常，所述的载体包括水性或者酒精/水性溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物可以包括氯化钠溶液、Ringer’s右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸盐的Ringer’s或不挥发性油。此外，静脉内媒介物可以包括流动性和营养补充剂和电解质补充剂，例如基于Ringer’s右旋糖的那些。此外，还可以存在防腐剂和其他添加剂，例如杀菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体。通常参见Remington′s PharmaceuticalSciences，16th Ed.，Mack，ed.1980。
然而，应该理解的是，本发明的替代实施方案不限于临床应用。本发明可以有利地应用于医学和生物学研究。在本发明的研究应用中，所述的货物分子可以为药物或诊断试剂。本发明的运输分子可以单独地用作实验室研究反应剂，或者可以用作运输分子缀合试剂盒的一部分。
尽管我们已经描述了本发明的多个实施方案，但是显而易见的是可以改变我们的基础构造，从而提供利用本发明的方法和产物的其他实施方案。因此，应该理解的是本发明的范围是由所附的权利要求书定义的，而不是由以举例方式列出的具体实施方案定义的。
实施例1
本研究的目的是评价使用流通式扩散槽(flow-throughdiffusion cell)来在体外将大型货物分子(肉毒杆菌毒素A型)递送至人类皮肤的可能性。由于所述的毒素具有相当大的尺寸，所以预期未使用任何运输分子的真皮吸收为可忽略的那样低。因此，加入不同毒素/载体比例的载体溶液，以试图增大/促进通过角质层的真皮吸收。除了在各时间点评价受体流体中存在的量以外，在24小时以后评价各种皮肤层中的分布情况。完整的产品(即，毒素/白蛋白复合物，包括辅助蛋白质)用¹²⁵I进行放射性标记。
1.1测试系统
皮肤膜的制备：由冷冻的皮肤样品制备人皮肤膜(在腹部手术后直接得到的单一供体)。在解冻后，使用Dermatome 25mm(Nouvag GmbH，Germany)将所述的皮肤用皮刀处理为大约400μm的记录厚度。
流通式扩散槽：将所述的皮肤膜放置在9mm流通式自动化扩散槽(PermeGear Inc.，Riegelsville，PA，USA)中。在环境湿度下，将皮肤表面的温度保持在大约32℃。以大约1.6ml h-1的速度泵入受体流体，该受体流体由含有0.01％叠氮化钠(w/v)的磷酸缓冲盐溶液(PBS)构成。
1.2试验设计和方法
测试物质的¹²⁵I-标记：在100μL 50mM KH₂PO₄缓冲剂(pH 7.2)中重构装有Neuronox产物的小瓶中的内容物。在碘化过程中，将37MBq Na¹²⁵I(10μl)，20μl溶于水中的大约100,000倍稀释的过氧化氢溶液(30％(v/v)强双氧水)和20μl乳过氧化物酶(4μg.10μL-1水)加入到装有产物的小瓶中。在大约60秒后，通过加入溶于磷酸缓冲剂中的50μL酪氨酸溶液(1mg mL-1)来停止碘化，从而除去尚未与可利用的蛋白质(毒素、白蛋白等)发生反应的过量的¹²⁵I。1分钟后，通过使用用含有0.5％(w/v)BSA的测定缓冲剂平衡的、大约10ml体积的Sephadex G25细粒柱，来从放射性标记的蛋白质中分离出¹²⁵I(与L-酪氨酸结合)。收集大约250μL的级份。取出一部分级份以用于反射性活性的测定。将其他级份储存在2-10℃下，直到进一步使用。
试验设计：针对其在K15RT2载体溶液中渗透皮肤的能力来评价产品。在施加所述的测试化合物之前，通过测定氚标记的水的渗透系数(Kp)来估测皮肤的完整性。试验设置如下所示：