一种USPIOPLARGD复合物及其制备方法和应用.pdf

本发明公开了一种USPIO-PLA-RGD复合物及其制备方法和应用，所述的USPIO-PLA-RGD复合物为：以USPIO为核心，外面包裹PLA，记为PLA-USPIO；然后利用PLA表面暴露的官能基团羧基与RGD肽的氨基进行共价偶联得到所述的USPIO-PLA-RGD复合物，其水合粒径为90-105nm。本发明所述的USPIO-PLA-RGD复合物作为磁共振肿瘤新生血管靶向对比剂应用。本发明利用αvβ3整合素受体与其配体RGD肽亲和力高的特性来实现靶向显影，其结合具有特异性、选择性、饱和性、亲和力强和生物效应明显等特点。利用配体RGD肽作为USPIO的载体，通过受体介导作用，增加药物在病灶局部的浓度，降低毒副作用，达到靶向肿瘤新生血管活体显像目的。

1、  一种USPIO-PLA-RGD复合物，所述的USPIO-PLA-RGD复合物为：以USPIO为核心，外面包裹PLA，记为PLA-USPIO；然后利用PLA表面暴露的官能基团羧基与RGD肽的氨基进行共价偶联得到所述的USPIO-PLA-RGD复合物；所述USPIO-PLA-RGD复合物的水合粒径为90-105nm；所述的USPIO即超微型超顺磁性氧化铁微粒，所述的PLA即聚乳酸，所述的RGD肽即精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽。

2、  如权利要求1所述的USPIO-PLA-RGD复合物，其特征在于所述的USPIO的核心粒径为3～5nm。

3、  如权利要求1或2所述的USPIO-PLA-RGD复合物，其特征在于所述的PLA-USPIO的水合粒径为60-75nm。

4、  一种如权利要求1所述的USPIO-PLA-RGD复合物的制备方法，其特征在于所述的制备方法包括如下步骤：
(1)PLA-USPIO的合成
取FeCl₂.4H₂O、FeCl₃.6H₂O和PLA，使之均匀分散在15～25％乙醇水溶液中，混合溶液中Fe²⁺与Fe³⁺摩尔比为1∶1.6～2.2，所述FeCl₂.4H₂O和PLA的投料质量之比为1∶6～7，所述15～25％乙醇水溶液的体积用量以FeCl₂.4H₂O的质量计为60～70ml/g；在化学惰性气体保护下，滴加氨水或氢氧化钠溶液使pH值达到9～10，剧烈搅拌反应，然后取出反应溶液陈化、洗涤、离心得到PLA-USPIO，并重新分散到去离子水中；
(2)RGD与PLA-USPIO的偶联
在pH为4～6的缓冲液体系中，以EDC和sulfo-NHS为活化剂，所述的EDC与sulfo-NHS的投料摩尔比为1-1.5∶1，使PLA-USPIO表面的羧基活化，所述PLA-USPIO与EDC的投料摩尔比为1∶25～35，所述pH为4～6的缓冲液体系中Fe离子的终浓度为0.8～1.5mg/ml；然后调节缓冲液体系的pH值在7～9，加入RGD肽使USPIO-PLA和RGD肽搅拌反应，充分反应后终止反应，即得到USPIO-PLA-RGD；所述PLA-USPIO和RGD肽的投料摩尔比为1∶25～35，所述pH值在7～9的缓冲液体系中控制RGD肽的终浓度为1～1.5mg/ml；所述的EDC即1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺，所述的sulfo-NHS即N-羟基硫代琥珀酰亚胺；所述的PLA-USPIO的摩尔数是以其中USPIO的摩尔数计。

5、  如权利要求1所述的USPIO-PLA-RGD复合物的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中剧烈搅拌反应时间在15～30分钟。

6、  如权利要求1所述的USPIO-PLA-RGD复合物的制备方法，其特征在于所述反应溶液的陈化条件为：在75～85℃陈化1.5～2h。

7、  如权利要求1所述的USPIO-PLA-RGD复合物的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中，pH为4～6的缓冲液和pH为7～9的缓冲液各自独立选自下列一种：磷酸盐缓冲液，硼酸盐缓冲液，碳酸盐缓冲液，HEPES缓冲液。

8、  如权利要求1所述的USPIO-PLA-RGD复合物的制备方法，其特征在于所述PLA-USPIO和RGD肽的反应时间为1.5～2h。

9、  如权利要求1所述的USPIO-PLA-RGD复合物作为磁共振肿瘤新生血管靶向对比剂的应用。

一种USPIO-PLA-RGD复合物及其制备方法和应用
一、技术领域
本发明属于医疗检测试剂技术领域，涉及一种USPIO-PLA-RGD复合物及其制备方法和应用，尤其是其作为在磁共振成像中能特异性使肿瘤新生血管显像的对比剂的应用。
二、背景技术
肿瘤的生长、浸润、转移、预后与微血管生成密切相关。传统的定量评价肿瘤血管生成的“金标准”——肿瘤MVD(Mean VascularDensity)计数由于其有创性、对准确取材的依赖性且无法对肿瘤血管生成活性进行功能评价等缺点，并不是一种理想的检查手段。因此，寻找一种无创、准确、在活体上可重复实施、能获取肿瘤微血管生成过程直接定量信息的成像方法，一直是现代肿瘤影像学研究的重要课题之一。分子影像学的出现为肿瘤血管生成的深入研究引入了新的思维方式和研究手段。目前有关肿瘤血管生成的分子影像学研究主要集中于核医学、光学成像、超声成像、磁共振成像等领域。由于核医学的辐射性和较低分辨率、光子成像的低穿透性以及超声成像的低分辨率，其应用受到限制。MRI具有空间分辨力高和多序列、多参数、多方位成像的优点，在分子成像中具有广阔的发展前景。用于MRI靶向标记的磁性纳米微粒对比剂主要包括顺磁性Gd3+类对比剂和超顺磁性氧化铁微粒(Superparamagnetic Iron Oxide，SPIO)对比剂。有关肿瘤血管生成的MR分子成像研究，主要集中于Gd³⁺类对比剂。由于其在体内清除速度快、分布无特异性、常规场强下MR成像所需Gd³⁺浓度高；同时新近研究表明，肾功能不良者应用Gd³⁺类对比剂后，出现肾源性系统纤维化(NSF)的风险大大增加，因此实际的临床应用需要进一步深入研究。SPIO根据颗粒大小分为普通的SPIO(一般直径＞50nm)和超微型超顺磁性氧化铁纳米微粒USPIO(UltrasmallSuprparamagnetic Iron Oxide，，最大不超过50nm)。USPIO粒径更小、穿透力更强，弛豫率约为同样条件下Gd³⁺的7～10倍，血循环半衰期长，且具有生物可降解性，能被细胞代谢后进入正常血浆铁池，参与体内生理代谢过程。因此，USPIO是目前较理想的MR示踪剂，一方面主要用于靶向肝、脾、淋巴结、骨髓等富含网状内皮细胞的组织和器官的MR成像；另一方面国内外学者先后采用不同的生物活性材料包裹USPIO，并与特定的抗体或配体结合制成新的靶向性纳米磁探针，用于MR分子成像研究，包括巨噬细胞受体成像、肿瘤细胞转铁蛋白受体、叶酸受体成像、动脉粥样硬化斑块分子成像及干细胞移植后迁徙、分化的示踪成像，显示了广阔的应用前景。Zhang等[Zhang C，Jugold M，Woenne EC，Lammers T，Morgenstern B，Mueller MM，Zentgraf H，Bock M，Eisenhut M，Semmler W，Kiessling F.Specifictargeting of tumor angiogenesis by RGD-conjugated ultrasmallsuperparamagnetic iron oxide particles using a clinical 1.5-T magneticresonance scanner.Cancer Res，2007，67(4)：1555-1562.]利用APTMS包被USPIO并与RGD肽偶联形成靶向肿瘤新生血管的纳米磁性探针，进行了体外细胞学水平与活体MR分子成像研究。结果表明，RGD肽修饰的USPIO纳米磁探针在体外具有良好的靶向肿瘤新生血管内皮细胞整合素αvβ3受体的作用，而在活体内分子成像效果并不理想。我们采用聚乳酸(Poly lactic acid，PLA)作为包裹材料，结果显示其具有更好的生物相容性和稳定性。
三、发明内容
本发明要解决的技术是提供一种USPIO-PLA-RGD复合物及其制备方法和应用，将其作为在磁共振成像中能特异性使肿瘤新生血管显像的对比剂，具有特异性高、选择性强、毒副作用低、生物相容性和稳定性好等优点。
一种USPIO-PLA-RGD复合物，所述的USPIO-PLA-RGD复合物为：以USPIO为核心，外面包裹PLA，记为PLA-USPIO；然后利用PLA表面暴露的官能基团羧基与RGD肽的氨基进行共价偶联得到所述的USPIO-PLA-RGD复合物；所述USPIO-PLA-RGD复合物的水合粒径为90-105nm；所述的USPIO即超微型超顺磁性氧化铁微粒，所述的PLA即聚乳酸，所述的RGD肽即精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽。
本发明中所述USPIO-PLA-RGD复合物的核心USPIO的粒径优选为3-5nm。
本发明中所述的PLA-USPIO的水合粒径优选为60-75nm。
本发明提供了一种上述USPIO-PLA-RGD复合物的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：
(1)PLA-USPIO的合成
取FeCl₂.4H₂O、FeCl₃.6H₂O和PLA，使之均匀分散在15～25％乙醇水溶液中，混合溶液中Fe²⁺与Fe³⁺摩尔比为1∶1.6～2.2，所述FeCl₂.4H₂O与PLA的投料质量之比为1∶6～7，所述15～25％乙醇水溶液的体积用量以FeCl₂.4H₂O的质量计为60～70ml/g；在化学惰性气体保护下，滴加氨水使pH值达到9～10，剧烈搅拌反应，然后取出反应溶液陈化、洗涤、离心得到PLA-USPIO，并重新分散到去离子水中；
(2)RGD与PLA-USPIO的偶联
在pH为4～6的缓冲液体系中，以EDC和sulfo-NHS为活化剂，所述的EDC与sulfo-NHS的投料摩尔比为1-1.5∶1，使PLA-USPIO表面的羧基活化，所述PLA-USPIO与EDC的投料摩尔比为1∶25～35，所述pH为4～6的缓冲液体系中控制Fe离子的终浓度为0.8～1.5mg/ml；然后调节缓冲液体系的pH值在7～9，加入RGD肽使PLA-USPIO和RGD肽搅拌反应，充分反应后终止反应，即得到USPIO-PLA-RGD；所述PLA-USPIO和RGD肽的投料摩尔比为1∶25～35，所述pH值在7～9的缓冲液体系中控制RGD肽的投料终浓度为1～1.5mg/ml；所述的EDC即1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺，所述的sulfo-NHS即N-羟基硫代琥珀酰亚胺。本发明中PLA-USPIO的摩尔数是以其中USPIO的摩尔数计；
所述步骤(1)中，乙醇水溶液的浓度推荐为15～25％，优选20％；步骤(1)中剧烈搅拌反应时间一般在15～30分钟。所述的剧烈搅拌反应在化学惰性气体保护下进行，所谓的化学惰性气体除了狭义上的惰性气体外，还包括不参与本发明反应的气体，如氮气等，本发明优选在氮气保护下进行反应。本发明具体推荐所述反应溶液的陈化条件为：在75～85℃陈化1.5～2h，优选在80℃陈化2h。
本发明所述步骤(2)分为两个过程，一是活化过程，二是偶联过程。在活化过程中，在活化剂EDC和sulfo-NHS的作用下，PLA-USPIO表面的羧基被活化，此过程在pH为4～6的活化缓冲液体系中进行，最优选在pH为5.5的活化缓冲液体系中进行；随后经过活化的PLA-USPIO与RGD肽在pH值在7～9的偶联缓冲液中发生偶合反应得到RGD-PLA-USPIO，最优选在pH为8.8的偶联缓冲液体系中反应。活化缓冲液和偶联缓冲液可选择不同的缓冲液，也可选择相同的缓冲液，本发明所述的pH为4～6的活化缓冲液和pH值在7～9的偶联缓冲液可独立选自下列之一：PBS(磷酸盐缓冲液)，boratebuffer(硼酸盐缓冲液)，bicarbonate/carbonate(碳酸盐缓冲液)，HEPES缓冲液。一般为操作方便，活化缓冲液和偶合缓冲液可选用同一类缓冲液，本发明优选使用硼酸盐缓冲液。
本发明所述的PLA-USPIO和RGD肽的投料摩尔比推荐为1∶25～35，优选1∶30；所述的PLA-USPIO与EDC的投料摩尔比推荐为1∶25～35，优选1∶30；所述的EDC与sulfo-NHS的投料摩尔比为1-1.5∶1
本发明在活化过程中，优选控制活化缓冲液中Fe离子的终浓度为0.8～1mg/ml。
所述PLA-USPIO和RGD肽的反应时间推荐为1.5～2h。
本发明所述的USPIO-PLA-RGD复合物作为磁共振肿瘤新生血管靶向对比剂的应用，利用USPIO-PLA-RGD肽复合物与肿瘤新生血管内皮细胞上的αvβ3受体高亲和力的特性来实现靶向显影。
本发明的有益效果在于：
a)本发明利用αvβ3整合素受体与其配体RGD肽亲和力高的特性来实现靶向显影，是受体-配体导向系统，其结合具有特异性、选择性、饱和性、亲和力强和生物效应明显等特点。利用配体RGD肽作为USPIO的载体，通过受体介导作用，增加药物在病灶局部的浓度，降低毒副作用，达到靶向肿瘤新生血管活体显像目的。
b)本发明以PLA作为包裹材料，具有很好的生物相容性和稳定性。
四、附图说明
图1是实施例1制得的PLA-USPIO的透射电镜图；
图2是实施例1制得的PLA-USPIO的动态光散射谱；
图3是实施例1制得的RGD-PLA-USPIO的动态光散射谱；
图4为实施例2中HUVECs细胞和RGD-PLA-USPIO共同孵育30分钟后的Prussian Blue Stain结果；
图5是实施例2中HUVECs细胞和PLA-USPIO共同孵育30分钟后Prussian Blue Stain结果；
图6是实施例3中兔VX2肿瘤在RGD-PLA-USPIO注射前后的磁共振T1WI与T2WI信号强度变化结果；
图7是实施例3中兔VX2肿瘤在RGD-PLA-USPIO注射前后的磁共振T2*WI与SWI信号强度变化结果。
五、具体实施方式
下面以具体实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但本发明的保护范围不限于此：
实施例1：USPIO-PLA-RGD复合物的制备
1、PLA-USPIO的合成
730毫克FeCl₃.6H₂O和300毫克FeCl₂.4H₂O溶于20ml含20％乙醇的去离子水与乙醇的混合溶液中，Fe²⁺与Fe³⁺摩尔比约为1∶2。取2g聚乳酸溶于上述溶液中，必要时以超声作用使各项组分充分均一分散在溶液体系中。在氮气保护条件下，逐滴加入5M NaOH或者28％NH₃.H₂O，使pH值达到10，剧烈搅拌反应半小时。取出反应溶液在80℃水浴中陈化2小时促使晶体成熟。以去离子水洗涤，10000转离心10分钟5次后得到磁性纳米粒子，调整Fe离子浓度为5mg/ml。
2、RGD与PLA-USPIO的偶联
取100μl Fe离子浓度为5mg/ml PLA-USPIO，加入100μl蒸馏水等比稀释后，以活化缓中液(pH5.7、20Mm borate buffer)配成1mg/ml的溶液。分别取5mg的EDC和sulfo-NHS溶于活化缓冲液，终浓度1mg/ml。取EDC和sulfo-NHS各30μl依次加入PLA-USPIO体系，以磁力搅拌器在室温搅拌反应10分钟。以460μl反应缓冲液(pH9、10mM borate buffer)调节pH值到8.8。加入200μlRGD(7-8mg/ml)，磁力搅拌室温反应2小时后以1M Tris-HCl终止反应。用磁铁除去多余的淬灭试剂，调整RGD-PLA-USPIO的Fe浓度为0.5mg/ml。
实施例2：RGD-PLA-USPIO复合物的体外表征
1)透射电镜：透射电镜图如图1所示，图1显示，USPIO-PLA-RGD复合物的核心USPIO的粒径在3-5nm左右。
2)动态光散射：将实施例1制得的PLA-USPIO水溶液和RGD-PLA-USPIO水溶液分别置于粒度仪中，其动态光散射谱分别如图2和图3所示，结果显示：PLA-USPIO的水合粒径为62nm左右，RGD-PLA-USPIO的水合粒径在95nm左右。
3)FT-IR：将RGD-PLA-USPIO冻干后取固体行FT-IR，在谱线上可以观察到羧基峰。
4)RGD-PLA-USPIO的体外实验
将人脐静脉内皮细胞HUVECs(上海交通大学药学院馈赠)种植于六孔板，分别给与实施例1制得的含RGD-PLA-USPIO的培养基2ml或含PLA-USPIO的培养基2ml，孵育2小时后收集细胞，分散于明胶中进行MR检测。对于Prussian Blue Stain则将细胞离心后重新种植于玻片上，孵育过夜。以4％多聚甲醛固定细胞半小时，用蒸馏水洗涤，加入2％稀盐酸和2％亚铁氰化钾的混合溶液，反应半小时后再以蒸馏水洗涤3次，以核快红染色，脱水透明后封片。HUVECs细胞和RGD-PLA-USPIO共同孵育30分钟后，可见在细胞周围有蓝色的铁颗粒呈花环样附着(如图4所示)，表明RGD-PLA-USPIO与内皮细胞表面整合素受体特异性结合；HUVECs细胞和PLA-USPIO共同孵育30分钟后，在内皮细胞周围没有见到蓝色铁颗粒(如图5所示)，表明没有连接RGD的PLA-USPIO不能与内皮细胞表面的整合素受体进行有效的特异性结合。
实施例3：RGD-PLA-USPIO荷瘤动物实验
1)兔VX2肿瘤模型制备
纯种新西兰大白兔，月龄2～3个月，雌雄不限，体重1.6～1.8kg。利用咪唑安定注射液(5mg/kg)与盐酸氯胺酮注射液(25mg/kg)混合溶液肌肉注射麻醉成功后，对其一侧大腿近段外侧皮肤常规脱毛、消毒，将0.1ml VX2肿瘤组织悬液注入大腿股外侧肌内，约2周成模。肿瘤呈类圆形实质性肿块，被膜清晰，内部信号均匀一致。
2)实验动物MR成像
新西兰大耳白兔在后肢接种VX₂肿瘤，约两周后备用。在注药前先行麻醉并在耳缘静脉置管，在1.5T磁共振行平扫。完成扫描后，按Fe 3mg/kg经耳缘静脉留置管分别注射实施例1制得的RGD-PLA-USPIO和PLA-USPIO并进行即时、15分钟、30分钟、1小时、6小时、24小时动态扫描并测量各时段MR信号强度。
3)MR信号测量
在相同层面分别在肿瘤、瘤周组织、对侧后肢肌肉和肝脏取一致的感兴趣区(面积为3mm)，测量T1WI/T2WI/T2*WI等序列的信号强度，计算T2值，并做时间-信号强度曲线。
4)数据处理
采用SPSS 10.0以ANOVA方法对所得数据进行统计学处理。在RGD-PLA-USPIO药物注射后30分钟，肿瘤周边信号开始下降，其后信号逐步降低，在6小时达到最低。而注射PLA-USPIO后，肿瘤部位未出现明显的信号降低。
MR成像结果如图6、图7所示，其中：
图6是注射前在T1WI肿瘤基本为等信号，T2WI为高信号，注射RGD-PLA-USPIO之后显示T1WI肿瘤整体信号略有提高，在T2WI在肿瘤边缘可见多个信号减低区。
图7是注射RGD-PLA-USPIO之后在T2*WI图像可以发现比T2WI更为显著的信号减低区，在SWI图像的相应解剖区域可见更为明显的影像学表现，提示SWI和T2*WI比T2WI对于USPIO的检测更为敏感。