一种在端粒酶阳性肿瘤细胞特异表达标记基因和治疗基因的慢病毒及其用途.pdf

本发明公开一种重组慢病毒，其内含有重构后的端粒酶基因启动子，并且该病毒的载体质粒内含有一个以上外源基因。所述病毒的载体质粒内含的外源基因是一个标记示踪基因加上一个肿瘤治疗基因、或者仅一个标记示踪基因。本发明提供的重组慢病毒可以在制备肿瘤生物显影剂、及在制备活体端粒酶活性肿瘤的生物治疗药物中得到应用。

1、  一种重组慢病毒，其特征在于其内含有重构后的端粒酶基因启动子，并且该病毒的载体质粒内含有一个以上外源基因。

2、  根据权利要求1所述的重组慢病毒，其特征是所述慢病毒由三质粒系统：胞膜质粒pMD2G、包装质粒psPAX2和载体质粒pLenti-hTERT-eGFP组成；或由四质粒系统：包胞膜质粒pLP/VSVG、装质粒pLP1，pLP2、和载体质粒pLenti-hTERT-eGFP组成。

3、  根据权利要求2所述的重组慢病毒，其特征在于所述重构后的端粒酶基因启动子是端粒酶逆转录酶基因启动子、端粒酶RNA组分基因启动子其中之一。

4、  根据权利要求3所述的重组慢病毒，其特征是将端粒酶逆转录酶基因启动子截取其核心成分，并加入三个E-box加以改良，得到所述重构后的端粒酶逆转录酶基因启动子SEQ ID NO：1。

5、  根据权利要求1所述的重组慢病毒，其特征在于所述病毒的载体质粒内含的外源基因是一个标记示踪基因加上一个肿瘤治疗基因、或者仅一个标记示踪基因。

6、  根据权利要求书5所述的重组慢病毒，其特点是所述病毒所携带的标记示踪基因取自红色荧光蛋白RFP基因、绿色荧光蛋白GFP或eGFP基因、荧光素酶基因及各种核素标记基因中的一种；病毒所携带的肿瘤治疗基因选自：前药转换酶基因、抑癌基因、细胞凋亡基因和细胞因子基因其中的一种。

7、  根据权利要求6所述的重组慢病毒，其特征是所述标记示踪基因和肿瘤治疗基因相对位置可以是以下几种之一：启动子-示踪基因-IRES2-治疗基因、启动子-治疗基因-IRES2-示踪基因、启动子-示踪基因-治疗基因、启动子-治疗基因-示踪基因。

8、  权利要求1所述的重组慢病毒在制备肿瘤生物显影剂中的应用。

9、  权利要求1所述的重组慢病毒在制备活体端粒酶活性肿瘤的生物治疗药物中的应用。

一种在端粒酶阳性肿瘤细胞特异表达标记基因和治疗基因的慢病毒及其用途
发明领域
本发明涉及重组慢病毒基因转移技术。结合端粒酶基因启动子的肿瘤特异启动功能，用慢病毒转基因技术在体外研究肿瘤的发生和发展及治疗性药物；在体内实施肿瘤的示踪和在体治疗。
背景技术
恶性肿瘤是目前人类健康面临的最大威胁，传统的恶性肿瘤的治疗手段包括手术、化疗、放疗等。但对很多中晚期肿瘤患者，这些传统治疗方法就显得力不从心，与此同时生物治疗就成为一种必需的手段。基因治疗是生物治疗的方式之一，将基因通过载体转入病人体内，从而达到治疗和预防疾病的目的。基因治疗的一大关键问题是肿瘤靶向性问题。肿瘤的基因治疗是建立在诊断明确，定位明确，精确把握治疗范围和治疗程度的基础上的。肿瘤靶向性活体生物萤光成像技术在肿瘤的基因诊断和实时监测肿瘤发生发展的病理过程中有非常宽阔的应用前景。活体生物萤光成像技术具有以下几个常规检测手段所不具备的优点：(1)无创伤性；(2)可多次重复在不同时间点检测；(3)快速扫描成像(时间少于5min)；(4)可以使生物活体整体成像。活体生物萤光成像技术与转基因动物相结合可以实时示踪许多重要细胞和分子，特别是肿瘤细胞、免疫相关细胞和介质，从而洞悉其在疾病发生发展过程中所扮演的角色，为揭示多种疾病病理过程提供了线索。在动物模型的病理过程研究中，活体生物萤光成像技术的无创检测报告基因表达这一能力与传统的将实验动物处死后再进行组织染色、酶活性分析的方法相比有巨大优势。活体生物萤光成像技术在实验中可在同一实验动物体内获得全部时间点的整体数据，可以用极少的实验动物而迅速获得更全面的数据，这样就大大地节省了实验动物、时间以及实验经费。由于能够对同一动物进行连续检测这样就最大程度减少了不同实验动物之间的个体差异以及传统检测方法误差所造成的对实验结果的影响。更重要的是活体生物萤光成像技术的敏感性极高，有研究证实活体生物萤光成像技术检测肿瘤细胞的敏感性甚至超过了流式细胞仪体外检测的敏感性。与其他用于检测细胞游走增殖的标记技术如萤光染料、放射性探针等相比活体生物萤光成像技术对标靶细胞无毒副作用，并且也不会因标靶细胞增殖分裂，信号稀释而丧失标记作用。
活体生物萤光成像技术在肿瘤方面可以应用于快速的测量各种癌症模型中肿瘤的生长，并可对癌症治疗中癌细胞的变化进行实时观测评估；可以无创伤地定量检测小鼠整体的原位瘤、转移瘤及自发瘤。已有研究人员使用萤光素酶和GFP作为报告子活体成像肿瘤细胞，并探讨了使用这些报告基因在细胞分子水平研究肿瘤的前景。而且研究证实使用活体生物萤光成像技术获得的实验结果与MRI成像的结果能够达到91％的一致性，这进一步证明活体生物萤光成像技术在活体分析肿瘤的时间空间分布方面是一个极其优秀的工具。MRI测出的肿瘤体积与活体生物萤光成像测得的肿瘤组织所产生的光子数呈线性相关。由于MRI测得的体积还包括肿瘤周边的水肿、浸润的细胞、死亡细胞的残骸，而活体生物萤光成像测得的却只有具有代谢活力的肿瘤细胞因此更具研究价值。
活体生物萤光成像技术最基本的要求是要将外源的显像基因靶向性导入活体细胞表达。因此需要一种高效、安全的基因导入系统，也即是转基因载体系统。近年来，研究人员提出了癌症的靶向基因-病毒治疗策略(targetinggene-virotherapy of cancer)，即将高效安全的病毒转基因系统和特定的肿瘤选择元件结合起来，使外源的显像基因或治疗基因能够通过病毒载体选择性的转移到肿瘤细胞中去，并在其中表达。癌症的靶向基因-病毒治疗策略，可克服传统肿瘤基因治疗中转染效率低、靶向性差、目的基因表达量低、杀伤力不够等缺点，因此，癌症的靶向基因-病毒治疗应该会比过去的基因治疗方法效果好很多。
靶向基因-病毒治疗策略之关键步骤是解决两个问题：(1)如何选择高效安全的基因转移系统，即病毒。(2)如何选择和实施基因转移的肿瘤靶向性元件。
病毒载体有两类：一类可以整合到染色体，如逆转录病毒、腺相关病毒、慢病毒；另一类不能整合到染色体，如腺病毒、单纯疱疹病毒及EB病毒。逆转录病毒载体只能感染分裂期细胞，容纳外源基因的DNA片段长度不超过8kb；腺病毒载体感染细胞时，病毒DNA游离在细胞核内，并不整合到染色体上，在体内不能实现稳定的长期表达，且反复应用容易引起免疫反应。而以人类免疫缺陷病毒-1(H IV-1)来源的慢病毒载体越来越受到人们的重视。研究发现慢病毒载体最大的特点是可以感染非分裂期细胞，人们已成功地应用慢病毒载体感染了神经细胞、肝细胞、造血干细胞、胰岛细胞、肌肉细胞、视网膜色素上皮细胞、气道上皮细胞等。此外，慢病毒载体容纳外源性目的基因的片段大，可以在体内较长期的表达，免疫反应小，安全性较好。这些优点使慢病毒成为基因治疗中最理想的载体。
基因转移的肿瘤靶向性一直是肿瘤基因治疗的瓶颈问题。多种肿瘤靶点已经被逐渐明确的阐述，本发明使用端粒酶催化亚基启动子作为肿瘤靶点。端粒存在于真核细胞染色体末端。随着细胞的逐次分裂，端粒逐渐变短，约每分裂一次减少50-200个核苷酸，细胞分裂至一定次数，端粒缩短至一定程度，会导致细胞死亡。当细胞发生恶变时，通过某种机制端粒酶被激活，使得分裂过程中的细胞端粒延长，从而维持染色体的稳定，使细胞逃逸死亡获得永生，最终导致肿瘤细胞不断增殖。因此端粒酶激活在肿瘤细胞发生发展过程中起关键作用。端粒酶在90％肿瘤细胞中均为阳性，而极大多数正常细胞端粒酶均为阴性，因此端粒酶可作为肿瘤细胞一种特征性标记。目前研究证实，人的端粒酶由三个部分组成：1.RNA组分(hTR)，2.端粒酶结合蛋白(hTP)，3.端粒酶逆转录酶(hTERT)。由于在大多数肿瘤细胞或肿瘤细胞株中端粒酶逆转录酶高表达，而在正常细胞中呈不表达或低表达，表明端粒酶逆转录酶启动子在极大多数肿瘤细胞中具有启动活性。某些文献也将端粒酶逆转录酶称为端粒酶催化亚基。
随着肿瘤的基因治疗的发展，示踪基因和治疗基因的研究已经非常深入。多种肿瘤示踪基因和治疗基因早已用于肿瘤的临床诊断、生物治疗和肿瘤药物开发。
活体生物萤光成像技术是近年来发展起来的一项崭新的分子、基因表达的分析检测系统.多种生物荧光基因在细胞内表达可以直接或间接的发出荧光，在体外用特殊的荧光检测设备能够精确探测到这种荧光。这些设备包括CCD照相机(chargecoupled device camera，CCD camera)、双光子激发显微镜(two-photon excitationmicroscopy)等。研究比较深入的生物荧光蛋白或基因是萤光素酶基因和绿色荧光蛋白基因。萤光素酶基因的表达产物荧光素酶在ATP存在的前提下可以催化其底物荧光素反应并发出荧光。绿色荧光蛋白(GFP)是Chalfic等从研究维多利亚水母(Aequorea Victoria)发光现象中分离纯化出绿色荧光蛋白(Green FluorescentProtein，GFP)基因，由于其分子量小，蛋白性质极为稳定，转染细胞后，不影响目的基因的表达及目的蛋白的结构和功能，对细胞无毒性作用，易于耐受高温等处理，无光漂白作用，用甲醛固定和石蜡包埋不影响其荧光特性，能够在异源细胞中稳定表达，无须辅助因子或共反应因子加入即可在紫外光或蓝光激发下发射荧光。基于以上优点，这两种荧光报告基因被广泛用于生物显像和体内示踪的研究中。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组慢病毒，它包含有肿瘤特异性启动子启动表达的目的外源基因，该目的外源基因是经证实可以对肿瘤实施活体显像和同步治疗的基因片段。
本发明所涉及的慢病毒是基于人类免疫缺陷病毒HIV-1改建的，其内含有重构后的端粒酶基因启动子，并且该病毒的载体质粒内含有一个以上外源基因。
所述慢病毒可以由三质粒系统：胞膜质粒pMD2G、包装质粒psPAX2和载体质粒pLenti-hTERT-eGFP组成；或由四质粒系统：包胞膜质粒pLP/VSVG、装质粒pLP1，pLP2、和载体质粒pLenti-hTERT-eGFP组成。
上述重构后的端粒酶基因启动子是端粒酶逆转录酶基因启动子、端粒酶RNA组分启动子其中之一。
将上述端粒酶逆转录酶基因启动子截取其核心成分，并加入三个E-box加以改良，得到所述重构后的端粒酶逆转录酶基因启动子SEQ ID NO：1。
上述病毒的载体质粒内含的外源基因是一个标记示踪基因加上一个肿瘤治疗基因、或者仅一上标记示踪基因。
上述病毒所携带的标记示踪基因取自红色荧光蛋白RFP基因、绿色荧光蛋白GFP或eGFP基因、荧光素酶基因及各种核素标记基因中的一种；病毒所携带的肿瘤治疗基因选自：前药转换酶基因、抑癌基因、细胞凋亡基因和细胞因子基因其中的一种。
上述标记示踪基因和肿瘤治疗基因相对位置可以是以下几种之一：启动子-示踪基因-IRES2-治疗基因、启动子-治疗基因-IRES2-示踪基因、启动子-示踪基因-治疗基因、启动子-治疗基因-示踪基因。
在一个实施方案中，使用了以下肿瘤特异性启动子之一：人端粒酶逆转录酶基因启动子、人端粒酶RNA组分基因启动子。在该启动子之后接入以下至少一种肿瘤示踪基因：绿色荧光蛋白(eGFP)基因，荧光素酶(luciferase)基因。然后用基于HIV-1的慢病毒第三代包装系统将该表达质粒包装成慢病毒。第三代包装系统包括四种质粒：包胞膜质粒pLP/VSV-G、装质粒pLP1，pLP2、和自主构建的转移质粒组成。在体外试验中，本发明成功用该病毒选择性感染了端粒酶阳性肿瘤和端粒酶阳性的正常细胞，并经特殊检测手段证实所使用的改良hTERT启动子在体外以上细胞中具有较强启动能力，可启动示踪基因较强表达。相比之下，使用同种病毒感染端粒酶阴性肿瘤细胞和端粒酶阴性正常细胞，检测结果发现该启动子在其中弱表达甚至不表达。在活体试验中，本发明成功用该病毒以尾静脉注射的方式，分别感染端粒酶阳性肿瘤大鼠模型和端粒酶阴性肿瘤大鼠模型，使用以下两种方式之一：CCD照相机(charge-coupled device camera、CCD)、双光子激发显微镜(two-photonexcitation microscopy)。对活体大鼠肿瘤中eGFP的表达进行显像。检测结果证实在端粒酶阳性肿瘤大鼠模型活体显像中，GFP有较强表达，肿瘤能够清晰成像；而在端粒酶阴性肿瘤大鼠模型中，GFP不能被成像系统所检测到。在进一步的活体研究中，本发明在人端粒酶逆转录酶基因启动子启动的eGFP之后接入胞嘧啶脱氨酶(CD)基因，并用该病毒感染端粒酶阳性肿瘤大鼠模型和端粒酶阴性肿瘤大鼠模型，使用相同的成像设备多时相检测肿瘤的eGFP表达和肿瘤的杀伤效应。结果证实在端粒酶阳性肿瘤大鼠模型活体显像中，eGFP有较强表达，且随时间推移肿瘤范围逐渐缩小，证明了CD基因对肿瘤的靶向性杀伤作用；而在端粒酶阴性肿瘤大鼠模型中，eGFP不能被成象系统所检测到，不同时相处死肿瘤大鼠发现肿瘤不缩小。
HIV-1病毒DNA的主要结构基因及其排列形式与其它逆转录病毒相同，均为5′LTR-gag-pro-pol-env-3′LTR。其中gag基因编码病毒的核心蛋白，pol基因编码病毒复制所需的酶类，env基因编码病毒的包膜糖蛋白，pro基因则编码切割蛋白前体所需的蛋白酶。与其它逆转录病毒不同的是，HIV-1基因组尚有较多调节基因，其中属于HIV-1基因复制所必需的tat基因和rev基因，分别编码两个反式激活因子Tat蛋白和Rev蛋白，前者在HIV-1基因组复制和转录延伸过程中发挥重要作用，后者则可促使HIV-1基因的表达由早期向晚期转化。非HIV-1复制所必需的调节基因有nef、vif、vpr和vpu。这些基因的编码产物都有各自的功能。
HIV-1载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的同源性，如将包装成分上5′L TR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、3′LTR换成SV40polyA等。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。本实验所使用的慢病毒载体是在多次改建优化载体性能后的第三代四质粒慢病毒表达系统。所有基因的表达均依赖外源性的强组成性启动子。包装系统被分为互不重叠的一个gag/pol质粒和一个rev质粒。为了降低包装质粒和转移质粒重组的可能性，将gag/pol的编码优先性从HIV的AU富含区改变到人类基因更易找到的序列(人类化)。由此分裂了HIV基因组中的不稳定序列(INS)。这种改造使得gag/pol序列的表达不依赖Rev/RRE系统。载体安全性在两方面得到改善：(1)包装质粒的RRE/Rev依赖性的消除降低了载体质粒和包装质粒之间的同源性。(2)gag/pol序列的人类化进一步降低了包装质粒和载体质粒的gag序列的同源性。本发明改建的慢病毒载体改建于invitrogen公司的pLenti6/V5TOPO质粒。将其CMV启动子更换为我们设计的肿瘤特异性hTERT启动子.再在其后加入我们的目的基因。该基因转移系统包括四个质粒：表达gag/pol的pLP1质粒，表达rev的pLP2质粒，表达胞膜蛋白的pLP/VSV-G质粒，以及我们构建的载体质粒。
在本发明实施例之一，成功构建了包含肿瘤特异性改良型hTERT启动子，以及在其调控下特异表达肿瘤示踪基因(绿色荧光蛋白或荧光素酶)和治疗基因(胞嘧啶脱氨酶)的载体质粒。并用慢病毒第三代载体系统包装，检测滴度后感染端粒酶阳性和端粒酶阴性肿瘤小鼠模型。并用CCD照相机检测了在活体肿瘤内表达的绿色荧光蛋白。同时给予前药5-氟胞嘧啶，观察绿色荧光示踪的肿瘤杀伤范围和程度。结果发现该病毒能够对端粒酶阳性肿瘤进行清晰有效的在体显影，并同时对肿瘤具有较强杀伤效应。
附图说明
图1：pLenti6/V5TOPO克隆表达载体质粒(invitrogen公司)。
图2：pUC57质粒测序图谱。
图3：pLenti-hTERT-eGFP质粒测序图谱。
图4：pLenti-hTERT-eGFP和对照组pLenti-CMV-eGFP质粒转染人肝癌细胞HepG II后绿色荧光蛋白的表达。左为pLenti-hTERT-eGFP，右为pLenti-CMV-eGFP。
图5：pLenti-hTERT-eGFP和pLenti-CMV-eGFP质粒转染人结肠癌细胞SW480后绿色荧光蛋白的表达。左为pLenti-hTERT-eGFP，右为pLenti-CMV-eGFP。
图6：pLenti-hTERT-eGFP和pLenti-CMV-eGFP质粒转染人胃癌细胞SGC-7901后绿色荧光蛋白的表达。左为pLenti-hTERT-eGFP，右为pLenti-CMV-eGFP。
图7：pLenti-hTERT-eGFP和pLenti-CMV-eGFP质粒转染人胚肾细胞293FT后绿色荧光蛋白的表达。左为pLenti-hTERT-eGFP，右为pLenti-CMV-eGFP。
图8：pLenti-hTERT-eGFP和pLenti-CMV-eGFP质粒转染正常人肝细胞LO2后绿色荧光蛋白的表达。左为pLenti-hTERT-eGFP，右为pLenti-CMV-eGFP。
图9：pLenti-hTERT-eGFP和pLenti-CMV-eGFP质粒转染人骨肉瘤细胞U2OS后绿色荧光蛋白的表达。左为pLenti-hTERT-eGFP，右为pLenti-CMV-eGFP。
图10：pLenti-hTERT-eGFP和pLenti-CMV-eGFP质粒转染正常人成纤维细胞HF后绿色荧光蛋白的表达。左为pLenti-hTERT-eGFP，右为pLenti-CMV-eGFP。
图11：pGL-3basic质粒图谱。
图12：Luciferase全长基因PCR产物电泳图。
图13：用BamH I和xho I酶切鉴定pLenti-hTERT-luciferase质粒电泳图。
图14：用检测引物对重组pLenti-hTERT-luciferase质粒做菌落PCR，电泳结果图。
图15：重组质粒pLenti-hTERT-luciferase测序图。
图16：用质粒pLenti-hTERT-luciferase和pLenti-CMV-luciferase转染七种细胞。图中每种颜色直方图代表一种细胞，每组直方图从左至右不同颜色分别为：人结肠癌细胞SW480、人胃癌细胞SGC-7901、人肝癌细胞Hep G II、正常人肝细胞LO2、人胚肾细胞293FT、人骨肉瘤细胞U2OS、人成纤维细胞HF。其中人骨肉瘤细胞U2OS、人成纤维细胞HF为端粒酶阴性，其余全部为阳性。横轴标注的符号为转染的质粒，从左至右分别是pLenti-hTERT-luciferase质粒；
pLenti-CMV-luciferase质粒；Negative为阴性对照，内不含启动子；positive为阳性对照，内含SV40启动子；wildtype为含野生型hTERT启动子的对照质粒。
图17：共转染10小时候293FT细胞照片。可见细胞内毒性空斑。
图18：重组病毒感染大鼠Hep GII肝癌模型。
图19：重组病毒感染大鼠SGC-7901胃癌模型。
图20：重组病毒感染大鼠SW480结肠癌模型。
图21：重组病毒感染大鼠U2OS骨肉瘤模型。
具体实施方式
实施过程分为体外部分和体内部分。体外部分以pLenti6/V5TOPO质粒为基础构建了改良型hTERT启动子启动eGFP或luciferase基因表达的质粒，并分别用该质粒在体外瞬时转染多种端粒酶阳性和端粒酶阴性肿瘤细胞，采用不同手段检测了eGFP或luciferase基因的表达特点和表达强度。以确定我们设计的该启动子是否具有端粒酶阳性肿瘤特异性。体内部分将体外构建的质粒在绿色荧光蛋白之后接入胞嘧啶脱氨酶基因，并使用第三代慢病毒载体系统将该质粒包装成慢病毒，感染端粒酶阳性和端粒酶阴性肿瘤大鼠模型。并用CCD照相机检测了在活体肿瘤内表达的绿色荧光蛋白。同时给予前药5-氟胞嘧啶，观察绿色荧光示踪的肿瘤杀伤范围和程度。
1体外部分
1.1hTERT启动子调控绿色荧光蛋白表达的慢病毒转移质粒构建。
从invitrogen公司购得pLenti6/V5TOPO克隆表达载体盒。其中包括pLenti6/V5TOPO质粒(质粒图谱见图1)及质粒专用扩增菌株Stb13，包装细胞系293FT。pLenti6/V5TOPO质粒是一种高效的慢病毒表达载体质粒。该质粒的CMV启动子是一个强势启动子，其后有一个TOPO定向克隆位点，是一种一端为钝端另一端为粘性末端的克隆位点。此位点一旦连接即不能再次断开，属于一次性位点。我们从pEGFP-C1质粒上PCR扩增eGFP全长序列，并用TOPO定向克隆的方式装载至装载至pLenti6/V5TOPO质粒的TOPO位点。
具体实施方式为：运用Primer Premier 5.0软件设计eGFP的扩增引物，并在上游引物起始子ATG前加入TOPO识别位点CACC。将该PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测。将eGFP全长序列PCR产物用TOPO定向克隆的方式连接到pLenti6/V5TOPO质粒的定向克隆位点。根据试剂盒(invitrogen公司)的说明，TOPO连接反应的混合比例如下：