一种中药组合物在制备保护内皮细胞屏障功能完整性药物中的应用.pdf

本发明公开了一种中药组合物在制备保护内皮细胞屏障功能完整性药物中的应用，本发明中药组合物能够抑制细胞粘附分子的表达，减少炎症反应，增加血管内皮钙粘素含量，保护内皮细胞屏障功能完整性。

1.  一种中药组合物在制备保护内皮细胞屏障功能完整性药物中的应用，其特征在于所述中药组合物由如下重量份的原料药制成：
人参3-10  水蛭3-11  土鳖虫5-10  乳香(制)1-5  赤芍3-9  降香1-5
檀香1-5   全蝎3-9   蝉蜕3-12    蜈蚣1-3      冰片1-7  酸枣仁(炒)3-10。

2.  如权利要求1所述的应用，其特征在于所述中药组合物由如下重量份的原料药制成：
人参6  水蛭10  土鳖虫7 乳香(制)2 赤芍5  降香2
檀香2  全蝎7   蝉蜕7   蜈蚣1     冰片5  酸枣仁(炒)5。

3.  如权利要求1所述的应用，其特征在于所述中药组合物由如下重量份的原料药制成：
人参10  水蛭8  土鳖虫7  乳香(制)2  赤芍5  降香2
檀香2   全蝎9  蝉蜕7    蜈蚣1      冰片5  酸枣仁(炒)5。

4.  权利要求1所述的应用，其特征在于所述中药组合物由如下重量份的原料药制成：
人参6  水蛭11  土鳖虫7  乳香(制)2  赤芍5  降香2
檀香2  全蝎3   蝉蜕7    蜈蚣1      冰片5  酸枣仁(炒)5。

5.  如权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于所述中药组合物的活性成分由下列成分组成：
a平均粒径小于100μm的全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫、蝉蜕及制乳香药粉；
b冰片药粉；
c由降香和檀香提取的挥发油；
d人参用乙醇提取后的醇提液经浓缩后的醇提浸膏；
e提取成分c后的降香和檀香药渣的水提液、赤芍和炒酸枣仁加水煎煮后的水提液以及提取成分d后的人参药渣的水提液过滤、混匀后浓缩成的水提浸膏。

6.  如权利要求1-4中任一项及权利要求5所述的应用，其特征在于所述中药组合物的制剂剂型为胶囊剂、片剂、丸剂、口服液、软胶囊剂或滴丸剂。

7.  如权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于所述中药组合物在制备抑制细胞粘附分子的表达药物中的应用。

8.  如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的细胞粘附分子为P-选择素和细胞间粘附分子1中之一或二者。

9.  如权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于所述中药组合物在制备减少炎症反应的药物中的应用。

10.  如权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于所述中药组合物在制备增加血管内皮钙粘素含量的药物中的应用。

一种中药组合物在制备保护内皮细胞屏障功能完整性药物中的应用
技术领域
本发明涉及一种中药组合物的新用途，具体地，涉及一种中药组合物在制备保护内皮细胞屏障功能完整性药物中的应用，属中药应用领域。
背景技术
内皮细胞是血液与血管壁之间的结构和功能屏障，内皮细胞受损是动脉粥样硬化形成的始发因素，粘附分子在内皮细胞受损过程中起了重要作用，因此如何控制内皮细胞粘附分子的表达在防止脉粥样硬化发生中是至关重要的。
急性心肌梗死(Acute myocardial infarction，AMI)再灌注后的短暂时间内，即可在心肌损伤区内观察到多形核中性粒细胞的聚集，活化的中性粒细胞不仅释放出大量活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)、蛋白水解酶和促炎症介质，增加血管通透性，还能堵塞微血管引起二次缺血，并渗出至周围组织引起炎症反应和组织损伤，从而引起内皮细胞屏障功能障碍。[Engler RL，Schmid-Schonbein GW，Pavelec RS.狗心肌缺血再灌注白细胞毛细血管填塞.Am J Pathol.1983 Apr；111(1)：98-111；Saeed SA，Waqar MA，Zubairi AJ，et al.心肌缺血再灌注损伤：活性氧与中性粒细胞的角色.J Coll Physicians Surg Pak.2005 Aug.15(8)：507-14.]
冠脉内皮细胞是心脏抵御炎症损伤的第一道防线，它不仅发挥着屏障功能，同时也通过调节NO和腺苷的水平阻止中性粒细胞的聚集和粘附。研究发现，再灌注损伤过程中，ROS可以上调粘附分子的表达，如P-选择素和ICAM-1，促进细胞因子和补体的释放，进而活化中性粒细胞，后者通过粘附分子依赖机制，如P-选择素，可以直接损伤内皮细胞，抑制NO的合成，诱发血管收缩。缺血再灌注过程中，中性粒细胞和内皮细胞间的相互作用主要是由细胞表面粘附分子所介导。在炎症部位，中性粒细胞的贴壁和滚动主要依赖于细胞表面P-选择素糖蛋白配体1和内皮表面的P-选择素之间的识别，这是炎症反应和白细胞渗出过程的重要始动因素。ICAM-1和VCAM-1同属于免疫球蛋白超家族成员，定位于血管内皮细胞表面，两者分别与相应的配体CD11/CD18复合物和VLA-4相结合介导白细胞的聚集和稳定粘附，促进白细胞的活化和炎性渗出。缺血再灌注过程能够激活ROS敏感信号通路，促使核转录因子AP-1和kappaB活化，粘附分子ICAM-1，VCAM-1，P-选择素和E-选择素的转录增加，导致内皮细胞粘附性增强和白细胞渗出增加。因此，细胞表面粘附分子表达水平反映了血管内皮细胞损伤及炎症浸润的程度。
内皮细胞间连接蛋白在维持内皮细胞功能和结构完整性中发挥至关重要的作用。血管内皮钙粘素表达于内皮细胞表面，它能介导钙离子依赖的同型细胞间粘附，不仅参与内皮细胞的生长、存活和迁移等过程，并且还在调节内皮细胞完整性方面发挥非常重要的作用。研究显示，用特异性抗体阻断血管内皮钙粘素介导的细胞间相互作用，将会破坏内皮细胞完整性，同时增加中性粒细胞的渗出。与其它钙粘素一样，血管内皮钙粘素的胞浆部分与犰狳蛋白家族成员β-连环蛋白和γ-连环蛋白相结合，后两者借助α-连环蛋白连接到肌动蛋白细胞骨架上，血管内皮钙粘素的功能主要受细胞骨架变化和细胞内蛋白磷酸化的调节。研究显示，在氧化应激过程中，ROS能增加肌球蛋白轻链磷酸化，促进细胞收缩，同时伴随有连接蛋白的解离和再分布，导致内皮细胞屏障功能障碍，毛细血管通透性增加和炎症细胞渗出增多。
本发明是在第01131203.3号中国专利和第200410048292.2号专利的基础上进行的改进发明，在此全文引用该两专利文件记载的内容。本发明提供了一种中药组合物在制备保护内皮细胞屏障功能完整性药物中的应用。
发明内容
本发明目的是提供一种中药组合物在制备保护内皮细胞屏障功能完整性药物中的应用。
本发明中药组合物能够抑制细胞粘附分子的表达，减少炎症反应，增加血管内皮钙粘素含量，保护内皮细胞屏障功能完整性。
优选地，所述细胞粘附分子为P-选择素和细胞间粘附分子1中之一或二者。
本发明的另一个目的是提供该中药组合物在制备保护内皮细胞屏障功能完整性药物中的应用中的活性成分。
本发明应用中，所述中药组合物由如下重量份的原料药制成：
人参3-10  水蛭3-11  土鳖虫5-10  乳香(制)1-5  赤芍3-9  降香1-5
檀香1-5   全蝎3-9   蝉蜕3-12    蜈蚣1-3      冰片1-7  酸枣仁(炒)3-10；
优选地，该中药组合物由如下重量份的原料药制成：
人参6  水蛭10  土鳖虫7  乳香(制)2  赤芍5  降香2
檀香2  全蝎7   蝉蜕7    蜈蚣1      冰片5  酸枣仁(炒)5；
或：
人参10  水蛭8  土鳖虫7  乳香(制)2  赤芍5  降香2
檀香2   全蝎9  蝉蜕7    蜈蚣1      冰片5  酸枣仁(炒)5；
或：
人参6  水蛭11  土鳖虫7  乳香(制)2  赤芍5  降香2
檀香2  全蝎3    蝉蜕7   蜈蚣1      冰片5  酸枣仁(炒)5；
本发明中药组合物中，原料药材的拉丁名及其加工方法来自《中药大辞典》(1977年7月，第一版，上海科学技术出版社)和《中国药典》(2005年版，化学工业出版社)。
本发明的应用中，所述中药组合物各原料中的一种或几种，可单独或同时被相同药性、功效的中药原料药替换，替换后，组合物制剂和作用不发生变化。
本发明的应用中，该中药组合物的活性成分由下列成分组成：
a平均粒径小于100μm的全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫、蝉蜕及制乳香药粉；
b冰片药粉；
c由降香和檀香提取的挥发油；
d人参用乙醇提取后的醇提液经浓缩后的醇提浸膏；
e提取成分c后的降香和檀香药渣的水提液、赤芍和炒酸枣仁加水煎煮后的水提液以及提取成分d后的人参药渣的水提液过滤、混匀后浓缩成的水提浸膏。
本发明的应用中，所述中药组合物剂型为胶囊剂、片剂、丸剂、口服液、软胶囊或滴丸剂。
本发明中药组合物制剂还可以按常规的制剂工艺，例如，范碧亭《中药药剂学》(上海科学出版社1997年12月第1版)记载的制备工艺，制成药剂学可接受的任意常规剂型，例如胶囊剂、片剂、丸剂、口服液、软胶囊、滴丸等。
本发明的应用中，所述中药组合物为胶囊剂、片剂、丸剂、口服液、软胶囊、滴丸制剂中的一种，为使上述剂型能够实现，需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料，例如：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：PEG6000，PEG4000，虫蜡等。为使上述剂型能够实现中药药剂学，需在制备这些剂型时加入药学可接受的其它辅料(范碧亭《中药药剂学》，上海科学出版社1997年12月第1版中各剂型记载的辅料)。
本发明胶囊剂优选通过以下制备方法制成：将上述配比的水蛭、全蝎、蝉蜕、土鳖虫、蜈蚣等五味药洗净，低温烘干，备用；檀香、降香提取挥发油，药渣及水溶液备用；人参用70％乙醇加热回流提取二次，第一次3小时，第二次2小时，合并提取液，回收乙醇至无醇味；人参药渣与檀香、降香的药渣以水溶液合并，加入赤芍、酸枣仁(炒)，加水煎煮二次，第一次3小时，第二次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.20-1.25(60℃)的清膏，加入上述人参醇提液，混匀，低温干燥，粉碎成细粉；乳香(制)与水蛭等五味共粉碎成细粉；冰片研细，分别与上述细粉配研，混匀，喷入挥发油，混匀，装入胶囊，即得。
或者，本发明制剂优选通过以下制备方法制成：
a)原料药的重量比为：人参3-10份、水蛭3-11份、土鳖虫5-10份、制乳香1-5份、赤芍3-9份、降香1-5份、檀香1-5份、全蝎3-9份、蝉蜕3-12份、蜈蚣1-3份、冰片1-7份、炒酸枣仁3-10份；
b)药材粉碎工艺：
将全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫和蝉蜕五种虫药经净选、水洗处理后和净选炮制后的制乳香按处方配料，由粉碎机进行粉碎，药粉细度达到80目以上；粗粉后的药粉经各种超微粉碎技术进行超微粉碎，使药粉平均粒径小于100μm；待粉碎的药材经清洗烘干灭菌后，配料；
c)提取浓缩和干燥工艺：
降香和檀香先加水提取挥发油后再用水提取，赤芍和酸枣仁加水煎煮，水提液过滤后，待浓缩成浸膏；人参用乙醇提取后，再用水提取，醇提液回收乙醇后，浓缩成醇提浸膏，水提液过滤与所有的水提液混匀后浓缩成水提浸膏；
d)制剂工艺：
在沸腾制粒干燥机中加入超微粉碎粉，再将步骤c)所得提取浸膏喷入制粒；将制成的颗粒经整粒，加入冰片细粉，喷入由降香和檀香提取的挥发油，混匀后由胶囊充填机充填，制成胶囊。
或者，本发明胶囊剂优选通过以下制备方法制成：
a)原料药的重量比为：人参3-10份、水蛭3-11份、土鳖虫5-10份、乳香(制)1-5份、赤芍3-9份、降香1-5份、檀香1-5份、全蝎3-9份、蝉蜕3-12份、蜈蚣1-3份、冰片1-7份、炒酸枣仁3-10份；
b)药材粉碎工艺：
将全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫和蝉蜕五种虫药经净选、水洗处理后和净选炮制后的制乳香按处方配料，由粉碎机进行粉碎，药粉细度达到80目以上；粗粉后的药粉经各种超微粉碎技术进行超微粉碎，使药粉平均粒径小于100μm；待粉碎的药材经清洗烘干灭菌后，配料；
c)提取浓缩和干燥工艺：
降香和檀香先加水提取挥发油后再用水提取，赤芍和酸枣仁加水煎煮，水提液过滤后，待浓缩成浸膏；人参用乙醇提取后，再用水提取，醇提液回收乙醇后，浓缩成醇提浸膏，水提液过滤与所有的水提液混匀后浓缩成水提浸膏，将浸膏直接喷雾干燥成喷雾粉；
d)制剂工艺：
将超微粉碎粉与步骤c)所得喷雾干燥粉一起加到沸腾制粒干燥机中，再喷溶媒制成颗粒；将制成的颗粒经整粒，加入冰片细粉，喷入由降香和檀香提取的挥发油，混匀后由胶囊充填机充填，制成胶囊。
本发明应用中，本发明组合物的用量，按原料药总重量计，为每次0.8-3克，每日服用2-4次，优选为每次1.11-2.22克，每日服用三次。
为阐明本发明中药组合物保护内皮细胞屏障功能完整性的活性，用按实施例1方法制得的胶囊内容物干粉(以下称本发明药物)进行了下列动物试验。
一、材料和方法
1、动物与分组
选用中华小型猪30只(购于北京农业大学)，雌雄匹配，体重30公斤左右，应用随机排列表，随机分成模型对照组，小[0.05g/(kg·d)]、中[0.2g/(kg·d)]、大剂量[0.5g/(kg·d)]本发明药物治疗组和假手术组，每组6只。
2、药物与用法
本发明药物胶囊干粉(1.43g生药干粉，由石家庄以岭药业股份有限公司提供)混于饲料中，于AMI造模前3天开始，每天喂食给药1次。小剂量0.05g·kg·^-1·d^-1、中剂量0.2g·kg·^-1·d^-、大剂量0.5g·kg·^-1·d^-。
3、急性心肌梗死再灌注模型
于胸骨正中打开胸腔，纵行切开心包膜，暴露心脏，并将心包膜缝合于胸壁呈吊篮状，于冠状动脉左前降支(LAD)远端1/3～1/2处，将结扎线穿入一长约3～4cm的硅胶管腔内结扎3小时，再松解1小时建立AMI再灌注模型。假手术组冠脉下只穿线，不结扎。实验结束时，从左心室注入4％的硫磺素(thioflavin-S)1ml/kg，使再灌注区着色，无再流区不着色；再于原位重新结扎前降支，从左心室再注入埃文氏(Evan’S)蓝，使结扎区外着蓝色，结扎区不着蓝色。立即取出心脏，剪除左右心耳及残余大血管，于冰生理盐水中荡洗去除残余血液；取部分正常区、再灌注区和无再流区心肌以锡纸包被，标记后保存于液氮中，以备提取总RNA、蛋白和组织匀浆之用，另取部分组织置于4％多聚甲醛中固定，以备HE染色之用。
4、心肌组织中细胞粘附分子蛋白含量测定
取心肌组织约100mg，加入10倍体积冰预冷PBS缓冲液(PH 7.4)，在冰上迅速匀浆18,000rpm，1～2min，4℃离心，2000rpm，15min，仔细收集上清，置于-70℃保存。采用ELISA方法测定心肌组织匀浆中P-选择素、ICAM-1和VCAM-1的含量。具体操作按试剂盒说明书进行，试剂盒购自美国Rapidbio(RB)公司。
5、心肌组织中细胞粘附分子mRNA含量测定
取心肌组织约100mg提取总RNA，将提取的总RNA逆转录成cDNA，以cDNA为模板进行实时反转录聚合酶链反应(Real-time PCR)反应，引物分别为P-选择素上游5’-TCACCTGTGATGA AGGCTCG-3’，下游5’-TTCAAGCCGAAGGTTCCCAG-3’；ICAM1上游5’-CCTGGAT CAATGGAACCGAG-3’，下游5’-TCGTTCAGTGT CACCACAGC-3’；VCAM1上游5’-AGT GATGGCTTTCCAGCTCC-3’，下游5’-TCCTTGACGCTCTCAGAAGG-3’；β-肌动蛋白(β-actin)上游5’-AGGTCATCACCATCGGCAAC-3’，下游5’-TCTCCTTCTGC ATCCTGTCG-3’，PCR反应的具体步骤是：95℃变性5min后，再以95℃30s、59℃30s两步法进行40个循环。每对引物，每种模板，各3个平行管反应。获得同一个样品目的基因的CT值与β-肌动蛋白的CT值，计算出：ΔCT＝CT目的基因-CTβ-肌动蛋白，目的基因的平均相对含量＝2^{-平均ΔΔCT}，(ΔΔCT＝ΔCT未知-ΔCT参照)。
6、心肌组织HE染色观察
标本固定24小时以上，常规石蜡包埋，切片至3～4μm，贴片后脱蜡至水，常规HE染色，显微镜下观察心肌组织形态。
7、心肌组织中内皮细胞间连接蛋白含量测定
10％SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白样品，转移至硝酸纤维素膜，5％脱脂奶粉室温封闭1～1.5小时，加入适量比例的一抗(山羊抗人血管内皮钙粘素(VE-cadherin)，β-连环蛋白(β-catenin)，γ-连环蛋白(γ-catenin)多抗购自美国Santa Cruz公司)，4℃过夜。TBST洗膜3次，加入适量的碱性磷酸酶标记的兔抗山羊IgG，室温2小时，TBST洗膜3次，加入显色底物(NBT/BCIP)避光显色，待出现清晰条带后终止反应。图像以AlphaImager3400分析软件对其进行灰度对比分析。将目的蛋白条带的灰度与内参蛋白条带的灰度相比，再乘以100％，以消除上样量差异的影响，对比各组样本蛋白表达水平的变化情况。
8、统计学方法
实验数据以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS11.5进行统计学处理，同组间的比较用配对t检验，多个样本均数的比较用方差分析和q检验，多个样本均数与同一对照组比较用Dunnet t检验，以P＜0.05(双尾)表示差异有统计学意义。
二、结果
1、心肌组织P-选择素蛋白和mRNA含量
正常区心肌组织中P-选择素蛋白和mRNA含量在各组之间均无显著性差异(P均＞0.05)。与正常区心肌组织比较，模型组和药物治疗组一样，再灌注区和无再流区心肌组织中P-选择素蛋白含量均显著升高(P均＜0.05)，且无再流区升高更明显(P均＜0.01)；再灌注区和无再流区心肌组织中P-选择素mRNA水平也有显著升高(P均＜0.05)，提示再灌注区和无再流区局部粘附分子表达上调，促进炎症细胞粘附和浸润。
与模型组相比较，小剂量组再灌注区和无再流区P-选择素蛋白和mRNA含量无显著变化(P＞0.05)；中剂量和大剂量组的再灌注区和无再流区心肌组织中P-选择素蛋白含量有显著降低(P＜0.05)；而且大剂量组再灌注区和无再流区P-选择素mRNA含量也有显著降低(P＜0.05)，提示中剂量本发明药物可以抑制受损心肌局部P-选择素的蛋白表达，而大剂量本发明药物可以同时抑制P-选择素的转录和翻译，减少局部炎症细胞粘附和浸润，减轻炎症损伤(表1、2)。
表1各组在各区心肌组织P-选择素蛋白水平的变化(ng/mgprot，X±S)

与正常区相比：#P＜0.05，##P＜0.01；与再灌注区相比：+P＜0.05，++P＜0.01；与对照组相比：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01
表2各组在各区心肌组织P-选择素mRNA水平的变化
(相对假手术组正常区含量，X±S)

与正常区相比：#P＜0.05，##P＜0.01；与再灌注区相比：+P＜0.05，++P＜0.01；与对照组相比：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01
2、心肌组织中细胞间粘附分子1(ICAM-1)蛋白和mRNA含量
正常区心肌组织中ICAM-1蛋白和mRNA含量在各组之间均无显著性差异(P均＞0.05)。与正常区心肌组织比较，模型组和药物治疗组一样，再灌注区和无再流区心肌组织中ICAM-1蛋白和mRNA含量均显著升高(P均＜0.01)，且无再流区升高更显著(P均＜0.05)，提示再灌注区和无再流区局部粘附分子表达上调，促进炎症细胞浸润。
与模型组相比较，小剂量组再灌注区和无再流区心肌组织中ICAM-1蛋白和mRNA含量无显著降低(P均＞0.05)；中剂量和大剂量组的再灌注区和无再流区心肌组织中ICAM-1蛋白含量有显著降低(P均＜0.05)；而且大剂量组再灌注区ICAM-1 mRNA含量也有显著降低(P＜0.05)，提示中剂量本发明药物可以抑制受损心肌局部ICAM-1的表达，大剂量本发明药物可以有效抑制ICAM-1的转录和翻译，减轻局部炎症细胞浸润(表3、4)。
表3各组在各区心肌组织ICAM-1蛋白水平的变化(ng/mgprot，X±S)

与正常区相比：#P＜0.05，##P＜0.01；与再灌注区相比：+P＜0.05，++P＜0.01；与对照组相比：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01
表4各组在各区心肌组织ICAM-1 mRNA水平的变化
(相对假手术组正常区含量，X±S)

与正常区相比：#P＜0.05，##P＜0.01；与再灌注区相比：+P＜0.05，++P＜0.01；与对照组相比：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01
3、心肌组织中血管细胞粘附分子1(VCAM-1)蛋白和mRNA含量
正常区心肌组织中VCAM-1蛋白和mRNA含量在各组之间均无显著性差异(P均＞0.05)。与正常区心肌组织比较，模型组和药物治疗组一样，再灌注区和无再流区心肌组织中VCAM-1蛋白和mRNA含量均显著升高(P均＜0.01)，且无再流区升高更显著(P均＜0.05)，提示再灌注区和无再流区局部粘附分子表达上调，促进炎细胞浸润和内皮损伤。
与模型组相比较，不同剂量药物治疗组的再灌注区和无再流区心肌组织中VCAM-1蛋白和mRNA含量有所降低，但是没有显著性差异(P均＞0.05)，提示本发明药物不能抑制受损心肌局部VCAM-1的转录和翻译(表5、6)。
表5各组在各区心肌组织VCAM-1蛋白水平的变化(ng/mgprot，X±S)

与正常区相比：#P＜0.05，##P＜0.01；与再灌注区相比：+P＜0.05，++P＜0.01；与对照组相比：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01
表6各组在各区心肌组织VCAM-1 mRNA水平的变化
(相对假手术组正常区含量，X±S)

与正常区相比：#P＜0.05，##P＜0.01；与再灌注区相比：+P＜0.05，++P＜0.01；与对照组相比：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01
4、心肌组织炎症浸润情况的观察
如图1-4所示，光镜下，假手术组、模型对照组及药物治疗组正常区心肌组织形态结构完整。模型对照组中，再灌注区和无再流区局部有大量的炎细胞浸润，无再流区可见凝固性坏死，心肌纤维呈波浪状，心肌细胞肿胀，胞浆嗜伊红增高，胞浆内出现颗粒状物。与模型对照组相比，小剂量组再灌注区和无再流区心肌组织仍可见明显的炎细胞浸润；中剂量和大剂量组炎症细胞浸润和心肌组织的损伤有明显改善，表明中剂量和大剂量本发明药物可以明显抑制心肌局部炎症浸润，减轻内皮细胞和心肌组织的损伤。
5、心肌组织血管内皮钙粘素(VE-cadherin)含量
各组正常区心肌组织血管内皮钙粘素蛋白含量无显著性差异(P均＞0.05)。与正常区相比较，模型组和药物治疗组再灌注区和无再流区心肌组织中血管内皮钙粘素均显著减低(P均＜0.05)，且无再流区降低更显著(P均＜0.05)，提示再灌注区和无再流区血管内皮细胞完整性受损，无再流区更加明显。
与模型组相比较，小剂量和中剂量组再灌注区和无再流区血管内皮钙粘素含量无显著增加(P均＞0.05)；大剂量组再灌注区和无再流区血管内皮钙粘素含量有显著增加(P均＜0.05)，提示大剂量本发明药物能够抑制内皮细胞连接蛋白的降解，保护内皮细胞结构完整性(表7)。
表7各组在各区心肌组织血管内皮钙粘素含量的变化(相对灰度值％，X±S)

与正常区相比：#P＜0.05，##P＜0.01；与再灌注区相比：+P＜0.05，++P＜0.01；与对照组相比：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01
6、心肌组织β-连环蛋白(β-catenin)含量
各组正常区心肌组织β-连环蛋白含量无显著性差异(P均＞0.05)。与正常区相比较，模型组和药物治疗组再灌注区β-连环蛋白含量降低，但无显著性差异(P均＞0.05)，无再流区β-连环蛋白含量降低显著(P均＜0.01)，提示无再流区血管内皮细胞完整性受损显著。
与模型组相比较，药物治疗组再灌注区和无再流区β-连环蛋白含量增加，但无统计学差异(P均＞0.05)，提示本发明药物不能够增加β-连环蛋白的表达水平。(表8)
表8各组在各区心肌组织β-连环蛋白含量的变化(相对灰度值％，X±S)


与正常区相比：#P＜0.05，##P＜0.01；与再灌注区相比：+P＜0.05，++P＜0.01；与对照组相比：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01
7、心肌组织γ连环蛋白(γ-catenin)含量
各组正常区心肌组织γ连环蛋白含量无显著性差异(P均＞0.05)。与正常区相比较，模型组和药物治疗组再灌注区和无再流区γ连环蛋白含量无显著性差异(P均＞0.05)，提示心肌缺血再灌注过程中，γ连环蛋白含量无明显变化。(表9)
表9各组在各区心肌组织γ连环蛋白含量的变化(相对灰度值％，X±S)

与正常区相比：#P＜0.05，##P＜0.01；与再灌注区相比：+P＜0.05，++P＜0.01；与对照组相比：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01
三、结论
以上研究结果发现与正常心肌组织相比，模型组再灌注区和无再流区P-选择素和ICAM-1蛋白及mRNA水平都有明显升高，无再流区比再灌注区炎症损伤程度更加显著。此外，心肌组织HE染色结果也显示，模型对照组的再灌注区和无再流区局部有大量炎细胞浸润，无再流区心肌细胞肿胀，胞浆嗜伊红增高，胞浆内可见颗粒状物。这些结果表明粘附分子表达上调所介导的内皮损伤和炎细胞浸润，在保护内皮细胞屏障功能完整性中起着重要的作用。
与模型对照组相比，中剂量和大剂量本发明药物可以明显降低再灌注区和无再流区P-选择素和ICAM-1蛋白表达，而大剂量本发明药物可以从mRNA的转录水平上抑制P-选择素和ICAM-1的表达。病理形态学检测结果表明，与模型对照组相比，中剂量和大剂量本发明药物组炎症细胞浸润程度也明显降低，大剂量组的抑制效果更加明显。以上结果表明本发明药物可以降低心肌损伤局部细胞粘附分子的表达，抑制中性粒细胞活化，减轻内皮细胞损伤和心肌局部炎症浸润。
与正常心肌组织相比，再灌注区血管内皮钙粘素的表达明显减少，无再流区内血管内皮钙粘素和β-连环蛋白的含量显著降低，而γ-连环蛋白含量在各区之间无明显差异，表明再灌注区内皮细胞完整性已经受损，无再流区损伤程度更重，而且血管内皮钙粘素和β-连环蛋白在维持内皮细胞屏障功能中有重要的作用，其表达水平下调促进了无再流的发生。与模型对照组相比，大剂量本发明药物可以提高再灌注区和无再流区血管内皮钙粘素表达水平，表明大剂量本发明药物能够抑制血管内皮钙粘素的降解，改善和保护内皮细胞结构完整性，继而维持血管内皮屏障功能。
综上所述，本发明药物能够抑制细胞粘附分子的表达，抑制炎症反应，增加血管内皮钙粘素含量，保护内皮细胞屏障功能完整性。
附图说明
图1光镜观察心肌组织HE染色结果(高倍)A：假手术组；B：模型对照组再灌注区；C：模型对照组无再流区；
图2光镜观察心肌组织HE染色结果(高倍)D：小剂量组再灌注区；E：小剂量组无再流区；
图3光镜观察心肌组织HE染色结果(高倍)F：中剂量组再灌注区；G：中剂量组无再流区；
图4光镜观察心肌组织HE染色结果(高倍)H：大剂量组再灌注区；I：大剂量组无再流区
具体实施方式
实施例1：胶囊剂的制备
a)原料药配方为：
人参39.6g  水蛭72.6g  土鳖虫46.2g  乳香(制)13.2g
赤芍33g    降香13.2g  檀香13.2g    全蝎19.8g
蝉蜕46.2g  蜈蚣6.6g   冰片33g      酸枣仁(炒)33g；
b)药材粉碎工艺：
将全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫和蝉蜕五种虫药经净选、水洗处理后和净选炮制后的制乳香按处方配料，由粉碎机进行粉碎，药粉细度达到80目以上；粗粉后的药粉经各种超微粉碎技术进行超微粉碎，使药粉平均粒径小于30-40μm；待粉碎的药材经清洗烘干灭菌后，配料；
c)提取浓缩和干燥工艺：
降香和檀香先加水提取挥发油后再用水提取，赤芍和酸枣仁加适量水煎煮二次，每次3小时，合并水煎液，水提液过滤后，待浓缩成浸膏；人参用适量70％的乙醇提取二次，每次3小时，合并提取液，回收乙醇至无醇味，再用水提取，醇提液浓缩成相对密度为0.9～1.1(60℃)醇提浸膏，水提液过滤与上述所有水提液混匀后浓缩至相对密度为0.9～1.1(60℃)的清膏，备用；
d)制剂工艺：
在沸腾制粒干燥机中加入超微粉碎粉，再将步骤c)所得提取浸膏喷入制粒；将制成的颗粒经整粒，加入冰片细粉，喷入由降香和檀香提取的挥发油，混匀后由胶囊充填机充填，制成1000粒胶囊。
用法与用量：口服。一次2～4粒，一日3次。
实施例2：片剂的制备
a)原料药配方为：
人参66g    水蛭52.8g  土鳖虫46.2g  乳香(制)13.2g
赤芍33g    降香13.2g  檀香13.2g    全蝎59.4g
蝉蜕46.2g  蜈蚣6.6g   冰片33g      酸枣仁(炒)33g
b)药材粉碎工艺：
将全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫和蝉蜕五种虫药经净选、水洗处理后和净选炮制后的制乳香按处方配料，由粉碎机进行粉碎，药粉细度达到80目以上；粗粉后的药粉经各种超微粉碎技术进行超微粉碎，使药粉平均粒径小于70-90μm；待粉碎的药材经清洗烘干灭菌后，配料；
c)提取浓缩和干燥工艺：
降香和檀香先加水提取挥发油后再用水提取，赤芍和酸枣仁加适量水煎煮二次，每次3小时，合并水提液，过滤后，待浓缩成浸膏；人参用适量70％的乙醇提取二次，每次3小时，合并提取液，回收乙醇至无醇味，再用水提取，醇提液浓缩成相对密度在60℃测定为1.0～1.05醇提浸膏，水提液过滤与上述所有水提液混匀后浓缩至相对密度为1.0～1.1(60℃)的清膏，备用；
d)制剂工艺：
在沸腾制粒干燥机中加入超微粉碎粉，再将步骤c)所得提取浸膏喷入制粒；将制成的颗粒经整粒，加入冰片细粉，喷入由降香和檀香提取的挥发油，按常规制剂工艺压制成1000片。
本发明药物的用量，为每次2-4片，每日服用三次。
实施例3：丸剂的制备
a)原料药配方为：
人参39.6g  水蛭66g    土鳖虫46.2g  乳香(制)13.2g
赤芍33g    降香13.2g  檀香13.2g    全蝎46.2g
蝉蜕46.2g  蜈蚣6.6g   冰片33g      酸枣仁(炒)33g
b)药材粉碎工艺：
将全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫和蝉蜕五种虫药经净选、水洗处理后和净选炮制后的制乳香按处方配料，由粉碎机进行粉碎，药粉细度达到80目以上；粗粉后的药粉经各种超微粉碎技术进行超微粉碎，使药粉平均粒径10-20μm；待粉碎的药材经清洗烘干灭菌后，配料；
c)提取浓缩和干燥工艺：
降香和檀香先加水提取挥发油后再用水提取，赤芍和酸枣仁加适量水煎煮二次，每次3小时，合并水提液，过滤后，待浓缩成浸膏；人参用适量70％的乙醇提取二次，每次3小时，合并提取液，回收乙醇至无醇味，再用水提取，醇提液浓缩成相对密度为0.9～1.0(60℃)醇提浸膏，水提液过滤与上述所有水提液混匀后浓缩至相对密度为1.0～1.1(60℃)的清膏，备用；
d)制剂工艺：
在沸腾制粒干燥机中加入超微粉碎粉，再将步骤c)所得提取浸膏喷入制粒；将制成的颗粒经整粒，加入冰片细粉，喷入由降香和檀香提取的挥发油，按常规制剂工艺，制成1000粒丸剂。
本发明药物的用量，为每次2-4粒，每日服用三次。